Summary
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere informazioni microstrutturali quantitative dell'ippocampo in un ratto con lieve lesione cerebrale traumatica. Questo viene fatto utilizzando un protocollo avanzato di imaging a risonanza magnetica ponderata per la diffusione e un'analisi basata sulla regione di interesse delle mappe di diffusione parametrica.
Abstract
La lesione cerebrale traumatica mite (mTBI) è il tipo più comune di lesione cerebrale acquisita. Poiché i pazienti con lesioni cerebrali traumatiche mostrano un'enorme variabilità ed eterogeneità (età, sesso, tipo di trauma, altre possibili patologie, ecc.), i modelli animali svolgono un ruolo chiave nei fattori di svelamento che sono limitazioni nella ricerca clinica. Forniscono un ambiente standardizzato e controllato per studiare i meccanismi biologici delle lesioni e la riparazione dopo la TBI. Tuttavia, non tutti i modelli animali imitano efficacemente la natura diffusa e sottile di mTBI. Ad esempio, i modelli di impatto corticale controllato (CCI) e lesione di percussioni liquide laterali (LFPI) comunemente usati fanno uso di craniotomia per esporre il cervello e indurre traumi focali diffusi, che non sono comunemente osservati in mTBI. Pertanto, questi modelli sperimentali non sono validi per imitare mTBI. Pertanto, un modello appropriato deve essere utilizzato per esaminare mTBI. Il modello di caduta del peso di Marmarou per i ratti induce alterazioni microstrutturali simili e disturbi cognitivi come si vede nei pazienti che subiscono un trauma lieve; pertanto, questo modello è stato selezionato per questo protocollo. La tomografia computerizzata convenzionale e le scansioni a risonanza magnetica (MRI) di solito non mostrano danni in seguito a una lesione lieve, perché mTBI induce spesso solo lesioni sottili e diffuse. Con la risonanza magnetica ponderata per la diffusione, è possibile studiare le proprietà microstrutturali del tessuto cerebrale, che possono fornire maggiori informazioni sulle alterazioni microscopiche in seguito a un trauma lieve. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è quello di ottenere informazioni quantitative di una regione di interesse selezionata (cioè l'ippocampo) per seguire la progressione della malattia dopo aver ottenuto una lesione cerebrale lieve e diffusa.
Introduction
Lesione cerebrale traumatica (TBI) ha guadagnato più attenzione negli ultimi anni, come è diventato chiaro che queste lesioni cerebrali possono provocare conseguenze cognitive, fisiche, emotive e sociali per tutta la vita1. Nonostante questa crescente consapevolezza, Lieve TBI (mTBI, o commozione cerebrale) è ancora spesso sottosegnalato e non diagnosticato. MTBI è stato indicato come un'epidemia silenziosa, e gli individui con una storia di mTBI mostrano tassi più elevati di abuso di sostanze o problemi psichiatrici2. Diversi pazienti con mTBI non vengono diagnosticati ogni anno a causa della natura diffusa e sottile delle lesioni, che spesso non sono visibili sulla tomografia computerizzata convenzionale (TC) o sulle scansioni rm (RMI) a risonanza magnetica. Questa mancanza di prove radiologiche di lesioni cerebrali ha portato allo sviluppo di tecniche di imaging più avanzate come la risonanza magnetica a diffusione, che sono più sensibili ai cambiamenti microstrutturali3.
La risonanza magnetica a diffusione consente la mappatura in vivo della microstruttura, e questa tecnica di risonanza magnetica è stata ampiamente utilizzata negli studi TBI4,5,6. Dal tensore di diffusione, l'anisotropia frazionaria (FA) e la media diffusione (MD) vengono calcolate per quantificare l'alterazione nell'organizzazione microstrutturale a seguito di lesioni. Recenti recensioni in pazienti mTBI segnalano aumenti in FA e diminuzioni in MD a seguito di lesioni, che può essere indicativo di gonfiore assonale7. Contrariamente, si riscontrano anche aumenti di MD e diminuzioni nella FA e sono stati suggeriti per essere alla base di interruzioni nella struttura parenchimale a seguito della formazione di edema, della degenerazione assonale o del disallineamento/rottura delle fibre8. Questi risultati misti possono essere parzialmente spiegati dalla significativa eterogeneità clinica di mTBI causata da diversi tipi di impatto e gravità (ad esempio, accelerazione della rotazione, trauma da corpo contundente, lesioni da scoppio o combinazione del primo). Tuttavia, attualmente non esiste un chiaro consenso sulla patologia sottostante e sulla base biologica/cellulare alla base delle alterazioni nell'organizzazione microstrutturale.
