Summary
Denne protokol beskriver en original opsætning, der kombinerer spektral-og fluorescens livstids målinger for at evaluere Förster resonans energioverførsel (FRET) mellem de rhodamine baserede fluorescerende sonder og lignin polymer direkte i tykke plante sektioner.
Abstract
I lignocellulosisk biomasse (LB) er aktiviteten af enzymer begrænset af forekomsten af ikke-specifikke interaktioner med lignin under hydrolyse processen, som bevarer enzymer langt fra deres substrat. Karakterisering af disse komplekse interaktioner er således en udfordring i komplekse substrater som LB. Metoden her måler molekylære interaktioner mellem fluorophore-mærkede molekyler og Native Auto luorescent lignin, der skal afsløres af Förster Resonance energioverførsel (FRET). I modsætning til FRET målinger i levende celler ved hjælp af to eksogene fluorophorer, er FRET målinger i planter ved hjælp af lignin ikke trivielt på grund af dens komplekse autofluorescens. Vi har udviklet en original erhvervelse og analyse rørledning med korreleret observation af to komplementære egenskaber af fluorescens: fluorescens emission og levetid. sFLIM (spektral og fluorescerende Lifetime Imaging mikroskopi) giver kvantificering af disse interaktioner med høj følsomhed, afslører forskellige interaktions niveauer mellem biomolekyler og lignin.
Introduction
Hydrolyserende lignocellulose til monomeriske sukkerarter som glukose kræver enzymer. Deres aktivitet er kendt for at være behersket af etableringen af ikke-specifikke interaktioner mellem enzymer og lignin1,2, sidstnævnteer en hydrofobe polymer og en vigtig bestanddel af lignocellulose3. Således er kvantitativ måling af sådanne interaktioner direkte i cellulær skala en udfordring, der skal løses for at optimere enzym katalytisk aktivitet og lignocellulose forbehandling4.
Förster (eller fluorescens) resonans energioverførsel (FRET)-måling er en metode til at vurdere biomolekyler interaktion in situ. Denne ikke-overførsel energioverførsel kan forekomme mellem en donor og en acceptor fluoroforet, hvis de opfylder forskellige betingelser. Donor emissionsspektret skal overlappe, i det mindste delvist, kontrakttagere excitation spektrum. Valget af fluorophorer er således afgørende for sådanne eksperimenter. Derefter, overførslen effektivitet falder med den sjette effekt af deres afstand5 og kun opstår, hvis begge molekyler er i tæt nærhed (typisk i nanometer området). Andre uforudsete udgifter kan ændre overførsels effektiviteten såsom dipol-Dipole orientering, men afbødet, hvis fluorophorer har fleksibilitet.
Fret kan måles ved forskellige teknikker og detaljerede beskrivelser kan findes i litteratur6,7. Kort sagt er de vigtigste metoder baseret på: i) sensibiliseret emission, hvor variationen i acceptoremissionsfluorescensen følges, og som hovedsagelig giver kvalitative resultater; II) acceptor foto blegning, hvor donor emission fluorescens måles før og efter acceptor foto blegning (i dette tilfælde, mere præcise FRET skøn kan opnås, men kræver stærk laser effekt anvendes til faste prøver); og III) livslang måling, der aftager for donor i nærværelse af acceptoren. Denne metode kræver specifikke instrumenter og giver mulighed for præcise og følsomme interaktionsmålinger mellem fluorophorer. I betragtning af Fret måling mellem fluorescerende sonder og lignocellulose, den største vanskelighed er, at lignocellulose ikke er en enkelt velkarakteriseret fluorophore: det har en stærk indfødte og spektralt-dækkende autofluorescens, hovedsagelig stammer fra lignin, og afhængig af biomasse arter8,9.
I dette dokument foreslår vi en ny og original procedure, der er tilpasset dele af træ/plante prøver. Denne sFLIM baserede metode åbner vejen for kvantitative FRET målinger mellem fluorescerende sonder og lignin i indfødte lignocellulose prøver.
Protocol
1. forberedelse af prøver
Bemærk: efterfølgende trin til klargøring af prøverne er beskrevet i figur 1.
- Forberedelse af plante prøve
- Fra træstammer eller fragmenter skæres 1 cm lange prøver med barberblade uden at beskadige deres struktur.
