Summary
该协议演示了从小鼠眼部表面细胞同时检测活原培养物中的活性氧物种（ROS）、活细胞和死细胞。2'，7'-二氯氟乙酸酸酯，碘化钠和Hoechst染色分别用于评估ROS，死细胞和活细胞，然后成像和分析。
Abstract
由于各种环境因素，眼部表面经常磨损。暴露于UV-C辐射构成职业健康危害。在这里，我们演示了从小鼠眼部表面向UV-C辐射暴露的原发干细胞。活性氧物种（ROS）的形成是氧化应激/损伤程度的读出。在实验性体外环境中，评估氧化应激产生的死细胞百分比也至关重要。在本文中，我们将演示UV-C暴露小鼠原眼表面干细胞的2'，7'-二氯氟乙酸（DCFDA）染色及其基于DCFDA染色荧光图像的定量。DCFDA 染色直接对应于 ROS 生成。我们还通过同时染色碘化（PI）和Hoechst 3332以及DCFDA（ROS阳性）和PI阳性细胞的百分比，证明了死细胞和活细胞的定量。
Introduction
眼部表面（OS）是一个功能单元，主要由角膜的外层和腺上皮组成，角膜、乳腺、美博体腺、结膜、部分眼睑边缘和内侧转导信号1。透明圆顶形角膜层将光线聚焦到视网膜上。这种血管组织由细胞成分组成，如上皮细胞、角质细胞和内皮细胞以及胶原蛋白和糖甘油2等细胞成分。该地区被眼泪排干，也提供大部分的营养。操作系统的解剖位置迫使它与外部环境直接接触，经常使其暴露于各种苛刻的成分，如明亮的光线、微生物、灰尘颗粒和化学品。此因素使操作系统容易受到身体伤害，并容易出现各种疾病。
氧化应激是由于活性氧物种（ROS）的产生与内源抗氧化防御机制3之间的不平衡引起的。ROS分为活性分子和自由基，两者都来自分子氧（O2）通过线粒体氧化磷酸化4。前者由非基类组成，如过氧化氢（H2O2）、单氧（1O2），后者包括超氧化物氧化离子（O2-）和羟基基（+OH）等物种。这些分子是正常细胞过程的副产品，它们的作用与重要的生理功能有关，如信号转导、基因表达和宿主防御5。ROS的增强生产已知产生对诸如病原体入侵，异种生物和暴露于紫外线（UV）辐射4等因素。这种ROS的过度生产导致氧化应激，导致核酸、蛋白质和脂质6等分子的损伤。
自然阳光是紫外线辐射的主要来源，由UV-A（400~320nm）、UV-B（320–290 nm）和UV-C（290~200nm）7组成。据报道，波长和光谱能量之间存在反比相关性。虽然天然UV-C辐射被大气吸收，但汞灯和焊接仪器等人工辐射会发出，因此构成职业危害。暴露于眼睛的症状包括光角炎和光角结膜炎8。ROS的产生是造成紫外线诱发细胞损伤的主要机制之一。在目前的研究中，我们演示了在暴露于UV-C的小鼠原样眼表面细胞/干细胞中使用2'，7'-二氯二氢氟乙酸二乙酸（DCFDA）染色方法检测ROS。绿色荧光是使用荧光显微镜捕获的。细胞分别与两种染料，Hoechst 33342和红色碘化钠进行反染色，以染色活细胞和死细胞。
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Protocol
该实验是在从瑞士白化鼠眼中提取的原发性眼细胞/干细胞上进行的。利用动物来采集眼睛进行这项实验得到了机构动物伦理委员会（被认为是大学）的批准（IEAC批准号，6a/19.10.2016）。
1. 试剂制剂
注：从小鼠眼部表面衍生的初级细胞/干细胞超出本协议的范围。因此，我们演示UV-C暴露剂量，用于评估ROS的试剂制备，活细胞和死细胞及其定量。有关试剂（10%胎儿牛血清、DCFDA、Hoechst 和碘化钠库存溶液，以获取最终染色溶液），请参阅表 1。
- 通过在5.13 mL DMSO中溶解25毫克的DCFDA粉末，制备10mM DCFDA的库存溶液。盐分 250 μL 每个琥珀色 1.5 mL 管，储存在 -20°C。
- 通过在2.5 mL的去离子水中溶解25mg小瓶的全部含量，制备10mg/mL（16.23 mM溶液）的霍普赫斯特33342的库存溶液。在琥珀色微离心管中制造100μL的等分，在2-6°C下储存长达6个月。对于长期存储，储存在-20°C。