I modelli animali forniscono un'impostazione standardizzata e controllata per studiare i meccanismi biologici delle lesioni e riparare seguendo la TBI in modo più dettagliato. Sono stati sviluppati diversi modelli sperimentali per la TBI che rappresentano diversi aspetti della TBI umana (ad esempio, traumi focali o diffusi o traumi causati da forze rotazionali)9,10. I modelli animali di uso comune includono i modelli di impatto corticalecontrollato (CCI) e le lesioni a percussioni liquide laterali (LFPI) 11,12. Anche se i parametri sperimentali possono essere ben controllati, questi modelli fanno uso di una craniotomia per esporre il cervello. Craniotomie o fratture del cranio non sono comunemente osservate in mTBI; pertanto, questi modelli sperimentali non sono validi per imitare mTBI. Il modello di accelerazione d'impatto sviluppato da Marmarou et al.13 fa uso di un peso che viene lasciato cadere da una certa altezza sulla testa del ratto, che è protetto da un casco. Questo modello animale induce simili alterazioni microstrutturali e disturbi cognitivi come si vede nei pazienti che subiscono traumi lievi. Pertanto, questo modello di goccia di peso Marmarou è appropriato per studiare l'imaging di biomarcatori per mTBI diffuso14,15.
Questo rapporto dimostra l'applicazione della risonanza magnetica a diffusione avanzata in un modello di ratto mTBI utilizzando il modello di caduta del peso Marmarou. Il primo dimostrato è come indurre un trauma lieve e diffuso, e viene quindi fornita l'analisi utilizzando il modello di imaging a tensore di diffusione (DTI). Informazioni biologiche specifiche sono ottenute con l'uso di modelli di diffusione più avanzati [cioè, imaging di curtosi di diffusione (DKI) e modello di integrità del tratto di materia bianca (WMTI)]. In particolare, si infliggono traumi lievi e i cambiamenti microstrutturali vengono quindi valutati nell'ippocampo utilizzando la risonanza magnetica convenzionale a peso T2 e un protocollo avanzato di imaging a diffusione.
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Protocol
Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico degli Animali dell'Università di Gand (ECD 15/44Aanv) e tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida della Commissione europea (direttiva 2010/63/UE).
1. Preparazione degli animali e fissaggio del casco
- Pesare un ratto Wistar H femmina (250 g o 12 settimane di età) e anesizzare in una piccola camera di induzione riempita con una miscela di isoflurane (5%) e O2 per almeno 1 min.
- Iniettare il ratto con 0,05 mg/kg di buprenorfine sottocutaneamente nel collo, restituirlo alla gabbia di casa e consentire l'analgesia preventiva per almeno 30 min per avere effetto.
NOTA: Durante l'attesa di 30 min, il sito chirurgico può essere preparato. - Collocare una piastra di riscaldamento tenuta a 37 gradi sotto il campo chirurgico. Posizionare gli strumenti chirurgici sterilizzati sul campo chirurgico che è stato disinfettato con il 70% di etanolo.
- Riporre il ratto nella camera di induzione e anesizzare il ratto fino a quando non è risponde a una zampa o un pizzico di coda.
- Posizionare il ratto sul campo chirurgico e inserire un catetere nella vena laterale della coda. Successivamente, radere la testa del ratto, rimuovere la pelliccia in eccesso e disinfettare il cuoio capelluto e il resto dell'area chirurgica con cloroexidina.
- Iniettare 100 luna del 2% di lidocaina localmente nel cuoio capelluto.
- Fare un'incisione mediana utilizzando un bisturi taglia 11 per esporre il cranio, rimuovendo eventuali membrane in eccesso con piccole forbici. Ritirare la pelle utilizzando uno speculum oculare con una diffusione massima di 1 cm. Inoltre, rimuovere il periosteo strofinando delicatamente un batuffolo di cotone sterile sul cranio fino a quando il periosteo non è più presente.
- Mettere una goccia di colla di tessuto sul cranio e una sul disco metallico sterilizzato (diametro di 10 mm e spessore 3 mm), che funge da casco. Incollare il disco circa un terzo prima e due terzi dietro il bregma. Lasciare asciugare la colla per 1 min.
2. Induzione di lesioni cerebrali traumatiche (TBI)
- Posizionare il ratto sul letto su misura con un materasso in schiuma di una certa costante di molla (vedi Tabella dei Materiali). Posizionare il ratto direttamente sotto un tubo di plastica trasparente con un peso in ottone di 450 g con il casco il più orizzontale possibile. Staccare il ratto dall'anestesia.
- Tirare il peso fino a 1 m e rilasciare quando è pronto. Assicurarsi che sia presente un secondo sperimentatore per allontanare il ratto dal tubo di plastica immediatamente dopo l'impatto per evitare un secondo impatto.
NOTA: i ratti feriti fittizi ricevono la stessa procedura sperimentale (passaggi da 1.1 a 2.7), ad eccezione del passaggio 2.2. - Riattaccare il ratto all'anestesia e iniettare 1 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) attraverso il catetere per ridurre lo shock emodinamico.
NOTA: È possibile che il ratto smetta brevemente di respirare a causa dell'impatto. Comprimere delicatamente il torace se il ratto non respira spontaneamente dopo 2 s per incoraggiare il riflesso respiratorio. - Rimuovere il casco tirandolo delicatamente dal cranio. Rimuovere la colla rimanente dal cranio e dalla pelle e chiudere l'incisione con sutura chirurgica. Applicare il gel di analgesia locale utilizzando una punta sterile applicatore.
- Posizionare il topo sul letto del scanner CT. Confermare la posizione corretta utilizzando una scansione scout. Regolare il campo visivo per consentire l'imaging dell'intera testa all'interno di una posizione del letto. Somministrare uno scopo generale, la TAC a bassa dose per escludere le fratture del cranio.
