Summary
يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2', 7'-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.
Abstract
يتعرض سطح العين للبلى العادية بسبب عوامل بيئية مختلفة. ويشكل التعرض للأشعة فوق البنفسجية - C خطرا على الصحة المهنية. هنا، نُظهر تعرض الخلايا الجذعية الأولية من سطح العين للفأر ة إلى الأشعة فوق البنفسجية-C. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل هو قراءة مدى الإجهاد التأكسدي / الضرر. في الإعداد التجريبي في المختبر ، من الضروري أيضًا تقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. في هذه المقالة، سوف نبرهن على 2',7'-Dichloroforesindiacetate (DCFDA) تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية-C يتعرض الخلايا الجذعية الرئيسية سطح العين الماوس وقياسها على أساس الصور الفلورية من تلطيخ DCFDA. DCFDA تلطيخ يتوافق مباشرة مع جيل ROS. كما نبرهن على القياس الكمي للخلايا الميتة والحية عن طريق تلطيخ متزامن مع يوديد البروبيديوم (PI) وهويشت 3332 على التوالي والنسبة المئوية لخلايا DCFDA (ROS إيجابية) وPI الإيجابية.
Introduction
سطح العين (OS) هو وحدة وظيفية تتكون أساسا من الطبقة الخارجية والظهارة الغدية للقرنية، الغدة lachrymal، الغدة meibomian، الملتحمة، جزء من هوامش غطاء العين والداخلية التي تشير عبر الترانسدوس1. تركز طبقة القرنية الشفافة على شكل قبة الضوء على شبكية العين. يتكون هذا النسيج اللاوعي من مكونات خلوية مثل الخلايا الظهارية والخلايا القرنية والخلايا الانائية والمكونات الخلوية مثل الكولاجين وجليكوزامينوجليكان2. يتم استنزاف المنطقة من الدموع التي توفر أيضا معظم المواد الغذائية. الموقع التشريحي لنظام التشغيل يجبرها على أن تكون على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية، وغالبا ما يعرضها لمختلف المكونات القاسية مثل الضوء الساطع والميكروبات وجزيئات الغبار والمواد الكيميائية. هذا العامل يهيئ نظام التشغيل للإصابات الجسدية ويجعلها عرضة لمختلف الأمراض.
يحدث الإجهاد التأكسدي بسبب اختلال التوازن بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وآليات الدفاعات المضادة للأكسدة الذاتية3. يتم تصنيف ROS إلى جزيئات تفاعلية وجذور حرة ، وكلاهما مشتق من الأكسجين الجزيئي (O2)من خلال فوسفوريل الأكسدة الميتوكوندريا4. تتكون المجموعة السابقة من أنواع غير جذرية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)، الأكسجين المنفرد(1O2)، ويشمل هذا الأخير أنواعًا مثل أنيونات أكسيد فائق (O2-) ، وجذور الهيدروكسيل(•OH) ، من بين أمور أخرى. هذه الجزيئات هي المنتجات الثانوية للعمليات الخلوية العادية وأدوارها قد تورطت في وظائف فسيولوجية هامة مثل نقل الإشارة ، والتعبير الجيني ، والدفاع المضيف5. ومن المعروف أن إنتاج معزز من ROS يتم إنشاؤه استجابة لعوامل مثل غزو مسببات الأمراض ، xenobiotics ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)4. هذا الإفراط في إنتاج ROS يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي الذي يؤدي إلى تلف الجزيئات مثل الأحماض النووية والبروتينات والدهون6.
