Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Avanceret diffusion Imaging i hippocampus af rotter med mild traumatisk hjerneskade

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/60012
Automatic Translation
1, 1, 1
1Infinity lab, Medical Imaging and Signal Processing Group, Ghent University

Summary

Det overordnede mål med denne procedure er at opnå kvantitative mikrostrukturelle oplysninger af hippocampus i en rotte med mild traumatisk hjerneskade. Dette gøres ved hjælp af en avanceret diffusion-vægtet magnetisk resonans imaging protokol og region-of-Interest baseret analyse af parametrisk diffusion kort.

Abstract

Mild traumatisk hjerneskade (mTBI) er den mest almindeligt forekommende form for erhvervet hjerneskade. Da patienter med traumatisk hjerneskade viser en enorm variation og heterogenitet (alder, køn, type af traumer, andre mulige patologier, etc.), dyremodeller spiller en central rolle i unraveling faktorer, der er begrænsninger i klinisk forskning. De giver en standardiseret og kontrolleret indstilling til at undersøge de biologiske mekanismer for skade og reparation efter TBI. Men ikke alle animalske modeller efterligner den diffuse og subtile karakter af mTBI effektivt. For eksempel gør de almindeligt anvendte kontrollerede kortikale virkninger (CCI) og lateral Fluid percussion skade (LFPI) modeller brug af en kraniotomi for at eksponere hjernen og fremkalde udbredt fokal traume, som ikke er almindeligt forekommende i mTBI. Derfor er disse eksperimentelle modeller ikke gyldige til efterligne MTBI. Således bør en passende model anvendes til at undersøge mTBI. Marmarou vægt drop model for rotter inducerer lignende mikrostrukturelle ændringer og kognitive funktionsnedsættelser som ses hos patienter, der opretholder mild traume; Derfor blev denne model valgt for denne protokol. Konventionelle computertomografi og magnetisk resonans imaging (MRI) scanninger viser almindeligvis ingen skade efter en mild skade, fordi mTBI inducerer ofte kun subtile og diffuse skader. Med diffusions vægtet MRI er det muligt at undersøge mikrostrukturelle egenskaber af hjernevæv, som kan give mere indsigt i de mikroskopiske ændringer efter milde traumer. Derfor er målet med denne undersøgelse er at opnå kvantitative oplysninger om en udvalgt region-af-interesse (dvs., hippocampus) at følge op sygdomsprogression efter opnåelse af en mild og diffus hjerneskade.

Introduction

Traumatisk hjerneskade (TBI) har fået mere opmærksomhed i de seneste år, da det er blevet klart, at disse hjerneskader kan resultere i livslang kognitive, fysiske, følelsesmæssige, og sociale konsekvenser1. På trods af denne stigende bevidsthed, mild TBI (mTBI, eller hjernerystelse) er stadig ofte underrapporteret og udiagnosticeret. MTBI er blevet omtalt som en tavs epidemi, og personer med en historie mTBI viser højere satser for stofmisbrug eller psykiatriske problemer2. Flere patienter med mTBI går udiagnosticeret hvert år på grund af den diffuse og subtile karakter af de skader, som ofte ikke er synlige på konventionel computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) scanninger. Denne mangel på radiologiske beviser for hjerneskade har ført til udvikling af mere avancerede billeddiagnostiske teknikker såsom diffusion MRI, som er mere følsomme over for mikrostrukturelle ændringer3.

Diffusion MRI tillader in vivo kortlægning af mikrostrukturen, og denne MRI teknik har været anvendt i udstrakt grad i TBI undersøgelser4,5,6. Fra diffusions tensor beregnes fraktioneret anisotropi (FA) og gennemsnitlig difsivitet (MD) for at kvantificere ændringer i den mikrostrukturelle organisation efter skade. Nylige anmeldelser i mTBI patienter rapporterer stigninger i FA og fald i MD efter skade, som kan være tegn på axonal hævelse7. I modsætning hertil er stigninger i MD og fald i FA også fundet og er blevet foreslået til at underbyde afbrydelser i parentchymal struktur efter ødem dannelse, axonal degeneration, eller fiber forskydning/afbrydelse8. Disse blandede fund kan delvis forklares ved den signifikante kliniske heterogenitet af mTBI forårsaget af forskellige typer af virkninger og sværhedsgrad (f. eks. rotation-acceleration, stump kraft traumer, blast skade eller kombination af førstnævnte). Men i øjeblikket er der ingen klar konsensus om den underliggende patologi og biologisk/cellulære grundlag understøtter ændringer i den mikrostrukturelle organisation.

Dyremodeller giver en standardiseret og kontrolleret indstilling til at undersøge biologiske mekanismer for skade og reparation efter TBI mere detaljeret. Flere eksperimentelle modeller for TBI er blevet udviklet og repræsenterer forskellige aspekter af human TBI (f. eks focal vs. diffus traume eller traumer forårsaget af roterende kræfter)9,10. Almindeligt anvendte dyremodeller omfatter kontrollerede kortikale virkninger (CCI) og lateral Fluid percussion skade (LFPI) modeller11,12. Selv om de eksperimentelle parametre kan være velkontrolleret, disse modeller gør brug af en kraniotomi at udsætte hjernen. Craniotomier eller kraniet frakturer er ikke almindeligt forekommende i mTBI; Derfor er disse eksperimentelle modeller ikke gyldige til efterligne MTBI. Den effekt acceleration model udviklet af Marmarou et al.13 gør brug af en vægt, der er faldet fra en vis højde på rotte hovedet, som er beskyttet af en hjelm. Denne dyremodel inducerer lignende mikrostrukturelle ændringer og kognitive funktionsnedsættelser som set hos patienter, der opretholder milde traumer. Derfor er denne marmarou vægt dråbe model egnet til at undersøge Imaging biomarkører for diffus MTBI14,15.