NOTA: La frattura del cranio è un criterio per l'eutanasia. - Collocare il topo in una gabbia pulita su una piastra di riscaldamento (37 gradi centigradi). Monitorare il tempo per riprendere conoscenza. Una volta che il topo è in grado di sedersi in posizione verticale, il ratto può essere restituito alla gabbia di casa.
- Somministrare una seconda dose di 0,05 mg/kg di buprenorfine un giorno dopo l'induzione di TBI.
3. Risonanza magnetica a diffusione (RM)
NOTA: l'imaging ponderato per la diffusione viene eseguito prima e 1 giorno dopo l'induzione del trauma.
- Anestesizzare il ratto in una piccola camera di induzione riempita con una miscela di isoflurane (5%) e O2. Quando il ratto non risponde a una zampa o un pizzico di coda ridurre l'anestesia al 2% con una portata di 500 ml/min. Trasferire l'animale al letto del scanner in posizione prona testa-prima.
- Posizionare il ratto nel supporto della testa con la barra dei denti e il cono naso, fornendo l'anestesia, e far scorrere la testa in avanti fino a quando il centro del cervello è al livello del centro della bobina MRI volume quadratura. Applicare unguento lubrificante agli occhi in piccole quantità per evitare danni alla cornea. Fissare la testa con un piccolo pezzo di nastro adesivo per evitare il movimento durante la scansione.
- Mettere un tampone di pressione sotto il torace del ratto per monitorare la respirazione e coprire il ratto con una coperta di riscaldamento dell'acqua calda circolante e un involucro a bolle per mantenere il ratto caldo. Prima della scansione, controllare il monitor respiratorio per assicurarsi che il segnale sia chiaro senza rumore e che il ciclo respiratorio sia coerente. Se necessario, spostare il cuscinetto a pressione.
NOTA: La frequenza respiratoria deve essere mantenuta tra 1 respiro per 1.200-1.700 ms regolando il livello di anestesia tra 1%-2%. - Far scorrere la bobina del volume della quadratura sulla testa. Regolare i condensatori di sintonizzazione e di corrispondenza della bobina alla frequenza corretta e ostacolare secondo le istruzioni fornite dal fornitore della bobina. Far avanzare il letto dello scanner nel foro dello scanner per avviare la scansione.
- Ottenere una scansione scout a tre piani di default ("tripilot") per garantire il corretto posizionamento.
- Caricare la sequenza tripilota nel controllo scansione facendo clic su Nuova scansione e selezionando la sequenza tripilota dall'elenco dei protocolli. Quindi, fare clic sul pulsante semaforo per avviare la scansione.
- Quando la scansione è terminata, caricare la scansione nel display dell'immagine e assicurarsi che 1) la testa è sdraiata dritta e 2) il cervello è posizionato al centro del magnete e della bobina. Regolare la posizione della testa e/o del letto dello scanner, se necessario, e acquisire una nuova scansione tripilota.
- Regolare il campo magnetico locale utilizzando un protocollo di shimming automatico di secondo ordine: caricare il protocollo shim di secondo ordine nel controllo scan come descritto nel passaggio 3.5.1. Quindi, fare clic sulla scheda Acq Aggiustamenti di corrente Regolazione specifica del metodo per l'omogeneità del campo locale nella finestra Strumento di controllo Spettrometro per avviare lo shimming automatico.
- Caricare una nuova immagine rapida T2 con la sequenza Refocused Echoes (RARE) nel controllo Scansione come descritto nel passaggio 3.5.1.
- Acquisire immagini ponderate T2 utilizzando le impostazioni predefinite, ad eccezione dei seguenti parametri:
- Aprire la scheda Modifica scansione e regolare il tempo di ripetizione (TR) e il tempo di eco (TE) rispettivamente su 5.500 ms e 37 ms. Inoltre, modificare il campo visivo e la dimensione della matrice in modo da consentire una risoluzione in piano più elevata di 109 m x 109 m (risoluzione di default: 156 x 156 m). Assicurarsi che lo spessore della fetta sia di 600 m, che il numero di sezioni sia impostato su 45 e che il fattore RARE sia impostato su 8.
- Aprire l'editor Geometria e posizionare il pacchetto di sezioni nella posizione corretta, incluso il bulbo del cervello e il cervelletto.
- Caricare tre nuove sequenze spin-echo ponderate (DtiEpi) di diffusione eco-planare dalla cartella B_FU-IN al protocollo Scan Control, come descritto al passaggio 3.5.1.
NOTA: utilizzando tre diversi "shell" di diffusione, si può stimare il modello4dell'imaging a tensore di diffusione (DTI),16, modello17, e il modello WMTI (White matter tract integrity) 18. Si consiglia di utilizzare almeno tre diversi valori b, con il valore b più alto con un massimo di 3000 s/mm2 con almeno 15 direzioni equidistanti per ogni guscio di imaging17.- Acquisire immagini ponderate di diffusione (DHE) utilizzando le impostazioni predefinite, oltre alle seguenti impostazioni:
- Aprire la scheda Modifica scansione e regolare i parametri geometrici nella scheda Geometria.
- Impostare l'orientamento della sezione su assiale e il numero di fette su 25, con uno spessore di fetta di 500 m e una distanza di interfetta di 600 m. Modificare la direzione di lettura in sinistra-destra.