- Integrer prøver i polyethylenglycol (PEG) medium, ved at dyppe dem i flere på hinanden følgende opløsninger af stigende PEG koncentration fortyndet i vand indtil nå 100% PEG.
- Placer prøven under vakuum for at fjerne vand.
- Rør forsigtigt prøverne i 30% v/v-PIND i 24 timer.
- Rør forsigtigt prøverne i 50% v/v-PIND i 24 timer.
- Rør forsigtigt prøverne i 100% PEG i 24 timer ved 70 °C (ren PIND er solid ved stuetemperatur).
- Prøverne udtages i kapsler ved 70 °C (på en kogeplade), hvorefter temperaturen gradvist mindskes, indtil der opnås stuetemperatur.
- Forbered forsigtigt 30-60 μm tykkelse flade sektioner fra disse PEG blokke ved hjælp af en mikrotomer og engangsblade knive.
- Saml og vask sektioner i tre på hinanden følgende bade af vand i 5 min at fjerne PIND fra sektionerne.
- Klargøring af fluorescerende sonde
- Forbered bufferopløsning på 30 mM fosfat ved pH 6,0.
- Veje PIND rhand dextran rhodamin sonde pulver.
- Probe pulveret opløses i bufferen med kontinuerlig omrøring i et hætteglas til 1 time i mørke ved en slutkoncentration på 0,1 g/L.
- Plante prøve farvning
- Der inkubates med 500 μL fluorescerende sonde (se punkt 1.2.3) for 72 h (ingen omrøring) i et plastrør (højst 3 sektioner pr. tube) i mørket.
- Pick-up en sektion med en børste, adsorberet bufferen med et rent ark (undgå at tørre afsnittet), og derefter montere de inkuberet sektioner mellem et cover glas og en #1.5H Cover seddel.
2. kalibrering af fluorescens levetid og spektral målesystem
Bemærk: den komplette arbejdsgang for sFLIM-måling vises i figur 2.
- Bestem spektral vindues bredden for sFLIM-detektoren.
- Put urinstof krystaller i en dyrknings boks med en 0,17 μm glasbund.
- Placer dyrknings boksen på en mikroskop prøveholder, og vælg 20x-målsætningen.
- Vælg en ti: SA laser med en 900 nm bølgelængde og 2% strøm, og tænde scanningen.
- Saml det andet harmoniske signal på sFLIM-detektoren.
Bemærk: det andet harmoniske signal udsendes ved nøjagtig halv excitation bølgelængde på 450 Nm; mens øjeblikkelig, denne foranstaltning giver også instrumentale responsfunktion af systemet. - Juster gradvist laser excitation bølgelængde fra 900 til 980 nm indtil det andet harmoniske signal er indsamlet i den anden spektral kanal (462,5 nm).
- Bestem spektral vindues længde (12,5 nm).
- Hvis spektral intervallet afviger fra det forventede, skal du foretage fejlfinding ved at benytte følgende fremgangsmåde.
- Justér laseren til 910 nm.
- Flyt rist positionen med et rullehjul for at måle det andet harmoniske signal på den første kanal (første kanal grænse).
- Justér laseren til 935 nm.
- Flyt rist positionen med et rullehjul for at måle det andet harmoniske signal på den første kanal (anden kanal grænse).
- Kalibrering af de overordnede spektrometer kanaler
- Indsæt spejlet på mikroskop scenen.
- Vælg den synlige kontinuerlige laser (458 nm, 1% effekt).
- Indsaml refleksions signalet på sFLIM-detektoren, og kontrollér, om fotoner måles i den relevante spektral kanal.
- Gentag trin 2.2.2 og 2.2.3 med alle tilgængelige kontinuerlige lasere (514 nm, 561 nm og 633 nm).
- Hvis spektral kanalen afviger fra, hvad der forventes, skal du flytte ristepositionen med rullehjulet og gentage trin 2,1 og 2,2.
3. prøve fluorescens karakterisering
- I et spektrofluorometer, der er udstyret med et tilbehør til filmholderen (f. eks. Jasco FP-8500-instrumentet), placeres plante sektions prøven (ikke inkuberet med fluorescerende sonde).
- Mål fluorescens emission typisk på området 300-600 nm mens spændende prøven typisk på området 250-550 nm.