Denne rapport viser anvendelsen af avanceret diffusion MRI i en mTBI rotte model ved hjælp af Marmarou vægt drop model. Første vist er, hvordan man fremkalder en mild og diffus traume, og analyse ved hjælp af diffusion tensor Imaging (DTI) model er derefter forudsat. Specifikke biologiske oplysninger opnås ved brug af mere avancerede diffusionsmodeller [dvs. diffusion Kurtosis Imaging (DKI) og hvide substans Tract (WMTI) model]. Specielt er der påført milde traumer, og mikrostrukturelle ændringer evalueres derefter i hippocampus ved hjælp af konventionel T2-vægtet MRI og en avanceret diffusions billedbehandlings protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen er blevet godkendt af den dyreetiske Komité ved universitetet i Gent (ECD 15/44Aanv), og alle eksperimenter blev gennemført i overensstemmelse med Europa-Kommissionens retningslinjer (direktiv 2010/63/EU).

1. tilberedning af dyr og hjelm fastgørelse

  1. En kvindelig Wistar H rotte (± 250 g eller 12 uger) vejes og bedødes i et lille induktions kammer fyldt med en blanding af isofluran (5%) og O2 i mindst 1 min.
  2. Injicer rotten med 0,05 mg/kg buprenorphin subkutant i nakken, Vend den tilbage til hjem buret, og lad foremptive analgesi i mindst 30 minutter for at tage en effekt.
    Bemærk: under 30 min ventetid kan operationsstedet forberedes.
  3. Placer en varmepude, der opbevares ved 37 °C, under operationsområdet. Placer de steriliserede kirurgiske instrumenter på operationsområdet, der blev desinficeret med 70% ethanol.
  4. Placer rotten tilbage i induktions kammeret og bedøve rotten, indtil den ikke reagerer på en pote eller hale knivspids.
  5. Placer rotten på operationsområdet og Indsæt et kateter i den laterale hale vene. Derefter barberer rotte hovedet, fjerne overskydende pels og desinficere hovedbunden og resten af det kirurgiske område med chlorohexidin.
  6. Injicer 100 μL af 2% lidocain lokalt i hovedbunden.
  7. Lav en midterlinje indsnit ved hjælp af en skalpel størrelse 11 at udsætte kraniet, fjerne eventuelle overskydende membraner med lille saks. Træk huden tilbage ved hjælp af et okulært Spekulum med en maksimal spredning på 1 cm.  Derudover fjernes periosteum ved forsigtigt at gnide en steril bomulds knop over kraniet, indtil periosteum ikke længere er til stede.
  8. Sæt en dråbe væv lim på kraniet og en på den steriliserede metalliske Skive (diameter på 10 mm og 3 mm tykkelse), som fungerer som hjelmen. Lim skiven ca. en tredjedel før og to tredjedele bag bregma. Lad limen tørre i 1 min.

2. induktion af traumatisk hjerneskade (TBI)

  1. Placer rotten på den specialfremstillede seng med en skum madras af visse fjederkonstant (Se tabel over materialer). Placer rotten direkte under et gennemsigtigt plastikrør med en 450 g messing vægt med hjelmen så vandret som muligt. Frigør rotten fra anæstesi.
  2. Træk vægten op til 1 m, og slip den, når den er klar. Sørg for, at der er en anden eksperimententer til stede for at flytte rotten væk fra plastik røret umiddelbart efter påvirkning for at forhindre en anden påvirkning.
    Bemærk: de fingeret sårede rotter får samme eksperimentelle procedure (trin 1.1 – 2.7), bortset fra trin 2,2.
  3. Re-vedhæfte rat til anæstesi og injicere 1 mL fysiologisk opløsning (0,9% NaCl) via kateteret for at reducere hæodynamisk chok.
    Bemærk: det er muligt, at rotten kortvarigt holder op med at trække vejret på grund af virkningen. Komprimer forsigtigt brystkassen, hvis rotten ikke spontant indånde efter 2 s for at opmuntre åndedræts refleksen.
  4. Fjern hjelmen ved forsigtigt at trække den fra kraniet. Fjern eventuelt resterende lim fra kraniet og huden og luk indsnittet med kirurgisk sutur. Påfør lokal analgesi gel ved hjælp af en steril applikator spids.
  5. Placer rotten på sengen af CT-scanneren. Bekræft den korrekte position ved hjælp af en spejder scanning. Juster synsfeltet for at muliggøre billeddannelse af hele hovedet inden for én senge position. Administrer et generelt formål, lav dosis CT-scanning for at udelukke kraniets frakturer.
    Bemærk: kraniet fraktur er et kriterium for eutanasi.
  6. Anbring rotten i et rent bur på en varmepude (37 °C). Overvåg tiden for at genvinde bevidstheden. Når rotten er i stand til at sidde oprejst, kan rotten returneres til hjemmet bur.
  7. Giv en anden dosis på 0,05 mg/kg buprenorphin en dag efter TBI induktion.