- Fare clic sulla scheda Contrasto per regolare il tempo di eco a 24 ms e il tempo di ripetizione a 6.250 ms.
- Impostare la larghezza di banda su 250.000 Hz e attivare la soppressione del grasso. Regolare il numero di medie su uno.
- Fare clic sulla scheda Ricerca e modificare il numero di medie (segmenti EPI) in 4.
- Fare clic sulla scheda Diffusione all'interno della scheda di ricerca. Eseguire questo passaggio separatamente per ciascuno dei tre gusci di diffusione.
- Regolare il numero di direzioni di diffusione a 32 per il primo guscio, 46 per il secondo guscio e 64 per il terzo guscio.
- Regola le direzioni delle sfumature con i file delle direzioni dei gradienti personalizzati.
- Modificare il numero di immagini B0 a 5 per il primo guscio, 5 per la seconda shell e 7 per il terzo guscio.
- Regolare il valore b per direzione su 800 s/mm2 per il primo guscio, 1500 s/mm2 per il secondo guscio e 2000 s/mm2 per il terzo guscio.
NOTA: la regolazione delle direzioni dei gradienti con un file di indicazioni sfumature personalizzate può essere eseguita manualmente impostando Enter Diffusion Directions su yes o automaticamente utilizzando la macro DTI_SET_DIRECTIONS.
- Aprire l'editor Geometria e posizionare il campo visivo tra il bulbo e il cervelletto contenente solo il cervello per ridurre l'artefatto e il tempo di scansione. Posizionare sei bande di saturazione di 5 mm all'esterno del cervello per ridurre gli artefatti facendo clic su Saturazione e facendo scorrere le bande nella posizione preferita utilizzando le barre di scorrimento.
NOTA: Il bulbo e il cervelletto possono essere identificati sulla base di punti di riferimento anatomici e delle tre immagini della scansione tripilota.
- Acquisire le sequenze importate facendo clic sul simbolo del semaforo. Utilizzando le impostazioni dei parametri sopra descritti, il tempo di acquisizione della scansione T2-RARE è di 12 min, del primo guscio DWI 15 min, del secondo guscio DWI 21 min e del terzo guscio 30 min. Il tempo di acquisizione totale è di circa 80 min (su un singolo sistema di canali del ricevitore).
- Al termine del protocollo di scansione, rimuovere l'animale dal letto dello scanner e posizionarlo in una gabbia pulita con un pad di riscaldamento a 37 gradi centigradi. Riportare l'animale alla gabbia di casa quando riacquista conoscenza.
4. Elaborazione delle immagini
NOTA: Nelle sezioni seguenti, l'elaborazione delle immagini di diffusione è descritta in MRtrix3, ExploreDTI19 e Amide software20 che sono strumenti di accesso aperto. Tuttavia, i passaggi di pre-elaborazione possono essere eseguiti in altre caselle degli strumenti (ad esempio, FSL, MedInria, DTIStudio).
- Trasferire i dati acquisiti dalla console di acquisizione esportando il file 2dseq.
- Convertire i file 2dseq (file DWI grezzi) nel formato .mif, che è la formattazione standard di MRtrix3, per consentire ulteriori passaggi di pre-elaborazione in MRtrix3. Inoltre, concatenare le tre conchiglie di diffusione utilizzando i seguenti comandi nella shell:
convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2.mih (per le immagini ponderate T2)
convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1.mih (per la prima conchiglia di diffusione)
convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2.mih (per la seconda conchiglia di diffusione)
convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3.mih (per la terza conchiglia di diffusione)
mrcat ratID_dwi1.mif ratID_dwi2.mif ratID_dwi3.mif ratID_dwi.mif - Eseguire la correzione del rumore e la correzione del squillo di Gibbs sui DWI in MRtrix321,22. Inoltre, convertire le immagini DWI corrette e l'immagine T2 in formato NIFTI utilizzando i seguenti comandi:
dwidenoise ratID_dwi.mif ratID_dwi_denoised.mif
mrdegibbs ratID_dwi_denoised.mif ratID_dwi_denoised_gr.mif
mrconvert ratID_dwi_denoised_gr.mif ratID.nii
mrconvert ratID_T2.mif ratID_T2.nii - Eseguire la correzione per le distorsioni di corrente EPI, movimento ed Eddy in ExploreDTI:
- Convertire le immagini NIFTI in un file .mat facendo clic su Calcola file DTI . Convertire i dati non elaborati in un file DTI.mat. Modificare la stima del tensore di diffusione in lineare pesato e il valore b in NaN. Regolare le dimensioni del voxel a 0,333 0,333 0,6, il numero di immagini non DWI a 17, il numero di immagini DWI a 142 e la dimensione della matrice a 105 105 25.
NOTA: impostando il valore b su NaN, ExploreDTI considererà il set di dati del set di dati come un set di dati kurtosis. - Fare clic sulla scheda Impostazioni per regolare le impostazioni per la correzione EPI (questa opzione è disattivata per impostazione predefinita). Selezionare la correzione SM/EC/EPI, registrarsi anche su altri dati? e fare clic su Sì, per eseguire la correzione EPI (non rigida). Specificare il suffisso dell'immagine T2 anatomica corrispondente al set di dati di diffusione.