- 在去离子水中制备1mg/mL碘化钠的库存溶液，在琥珀色1.5 mL管中各1mL，并储存在4°C。
2. 细胞电镀和UV-C辐射处理
- 在电镀之前，使用温和的细胞分离剂（材料表）分离在我们的实验室中分离的小鼠原生眼表面细胞（未公布的结果;此类细胞是角膜上皮、基质细胞和角质细胞的混合物）。
- 板 0.2 x 106小鼠原孔表面细胞在 35 mm 0.2% 基底膜基质涂层细胞培养皿中，在 2.5 mL 的完整介质中。在5%CO2和加湿培养箱中，在37°C下孵育过夜。
注：从小鼠眼部表面培养原细胞的完整介质包括含有20%FBS、1%Pen-链球菌、1%谷氨酸、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%焦化酸钠和0.1%β-汞的DMEM高葡萄糖。 - 在将细胞暴露于各种剂量的 UV-C 之前，请丢弃最大体积的介质，只允许一层薄薄的介质 （+500 μL） 与细胞保持接触，仅够覆盖它们。
- 将盘子，一次一个到UV-C源/室（杂交烤箱/UV交叉连结器的下腔室;材料表）。将盘子放入室中，并取下盘子的盖子。盘的开盖位置确保细胞在UV-C照射期间获得最大的UV-C剂量。
- 将细胞暴露于不同等级/剂量的UV-C：1 J/m 2，100J/m2，1，000 J/m2和10，000 J/m2。
- UV-C 曝光后，立即更换每个洗盘的盖子，并将其从 UV-C 源室中取出。
- 将每个盘子带到层气流量罩，用 2 mL 的新鲜完整介质将每个盘子加满。
- 在37°C CO2培养箱中孵育细胞3小时。UV-C 暴露后三小时的孵育是可视化和量化早期效果的最佳选择。
3. 制备活细胞染色介质
- 在 UV-C 曝光后 3 h 细胞孵育的最后 15 分钟，新鲜制备染色介质。
- 预温 10 mL 的染色介质包含 10% FBS-DMEM，辅以 1% 笔链到 37 °C。
- 加入5 μL的10 mM DCFDA;5 μL 10 mg/mL Hoechst 溶液和 200 μL 1 mg/mL 碘化钠。DCFDA、Hoechst 和 PI 的最终浓度分别为 5 μM、5 μg/mL 和 20 μg/mL，在染色介质的 10 mL 中。
4. UV-C暴露小鼠原性眼细胞的DCFDA染色
- UV-C照射小鼠原发性眼细胞以不同剂量孵育3小时后，从35毫米培养皿中吸出介质。
- 从侧面轻轻地将 2 mL 新鲜烹制的 DCFDA 染色介质补充到每个盘子上。
- 用染色培养基在黑暗中在37°C CO2培养箱中孵育细胞15分钟，用于活细胞染色。
5. 查看DCFDA（ROS）、Hoechst和PI染色细胞
- 孵化完成后，丢弃染色介质。
- 向细胞添加新鲜的完整介质，并在倒置荧光显微镜/细胞成像仪（材料表）下观察细胞。拍摄所需的磁场：亮场、蓝色荧光、红色荧光、绿色荧光。
注：蓝色荧光染色细胞为核，绿色荧光为ROS生成细胞，红色荧光表示PI阳性死细胞。
6. 使用成像技术对染色细胞（霍赫斯特-蓝色、PI-死细胞和绿色-ROS）进行定量
- 将倒置荧光显微镜/细胞成像器下捕获的图像导出到 ImageJ 进行定量。
- 使用每个通道（即蓝色（Nuclei/Hoechst）、绿色（ROS）、红色（死/PI 阳性））按顺序打开每个图像，以进行计数。从未曝光的控制开始，依次移动到 1，100、1，000 和 10，000 J/m-2。
- 使用软件菜单中标记为交叉的细胞计数工具对每个字段的细胞计数工具进行计数 [蓝色正（Hoechst 阳性;核）、红色阳性（PI 阳性;死细胞）;每个图像中对应于每个图像中的绿色阳性 （ROS））]治疗。
- 通过单击每个字段中的每个特定信号进行计数。例如，单击蓝色/Hoechst 染色核将给出给定字段中的核总数。