3. diffusion magnetisk resonans imaging (MRI)

Bemærk: diffusions vægtet billeddannelse udføres før og 1 dag efter traume induktion.

  1. Anæstetiserer rotten i et lille induktions kammer fyldt med en blanding af isofluran (5%) og O2. Når rotten er ikke-lydhør over for en pote eller hale knibe reducere anæstesi til 2% med en strømningshastighed på 500 mL/min. Overfør dyret til scanner sengen i hoved-første udsatte position.
  2. Placer rotten i hoved holderen med tænderne bar og næse kegle, leverer anæstesi, og glide hovedet fremad, indtil midten af hjernen er på niveau med midten af kvadratur volumen MRI Coil. Påfør smøre salve til øjnene i små mængder for at forhindre skader på hornhinden. Fixate hovedet med et lille stykke tape for at undgå bevægelse under scanningen.
  3. Placer en trykplade under thorax af rotten til at overvåge respiration og dække rotten med en cirkulerende varmt vand varmetæppe og boble wrap at holde rotten varm. Før scanningen skal du kontrollere respirations monitoren for at sikre, at signalet er klart uden støj, og at den respiratoriske cyklus er konsistent. Flyt trykpladen, hvis det er nødvendigt.
    Bemærk: respirationshastigheden bør holdes mellem 1 åndedræt pr. 1200 – 1700 MS ved at justere niveauet af anæstesi mellem 1% – 2%.
  4. Skub den kvadrature volumen spole overhovedet. Justér tuning og matchende kondensatorer af spolen til den korrekte frekvens og impedans i henhold til instruktionerne fra spole leverandøren. Advance scanner sengen ind i scanner borehullet for at starte scanningen.
  5. Få en standard tre-plane spejder scanning ("tripilot") for at sikre korrekt positionering.
    1. Indlæs tripilot-sekvensen i scannings kontrolelementet ved at klikke på ny scanning og vælge tripilot-sekvensen på protokollisten. Klik derefter på knappen trafiklys for at starte scanningen.
    2. Når scanningen er færdig, indlæse scanningen i billedet displayet og sikre, at 1) hovedet ligger lige og 2) hjernen er placeret i midten af magnet og spole. Juster placeringen af hovedet og/eller scanner sengen, hvis det er nødvendigt, og erhverve en ny tripilot scanning.
  6. Juster det lokale magnetfelt ved hjælp af en automatiseret protokol til anden rækkefølge: Indlæs shim-protokollen i anden rækkefølge i scannings kontrolelementet som beskrevet i trin 3.5.1. Klik derefter på fanen ACQ | Aktuelle justeringer | Metode specifik justering for det lokale felt homogenitet i spektrometer Control Tool vindue for at starte automatiseret flimmer.
  7. Indlæs en ny T2 Rapid Imaging med refokuseret ekko (sjælden) sekvens i scanningen kontrol som beskrevet i trin 3.5.1.
    1. Hent T2-vægtede billeder ved hjælp af standardindstillingerne, bortset fra følgende parametre:
    2. Åbn fanen Rediger scanning , og Juster gentagelsestiden (TR) og ekko tiden (te) til henholdsvis 5.500 ms og 37 MS. Du kan også ændre synsfeltet og matrixstørrelsen for at give mulighed for en højere in-plane opløsning på 109 μm x 109 μm (standardopløsning = 156 μm x 156 μm). Sørg for, at udsnittets tykkelse er 600 μm, antallet af udsnit er indstillet til 45, og den sjældne faktor er angivet til 8.
    3. Åbn geometri editoren og Placer udsnitspakningen i den korrekte position, herunder bulbus i hjernen og cerebellum.
  8. Indlæs tre nye ECHO-planar diffusion-vægtet spin-ECHO-sekvens (DtiEpi) fra mappen B_DIFFUSION i scannings kontrolprotokollen som beskrevet i trin 3.5.1.
    Bemærk: ved hjælp af tre forskellige diffusions "skaller", kan diffusion tensor Imaging (DTI) model4,16, Diffusion Kurtosis Imaging (DKi) model17, og hvide stof-kanal integritet (wmti) model18 alle estimeres. Det anbefales at bruge mindst tre forskellige b-værdier, med den højeste b-værdi med et maksimum på 3000 s/mm2 med mindst 15 jævnt fordelte retninger pr. billed skal17.
    1. Hent diffusions vægtede billeder (DWIs) ved hjælp af standardindstillingerne, bortset fra følgende indstillinger:
    2. Åbn fanen Rediger scanning , og Juster de geometriske parametre under fanen geometri . Juster synsfeltet og matrixstørrelsen til 105 x 105 for at sikre en opløsning på 333 μm x 333 μm.
    3. Indstil udsnitsretningen til aksial og antallet af udsnit til 25, hvilket resulterer i en udsnitstykkelse på 500 μm og en Interslice-afstand på 600 μm. Ændre udlæse retningen til venstre-højre.
    4. Klik på fanen kontrast for at justere ekko tiden til 24 MS og gentagelsestiden til 6.250 MS.
    5. Indstil båndbredden til 250.000 Hz og drej fedt suppression på. Juster antallet af gennemsnit til et.
    6. Klik på fanen Research , og Rediger antallet af gennemsnit (EPI-segmenter) til 4.
    7. Klik på fanen diffusion under fanen Opslag. Udfør dette trin separat for hver af de tre diffusions skaller.
      1. Juster antallet af sprednings retninger til 32 for den første skal, 46 for den anden skal, og 64 for den tredje shell.
      2. Juster gradient retninger med brugerdefinerede gradient retninger filer.
      3. Ændre antallet af B0 billeder til 5 for den første shell, 5 for den anden shell, og 7 for den tredje shell.
      4. Juster b-værdien pr. retning til 800 s/mm2 for den første skal, 1500 s/mm2 for den anden skal og 2000 s/mm2 for den tredje skal.
        Bemærk: justering af gradient retninger med en brugerdefineret gradient retninger fil kan gøres manuelt ved at indstille Indtast diffusion retninger til Ja eller automatisk ved hjælp af DTI_SET_DIRECTIONS makro.
    8. Åbn geometri editoren og Placer synsfeltet mellem bulbus og cerebellum, der kun indeholder cerebrum for at reducere artefakt og scanningstid. Placer seks mætnings bånd på 5 mm uden for hjernen for at reducere artefakter ved at klikke på mætning og skubbe båndene i den foretrukne position ved hjælp af rullepanelerne.
      Bemærk: bulbus og cerebellum kan identificeres baseret på anatomiske landemærker og de tre billeder af tripilot scanningen.
  9. Hent de importerede sekvenser ved at klikke på trafiklys symbolet. Ved hjælp af indstillingerne for de parametre, der er beskrevet ovenfor, er anskaffelsestid for T2-sjælden scanning 12 min, af den første DWI Shell 15 min, af den anden DWI Shell 21 min og af den tredje Shell 30 min. Den samlede anskaffelsestid er ca. 80 min. (på et enkelt modtager kanalsystem).
  10. Ved afslutningen af scannings protokollen fjernes dyret fra scanner sengen, og dyret placeres i et rent bur med en varmepude ved 37 °C. Returner dyret til husburet, når det genvinder bevidstheden.