NOTA: ExploreDTI corregge le distorsioni EPI utilizzando la registrazione dell'immagine tra l'immagine anatomica non distorta e l'immagine di diffusione. - Fare clic sulla scheda Plugin e selezionare Correzione per il movimento del soggetto e le distorsioni EC/EPI e selezionare il file di dati di diffusione pre-elaborato dal passaggio 2.3. Assicurarsi che l'immagine T2 si trova nella stessa cartella e abbia la stessa base del nome del file di dati di diffusione (ad esempio, rat1.nii per il DWI e rat1_T2.nii per l'immagine anatomica). Questo passaggio genererà un file "nativo" ('native.mat') e "trasformato" ('trafo.mat').
- Convertire le immagini NIFTI in un file .mat facendo clic su Calcola file DTI . Convertire i dati non elaborati in un file DTI.mat. Modificare la stima del tensore di diffusione in lineare pesato e il valore b in NaN. Regolare le dimensioni del voxel a 0,333 0,333 0,6, il numero di immagini non DWI a 17, il numero di immagini DWI a 142 e la dimensione della matrice a 105 105 25.
- Calcolare le metriche DTI per ogni ratto facendo clic su Plugin ed Esporta cose in .nii e selezionando le mappe parametriche del modello DTI: anisotropia frazionaria (FA), media diffusività (MD), diffusività radiale (RD) e stampa(AD assiale) e stampavity assiale (AD; indicato come "più grande eigenvalue L1").
- Inoltre, esportare le mappe parametriche per il modello di curtosis (MK, AK e RK) e il modello WMTI (AWF, AxEAD, RadEAD e TORT). L'elaborazione delle immagini di diffusione comporterà 12 mappe parametriche (Figura 1, Figura 2, Figura 3) che possono essere utilizzate per ulteriori analisi microstrutturali.
- Creare un file di maschera per l'ippocampo di ogni ratto utilizzando MRtrix3.
- Caricare l'immagine FA del ratto nel visualizzatore MRtrix facendo clic su Strumento e editor ROI.
- Creare un nuovo ROI facendo clic sul pulsante""" e premere Modifica per disegnare il ROI su ogni sezione che include l'ippocampo (Figura 4). Per cancellare le aree indesiderate dal ROI disegnato, premere il pulsante destro del mouse.
- Una volta completato il disegno del ROI, salvare l'immagine della maschera facendo clic sul pulsante Salva.
NOTA: Questo file di maschera sarà un file di immagine binario NIFTI con voxel di valore 1 contenente il tessuto ippocampale, e i voxel rimanenti avranno valori pari a 0. Per standardizzare la regione dell'ippocampo tra i ratti, le mappe parametriche possono essere registrate con un modello specifico dello studio con regioni di interesse predefinite delineate23 o un atlante cerebrale di topo.
- Per estrarre le metriche di diffusione dell'ippocampo del ratto, utilizzare il file della maschera creato del passaggio 4.6 e aprire il software Amide.
- Aprire le mappe parametriche e l'immagine della maschera del ratto.
- Per aggiungere il ROI del file della maschera in Amide, selezionare l'immagine del file della maschera, fare clic su Modifica . Aggiunta di un ROI 3D Isocontour e fare clic sul ROI visualizzato nell'immagine della maschera. Assegnare al ROI un nome significativo e confermare che questo volume deve contenere solo voxel ne con un valore uno.
- Per calcolare i valori medi delle metriche di diffusione nell'ippocampo, fare clic su Strumenti Calcolare le statistiche del ROI e indicare le immagini e il ROI da includere. Dopo aver fatto clic su Esegui, apparirà un'altra schermata con valori calcolati che possono essere utilizzati per ulteriori analisi statistiche. Questo file può essere salvato o copiato in un formato dati preferito (ad esempio, file .xlsx o .csv).
5. Analisi statistica
NOTA: Nelle sezioni seguenti viene descritta l'elaborazione delle immagini di diffusione nelle statistiche SPSS 24; tuttavia, l'analisi statistica può essere eseguita in altre caselle degli strumenti statistiche.
- Caricare i dati nel formato wide in un file SPSS .sav.
- Per verificare le differenze statistiche tra i due gruppi per ogni timepoint (ad esempio, linea di base o post-infortunio di 1 giorno), fare clic su Analizza. Test non parametrici Finestre di dialogo per le tàlp- 2 Test di campioni indipendenti. Caricare le variabili che devono essere testate e specificare i gruppi (ad esempio, TBI e gruppi fittizi). Indicare il Mann-Whitney U come tipo di test.
- Per verificare le differenze statistiche tra i due punti temporali all'interno di ogni gruppo il file di dati deve essere diviso. Vai a Dati, Dividi file e indica Gruppi di confronto. Successivamente, fare clic su Analizza, Test non parametrici, Finestre di dialogo Legacy, 2 test di campioni correlati, caricare le variabili che devono essere confrontate e indicare Wilcoxon come tipo di test.
NOTA: per correggere confronti multipli, i valori di p vengono regolati per ogni modello di diffusione utilizzando la correzione Bonferroni [cioè, valore-p diviso per il numero di parametri confrontati (DTI 4, DKI 3 e WMTI 4)]. Più specificamente, p < 0.0125 è considerato significativo per i modelli DTI e WMTI e p < 0.016 è considerato significativo per il modello DKI.