- 计算结果为细胞死亡百分比（PI阳性细胞数 x 100 除以 Hoechst 阳性细胞数）和按紫外线损伤产生的 ROS 百分比（DCFDA 阳性细胞数 x 100 除以 Hoechst 阳性细胞数）。
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Representative Results
DCFDA是一种无色染料，是一种化学减少的荧光辛，用作检测细胞中ROS的指标。这种染料被困在细胞内，容易被氧化为荧光二氯氢氟素（DCF），发出绿色荧光。这种荧光可以通过荧光显微镜检测出来。细胞可以可视化并与ROS积累相关如下：（i） 没有ROS的活细胞发出高蓝色荧光;（二） ROS积累的活细胞发出高蓝色荧光和低绿色荧光;（三）ROS积累的死细胞发出低蓝色荧光，高红高绿荧光。
暴露于1J/m 2UV-C的控制细胞和细胞没有表现出DCFDA/ROS和PI阳性细胞。UV-C 未曝光对照显示核染色仅如 Hoechst 染色所示（图1）。然而，在UV-C未暴露对照细胞中未发现PI或DCFDA阳性细胞（图1）。
暴露于100J/m2 UV-C的细胞表现出低ROS和PI阳性细胞。以100J/m2的剂量接触UV-C时，小鼠眼表面的初级细胞显示DCFDA和PI共染色约5%，从而表明5%细胞中ROS和细胞死亡的形成（图1）。
暴露于1，000 J/m2 UV-C的细胞表现出60%-70%ROS和PI阳性细胞。以1000J/m2的剂量接触UV-C时，小鼠眼表面的初级细胞显示DCFDA和PI共染色约70%，从而表明70%的细胞中ROS和细胞死亡的形成（图1）。
暴露于10，000 J/m2 UV-C的细胞表现出100%ROS阳性细胞和+100%细胞死亡。当暴露于小鼠眼部原细胞时，最高的UV-C剂量（10，000 J/m2）导致100%细胞死亡（PI阳性细胞）和ROS形成（DCFDA染色），从而表明这种特殊UV-C剂量的最高杀伤力（图1）。
用1J/m2UV-C辐射处理的细胞没有显示任何ROS的积累，该剂量的活细胞百分比与对照细胞的百分比相当。细胞在100J/m2时表现出大量的细胞死亡和ROS积累。在用10，000J/m 2UV-C辐射治疗的细胞中观察到最多的ROS积累和细胞死亡。
量化结果（ROS生成百分比和根据第6.3节给出的公式的细胞死亡百分比）以条形图的形式绘制（图2）。X 轴表示 UV-C 剂量，而 Y 轴表示细胞的百分比。绿色条表示 ROS 的百分比，红色条表示不同剂量的 UV-C 辐射的细胞死亡（图 2）。在UV-C剂量下，ROS和死细胞的百分比分别为0%、0%、10%、70%和100%：未暴露控制、1 J/m 2、100 J/m2、1000J/m2和 10，000 J/m2（图 2）。
图1：暴露于各种剂量UV-C（未曝光对照，1，100，1，000，10，000 J/m2）的小鼠眼部表面原细胞的复合活细胞图像。这些图像在不同的滤镜下拍摄：亮场（用于细胞形态）、蓝色（霍斯特核染色）、绿色（ROS生成）和红色（碘化钠染色死细胞）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：条形图显示计算原小鼠眼表面细胞暴露于各种剂量的UV-C辐射时ROS生成百分比和死细胞百分比后获得的定量结果。X 轴表示 UV-C 剂量，Y 轴表示细胞的百分比。请点击此处查看此图的较大版本。
| 组件 | 体积 |
| 10% 含有 DMEM 的胎儿牛血清 | 9790 μL |
| DCFDA 库存解决方案 | 5 μL |
| 霍赫斯特 33342 库存解决方案 | 5 μL |
| 碘化丙酸酯库存溶液 | 200 μL |
表1：制备染色溶液所需的试剂。
| 问题 | 可能的原因 | 故障 排除 | 评论 |