4. billedbehandling

Bemærk: i de følgende afsnit er behandlingen af diffusions billederne beskrevet i MRtrix3, ExploreDTI19 og AMID software20 , som er Open Access-værktøjskasser. Forbehandlings trinnene kan dog udføres i andre værktøjskasser (f. eks. FSL, MedInria, DTIStudio).

  1. Overfør de erhvervede data fra anskaffelses konsollen ved at eksportere 2dseq-filen.
  2. Konverter 2dseq-filerne (RAW DWI-filer) til. MIF-formatet, som er standardformateringen af MRtrix3, for at give mulighed for yderligere forbehandlings trin i MRtrix3. Desuden sammenkoble de tre diffusions skaller ved hjælp af følgende kommandoer i skallen:
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2. MIH (for de T2-vægtede billeder)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1. MIH (for den første diffusions skal)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2. MIH (for den anden diffusions skal)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3. MIH (for den tredje diffusions skal)
    mrcat ratID_dwi1. MIF ratID_dwi2. MIF ratID_dwi3. MIF ratID_dwi. MIF
  3. Foretag støj korrektion og Gibbs-ringning korrektion på dwis i MRtrix321,22. Også, konvertere de korrigerede DWI billeder og T2 billede til NIFTI format ved hjælp af følgende kommandoer:
    dwidenoise ratID_dwi. MIF ratID_dwi_denoised. MIF
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised. MIF ratID_dwi_denoised_gr. MIF
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr. MIF ratID. NII
    mrconvert ratID_T2. MIF ratID_T2. NII
  4. Udfør korrektion for EPI, motion og Hvirvelstrømsforvrængninger i ExploreDTI:
    1. Konverter NIFTI-billederne til en. mat-fil ved at klikke på Beregn DTI*. mat-fil | Konverter RAW-data til DTI*. mat-fil. Omvurdering af diffusions tensor til vejet lineær og b-værdien til NaN. Juster voxel-størrelsen til 0,333 0,333 0,6, antal ikke-DWI-billeder til 17, antal DWI-billeder til 142 og matrix størrelse til 105 105 25.
      Bemærk: ved at indstille b-værdien til NaN vil ExploreDTI betragte datasættet som et Kurtosis-datasæt.
    2. Klik på fanen Indstillinger for at justere INDSTILLINGERNE for EPI-korrektion (dette er som standard slået fra). Vælg SM/EC/EPI korrektion, også registrere til andre data? og klik på Ja, at gøre EPI korrektion (ikke-stiv). Angiv suffikset for det anatomiske T2-billede, der svarer til diffusions datasættet.
      Bemærk: ExploreDTI korrigerer for EPI-forvrængninger ved hjælp af billedregistrering mellem det ikke-forvrængede anatomiske billede og diffusions billedet.
    3. Klik på fanen plugins , og vælg korrektion for emne bevægelse & EC/EPI-forvrængninger , og vælg den forbehandlede diffusions datafil fra trin 2,3. Sørg for, at T2-billedet er i den samme mappe og har samme base som diffusions datafilnavnet (f. eks. rat1. NII for DWI og rat1_T2. NII for det anatomiske billede). Dette trin vil generere en "native" (* native. mat) og "omdannet" fil (* Trafo. mat).
  5. Beregn DTI-Metrics for hver rotte ved at klikke på plugins og eksportere ting til *. NII og vælge de parametriske kort over DTI-modellen: fraktioneret anisotropi (FA), gennemsnitlig difsivitet (MD), radial difsivitet (RD) og aksial difsivitet (ad; betegnes som "største egenværdi L1").
  6. Derudover eksporterer du parametriske kort til Kurtosis-modellen (MK, AK og RK) og WMTI-modellen (AWF, AxEAD, RadEAD og TORT). Behandling af diffusions billeder vil resultere i 12 parametriske kort (figur 1, figur 2, figur 3), der kan anvendes til yderligere mikrostrukturel analyse.
  7. Opret en maske fil til hippocampus af hver rotte ved hjælp af MRtrix3.
    1. Indlæs ANLÆGS billedet for rotten i MRtrix-fremviseren ved at klikke på værktøj og ROI-Editor.
    2. Opret et nyt ROI ved at klikke på knappen "+" og tryk på Edit for at tegne ROI på hver skive, der omfatter hippocampus (figur 4). Tryk på højre museknap for at slette uønskede områder fra det tegnede ROI.
    3. Når tegningen af ROI er fuldført, Gem maske billedet ved at klikke på knappen Gem .
      Bemærk: Denne maske fil vil være en binær NIFTI billedfil med voxels af værdi 1, der indeholder hippocampus væv, og resterende voxels vil have værdier på 0. For at standardisere regionen hippocampus på tværs af rotter, kan parametrisk kort være co-registreret med en undersøgelse specifik skabelon med foruddefinerede områder af interesse afgrænset23 eller en rotte hjernen Atlas.
  8. At udtrække diffusions målinger af hippocampus af rat, bruge den oprettede maske fil af trin 4,6 og åbne AMID software.
    1. Åbn parametrisk kort og maske billede af rotten.
    2. Hvis du vil føje maske filens ROI til amid, skal du vælge billedet af maske filen, klikke på Rediger | Tilføj ROI | 3D Isocontour og klik på det ROI, som vises i maskens billede. Giv ROI et sigende navn, og Bekræft, at denne diskenhed kun skal indeholde voxels, der har en værdi på en.
    3. For at beregne middelværdien af diffusions målingerne i hippocampus skal du klikke på værktøjer | Beregn ROI statistik og angive de billeder og ROI, der skal medtages. Efter at have klikket Udfør, vil en anden skærm dukke op med beregnede værdier, der kan bruges til yderligere statistisk analyse. Denne fil kan enten gemmes eller kopieres til et foretrukket data format (f. eks.. xlsx-eller. csv-fil).