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Representative Results
Nello studio, tutti i ratti TBI (n - 10) sono sopravvissuti all'impatto e sono stati in grado di recuperare dall'impatto e dall'anestesia entro 15 min dopo il distacco dall'anestesia23. Sulle immagini TC, non c'erano prove di fratture craniche e le immagini T2 non mostravano anomalie come sanguinamento, ventricoli allargati o formazione di edema nel sito di contusione 1 giorno dopo il trauma (Figura 5). Così, sulla base di queste ispezioni visive delle immagini anatomiche, non sono state rilevate grandi lesioni focali, a conferma della natura diffusa e lieve della lesione.
La qualità del passaggio di coregistrazione (non rigida) tra l'immagine T2 e il set di dati di diffusione (passaggio 4.4) è stata esaminata aggiungendo una sovrapposizione dell'immagine T2 alla mappa FA codificata a colori (Figura 6). Quindi, le mappe parametriche FA, MD, AD e RD sono state calcolate (Figura 1) e caricate nel software Amide. Sulla base della mappa FA, è stato disegnato un ROI che include la struttura ippocampale (Figura 4). I valori statistici delle metriche di diffusione sono stati calcolati in media su tutti i voxel all'interno della regione di interesse e i valori medi di ogni metrica DTI sono stati esportati per ulteriori analisi. Un altro controllo di qualità dei dati di diffusione può essere eseguito ispezionando gli outlier nelle metriche DTI. Ad esempio, i valori FA nell'ippocampo dovrebbero essere di circa 0,15; pertanto, i valori di <0.10 (denoting isotropic diffusion) o >0.30 (i valori sono visti nella materia bianca) possono essere considerati come valori biologicamente implausibili. Questi punti dati dovrebbero essere respinti da un'ulteriore analisi. Inoltre, sono stati calcolati i valori medi per AK, RK e MK del modello di curtosi di diffusione, nonché a AWF, AxEAD, RadEAD e TORT del modello WMTI (Figura 2, Figura 3).
Nel nostro studio, l'analisi delle metriche DTI ha rivelato significativi valori FA aumentati (p - 0,007), e valori di diffusività in diminuzione (MD e RD) (p - 0,007 e p - 0,007, rispettivamente) in seguito all'impatto nel gruppo mTBI (Figura 7). Queste diminuzioni in RD e MD erano significativamente diverse dal gruppo sham (p - 0,005 e p - 0,004, rispettivamente). Le metriche di curtosi di diffusione hanno mostrato una significativa diminuzione della RK (p - 0,005) a seguito dell'impatto, ma nessuna modifica in AK o MK (Figura 8). Utilizzando il modello WMTI, RadEAD (p - 0,007) e TORT (p - 0,007) hanno mostrato una diminuzione significativa e un aumento, rispettivamente, nel gruppo mTBI 1 giorno dopo l'impatto (Figura 9C, D). I valori nel gruppo sham non hanno mostrato cambiamenti significativi.
Figura 1: Mappe parametriche rappresentative per anisotropia frazionaria (FA), media diffusività (MD), diffusività assiale (AD) e diffusività radiale (RD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mappe parametriche rappresentative per la curtosi media (MK), la curtosi assiale (AK) e la curtosi radiale (RK). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Mappe parametriche rappresentative per frazione di acqua assonale (AWF), diffusività assiale e radiale extra assonali (AxEAD, RadEAD) e tortuosità (TORT). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Creazione di una maschera in MRtrix3. Un ROI viene disegnato intorno all'ippocampo su tutte le fette contenenti il volume dell'ippocampo e il volume viene salvato come file di maschera. Questa operazione può essere eseguita singolarmente per ogni ratto o utilizzando un file maschera modello specifico dello studio in cui è possibile registrare ciascuna delle mappe parametriche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini ponderate TC e T2 di un animale mTBI rappresentativo 1 giorno dopo l'impatto. Le immagini TC (riga superiore) non mostrano fratture del cranio. Sulle immagini ponderate T2 (riga inferiore) non sono stati dimostrati sanguinamenti, ventricoli ingranditi o formazione di edema. Da notare che la formazione di edema è chiaramente visibile come un'area iperintensa intorno all'area della ferita dall'intervento chirurgico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Mappa FA codificata a colori del set di dati di diffusione sovrapposta all'immagine anatomica dopo la correzione per EPI, movimento e correzione della corrente Eddy in ExploreDTI. Mostrato è una cattiva correzione e co-registrazione a sinistra e buoni esempi a destra. Occorre assicurarsi che la codifica del colore sia corretta: direzione sinistra-destra in rosso (ad esempio, corpus callosum), direzione anteriore-posteriore in verde e direzione inferiore-superiore in blu (ad esempio, cingulum). Inoltre, l'immagine FA codificata a colori deve essere perfettamente allineata con l'immagine anatomica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Cambiamenti nelle metriche del tensore di diffusione dell'ippocampo per gli animali finti (n - 10) e mTBI (n - 10). A seguito dell'impatto, si è registrato un aumento significativo della FA (A) e una significativa diminuzione della comintazione media (B) e della diffusività radiale (D) negli animali mTBI (B,D). Non sono state osservate differenze significative per l'assia la diffusività (C) nei ratti mTBI. Gli animali farsi non hanno mostrato cambiamenti significativi nel DTI (p < 0,0125). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Cambiamenti nelle metriche di curtosi di diffusione dell'ippocampo per gli animali sham (n - 10) e mTBI (n - 10). A seguito dell'impatto, si è osservata una significativa diminuzione della RK (C) degli animali mTBI, ma nessuna variazione nell'AK (B) o MK (A). Gli animali farsi non hanno mostrato alcuna modifica (p < 0.0166). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Cambiamenti nelle metriche di integrità del tratto di materia bianca di ippocampo per sham (n - 10) e mTBI animali (n - 10). A seguito dell'impatto, si èriportata una significativa diminuzione del RadEAD ( C) e un aumento significativo del TORT (D) degli animali mTBI, ma nessun cambiamento in AWF o AxEAD (A,B). Gli animali farsi non hanno mostrato alcuna modifica (p < 0.0125). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Poiché mTBI è spesso il risultato di una lesione diffusa e sottile che non mostra anomalie sulla TC e sulle scansioni convenzionali della risonanza magnetica, la valutazione dei danni microstrutturali dopo un trauma lieve rimane una sfida. Pertanto, sono necessarie tecniche di imaging più avanzate per visualizzare l'intera estensione del trauma. L'applicazione della risonanza magnetica a diffusione nella ricerca TBI ha acquisito maggiore interesse nell'ultimo decennio, dove l'imaging a tensore di diffusione è più frequentemente utilizzato5. Una limitazione del modello DTI è l'assunzione di un processo di diffusione gaussiana che non è un'ipotesi precisa per la microstruttura cerebrale (costituita da una complessa rete di assoni e cellule con membrane che agiscono come barriere), con conseguente metriche DTI non specifiche la microstruttura biologica sottostante24. L'imaging della curtosi di diffusione è un'estensione del modello DTI e tenta di caratterizzare il grado di diffusione non gaussiana17. Ciò può fornire informazioni aggiuntive sull'eterogeneità o la complessità dei tessuti.
Tuttavia, uno svantaggio dei modelli DTI e DKI è che sono solo una rappresentazione del segnale di diffusione, che caratterizza il profilo di spostamento dell'acqua probabilistico ma non è specifico della microstruttura6. D'altra parte, il modello di integrità del tratto di materia bianca basato sul tensore curtosi è una tecnica di mappatura microstrutturale che incorpora informazioni biologiche a priori (presupposti) nel modello18. Attribuisce il segnale di diffusione ai compartimenti tissutali e può valutare gli attributi biologici in modo più diretto. Questi modelli biofisici possono quindi offrire nuove informazioni per descrivere le anomalie dopo mTBI e superare questo problema di non specificità6. Utilizzando questi tre diversi modelli, le alterazioni microstrutturali e i processi biologici sono stati visualizzati seguendo mTBI in modo più dettagliato, in particolare utilizzando il modello di caduta del peso Dimarou.
Il modello di goccia di peso Marmarou è facile da usare e richiede solo un intervento chirurgico minore; tuttavia, si raccomanda un secondo sperimentatore di allontanare il ratto dal tubo di vetro immediatamente dopo il primo impatto per evitarne uno secondo. Inoltre, a volte è necessario aiutare il ratto a ritrovare il riflesso respiratorio dopo l'impatto. Il protocollo di risonanza magnetica piuttosto lungo, con un tempo di acquisizione totale di circa 80 min, è ben tollerato sia dai ratti finti che da quelli mTBI. Tuttavia, durante la scansione, è importante monitorare il ciclo di respirazione e regolare l'anestesia se l'animale dorme troppo profondamente o leggermente. È anche importante mantenere l'animale caldo sia durante che dopo l'acquisizione fino a quando il ratto è completamente sveglio per evitare l'ipotermia.
Nella risonanza magnetica a diffusione avanzata, gli artefatti di movimento dovrebbero essere evitati il più possibile. Una soluzione semplice per ridurre il movimento durante la scansione è quella di fare uso di una barra dei denti e fissare la testa con un piccolo pezzo di nastro o due barre auricolari, se disponibile. Questo assicura che la testa non si muova su e giù ogni volta che il ratto prende un respiro.
Utilizzando protocolli DI risonanza magnetica a diffusione avanzati, le immagini acquisite devono passare attraverso diverse fasi di elaborazione (pre-), per lo più utilizzando diversi strumenti software, prima di poter essere utilizzate per ulteriori analisi. Uno svantaggio dell'utilizzo di diversi strumenti software per elaborare le immagini ponderate per la diffusione è che (spesso) ogni strumento utilizza il proprio formato di dati per codificare la tabella delle direzioni del gradiente. MRtrix3 memorizza le informazioni sul gradiente insieme all'immagine ponderata per la diffusione in un file .mif, mentre ExploreDTI utilizza un file separato (matrice B) per memorizzare le direzioni del gradiente. Pertanto, è importante verificare che le direzioni della sfumatura vengano trasferite correttamente da MRtrix3 a ExploreDTI. Questo può essere fatto controllando che la codifica del colore sia corretta sulle immagini FA codificate a colori [ad esempio, direzione sinistra-destra in rosso (ad esempio, corpus callosum), direzione anteriore-posteriore in verde e direzione inferiore-superiore in blu (ad esempio, cingulum)]. Le immagini FA codificate a colori possono essere utilizzate anche per verificare la qualità del processo di co-registrazione non rigida tra le immagini ponderate per la diffusione e le immagini strutturali ponderate T2.