| 当细胞用高到高紫外线剂量进行治疗时，没有或很少的ROS或PI阳性细胞被染色 | i. 使用旧的染色溶液。 | i. 使用新鲜制备的染色溶液。 | i. 早期制备的染色溶液会导致细胞的染色不当。 |
| ii. 过度的培养皿，导致细胞抢救UVC损伤。 | ii. 在每个35毫米细胞培养盘中只盘20万个细胞，在使其暴露于UVC剂量之前，绝不允许细胞生长超过12小时。 | ii. 过流细胞可以挽救UVC损伤，因此没有或很少ROS和PI阳性细胞将被可视化。 |
表 2：故障排除。
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Discussion
此处描述的DCFDA染色方法使用UV-C辐射处理的小鼠原生眼部活细胞中的ROS可视化。这种染色方法的一个优点是，它还允许研究人员研究UV-C（UVC暴露后3小时）对活细胞的直接影响，以及它们同时枚举ROS阳性和死细胞百分比的枚举。此外，由于染色方法用于活细胞，细胞可以在同一介质中进一步孵育更长时间（数天），以研究UV-C辐射的延迟效应。因此，这种染色方法使得在倒置荧光显微镜下能够可视化 ROS 生成（绿色），同时区分活细胞中的活细胞、凋亡细胞和死细胞群。但是，在某些情况下，尽管预期获得 ROS 阳性和 PI 阳性单元格，可视化可能会失败。对于此类实例，建议进行故障排除 （表 2）。
必须准确执行此协议，以获得最佳结果。最佳结果表明，作为特定UV-C剂量诱导的DNA损伤的精确读出而发出的绿色荧光信号/ROS的关联。换句话说，执行此步骤时，UV-C 曝光期间与细胞接触的介质体积不应太大，以免 UV-C 剂量引起所需的损伤。因此，必须保持最小的介质量，例如每 35 mm 盘中 500 μL，足以覆盖所有指定剂量的 UV-C 照射期间的细胞。其次，介质体积不应小到细胞在UV-C照射期间干燥。最后，在细胞暴露于UV-C后，应立即将细胞用新鲜介质加满以最佳体积（如2 mL），以进一步避免任何损害和产生ROS。
此技术的一个限制是生成的 ROS 类型。必须执行其他附加检测，以检测特定 ROS 类型，以响应 UV-C 剂量范围。例如，评估包括评估细胞内羟基（+OH）、细胞内超氧化物基、细胞内活性氮种类、线粒体羟基、线粒体超氧化物和使用过氧化氢在活细胞中使用市售试剂盒。这种技术的另一个局限性是，在剂量低于10J/m2和10，000 J/m2的剂量下，ROS生成百分比的可检测性。显然，当小鼠眼表面的初级细胞/干细胞暴露于小于10J/m2的UV-C剂量时，没有ROS阳性细胞可见。相反，当细胞暴露于超过10，000 J/m2的UV-C剂量时，100%ROS阳性细胞是可见的。因此，其他检测（例如酶分析、8-羟基脱氧核糖核酸（8-OHdG）（DNA损伤标记）的氧化应激标记的测量，以及不同剂量的DNA损伤蛋白的西方污点分析）可能有助于了解不同水平的细胞/分子损伤的程度/类型。该技术的第三个限制是UV-C剂量与不同细胞类型产生的ROS的相关性。这需要验证。
目前，DCFDA试剂盒可用于使用显微镜或流式细胞测定10、11进行ROS检测。然而，这种试剂盒费用昂贵，资源限制国家的研究实验室无法提供。因此，该协议是非常有用的，其效率类似于商业销售的方法。其次，我们结合碘化钠死细胞染色，以及DCFDA/ROS的生成。因此，使用这种方法可以同时进行ROS阳性和死细胞的活细胞监测。
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Disclosures
作者获得生物-拉德实验室印度私人有限公司的资助支持，赞助了这篇文章。
Acknowledgments
作者承认Yenepoya研究中心（被认为是大学）对基础设施的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
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