5. statistisk analyse

Bemærk: i de følgende afsnit beskriver vi behandlingen af diffusions billederne i SPSS Statistics 24; den statistiske analyse kan dog udføres i andre statistiske værktøjskasser.

  1. Indlæs dataene i det brede format i en SPSS *. sav-fil.
  2. Hvis du vil teste for statistiske forskelle mellem de to grupper for hvert tidspunkt (dvs. baseline eller 1-dages efter skade), skal du klikke på analysér | Ikke-parametriske tests | Ældre dialoger | 2 uafhængige prøver tests. Indlæs de variabler, der skal testes, og Angiv grupperne (dvs. TBI-og Sham-grupper). Angiv Mann-Whitney U som testtype.
  3. For at teste for statistiske forskelle mellem de 2 tidspunkt i hver gruppe datafilen skal opdeles. Gå til data, Opdel fil, og Angiv Sammenlign grupper. Derefter skal du klikke på Analysér, ikke-parametriske tests, Legacy dialoger, 2 relaterede prøver tests, indlæse de variabler, der skal sammenlignes og angive Wilcoxon som testtype.
    Bemærk: for at korrigere for flere sammenligninger justeres p-værdier for hver diffusions model ved hjælp af Bonferroni-korrektion [dvs. p-værdi divideret med antallet af parametre sammenlignet (DTI 4, DKI 3 og WMTI 4)]. Mere specifikt anses p < 0,0125 for at være signifikant for DTI-og WMTI-modellerne, og p < 0,016 anses for at være signifikant for DKI-modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I undersøgelsen, alle TBI rotter (n = 10) overlevede virkningen og var i stand til at inddrive fra virkningen og anæstesi inden for 15 min efter løsrivelse fra anæstesi23. På CT-billederne var der ingen tegn på kraniets frakturer, og T2-billederne viste ingen abnormiteter såsom blødning, forstørrede ventrikler eller ødem dannelse på kontusions stedet 1 dag efter traume (figur 5). Således, baseret på disse visuelle inspektioner af de anatomiske billeder, store fokale læsioner blev ikke påvist, bekræfter den diffuse og mild karakter af skaden.

Kvaliteten af koregistration (ikke-stiv) trin mellem T2-billed-og diffusions datasættet (trin 4,4) blev undersøgt ved at tilføje en overlejring af T2-billedet til det farvekodede FA-kort (figur 6). Derefter blev ANLÆGS-, MD-, AD-og RD-parametrisk kort beregnet (figur 1) og indlæst i AMID-softwaren. Baseret på anlægskortet blev der tegnet et investeringsafkast, herunder hippocampus-strukturen (figur 4). De statistiske værdier for diffusions målingerne blev beregnet i gennemsnit over alle voxels inden for interesseområdet, og middelværdien af hver DTI-måling blev eksporteret til yderligere analyse. En anden kvalitetskontrol af diffusions data kan udføres ved at inspicere outliers i DTI-målingerne. F. eks. bør anlægsværdier i hippocampus være omkring 0,15; Derfor kan værdier på < 0,10 (denoting isotropisk diffusion) eller > 0,30 (værdier ses i hvidt stof) betragtes som biologisk usandsynlige værdier. Disse datapoint bør afvises fra yderligere analyse. Desuden blev de gennemsnitlige værdier for AK, RK og MK af diffusions Kurtosis-modellen samt AWF, AxEAD, RadEAD og TORT af WMTI-modellen beregnet (figur 2, figur 3).