تتكون أشعة الشمس الطبيعية، المصدر الأكثر انتشارًا للأشعة فوق البنفسجية، من الأشعة فوق البنفسجية (400-320 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-B (320-290 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-C (290-200 نانومتر)7. وقد أبلغ عن وجود ارتباط عكسي بين الطول الموجي والطاقات الطيفية. وعلى الرغم من أن الغلاف الجوي يمتص الأشعة فوق البنفسجية - C الطبيعية، فإن المصادر الاصطناعية مثل مصابيح الزئبق وأدوات اللحام تنبعث منها، وبالتالي تشكل خطراً مهنياً. أعراض التعرض للعيون تشمل التهاب الكرات الضوئية والتهاب الكظر الملتحمة8. إنتاج ROS هي واحدة من الآليات الرئيسية لإلحاق الأشعة فوق البنفسجية الناجمة عن الضرر الخلوي9. في الدراسة الحالية، ونحن نبرهن على الكشف عن روس باستخدام 2',7'-ديكلوروديهيدروفلورسين diacetate (DCFDA) طريقة تلطيخ في خلايا سطح العين الأولية الماوس / الخلايا الجذعية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية-C. تم التقاط الفلورية الخضراء باستخدام المجهر الفلوري. وكانت الخلايا ملطخة بصبغتين، هما Hoechst 33342 ويوديد البروبيديوم الأحمر، لتلطيخ الخلايا الحية والميتة، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت التجربة على خلايا العين الأولية / الخلايا الجذعية المستمدة من عين الفأر ة المهق السويسرية. تمت الموافقة على استخدام الحيوانات لحصاد العيون لهذه التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية الحيوانية المؤسسية، ينبويا (تعتبر جامعة) (رقم موافقة IEAC، 6a/19.10.2016).
1. الاستعدادات من الكواشف
ملاحظة: اشتقاق الخلايا الأولية/الخلايا الجذعية من سطح العين الماوس خارج نطاق هذا البروتوكول. وبالتالي، فإننا نظهر جرعات التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C، وإعداد الكاشف لتقييم ROS والخلايا الحية والميتة وقياسها الكمي. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للاطلاع على المجلدات ذات الصلة من الكواشف (10٪ مصل الأبقار الجنينية، DCFDA، Hoechst وحلول مخزون يوديد البروبيديوم لإضافتها للحصول على محلول تلطيخ النهائي).
- إعداد حل الأسهم من 10 m DCFDA عن طريق إذابة 25 ملغ من مسحوق DCFDA في 5.13 مل من DMSO. Aliquot 250 μL كل في العنبر الملونة 1.5 أنابيب مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد محلول مخزون من 10 ملغ / مل (16.23 م م الحل) Hoechst 33342 عن طريق حل محتويات كامل قارورة 25 ملغ في 2.5 مل من الماء المغوني. جعل aliquots من 100 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الملونة العنبر وتخزينها في 2-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. للتخزين على المدى الطويل، قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
- إعداد محلول مخزون من 1 ملغ / مل يوديد البروبيديوم في الماء المؤين، aliquot 1 مل لكل من الأنابيب الملونة 1.5 مل العنبر، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
2. طلاء الخلايا والعلاج بالأشعة فوق البنفسجية-C
- قبل الطلاء ، فصل خلايا سطح العين الأولية الماوس معزولة في مختبرنا (النتائج غير المنشورة ؛ هذه الخلايا هي مزيج من الظهارة القرنية والخلايا المترفية والخلايا القرنية) باستخدام عامل انفصال الخلية لطيف(جدول المواد).
- لوحة 0.2 × 106 خلايا سطح العين الماوس الابتدائية في 35 ملم 0.2٪ غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة أطباق ثقافة الخلايا في 2.5 مل من وسائل الإعلام كاملة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪CO2 وحاضنة رطبة.
ملاحظة: تتكون الوسائط الكاملة لاستزراع الخلايا الأولية من سطح العين الماوس من الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 20٪ FBS، 1٪ Pen-العقدية، 1٪ Glutamax، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ بيروفات الصوديوم، و 0.1٪ α-mercaptoethanol. - قبل تعريض الخلايا لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية C، تجاهل الحجم الأقصى من وسائل الإعلام والسماح فقط طبقة رقيقة من وسائل الإعلام (~ 500 ميكرولتر) للبقاء على اتصال مع الخلايا، فقط ما يكفي لتغطيتها.
- خذ الأطباق ، واحدًا تلو الآخر إلى مصدر / غرفة UV-C (الغرفة السفلية لفرن التهجين / رابط عبر الأشعة فوق البنفسجية ؛ جدول المواد). وضع الطبق في الغرفة وإزالة غطاء الطبق. يضمن وضع الغطاء المفتوح للطبق أن تتلقى الخلايا الحد الأقصى لجرعة الأشعة فوق البنفسجية-C أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C.
- تعريض الخلايا لدرجات/جرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية-C: 1 J/m2،100J/m2،1000 J/m2 و 10،000 J/m2.
- بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية- C، استبدل غطاء كل من الأطباق على الفور وأزلها من غرفة مصدر الأشعة فوق البنفسجية-C.