- Plot fluorescens intensitet versus excitation og emission bølgelængder at tegne en 3D fluorescens kort.
- Bestem det maksimale excitation/emission område fra plottet.
4. spektral FRET måling
- Kalibrering af autofluorescens
- Vælg målsætningen 20x (NA: 0,8).
- Indstil to-photon laser excitation på 750 nm.
- Placer den eneste plante sektion med hvede halm (WS) mellem sliden og dæksedlen.
- Anvend følgende parametre i softwaren. Skift til lambda-tilstand. Vælg spektral detektoren ChS med en 9,7 nm opløsning. Vælg spektral intervallet mellem 420 og 722 nm.
- Erhverve billedet.
- Fastlæg donor emissions toppen (470 nm med dette setup).
- Acceptors kalibrering
- Placer rhodamine-baserede fluorescerende sonder i en dyrknings boks med en 0,17 μm glasbund.
- Erhverve billedet med den samme indstilling.
- Bestem acceptor emission Peak (570 nm med denne opsætning).
- Bestem spektral området med det maksimale "WS Alone" signal og intet acceptor signal som donor kun emission for sFLIM målinger (460-490 nm med denne opsætning).
- Prøve måling
- Placer den farvede plante sektion mellem diaset og dæksedlen.
- Erhverve billedet med den samme indstilling.
- Gem LSM-filen.
- Kvalitativt forbinder en stærk fret begivenhed med et fald i donor emission peak sammenlignet med "ws alene prøve" og en stigning i acceptor emission peak sammenlignet med b prøven.
5. sFLIM-målinger
Bemærk: for sFLIM setup, det anvendte system er et tids domæne sFLIM setup som beskrevet tidligere10. Et opretstående mikroskop og forskellige tids korrelerede enkelt foton tælle kort og confokale mikroskop fabrikanter kan anvendes, og protokollen bør tilpasses i overensstemmelse hermed.
- Skiftsystemet til sFLIM-tilstand.
- Angiv det konfokale mikroskop som beskrevet i punkt 4.1.1 og 4.1.2.
- Skift til den ikke-nedsænket tilstand i softwaren for at sende fluorescerende fotoner til sFLIM-detektoren.
- Indstil sFLIM-købet til enable -tilstanden for at tillade photon-OPTÆLLING på SPC150.
- Vælg 30 s Time Collection på SPC150.
- Kontrollér, at CFD er mellem 1 x 105 og 1 x 106.
Forsigtig: Sørg for, at antallet af fotoner målt på TCSPC-kortet altid er mindre end 1% af laserens excitation frekvens (i dette setup, laser excitation frekvens er 80 MHz og opdagelse sats kan ikke overstige 800 kHz i en pixel for at undgå en bunke op effekt11).
- Placer "WS Alone"-anlægs afsnittet mellem sliden og dæksedlen.
- Indstil softwaren til kontinuerlig tilstand for at tillade Laserscanning.
- Vælg måleområdet på prøven.
- Klik på Start på SPC150.
- Gem SDT-filen.
- Gentag processen for mindst 10 prøver pr. tilstand.
- Placer den farvede plante sektion mellem diaset og dæksedlen.
- Gentag trin 5.2.1-5.2.5.
6. sFLIM-analyse
- Vælg sFLIM data erhvervet fil på "WS Alone" og importere dem til SPCImage software ved hjælp af fil | Import.
- Vælg Tilpas parametre.
- Fra option | Model, skal du vælge ufuldstændige multi-eksponentialer: 12,5 ns.
- Fra option | Indstillinger, skal du vælge Beregn instrumental respons automatisk.
- Fra hoved panelets højre menu skal du vælge modellen 2 eksponentiel pasform:
- For hver kanal skal du anvende tilpasnings modellen og gemme fit-parametrene i et regneark (a1, a2, t1, t2).
- Til sammenligning mellem kanaler og eksperimenter beregnes den gennemsnitlige fluorescens levetid i et regneark (Tm):
- Beregn den gennemsnitlige levetid for alle prøver (mindst 10) i alle kanaler.
- Analysér Tm på donor kanaler (fra kanal 1 til 3:460-490 nm) og Bestem den dedikerede kanal (kanal 2 svarende til 467,5-480 nm), der viser det højeste foton nummer og svarer til lignin maksimal emission. Værdier fra kanal 2 skal bruges i trin 6,7.