I vores undersøgelse afslørede analysen af DTI-målingerne signifikante forhøjede anlægsværdier (p = 0,007) og reducerede difsivitet (MD og RD) (henholdsvis p = 0,007 og p = 0,007) efter påvirkning i mTBI-gruppen (figur 7). Disse fald i RD og MD var signifikant forskellige fra Sham-gruppen (henholdsvis p = 0,005 og p = 0,004). Diffusion Kurtosis målinger viste et signifikant fald i RK (p = 0,005) efter effekt, men ingen ændringer i AK eller MK (figur 8). Ved hjælp af WMTI-modellen viste RadEAD (p = 0,007) og TORT (p = 0,007) en signifikant nedgang og stigning i henholdsvis mTBI-gruppen 1 dag efter virkningen (figur 9c, D). Værdierne i Sham-gruppen viste ingen væsentlige ændringer.

Figure 1
Figur 1: repræsentative parametriske kort for fraktioneret anisotropi (FA), gennemsnitlig difsivitet (MD), aksial difsivitet (ad) og radial difsivitet (RD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative parametriske kort for gennemsnitlig Kurtosis (MK), aksial Kurtosis (AK) og radial Kurtosis (rk). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative parametriske kort for axonal vand fraktion (AWF), aksial og radial ekstra axonal difsivitet (AxEAD, RadEAD), og tortuositet (tort). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: oprettelse af en maske i MRtrix3. En ROI er trukket omkring hippocampus på alle skiver, der indeholder volumen af hippocampus, og lydstyrken gemmes som en maske fil. Dette kan enten gøres for hver rotte individuelt eller ved hjælp af en undersøgelse specifik skabelon maske fil, som hver af de parametriske kort kan være co-registreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: CT-og T2-vægtede billeder af et repræsentativt mTBI-dyr 1 dag efter påvirkning. CT-billederne (øverste række) viser ikke nogen kraniets frakturer. På de T2-vægtede billeder (nederste række) blev der ikke påvist blødning, forstørrede ventrikler eller ødem dannelse. Bemærk, ødem dannelse er klart synlig som en hyperintens område omkring sårområdet fra kirurgisk indgreb. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: farvekodet FA kort over diffusions data sæt overlagt med det anatomiske billede efter korrektion for EPI, motion, og hvirvelstrømskorrektion i ExploreDTI. Vist er en dårlig korrektion og medregistrering til venstre og gode eksempler til højre. Det bør sikres, at farvekodningen er korrekt: venstre-højre retning i rødt (f. eks Corpus callosum), forreste-posterior retning i grøn, og ringere-overlegen retning i blåt (f. eks cingulum). Desuden skal den farvekodede FA billede være perfekt afstemt med det anatomiske billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: ændringer i diffusions tensor-målinger af hippocampus for Sham (n = 10) og mTBI-dyr (n = 10). Efter virkningen var der en signifikant stigning i FA (a) og signifikant fald i gennemsnitlig Difsivitet (b) og radial Difsivitet (d) i MTBI-dyrene (b, d). Der blev ikke observeret signifikante forskelle for aksial difsivitet (C) hos MTBI-rotter. De fingeret dyr viste ingen signifikante DTI-ændringer (* p < 0,0125). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: ændringer i diffusion Kurtosis målinger af hippocampus for Sham (n = 10) og mTBI dyr (n = 10). Efter virkningen var der et signifikant fald i RK (C) af MTBI-dyrene, men ingen ændringer i AK (B) eller MK (a). De fingeret dyr viste ingen ændringer (* p < 0,0166). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: ændringer i hvide stof veje integritets målinger af hippocampus for Sham (n = 10) og mTBI-dyr (n = 10). Efter Impact, var der et signifikant fald i RadEAD (C) og signifikant stigning i tort (D) af MTBI dyrene, men ingen ændring i AWF eller Axead (a, B). De fingeret dyr viste ingen ændringer (* p < 0,0125). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da mTBI ofte er resultatet af en diffus og subtil skade, der ikke viser nogen abnormiteter på CT og konventionelle MRI-scanninger, er vurderingen af mikrostrukturelle skader efter et mildt traume fortsat en udfordring. Derfor er mere avancerede imaging teknikker er nødvendige for at visualisere det fulde omfang af traumet. Anvendelsen af diffusion magnetisk resonans imaging i TBI forskning har fået mere interesse i det sidste årti, hvor diffusion tensor Imaging er hyppigst anvendte5. En begrænsning af DTI-modellen er antagelsen om en Gaussian diffusions proces, som ikke er en præcis antagelse for hjernens mikrostruktur (bestående af et komplekst netværk af axoner og celler med membraner, der fungerer som barrierer), hvilket resulterer i DTI-Metrics, som ikke er specifikke for den underliggende biologiske mikrostruktur24. Diffusion Kurtosis Imaging er en udvidelse af DTI-modellen og forsøg på at karakterisere graden af non-Gaussian diffusion17. Dette kan give yderligere oplysninger om vævs heterogenitet eller kompleksitet.