Utilizzando ExploreDTI, le mappe parametriche sono state estratte utilizzando i modelli DTI, DKI e WMTI. Il modello DTI forniva mappe parametriche per MD, AD, RD e FA, mentre il modello DKI fornisce mappe parametriche per MK, AK e RK. Sebbene siano state calcolate quattro metriche del modello WMTI (ad esempio, AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), non è stato possibile estrarre la diffusività intra-assonale (IAD) all'interno di ExploreDTI. IAD può essere ottenuto utilizzando uno strumento MATLAB fornito dagli sviluppatori del modello WMTI25. A tale scopo, le immagini ponderate per la diffusione e le informazioni sul gradiente devono essere trasferite nuovamente da ExploreDTI a Matlab. Questo passaggio è nuovamente soggetto a errori relativi alla codifica delle informazioni sul gradiente. Inoltre, il tensore curtosi e i parametri WMTI devono essere stimati e calcolati nuovamente.
La pre-elaborazione delle immagini acquisite, la stima dei tensori e il calcolo delle mappe parametriche richiedono un lungo periodo di tempo di calcolo. Le correzioni per EPI, motion e eddy current richiedevano 40 min per set di dati su un server con otto core e 16 GB di RAM. Utilizzando un'analisi del ROI, i valori medi all'interno dell'ippocampo sono stati calcolati prima e 1 giorno dopo l'impatto. I cambiamenti nelle metriche DTI, DKI e WMTI sono stati poi quantificati nel gruppo mTBI. Tuttavia, nelle metriche DKI e AWF del modello WMTI, è stata osservata una grande variabilità intersoggetto, che ha provocato una differenza inaspettata nei valori di base tra i gruppi sham e mTBI. Questo è molto probabilmente il risultato di voxel contenenti valori biologicamente implausibili (outlier) all'interno della regione studiata e possono essere filtrati in studi futuri prima del calcolo dei valori medi in Amide.
In conclusione, questo protocollo dimostra la fattibilità della risonanza magnetica a diffusione avanzata per studiare e quantificare le alterazioni microstrutturali nell'ippocampo in un modello di ratto di mTBI. Utilizzando tre diversi modelli di diffusione, è possibile ottenere informazioni complementari sui processi biologici sottostanti che contribuiscono alle condizioni dopo mTBI. Ciò rappresenta un passo avanti nello sviluppo di biomarcatori per mTBI che potrebbero essere sufficientemente sensibili da identificare specifici cambiamenti microstrutturali nella fase iniziale dopo un impatto lieve.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Research Foundation - Flanders (FWO) per aver sostenuto questo lavoro (Numero di sovvenzione: G027815N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induction of trauma | |||
| 0.9% NaCl physiologic solution | B Braun | 394496 | |
| brass weight 450g | custom made | custom made | diamter 18mm and 210 mm height |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| ethilon II | Ethicon | EH7824 | FS-3, 4-0, 3/8, 16mm |
| Matrass | Foam to Size | Type E | |
| Plexiglas tube | ISPA Plastics | 416564 | M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m) |
| Preclinical CT scanner | Molecubes | X-cube | |
| Steel helmet | custom made | custom made | diameter 10 mm and 3 mm thickness |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| Vetergesic (buprenorphin) | EcuPhar | VETERG20 | 0.05 mk/kg |
| Xylocaine 2% gel | AstraZeneca | Xylocaine 2% | gel |
| Xylocaine (lidocain 2%) | Aspen/AstraZeneca | Xylocaine 2% gel | 100 μl injection |
| Diffusion MRI | |||
| Preclinical MRI acquisition software | Bruker Biospin MRI GmbH | Z400_PV51_CENTOS55 | ParaVision 5.1 MRI software |
| Preclinical MRI scanner | Bruker Biospin MRI GmbH | PharmaScan 70/16 | 7T MRI scanner |
| Quadrature volume coil | Bruker Biospin MRI GmbH | RF RES 300 1H 075/040 QSN TR | Model No: 1P T13161C3 |
| Small animal physiological monitoring unit | Rapid Biomedical | EKGHR02-0571-043C01 | Unit for respiratory monitoring |
| Water-based heating unit | Thermo Fisher Scientific | Haake S 5P | Model No: 1523051 |
| Anaesthesia | |||
| Anaesthesia movable unit | Veterenary technics | BDO - Medipass, Ijmuiden | |
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | |
| Oxygen generator | Veterenary technics | 7F-3 | BDO - Medipass, Ijmuiden |
| Diffusion image processing | |||
| Amide | http://amide.sourceforge.net | Version 1.0.5. | Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003) |
| ExploreDTI | http://www.exploredti.com | Version 4.8.6 | Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009) |
| MRtrix3 | http://www.mrtrix.org | Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 | Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images |
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