- Vælg sFLIM data erhvervet fil på farvede WS og importere dem til SPCImage software.
- Gentag trin 6.1-6.4.
- Beregn den fret effektivitet Efret for donor i den tidligere valgte kanal WS alene (tMD) og fra bejdset plante prøve (tMDA):
- Sammenlign sFLIM-og E-fret -værdier mellem WS og prøven.
- Overvej en positiv Efret forbundet med en homogen levetid fald mellem WS og prøven, der skal analyseres som en fret begivenhed (Se repræsentative resultater og værker af spriet et al.12 og terryn et al.10 for detaljer).
- Overvej en levetid fald fordelt forskelligt at være på grund af en blanding af FRET og lignin komprimering niveau og ikke fortolke som molekylære interaktioner.
- Overvej ingen livslang modifikation som fravær af målbare FRET signal, men ikke som en mangel på interaktion med lignin
Representative Results
For at demonstrere sflim evne til at dissekere molekylære interaktioner mellem lignin og fluorescently-mærkede molekyler, vi først brugt tre forskellige prøver (figur 3): indfødte hvede halm (ws), indfødte hvede halm inkuberet med peg Tagged med b (PR10), og indfødte hvede halm med dextran Tagged med b (DR10). PR10 er kendt for at interagere med lignin, mens DR10 formodes at være inert13,14,15. sFLIM kurver (figur 3, top) viser nogle ændringer, der kan opnås mellem referenceprøven (ws) og to interaktions tilfælde (DR10 og PR10). Faktisk kan man først let mærke fluorescens stigningen i spektral regioner svarende til den b emission område. Omhyggelig observation af de tre første kanal foton forfald kurver også afslører en stærkere bøjning for DR10 end for PR10. Efter montering af foton forfald kurver og beregning hver kanal gennemsnitlig fluorescens levetid, den FRET signatur bliver mere indlysende (figur 3, bund). Mens fluorescens levetid alternativt øger og aftager langs fluorescens spektret for WS-prøven, observeres en klar FRET signatur for både PR10 og DR10 med: 1) en konstant levetid værdi i den donor-only emissions kanal (3 første kanaler, i blåt); og 2) en stigende fluorescens levetid i spektral kanalen, som svarer til et stigende bidrag fra donor fluorophore i høj levetid.
Når entydig FRET er fastlagt, gør sammenligningen af lignin fluorescens levetid (Channel 2) det muligt at kvantificere levetids nedgangen mellem WS (0,47 NS), DR10 (0,42 NS) og PR10 (0,36 NS) og afslører således molekylære interaktioner mellem lignin og både PR10 og DR10 med en stærkere affinitet til PR10.
For at illustrere relevansen af denne metode til at kvantificere forskellige interaktions niveauer, vælger vi tre andre prøver, efterligner enzym tilgængelighed på behandlede plante prøver: syrebehandlede WS (AWS), i kombination med PR af to kontraplacerede molekylvægte på 5 kDa og 20 kDa (PR5 og PR20). Efter omhyggelig inspektion af sFLIM-signaturer ekstraheres lignin fluorescens levetid (figur 4). Som tidligere nævnt, lignin fluorescens levetid kan ændres af dets miljø16,17. Efter syrebehandling bliver fluorescens levetids foranstaltninger i AWS (0,28 NS) lavere end tidligere målt for WS (0,47 NS), hvilket bekræfter kravet i sFLIM-proceduren om entydig fortolkning af levetids fald og behovet for negative kontroller for hver afprøvet tilstand. Som forventet, en stærk levetid fald observeres, når du tilføjer PR til AWS, mens det interagerer med lignin. Desuden er interaktionen stærkere med PR5 (0,14 NS) sammenlignet med PR20 (0,16 NS), hvilket er i overensstemmelse med deres hydrodynamiske radius måling (2,3 nm og 4,8 nm for PR5 og PR20, henholdsvis), inducerende forskellige steriske begrænsninger og dermed højere tilgængelighed af PR5 til lignin.
Begge eksperimenter viser relevansen af denne metode til fint at vurdere lignin interaktioner med enzymer, afhængigt af deres størrelse og på plante prøver forbehandling.
Figur 1: forskellige tilberednings trin af prøverne. Hvede halm (WS) (A) er først reduceret i størrelse (B), der skal integreres i peg medium (C). Blokken skæres ved hjælp af en mikrotom, der er udstyret med engangsklinger (D). Efter vask anbringes de resulterende sektioner (E) til inkubation i peg eller dextran Tagged-rhodamin opløsning (F). Mærkede sektioner er monteret til sFLIM målinger (G). Skala stænger er 2 cm (A), 1 cm (B og C), 200 μm (E og G). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: komplet arbejdsgang for spektral fret-baserede interaktioner målinger. Figuren præsenterer opsætningen, som kombinerer spektral fluorescens intensitet og livstids målinger. Spektral fluorescensbilleder erhverves med et konfokalt mikroskop, og sekventielt fluorescens levetid for hvert spektralområde måles med sFLIM-detektoren. Analyse af foton forfald kurver muliggør nøjagtig bestemmelse af interaktioner mellem prøven og molekyler af interesse. Kalibreringer skal behandles for at undgå artefakter. For det første skal sFLIM-detektoren være spektralt kalibreret, og dens instrumentale responsfunktion skal kontrolleres. For det andet skal det komplekse autofluorescens signal kalibreres præcist for hver prøve for at bestemme fluorescens levetid i hver kanal før tilsætning af et acceptor molekyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative sFLIM-målinger. sflim kurver (toppanel) blev erhvervet på indfødte hvede halm (ws), WS inkuberet med peg Tagged med b (ws + peg) og indfødte hvede halm med dextran mærket med b (ws + Dex). For hver prøve blev sFLIM-kurver udstyret med en bi-eksponentiel henfalds model, og den gennemsnitlige fluorescens levetid blev beregnet for hver kanal (bundpanel). WS + PEG-og WS + DEX-prøverne udgør et fald i fluorescens levetid i kanalen, der kun svarer til Auto luorescens (tre første søjler) forbundet med en levetid stigning i kanalen svarende til en blandet emission af autofluorescens og rhodamine. Denne opførsel er karakteristisk for en FRET begivenhed mellem lignin og rhodamine-mærkede molekyler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: analyse af fluorescens levetid for den kanal, som svarer til lignin autofluorescens. Efter validering af en FRET-hændelse baseret på sFLIM-signaturen blev den gennemsnitlige fluorescens levetid målt på syrebehandlede WS (AWS) i kombination med PR5 eller PR20 (henholdsvis 5 kDa og 20 kDa). Mens begge PR-prøver præsenterer en levetid fald, den mindre er karakteriseret ved en stærkere levetid reduktion, afslører en stærkere molekyle interaktion med lignin. Metoden er således følsom nok til at skelne mellem både (middelværdi og standardfejl er repræsenteret, n > 10 pr. betingelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Korrelation fluorescens levetid og emissions spektrum målinger gør det muligt at kombinere fordele ved begge metoder. Faktisk mangler spektral målinger alene følsomhed og forbliver kvalitative. På den anden side er fluorescens levetid den foretrukne metode til traditionelle kvantitative FRET-målinger, men det blev påvist, at lignin autofluorescens kunne variere afhængigt af lignin komposition og miljø16. Således kan lignin interaktioner med en acceptor eller lignin strukturelle ændringer ikke diskrimineres, da de begge resulterer i en levetid fald. Som påvist, den udviklede metode giver entydig, følsom og kvantitativ måling af interaktioner mellem lignin og acceptor molekyler i plante sektioner. Selv om de forskellige trin i metoden er strengt optimeret, skal der udvises særlig forsigtighed for følgende punkter.
Med hensyn til prøverne er kvaliteten af anlægget sektion afgørende for at sikre in-Focus Imaging. De forskellige trin for PEG indlejring bør følges nøje. Det sidste vaske trin er afgørende for at sikre, at der ikke er interferens fra den resterende PIND i prøverne. Desuden bør buffer koncentrationen og pH-værdien holdes strengt identisk for alle målinger, da enhver ændring kan have en stærk indvirkning på fluorescens egenskaber.
Måling af levetid kan også være delikat. Den fluorescens levetid af donor kan være ustabil, for eksempel på grund af en høj excitation. I et sådant tilfælde kan tuning af laser strømmen og zoom løse problemet. En anden velkendt kilde til artefakter i TCSPC målinger er photon Pulse bunke. Faktisk kan TCSPC ikke måle hastigheden på to fotoner, der udsendes mellem de samme to laser impulser. Mens plante prøver er meget struktureret, Fluorescens er ikke homogen og kan føre til en skjult puls pileup effekt. Mens antallet af fotoner pr. sekund forbliver under 1% excitation-grænsen, kan det være højere i nogle prøveområder. For at sikre, at der ikke findes pileup-eksperimenter, kan det overvejes at måle donor fluorescens levetid ved en anden foton flux. Hvis levetiden stiger, mens flux falder, en pileup effekt ændrer målinger. Optimal foton flux opnås med donors levetid stabilitet.
Med hensyn til sFLIM forfald kurve analyse, anbefaler vi at stole på hver enkelt kurve pasform for at sikre, at modellen præcist beskriver målinger. Hvis det ikke er tilfældet, skal du først sikre dig, at ingen af de tidligere nævnte artefakter har ødelagt dataene. Derefter, trin 2.1.4 giver den instrumentale responsfunktion (IRF) af systemet. Hvis IRF præsenterer nogle afvigelser, skal du optimere den optiske sti for at minimere dem. Der kan også anvendes en målt IRF til montering under trin 6,2. Endelig kan tilpasnings modellens frihedsgrader øges til et tre-eksponentiel forfald i trin 6,2. Men antallet af fotoner, der kræves for individuel levetid og andel bestemmelse er høj, og det anbefales derfor kun at bruge dem til at opnå en mere stabil gennemsnitlig levetid fra trin 6,4. Mere udtømmende oplysninger om FLIM, dens karakterisering18, sflim og dens anvendelse12 især til lignin10, kan findes i litteraturen.
Selv om udfordrende, FRET måling i plantevæv ved hjælp af Native autofluorescens viser nogle fordele. I forhold til FRET målinger udført på levende væv, hvor interaktionsundersøgelser mellem biomolekyler ofte kræver genteknologi til at udtrykke iboende fluorescerende markører, lignificeret plantevæv som dem, der præsenteres her, tilbyder naturlig autofluorescens, og ydre partner fluorescerende sonder kan nemt tilføjes, sparer meget tid. Afhængigt af de analyserede plantearter og mulige forbehandlinger, der udføres, vil autofluorescens sandsynligvis blive ændret, således at den skal være omhyggeligt karakteriseret og fluoroforet, der anvendes som sonde, kan være nødvendigt at tilpasse.
SFLIM-metoden skal anvendes på fluorescerende sonder, der mangler katalytisk aktivitet (PEG og dextran). Inden for rammerne af plantelignocellulose hydrolyse kan interaktioner mellem enzymer i forskellige biomasse prøver udføres, hvilket muligvis resulterer i bestemmelse af virkningen af lokalisering (celler og væv) på interaktions styrken. Det næste optimerings trin vil være automatisering af analyse trinnet. Med nok analyserede data kunne der anvendes en maskin lærings baseret analyseprocedure til automatiseret fænotype analyse, hvilket ville øge dens modtagelighed over for en hurtig screening af enzym biomasse effektivitet. Desuden kræver sFLIM ikke fiksering af prøven og kan let anvendes på dynamiske enzym-lignin interaktionsstudier. En sådan unik metode er tilbøjelige til at guide enzym ingeniør strategi og biomasse forbehandling for at optimere lignocellulose valorization.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Fanny Laurent (billetpris) er varmt takkede for udarbejdelsen af tallene. Forskningssammenslutningen FRABio (universitetet i lille, CNRS) er anerkendt for at tilvejebringe det tekniske miljø, der bidrager til at opnå dette arbejde. Finansieringen blev indhentet fra det franske nationale forskningsagentur (LIGNOPROG-projektet ANR-14-CE05-0026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
| fine brush | to collect sections | ||
| glass vials | for incubations | ||
| high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
| Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
| Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
| microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
| mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
| mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
| mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
| nail polish | for mounting | ||
| pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
| poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
| razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
| rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
| sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
| sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
| sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
| tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |
References
- Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756 (2014).
- Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
- Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
- Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912 (2017).
- Clegg, R. M.
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
- Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52 (2018).
- Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
- Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74 (2018).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
- Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
- Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
- Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271 (2018).
- Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
- Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
- Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838 (2017).
- Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).