Men en ulempe ved DTI og DKI modeller er, at de kun er en gengivelse af diffusions signalet, som karakteriserer probabilistisk vand forskydning profil, men er ikke specifik for mikrostruktur6. På den anden side er den hvide substans-kanal integritets model baseret på Kurtosis tensor en mikrostrukturel kortlægnings teknik, der inkorporerer en priori biologisk information (antagelser) i model18. Det tilskriver diffusions signalet til vævs segmenter og kan vurdere biologiske egenskaber mere direkte. Disse biofysiske modeller kan således give nye oplysninger til at beskrive abnormiteter efter mTBI og overvinde denne ikke-specificitet spørgsmål6. Ved hjælp af disse tre forskellige modeller, mikrostrukturelle ændringer og biologiske processer var i stand til at blive visualiseret efter mTBI i flere detaljer, specifikt ved hjælp af Marmarou vægt dråbe model.

Marmarou vægt drop model er nem at bruge og kræver kun mindre kirurgi; Men, en anden eksperimententer anbefales at flytte rotte væk fra glasset røret umiddelbart efter den første virkning for at undgå en anden. Derudover, det er nogle gange nødvendigt at hjælpe rotten genvinde sin vejrtrækning refleks efter virkningen. Den temmelig lange MRI-protokol, med en samlet erhvervelse tid på omkring 80 min, er veltolereret af både Sham og mTBI rotter. Selvom, under scanningen, det er vigtigt at overvåge vejrtrækning cyklus og justere anæstesi, hvis dyret sover for dybt eller let. Det er også vigtigt at holde dyret varm både under og efter købet indtil rotten er helt vågen for at undgå hypotermi.

I avanceret diffusion MRI, bevægelse artefakter bør undgås så meget som muligt. En simpel løsning til at reducere bevægelse under scanningen er at gøre brug af en tænder bar og fikat hovedet med et lille stykke tape eller to øre stænger, hvis de er tilgængelige. Dette sikrer, at hovedet ikke vil bevæge sig op og ned, hver gang rotten tager et pust.

Ved hjælp af Advanced diffusion MRI protokoller, skal de erhvervede billeder passere gennem flere (præ-) behandling trin, for det meste ved hjælp af forskellige software-værktøjer, før de kan bruges til yderligere analyse. En ulempe ved at bruge forskellige softwareværktøjer til at behandle de diffusion-vægtede billeder er, at (ofte) hvert værktøj bruger sit eget data format til at kode gradient retninger tabellen. MRtrix3 gemmer forløbs oplysningerne sammen med det diffusions vægtede billede i en. MIF-fil, mens ExploreDTI gør brug af en separat fil (B-matrix) til at gemme forløbs anvisningerne. Derfor er det vigtigt at kontrollere, at gradient retninger er korrekt overført fra MRtrix3 til ExploreDTI. Dette kan gøres ved at kontrollere, at farvekodning er korrekt på farvekodede FA billeder [dvs. venstre-højre retning i rødt (f. eks Corpus callosum), forreste-posterior retning i grøn, og ringere-overlegne retning i blåt (f. eks cingulum)]. De farvekodede FA-billeder kan også bruges til at kontrollere kvaliteten af den ikke-stive medregistreringsproces mellem de diffusions vægtede billeder og de strukturelle T2-vægtede billeder.

Ved hjælp af ExploreDTI blev parametrisk kort udvundet ved hjælp af DTI-, DKI-og WMTI-modellerne. DTI-modellen leverede parametriske kort til MD, AD, RD og FA, mens DKI-modellen indeholder parametriske kort for MK, AK og RK. Selv om fire målinger af WMTI-modellen blev beregnet (dvs. AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), var det ikke muligt at udtrække intra-axonal difsivitet (IAD) inden for ExploreDTI. IAD kan fås ved hjælp af et MATLAB værktøj, der leveres af udviklerne af WMTI model25. For at gøre dette skal de diffusions vægtede billeder og gradient oplysninger overføres igen fra ExploreDTI til MATLAB. Dette trin er igen tilbøjelige til fejl vedrørende kodning af gradient oplysninger. Desuden skal Kurtosis-tensor og WMTI-parametrene estimeres og beregnes igen.

Forbehandling af de erhvervede billeder, vurdering af tensorer, og beregning af parametrisk kort kræver en lang periode af edb-tid. Rettelser til EPI, motion og Eddy Current kræves ~ 40 min pr datasæt på en server med otte kerner og 16 GB RAM. Ved hjælp af en ROI analyse, middelværdier inden for hippocampus blev beregnet før og 1 dag efter virkning. Ændringer i DTI-, DKI-og WMTI-målingerne blev derefter kvantificeret i mTBI-gruppen. I DKI-metrik og AWF i WMTI-modellen blev der dog observeret stor variabilitet i Inter-fag, hvilket resulterede i en uventet forskel i baselineværdier mellem Sham-og mTBI-grupperne. Dette er højst sandsynligt resultatet af voxels, der indeholder biologisk usandsynlige værdier (outliers) inden for den undersøgte region og kan filtreres ud i fremtidige undersøgelser før beregning af middelværdien i AMID.