- جلب كل من الأطباق إلى غطاء محرك الهواء تدفق الهواء laminar وأعلى حتى كل من الأطباق مع 2 مل من وسائل الإعلام الكاملة الطازجة.
- احتضان الخلايا لمدة 3 ساعة في حاضنة CO2 37 درجة مئوية. ثلاث ساعات من احتضان بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C هو الأمثل لتصور وتحديد الآثار في وقت مبكر.
3. إعداد وسائط تلطيخ الخلايا الحية
- إعداد وسائل الإعلام تلطيخ جديدة خلال آخر 15 دقيقة من 3 ح حضانة الخلية بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية- C.
- قبل الحارة 10 مل من وسائط تلطيخ تحتوي على 10٪ FBS-DMEM تكملها مع 1٪ القلم العقدية إلى 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 ميكرولتر من 10 مم DCFDA؛ 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 10 ملغ/مل و200 ميكرولتر من 1 ملغم/مل يوديد يوم بروبيديوم. التركيزات النهائية للDCFDA، Hoechst و PI هي 5 ميكرومتر، 5 ميكروغرام/مل و 20 ميكروغرام/مل، على التوالي، في 10 مل من وسائط تلطيخ.
4. DCFDA تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية - C يتعرض خلايا العين الماوس الأولية
- بعد 3 ساعة من حضانة الأشعة فوق البنفسجية -C تعرض خلايا العين الأولية الماوس بجرعات مختلفة، يستنشق وسائل الإعلام من الأطباق 35 ملم.
- تجديد مع 2 مل من إعداد هابا جديدة DCFDA تلطيخ وسائل الإعلام إلى كل من الأطباق بلطف من الجانبين.
- احتضان الخلايا مع وسائط تلطيخ لمدة 15 دقيقة في الظلام في حاضنة 37 درجة مئوية CO2 لتلطيخ الخلية الحية.
5. عرض DCFDA (ROS) ، Hoechst وPI الخلايا الملطخة
- بعد الانتهاء من الحضانة، تجاهل وسائل الإعلام تلطيخ.
- إضافة وسائط كاملة جديدة إلى الخلايا ومراقبة الخلايا تحت المجهر الفلورسنت مقلوب / صور الخلية(جدول المواد). تصوير الحقول المطلوبة: مشرق الميدان، الفلورية الزرقاء، الفلورية الحمراء، الفلورسينس الأخضر.
ملاحظة: الخلايا الزرقاء الملطخة الفلورية هي النوى، والفلورسينس الأخضر هو لخلايا توليد ROS والفلورية الحمراء يشير إلى الخلايا الميتة إيجابية PI.
6. القياس الكمي للخلايا الملطخة (Hoechst-Blue و PI-Dead و Green-ROS) باستخدام تقنيات التصوير
- تصدير الصور التي تم التقاطها تحت المجهر الفلوري المقلوب / صور الخلية إلى ImageJ للقياس الكمي.
- افتح كل صورة من الصور مرة واحدة، باستخدام كل قناة (أي زرقاء (نواة/هويشت)، خضراء (ROS)، حمراء (ميتة/إيجابية PI)) بالتتابع، للعد. ابدأ من عنصر التحكم غير المكشوف والانتقال بالتتابع إلى 1 و100 و1000 و1000 000J/m-2.
- عد الخلايا باستخدام أداة عد الخلايا التي تم وضع علامة عليها كصليب في قائمة البرامج لكل حقل من الحقول [موجب أزرق (إيجابي Hoechst ؛ النوى) ، إيجابي أحمر (PI إيجابي ؛ خلايا ميتة) ، موجب أخضر (ROS)] في كل من الصور المقابلة لكل من العلاجات.
- عد من خلال النقر على كل من إشارات محددة في كل من الحقول. على سبيل المثال، النقر على النوى الملونة الزرقاء / Hoechst سيعطي العدد الإجمالي للنواة في حقل معين.
- حساب النتائج كنسبة مئوية من وفيات الخلايا عن طريق تلف الأشعة فوق البنفسجية (عدد الخلايا الإيجابية PI × 100 مقسومة على عدد الخلايا الإيجابية Hoechst) والنسبة المئوية لإنتاج ROS عن طريق تلف الأشعة فوق البنفسجية (عدد الخلايا الإيجابية DCFDA × 100 مقسومًا على عدد الخلايا الإيجابية Hoechst).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DCFDA هو صبغة عديم اللون التي هي شكل من أشكال الفلورسين المختزلكيميائي استعمل كمؤشر للكشف عن روس في الخلايا. هذه الصبغة يحصل المحاصرين داخل الخلايا وتتأكسد بسهولة إلى الفلورسنت ديكلورودي هيدروفلورسين (DCF), التي تنبعث منها الفلورسيس الأخضر. يمكن الكشف عن هذا الفلورية باستخدام المجهر الفلوري. يمكن تصور الخلايا وربطها مع تراكم ROS على النحو التالي: (1) الخلايا الحية دون ROS تنبعث منها فلورانة زرقاء عالية؛ (2) الخلايا الحية دون ROS تنبعث منها الفلورسينالأزرق العالي. '2' تنبعث من الخلايا الحية ذات التراكم ROS تفلور أزرق مرتفع مع تفلور أخضر منخفض؛ و (3) الخلايا الميتة مع تراكم ROS تنبعث منها الفلورسينس الأزرق منخفضة مع ارتفاع الفلورية الخضراء الحمراء والعالية.
خلايا التحكم والخلايا المعرضة ل1 J/m2 من الأشعة فوق البنفسجية-C لم يحمل DCFDA/ ROS والخلايا الإيجابية PI. أظهرت السيطرة غير المكشوفة على الأشعة فوق البنفسجية-C تلطيخ نووي فقط كما هو مبين في تلطيخ Hoechst(الشكل 1). ومع ذلك ، لم تشاهد أي خلايا إيجابية PI أو DCFDA في خلايا التحكم غير المكشوفة فوق البنفسجية C(الشكل 1).
الخلايا المعرضة ل100 J/m2 من الأشعة فوق البنفسجية-C أظهرت انخفاض ROS والخلايا الإيجابية PI. وأظهرت الخلايا الأولية من سطح العين الماوس عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C بجرعة 100 J/m2 حوالي 5٪ تلطيخ مشترك من DCFDA وPI، وبالتالي، مما يشير إلى تشكيل روس وموت الخلايا في 5٪ من الخلايا(الشكل 1).
الخلايا المعرضة ل1,000 J/m2 من الأشعة فوق البنفسجية-C عرضت 60%-70% ROS والخلايا الإيجابية PI. وأظهرت الخلايا الأولية من سطح العين الماوس عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C بجرعة 1000 J/m2 حوالي 70٪ شارك تلطيخ DCFDA وPI، وبالتالي، مما يشير إلى تشكيل روس وموت الخلايا في 70٪ من الخلايا(الشكل 1).
الخلايا المعرضة ل10,000 J/m2 من الأشعة فوق البنفسجية-C أظهرت 100% ROS الخلايا الإيجابية و ~ 100% موت الخلايا. أدت أعلى جرعة من الأشعة فوق البنفسجية-C (10,000 J/m2)عند التعرض للخلايا الأولية للفئران إلى وفاة الخلايا بنسبة 100٪ (الخلايا الإيجابية PI) وتشكيل ROS (تلطيخ DCFDA)، مما يشير إلى أعلى معدل فتك لهذه الجرعة الخاصة بالأشعة فوق البنفسجية-C(الشكل 1).
ولم تظهر الخلايا المعالجة بـ 1 J/m2 من الأشعة فوق البنفسجية - C أي تراكم لـ ROS وكانت النسبة المئوية للخلايا الحية في هذه الجرعة مماثلة لتلك الموجودة في خلايا التحكم. أظهرت الخلايا كمية كبيرة من موت الخلايا وتراكم ROS عند 100 J/m2. ولوحظ تتراكم الخلايا وموت الخلايا في الخلايا التي عولجت بـ 000 10 J/m2 من الأشعة فوق البنفسجية- C.
تم رسم النتائج الكمية (النسبة المئوية لتوليد ROS والنسبة المئوية لوفاة الخلايا وفقاً للصيغ الواردة في القسم 6.3) في شكل رسم بياني شريطي(الشكل 2). يمثل المحور X جرعات الأشعة فوق البنفسجية-C بينما يمثل المحور Y النسبة المئوية للخلايا. يمثل الشريط الأخضر النسبة المئوية لـ ROS ، وتمثل القضبان الحمراء موت الخلية بجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية -C(الشكل 2). وكانت النسبة المئوية للخلايا ROS والخلايا الميتة من أجل 0٪، 0٪، 10٪، 70٪ و 100٪ في جرعات الأشعة فوق البنفسجية-C: التحكم غير المكشوفة، 1 J/m2،100 J/m2،1000 J/m2 و 10،000 J/m2، على التوالي(الشكل 2).
الشكل 1: صور الخلية الحية المركبة للخلايا الأولية لسطح العين الماوس المعرضة لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية-C (التحكم غير المكشوف، 1، 100، 1000، 1000، 1000 J/m2). تم التقاط هذه الصور تحت مرشحات مختلفة: الحقل الساطع (لمورفولوجيا الخلايا) والأزرق (وصمة عار نووية Hoechst) والأخضر (جيل ROS) والأحمر (الخلايا الميتة الملطخة ببروبيديوم). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الرسوم البيانية الشريطية التي تبين نتائج القياس الكمي التي تم الحصول عليها بعد حساب النسبة المئوية لتوليد ROS والنسبة المئوية للخلايا الميتة عند تعرض الخلايا السطحية الرئيسية للفئران إلى جرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية- C. يمثل المحور X جرعات الأشعة فوق البنفسجية-C، في حين يمثل المحور Y النسبة المئوية للخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكون | حجم |
| 10% مصل الأبقار الجنيني الذي يحتوي على DMEM | 9790 ميكرولتر |
| حل أسهم DCFDA | 5 ميكرولتر |
| هويشت 33342 حل الأسهم | 5 ميكرولتر |
| محلول أسهم البروبيديوم يوديد | 200 ميكرولتر |
الجدول 1: الكواشف اللازمة لإعداد محلول تلطيخ.
| المشكله | الأسباب المحتملة | استكشاف الاخطاء | تعليقات |
| لا أو القليل جدا ROS أو PI الخلايا الإيجابية ملطخة عندما تم التعامل مع الخلايا مع ارتفاع إلى أعلى جرعة الأشعة فوق البنفسجية | ط. استخدام محلول تلطيخ القديمة. | ط. استخدام حل تلطيخ أعدت حديثا. | ط. في وقت سابق أعدت حل تلطيخ يؤدي إلى تلطيخ غير لائق من الخلايا. |
| ii. طبق الثقافة Overconfluent مما أدى إلى إنقاذ الأضرار UVC من قبل الخلايا. | ii. لوحة فقط 0.2 مليون خلية في كل طبق ثقافة الخلية 35 ملم وأبدا السماح للخلايا أن تنمو لأكثر من 12 ساعة قبل تعريضهم لجرعات UVC. | ii. يمكن إنقاذ الخلايا Overconfluent من الضرر UVC، وبالتالي سيتم تصور أي أو القليل ROS والخلايا الإيجابية PI. |
الجدول 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تلطيخ DCFDA الموصوفة هنا تمكن من تصور ROS في خلايا حية العين الأولية الماوس تعامل مع الأشعة فوق البنفسجية-C. ميزة طريقة تلطيخ هذه هو أنه يسمح أيضا للباحثين لدراسة الآثار الفورية للأشعة فوق البنفسجية -C (3 ساعات بعد التعرض UVC) على الخلايا الحية وتعدادها في وقت واحد لنسبة إيجابية ROS، وكذلك، الخلايا الميتة. وعلاوة على ذلك، كما يتم استخدام طريقة تلطيخ على الخلايا الحية، يمكن احتضان الخلايا أكثر في نفس وسائل الإعلام لفترة أطول (عدة أيام) لدراسة الآثار المتأخرة للأشعة فوق البنفسجية-C. وبالتالي ، فإن طريقة تلطيخ هذه تجعل من الممكن تصور جيل ROS (الأخضر) والتمييز في وقت واحد بين مجموعات الخلايا الحية والمبرمجة والميتة في الخلايا الحية تحت مجهر فلوري مقلوب. ومع ذلك ، في ظل ظروف معينة ، على الرغم من توقع الحصول على الخلايا الإيجابية ROS وPI ، يمكن أن تفشل التصور. لمثل هذه الحالات، يتم اقتراح استكشاف الأخطاء وإصلاحها(الجدول 2).
يجب تنفيذ هذا البروتوكول بدقة للحصول على أفضل النتائج. تشير النتائج المثلى إلى ارتباط الإشارة الفلورية الخضراء المنبعثة/ROS الناتجة كقراءة دقيقة لتلف الحمض النووي الناتج عن جرعة UV-C. وبعبارة أخرى، لتنفيذ هذه الخطوة، لا ينبغي أن يكون حجم الوسائط التي هي على اتصال مع الخلايا أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C كثيرا بحيث فشل جرعة الأشعة فوق البنفسجية-C في الحصول على الضرر المطلوب. وبالتالي، فمن الضروري للحفاظ على الحد الأدنى من حجم وسائل الإعلام، ويقول 500 ميكرولتر لكل طبق 35 ملم، فقط ما يكفي لتغطية الخلايا أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C في جميع الجرعات المحددة. ثانيا، لا ينبغي أن يكون حجم وسائل الإعلام قليلا جدا بحيث تجف الخلايا أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C. وأخيرا، مباشرة بعد تعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية-C، وينبغي أن تصدرت الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة إلى الحجم الأمثل (ويقول 2 مل)، من أجل مزيد من تجنب أي أضرار وتوليد ROS.
أحد قيود هذه التقنية هو نوع ROS التي تم إنشاؤها. يجب إجراء عمليات إضافية أخرى للكشف عن نوع ROS المحدد استجابة لنطاقات جرعة UV-C. وتشمل هذه العينات تقييم الهيدروكسيل الجذور داخل الخلايا(•OH), الجذور فوق أكسيد الخلايا, أنواع النيتروجين التفاعلية داخل الخلايا, الجذور الهيدروكسيل الميتوكوندريا, أكسيدات فوق الميتوكوندريا, وبيروكسيد الهيدروجين في الخلايا الحية باستخدام مجموعات متاحة تجاريا. وثمة قيد آخر لهذه التقنية هو إمكانية الكشف عن النسبة المئوية لتوليد الموارد الكلية في جرعات تقل عن 10 J/m2 وما فوق 000 10 J/m2. على ما يبدو، لم تكن هناك خلايا إيجابية ROS مرئية عندما تعرضت الخلايا الأولية / الخلايا الجذعية من سطح العين الماوس لجرعات الأشعة فوق البنفسجية-C أقل من 10 J/m2. على العكس من ذلك، كانت الخلايا الإيجابية ROS 100٪ مرئية عندما تعرضت الخلايا لجرعة UV-C فوق 10،000 J/m2. وبالتالي، قد تكون التحاليل الأخرى (على سبيل المثال، تحليل الإنزيمات، وقياس علامات الإجهاد التأكسدي مثل 8-هيدروكسي أوكسيغوانوسين (8-OHdG) (علامة تلف الحمض النووي)، وتحليل اللطخة الغربية لبروتينات تلف الحمض النووي بجرعات مختلفة) مفيدة لفهم مدى/نوع الأضرار الخلوية/الجزيئية على مختلف المستويات. ويتمثل القيد الثالث لهذه التقنية في ارتباط جرعات الأشعة فوق البنفسجية -C بـ ROS المتولدة عبر أنواع مختلفة من الخلايا. يجب التحقق من صحة ذلك.
حاليا، مجموعات DCFDA متوفرة تجاريا للكشف عن ROS إما باستخدام المجهر أو تدفق علم الخلايا10،11. غير أن هذه المجموعات باهظة التكلفة ولا يمكن أن تتحملها مختبرات البحوث في البلدان المقيدة الموارد. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول مفيد للغاية بكفاءة أقرب إلى الطرق المباعة تجاريًا. ثانيا، قمنا بدمج صبغة البيوبيديوم الخلايا الميتة جنبا إلى جنب مع جيل DCFDA/ROS. وبالتالي ، يمكن إجراء مراقبة الخلية الحية للخلايا الإيجابية والميتة ROS في وقت واحد باستخدام هذه الطريقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تلقى المؤلفون دعمًا تمويليًا من مختبرات Bio-Rad الهند الخاصة المحدودة لرعاية المقال.
Acknowledgments
ويعترف أصحاب البلاغ بالدعم المقدم من مركز ينبويا للبحوث، ينبويا (الذي يعتبر جامعياً) لمرافق الهياكل الأساسية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J.
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