Afslutningsvis, denne protokol viser gennemførligheden af avanceret diffusion MRI til undersøgelse og kvantificering af mikrostrukturelle ændringer i hippocampus i en rotte model af mTBI. Ved hjælp af tre forskellige diffusionsmodeller kan der indhentes supplerende oplysninger om de underliggende biologiske processer, der bidrager til betingelserne efter mTBI. Dette repræsenterer et skridt fremad i udviklingen af biomarkører for mTBI, der kan være følsomme nok til at identificere specifikke mikrostrukturelle ændringer i den tidlige fase efter mild virkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Research Foundation-Flanders (FWO) for at støtte dette arbejde (tilskudsnummer: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, L. J., et al. Systematic Review of the Prognosis After Mild Traumatic Brain Injury in Adults. Cognitive, Psychiatric, and Mortality Outcomes: Results of the International Collaboration on Mild Traumatic Brain Injury Prognosis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (3), S152-S173 (2014).
  2. Buck, P. W. Mild Traumatic Brain Injury: A Silent Epidemic in Our Practices. Health & Social Work. 36 (4), 299-302 (2011).
  3. Bodanapally, U. K., Sours, C., Zhuo, J., Shanmuganathan, K. Imaging of Traumatic Brain Injury. Radiologic Clinics of North America. 53 (4), 695-715 (2015).
  4. Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. MR diffusion tensor spectroscopy and imaging. Biophysical Journal. 66 (1), 259-267 (1994).
  5. Hulkower, M. B., Poliak, D. B., Rosenbaum, S. B., Zimmerman, M. E., Lipton, M. L. A Decade of DTI in Traumatic Brain Injury: 10 Years and 100 Articles Later. American Journal of Neuroradiology. 34 (11), 2064-2074 (2013).
  6. Hutchinson, E. B., Schwerin, S. C., Avram, A. V., Juliano, S. L., Pierpaoli, C. Diffusion MRI and the detection of alterations following traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 612-625 (2018).
  7. Wallace, E. J., Mathias, J. L., Ward, L. Diffusion tensor imaging changes following mild, moderate and severe adult traumatic brain injury: a meta-analysis. Brain Imaging and Behavior. , 1-15 (2018).
  8. Rutgers, D. R., et al. White Matter Abnormalities in Mild Traumatic Brain Injury: A Diffusion Tensor Imaging Study. American Journal of Neuroradiology. 29 (3), 514-519 (2008).
  9. Bondi, C. O., et al. Found in translation: Understanding the biology and behavior of experimental traumatic brain injury. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 58, 123-146 (2015).
  10. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  11. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7 (AUG), (2016).
  12. Lyeth, B. G. Historical Review of the Fluid-Percussion TBI Model. Frontiers in Neurology. 7 (DEC), 1-7 (2016).
  13. Marmarou, A., Foda, M. A. A. -E., van den Brink, W., Campbell, J., Kita, H., Demetriadou, K. A new model of diffuse brain injury in rats. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  14. Heim, L. R., et al. The Invisibility of Mild Traumatic Brain Injury: Impaired Cognitive Performance as a Silent Symptom. Journal of Neurotrauma. 34 (17), 2518-2528 (2017).
  15. Zohar, O., Rubovitch, V., Milman, A., Schreiber, S., Pick, C. G. Behavioral consequences of minimal traumatic brain injury in mice. Acta Neurobiol Exp (Wars. 71 (1), 36-45 (2011).
  16. Pierpaoli, C., Basser, P. J. Toward a quantitative assessment of diffusion anisotropy. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 36 (6), 893-906 (1996).
  17. Jensen, J. H., Helpern, J. A. MRI quantification of non-Gaussian water diffusion by kurtosis analysis. NMR in Biomedicine. 23 (7), 698-710 (2010).
  18. Fieremans, E., Jens, H., Jensen, J. A. H. White matter characterization with diffusional kurtosis imaging. NeuroImage. 58, 177-188 (2011).
  19. Leemans, A. Explore DTI. , (2019).
  20. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
  21. Veraart, J., et al. Denoising of diffusion MRI using random matrix theory. NeuroImage. 142, 394-406 (2016).
  22. Veraart, J., Fieremans, E., Novikov, D. S. Diffusion MRI noise mapping using random matrix theory. Magnetic Resonance in Medicine. 76 (5), 1582-1593 (2016).
  23. Braeckman, K., et al. Dynamic changes in hippocampal diffusion and kurtosis metrics following experimental mTBI correlate with glial reactivity. NeuroImage: Clinical. 21 (August 2018), 101669 (2019).
  24. Jones, D. K., Knösche, T. R., Turner, R. White matter integrity, fiber count, and other fallacies: The do's and don'ts of diffusion MRI. NeuroImage. 73, 239-254 (2013).
  25. Matlab code DKI and WMTI model. , Available from: https://github.com/NYU-DiffusionMRI/Diffusion-Kurtosis-Imaging (2019).

Tags

Neurovidenskab traumatisk hjerneskade agnetisk resonans imaging Diffusion tensor Imaging prækliniske rotte hippocampus
Avanceret diffusion Imaging i hippocampus af rotter med mild traumatisk hjerneskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braeckman, K., Descamps, B.,… More

Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter