Summary
우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.
Abstract
Cadherins는 신생물뿐만 아니라 세포 분화의 조절에 중요한 역할을합니다. 여기에서 우리는 2개의 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 분화의 유도의 기원 그리고 방법 및 유방 선 발달 및 신생물 변환의 상호 보완적인 단계를 공부하기 위하여 그들의 사용을 기술합니다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 임신 한 Balb / c 마우스의 유선에서 유래. 태아 송아지 혈청 및 H이드로코르티손, I은린및 P롤락틴(HIP 배지)을 함유하는 배지에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 차별화된다. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 모유 단백질 β-카제인과 유청 산성 단백질(WAP)을 생산하며, 수유 유방 상피 세포와 유사하며, "돔"이라고 불리는 초보적인 유선 구조를 형성합니다.
EpH4 세포주는 임신한 Balb/c 마우스로부터 분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래되었다. HC11과 달리 EpH4 세포는 HIP 배지에서 3차원(3D) 성장 조건하에서 배양할 때 스페로이드(맘모스피어라고도 함)로 완전히 분화할 수 있습니다. 세포는 트립시네화되고, 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 구성된 20% 매트릭스에서 부유하고, 플라스틱 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트를 코팅하는 농축 매트릭스 층 위에 도금되고, 10% 매트릭스 함유 HIP 배지의 층으로 덮여 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 정점 기저 극성, 중공 루멘을 나타내는 중공 스페로이드를 형성하고 β-카제인 및 WAP를 생성합니다.
이러한 기술을 사용하여, 우리의 결과는 카데린 / Rac 신호의 강도가 HC11 세포의 분화에 중요하다는 것을 입증했다. Rac1은 분화에 필요하고 활성 RacV12의 낮은 수준은 분화를 증가시키는 반면, 높은 RacV12 레벨은 신생물을 유도하면서 분화를 차단한다. 대조적으로, EpH4 세포는 RacV12의낮은 수준에 의해 억제되는 유방 상피 분화에 있는 초기 단계를 나타냅니다.
Introduction
일반적인 조직 또는 종양에서, 세포는 3차원 조직에서 그들의 이웃에 접착을 위한 광대한 기회를 가지고 있고, 이것은 고밀도 세포 성장에 의해 배양에서 모방됩니다. 세포 대 세포 접착은 주로 세포 및 조직 구조를 정의하는 카데린 수용체를 통해 매개됩니다. 흥미롭게도, 최근에 는 카데린이 특히 생존 신호1에서신호 변환에 강력한 역할을한다는 것을 입증되었습니다. 역설적으로, 카데린으로부터 방출되는 이들 세포 간 접착 신호 중 일부는 최근 분화 및 신생물2둘 다에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 우리는 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 두 가지 대표적인 유형에서 분화의 유도 및 평가 방법을 기술한다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 상피 세포 분화의 연구에 유용한 모델을 제공할 수 있다. HC11 세포는 COMMA-1D 유래 세포주이며, 임신 중발/c 마우스3의유선에서 유래한다. 다른 COMMA-1D 유도체 클론과 달리, HC11 클론은 유생 호르몬에 의한 내인성 β-카제인 유전자의 체외 유도에 대한 다른 세포 유형과의 외인성 세포 간 매트릭스 또는 동조를 위한 요건이 없다3. 이러한 세포주는 정상 유방 상피의 중요한 특성을 유지했기 때문에 분화 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다: HC11 세포는 클리어된 유방 지방 패드4에서덕트 상피를 부분적으로 재구성할 수 있다. 더욱이, 그들은 H이드로코르티손 또는 덱사메타손과 같은 스테로이드의 존재에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 2차원(2D) 배양물에서 분화할 수 있으며, 이외에도I은술린과 P롤락틴(HIP 배지)이 결여되어 표피 성장 인자(EGF), 분화 억제제5,6,7. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 β-카제인 및 WAP와 같은 우유 단백질을 생성하며, 이는 유도 후 4일 이내에 서양 블로팅에 의해 검출됩니다. 동시에, HC11 세포의 부분은 초보적인 유방 선과 같은 구조를 형성하여 "돔"이라고 불리는 지형적 방식으로. 돔은 유도 후 4-5일 동안 볼 수 있으며 점차 적으로 크기가 10일까지 증가하고, β-카제인 생산량의 증가와 함께8. 흥미롭게도, HC11 세포는 돌연변이 p539를소유하고, 따라서 전뇌성 상태를 나타낸다. 이러한 이유로, HC11 모델은 동일한 세포 시스템에서 신생물과 함께 분화의 신호 네트워크를 연구하는 데 이상적입니다.
EPH4 세포, IM-2 세포의 유도체는, 원래 임신 중 발브/c마우스(10)로부터분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래된 비종양성 세포주이다. EpH4 세포는 2D 배양에서 연속상피 단층을 형성하지만 선형구조(10,11)로분화하지 는 않는다. 그러나, EHS 마우스 육종세포(12)에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 이루어진 물질의 3D 성장에 이어(EHS 매트릭스, 매트릭스, 또는 마트리겔, 물질표참조), HIP를 가진 자극 이외에, EpH4 세포는 유방선 분화의 초기 단계를 재차화할 수 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 심근 기저 극성과 중공 루멘을 나타내는 스페로이드 (유방 골격이라고도 함)를 형성하며, 수유 유방 상피 세포와 유사한 우유 단백질 β-카제인 및 WAP를 생성 할 수 있습니다. 미분화되는 HC11 세포와는 달리, 일부 발현 중간엽마커(13)EpH4 세포는 순수한 발광형태(14)를나타낸다. EpH4 세포는 또한 덱사메타손, 인슐린 및 프롤락틴15를통한 자극을 통해 2D 배양에서 우유 단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 접근은 3D 문화에서 유방 동맥 미세 환경을 모방하는 규정 효력의 연구 결과 배제합니다.
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Protocol
1. 도금 HC11 셀
- 멸균 기술을 사용하는 층류 후드에서 HC11 세포 배지의 50 mL로 병을 제조합니다: RPMI-1640 과 10% 태아 소 혈청 (FBS), 5 μg/mL 인슐린, 및 10 ng/mL EGF (재료 표참조).
- 접시 3 cm 페트리 접시 당 약 400,000 세포 : HC11 매체에 20 3cm 접시에 두 개의 10cm, 50 % confluent 페트리 접시를 전달합니다. 세포는 잘 퍼져 있어야하지만 건조는 피해야합니다.
- 진공 펌프를 사용하여 배지를 플라스크에 흡인합니다.
- 10cm 플레이트당 트립신 250 μL(재료 표참조)을 추가합니다. 트립신을 확산하고 부착 된 세포를 빼내기 위해 수평으로 유지하면서 접시를 양쪽에서 소용돌이치고 충돌하십시오.
- 4x 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법에서 관찰하기 위하여 세포가 파이펫팅의 앞에 가장자리에서 분리하기 시작했는지 확인합니다.
- 멸균 된 9 인치 파스퇴르 피펫에서 HC11 배지의 약 1.5 mL을 흡인하고 세포에 수직으로 분출합니다. 모든 세포를 빼내기 위해 분출하면서 페트리 접시를 돌이키십시오. 당신은 세포의 건조를 피하기 위해 빠르게 작동해야합니다.
- HC11 배지로 모든 세포를 병에 옮기고 소용돌이치세요.
- 각 3cm 페트리 접시에 셀 서스펜션의 피펫 2 mL. 페트리 접시를 교차하여 흔들어 고르게 펴발라보릅니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
- 다음날, 또는 세포가 ~90-100% 부유할 때, 배지를 흡인하고, FBS 및 인슐린으로 배지로 대체하지만 EGF가 결여된다.
2. HC11 셀의 분화 유도, 모니터링 및 정량화
- 24 시간 동안 EGF가 결여된 배지에서 세포를 성장시키고, 10 3 cm 플레이트에 분화 배지(HIP medium)를 추가합니다: RPMI-1640은 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisone(재료 표참조), 5 μg/mL Insulin 및 5 μg/mL P롤락틴(재료 표참조)으로 보충하였다.
- 다른 10개의 3cm 플레이트를 대조군으로 유지하십시오: 10% FBS와 5 μg/mL 인슐린이 결여된 배지로 변경하십시오.
- 배지를 2-3일마다 HIP 처리 된 세포와 대조군 둘 다로 변경합니다. 세포가 분리되지 않도록 조심스럽게 배지를 피펫.
- 분화를 모니터링하려면 (즉, "돔"의 형성), 위상 대조 현미경 검사법하에 세포를 관찰(그림 1A,왼쪽 패널). 세포가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 경우, 형광 현미경 검사법 (여기 = 485 /20; 방출 = 530/25; 배율 240x; 20x 목표)(그림 1A,오른쪽 패널)에서 관찰하십시오.
- 분화 정도를 양량화하기 위해, 한 페트리 접시에서 단백질을 추출하여 각각 HIP 처리 된 세포 및 대조군, 총 10 일 동안 하루에 한 번, β-카제인에 대한 웨스턴 블롯을 프로브 (재료 표참조)(그림 1B).
- 1.5 mL 얼음 차가운 인산완식염수 (PBS)로 얼음에 세포를 1.8 ml 플라스틱 원심 분리튜브로 긁어 냅니다.
- 350 x g,1 분, 4 °C에서 세포를 펠렛.
- 얼음으로 차가운 PBS로 펠릿 2x를 빠르게 씻으십시오. 잔여물을 빼내십시오.
- 라시스 버퍼 만들기: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EdTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF), 10 μg/mL 아프로틴, 10 μg/mL leupeptin16. 페트리 접시 3cm당 100 μL을 넣습니다.
- 추위에 10 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리로 용해를 명확히하십시오.
- 단백질 농도를 결정하고(재료 표참조) 각 샘플에서 10-20 μg의 단백질을 10% 폴리아크릴아미드-SDS 젤에 로드합니다.
- 45V에서 15 시간, 또는 ~ 2-2.5 h에 대한 100V에서 전기 포어.
- 전기 블로팅 전달 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인상으로 전달하십시오 (재료 표참조).
- 0.1% 트웬-20 (TBST)와 트리스 버퍼링 식염수에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 블록.
- 1차 항체를 첨가하고, 염소 항-β-카제인을 희석1:2,000 또는 마우스 항β 액틴을 1:1,000 희석하였다(재료표참조).
- TBST로 3x, 매번 5분씩 씻으소서.
- 이차 항체, 고추냉이 과산화증(HRP) 연결된 당나귀 항염소 희석 1:2,500, 또는 HRP 연계 말 항마우스 항체를 1:10,000 희석하였다.
- TBST로 3x, 매번 5분씩 씻으소서.
- 제조업체의 지침에 따라 멤브레인에 ECL 시약을 추가합니다(재료 표참조).
3. EHS 매트릭스에서 EpH4 세포의 도금 및 3D 성장
참고 : 매트릭스는 온도 및 lt;10 ° C에서 액체이며 위의 온도에서 고체입니다. -80 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전날 밤 4°C에서 해동합니다. 티슈 배양 플레이트와 파이펫 팁을 취급 하기 전에 -20 °C에서 냉각 하 고 매트릭스, 플레이트 및 파이펫 팁을 얼음에 유지 하 고 응고하지 않도록 합니다.
- 10% FBS 및 5 μg/mL 인슐린을 가진 RPMI-1640 배지에서 2D에서 EpH4 세포를 성장시다 (EGF는 필요하지 않습니다).
- 2개의 50 mL 원추형 튜브에 10%(v/v, 3,500 μL) 또는 20%(v/v 2,000 μL) 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 배지를 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
- 원액 매트릭스 150 μL24 웰 플레이트의 10 웰 (각 1cm2)을 코팅합니다. 파이펫 팁을 사용하여 매트릭스를 펼지. 거품을 만들지 마십시오. 매트릭스가 우물의 바닥에 고르게 분포되어 있는지 확인하기 위해 수평으로 유지하면서 부드럽게 플레이트의 측면을 누릅니다.
- 매트릭스가 고화될 수 있도록 1시간 동안 37°C에서 24웰 플레이트를 배양한다.
- HC11 세포에 대해 위에서 설명한 바와 같이 EpH4 세포를 트립시니화하고 혈세포계로 계산합니다. 잘 당 5 x 104 세포를 1.5 mL 멸균 원유 원심 분리튜브로 옮기고 250 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
- 조심스럽게 매체를 흡인하고 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 배지의 350 μL에서 세포를 재중단시키면서 원추형 튜브를 얼음 위에 유지하였다. 거품을 피하십시오. 단일 세포 현탁액을 보장하는 것이 중요합니다.
- 바닥 층 매트릭스가 고화되면 (매트릭스는 웰의 초기 코팅에 비해 반투명하고 밝은 색상으로 나타나야함), 각 코팅된 각 코팅에 350 μL의 셀 현탁액을 추가하고 CO2 인큐베이터에 37°C에 놓고 ~1시간 동안 20% 매트릭스 층이 고화될 수 있도록 합니다.
- 4x 목표와 위상 대조하에서 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 단일 셀이 표시되어야 합니다.
- 20% 매트릭스에서 부유한 350 μL 의 위에 10% 매트릭스를 함유하는 EpH4 배지의 200 μL을 첨가한다. 37 °C에서 배양하십시오.
4. 3D로 자란 EpH4 세포의 분화 유도(그림 2)
참고: 분화 외에도, EpH4 세포는 3D 배양에서 HGF (간세포 성장 인자)로 자극 될 때 수관 발생을 겪을 수 있습니다. 관내 외성장은 HIP 및 HGF 자극의 10일 후에 볼 수 있다.
- 매트릭스에서 도금 후 1일 EpH4 세포의 분화 유도를 시작한다. 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 우물에서 10 % 매트릭스를 포함하는 상단 매체의 150 μL을 조심스럽게 제거하십시오. HIP 및 10% 매트릭스를 함유한 EpH4 배지 200 μL을 첨가합니다.
- 최대 10일 동안 2일마다 10% 매트릭스-HIP 배지를 교체합니다. HIP 없이 동일한 10% 매트릭스 배지에서 대조군 세포를 성장시다.
- 위상 대비 하에서 유방구 형성을 모니터링합니다(그림3A,하부 패널).
5. 3D로 자란 EpH4 세포의 튜불로제네시스 유도(그림 3A 및 3C)
- 3.1-3.9단계에서 상세히 설명된 바와 같이 매트릭스에서 성장을 위해 24개의 웰 플레이트 및 EpH4 세포를 준비한다. 매트릭스에서 세포를 도금한 다음 날, 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 웰에서 10% 매트릭스를 함유하는 EpH4 배지의 150 μL을 제거한다. 10% 매트릭스, HIP 및 20 ng/mL HGF를 포함하는 EpH4 배지 200 μL을 추가합니다(재료 표참조).
- 최대 12-14일 동안 2일마다 10% 매트릭스/HIP/HGF 배지를 교체하십시오.
- 20x 또는 40x 대물렌즈(그림3A,우측 패널)를 사용하여 관 형성을 현미경으로 모니터링합니다.
6. 분화의 정량 : β 카제인을위한 웨스턴 블로팅
- 조심스럽게 우물에서 10 % 매트릭스 - HIP 매체 떨어져 파이펫. 20% 매트릭스 층을 350 μL의 얼음 차가운 PBS로 2x 헹구어 내보소서. 스페로이드는 여전히 매트릭스 층에 있어야합니다.
- 700-1,000 μL의 얼음 차가운 PBS를 1 mM에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 우물에 직접 넣습니다. 파이펫 팁으로 우물에서 100% 매트릭스의 바닥 층을 부드럽게 분리하여 해당 층에 존재하는 스페로이드를 회수합니다. 4°C에서 30분간 부드럽게 흔들어 주세요.
- 조심스럽게 원유관에 스페로이드 현탁액을 옮김을 옮김을 옮김. PBS-EDTA의 ~ 500 μL로 우물을 헹구어 우물에 남아있는 스페로이드를 회수하고 원유 관에 추가하십시오.
- 추가로 30 분 동안 얼음에 바위. 매트릭스가 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 보이는 매트릭스 덩어리가 보이면 PBS-EDTA를 더 추가하거나 더 오래 흔들어 주세요.
- 5 분 동안 350 x g에서 스페로이드를 펠렛하는 용액을 원심 분리기.
- 상월체를 흡인하고, 얼음-차가운 용해 완충액에서 스페로이드를 용해시키고, β-카제인, 사이클린 D1 및 p120RasGAP에 대한 프로브는16단계의 2.5단계에서와 같이 서양 블로팅에 의해. 1차 항체로서, 염소 항-β-카제인을 1:2,000, 토끼 항사이클린 D1희석 1:2,000, 마우스 항-p120 희석 1:2,000을 사용한다. 이차 항체의 경우, HRP 연동 당나귀 항염소 희석 1:2,500, HRP 링크 당나귀 안티 토끼 희석 1:2,500, HRP 링크 말 항 마우스 희석 1:10,000을 사용합니다.
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Representative Results
상피 세포와 지방세포의 분화가 카데린2의합류와 결합을 필요로 한다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 당사와 다른 사람들은 세포 간 부착 및 E-또는 N-카데린 및 카데린-11의 결합을 입증했습니다. 배양 된 세포의 합류와 함께 발생, 작은 GTPases Rac 및 세포 분열 제어 단백질 (Cdc42)의 활성의 극적인 증가를 트리거,이 과정은 인터류킨 -6 (IL6) 가족 사이토 카인 및 Stat3의 활성화로 이어진다 (전사-3의 신호 트랜스듀서 및 활성제16,17)18, 18. 18. 18. cadherin/Rac/IL6/Stat3 통로의 많은 분대가 분화 및 신생물 변환에 모두 참여할 수 있기 때문에, 그들은 이 두 정반대 프로세스의 상호 관련성에 대한 연구를 위한 분자 핸들을 제공합니다.
전술한 기술을 사용하여, 우리는 HC11 세포에서 Rac 신호의 강도에 대한 분화의 현저한 의존성을 입증하였다: 내인성 cRac1은 분화에 필요하지만, 낮은 수준에서 돌연변이 활성Rac V12는 분화 능력의 뚜렷한 증가를 야기하고, 높은 RacV12 수준은 신형성을 유도하면서 분화의 극적인 블록을 유발한다(그림1). 대조적으로, RacV12 발현의 낮은 수준조차도 EpH4 세포2에서분화를 차단하였다. 더욱이, RacV12는 HC1116을포함한 많은 세포 시스템에서 Stat3을 활성화하지만, 돌연변이 활성화 Stat3C는 신생물변환(20)을유도하면서 분화를 차단하였다.
우리는 3D 매트릭스 배양에서 EpH4 세포의 분화 특성을 더 탐구했습니다. β-카제인 생산이 8-10일 에서 정점에 도달한 반면, 사이클린 D-1 발현은 HIP 자극 후 4-6일 에서 최대화되었다(도3B). 이러한 발견은 EpH4 모델에서 증식과 분화 사이의 역관계를 지원합니다. DAPI (핵) 염색 및 공초점 현미경을 사용하여 개별 상피 세포의 위치를 결정, 우리는 내부 세포 사멸과 유방 구체에서 중공 루멘의 형성을 관찰(그림 3A,C). 우리는 또한 HIP 배지에 48 h에서 HGF (20 ng/mL)를 첨가하여 관형 구조의 형성을 초래하였다(그림 3A,C),이전 전자 현미경 연구21과일치. EpH4 모델을 사용하는 이러한 접근법은 유방 상피 분화의 특정 특징의 특성화와 뚜렷한 신호 트랜스덕션 경로와의 연관성을 허용합니다.
그림 1: HC11 세포 분화의 평가 및 정량화. (A)HC11 세포에서 형성된 돔은 분화 유도 후 10일 에서 GFP-RacV12의 낮은 수준을 발현한다. 왼쪽: 위상 대비; 오른쪽: 동일한 필드의 형광(이전에 게시되지 않은 사진). 스케일 바 = 100 μm; 배율 = 240x; 20배 목표. (B)HC11 분화 시 RacV12의 효과: 낮은(차선 19-24), 중간(레인 13-18), 또는 RacV12-GFP융합 컨퓨전 컨퓨전 컨퓨션 컨퓨전 구도의 높은(차선 7-12) 수준이 HC11 세포에서 발현되었다. 24시간 동안 EGF가 없는 상태에서 성장한 후, 지시된 바와 같이, 세포가 HIP 첨가또는 하지로 분화하도록 유도되었다. 세제 추출물을 지시된 일 수로 제조하고 로딩 대조군으로서 β-카제인 또는 β-액틴을 조사하였다. 낮은 RacV12-GFP발현 세포에서 β-카제인의 극적인 증가(레인 21-24 대 3-6), 높은 RacV12-GFP(레인9-12)의 발현시 극적인 감소에 주목한다. NE = 제어 배양물, EGF의 부재에서 성장하지만, 분화하도록 유도되지 않는다(Niit et al.2,허가를 따라서 재생). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 3D 매트릭스 배양에서 EpH4 세포를 성장시키는 오버레이 방법의 개략적. (A)6웰 플레이트의 웰을 처음에는 100% EHS 매트릭스로 코팅하였고, 37°C에서 고화되도록 허용하였으며 두께가 약 2-5 mm인 지하 막의 겔화 베드를 형성하였다. EpH4 세포를 20% 매트릭스를 가진 HIP 배지에서 단일 세포 현탁액으로서 이 침대에 시드하였다. 이것은 HIP 배지에서 10% 매트릭스로 오버레이되었다. 10% 매트릭스 배지는 격일로 교체되었다. 세포는 배양에서 4-5 일 후에 유방구를 형성하기 시작했습니다 (프로토콜 섹션 참조). (b)2D(단층) 및 3D(mammosphere) 배양으로 EpH4 세포의 위상 대비 이미지를 디지털 카메라(300x 배율)가 장착된 현미경을 사용하여 촬영하였다. 각 단계의 대표 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 3D 배양에서 EpH4의 3D 아시나르 형태 형성의 이벤트. (a)EpH4 세포는 도 2에서와같이 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에서 성장하였고 완전한 3D 배지에서 유지되었다. 형태 형성의 초기 단계에서, 세포는 증식, 형성 클러스터, 두 그룹으로 구성: (1) 편광 세포의 외부 층과 (2) 세포 사멸을 겪은 무질서한 세포의 내부 클러스터, 이전에 도시 된 바와 같이 세포 사멸에 대응12. 후자는 위상 대조 현미경 검사법에 의해 보인 것처럼 유방구의 중심의 어둡게 하는 특징을 특징으로 하는 중공 루멘의 형성으로 이끌어 냈습니다. 배지에 HGF(20 ng/mL)를 첨가하여 관형 구조의 형성을 초래하였다. HGF-유도 응집체의 60% 이상이 치료되지 않은 대조군 응집체에 비해 수관발생을 보였으며, 이는 그렇지 않았다. 각 단계에서 세포의 대표적인 위상 대비 사진은 디지털 카메라(300x 배율)가 장착된 현미경을 사용하여 촬영하였다. 축척 막대 = 100 μm). 결과는 적어도 3개의 실험을 대표한다. 회로도는 스타로바 외22에서적응되었다. (B)3D로 성장한 EpH4 세포를 지시된 날에 수확하였다. 단백질 농도를 정규화하고 동일한 단백질 양(20 μg)을 SDS-PAGE를 실시하였고, 이어서 지시된 항체를 사용하여 서양 블로팅 및 프로빙을 실시하였다. 수유 마우스(MGT)로부터 균질화된 유선을 생체 내 비교로 사용하였다. p120RasGAP은 독립적인 로딩 제어로 사용되었습니다. 사이클린 D1 발현은 처음 3-4일 동안 증식 세포와 일시적으로 일치하여 증가하였다. 대조적으로, β-카제인 발현은 성숙한 유방구의 형성에 상응하는 8-10일에 정점에 달했다. 결과는 두 가지 실험을 대표합니다. (C)매머스피어의 루멘 형성 및 관형성은 매트릭스 코팅 유리 커버슬립에서 자란 응집체에서 핵 DNA(형광청색)의 DAPI 염색을 사용하여 확인하였다. 세포는 3% 파라포름알데히드에 고정되었고, 25 μg/mL 디지도닌으로 투과화되었고, 비특이적 결합은 3% BSA로 차단하였다. 세포는 DAPI (파란색)로 핵 DNA를 염색하였다. 커버슬립을 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착하였다. 광현미경을 다광자 공초점 현미경을 사용하여 중앙 XY축 평면을 촬영하였다(스케일 바 = 100μm). 패널 B와 C의 이미지는 Starova 외22에서적응됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
HC11 세포는 신생물 형형과 함께 분화 연구에 이상적입니다. 추가적인 이점은 HC11 세포가 다양한 유전자를 발현하기 위해 Mo-MLV 기반 레트로바이러스 벡터로 쉽게 감염될 수 있다는 것입니다. 우리의 손에, EpH4 세포는 HC112보다는 동일 retroviral 벡터로 감염하는 것을 더 어려웠습니다.
세포 대 세포 접촉 및 성장 체포는 HC11 세포 분화를 위한 중요한 전제 조건입니다. 따라서, 세포층을 통해 균일한 분화를 달성하기 위해서는, 파종시에 페트리 접시 내의 세포의 균일한 분포를 달성하는 것이 중요하다. 이는 분화의 정량이 필요한 경우에 특히 중요합니다. 트립시니화는 단일 세포 현탁액이 달성되고 세포가 조작으로 인해 생존력을 잃지 않도록 최적화되어야 합니다.
트립시니화되는 세포는 높은 밀도로 성장한 세포가 서로 강하게 부착되는 경향이 있기 때문에 하위 (50-70%)이어야하며, 이를 분리하는 것은 어렵습니다. 세포를 건조하지 않으려면, 층류 후드의 바닥에 평평한 페트리 접시와 흡인, 다음 신속하게 배수 기울어. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다. 필요한 경우, 37°C 인큐베이터에 페트리 접시를 배치하여 트립신의 작용을 가속화할 수 있다.
세포는 유도 다음 10 일 동안 매우 풍부하기 때문에 고갈 된 영양소를 대체하는 것이 중요합니다. 배지가 변경될 때, 높은 세포 밀도 때문에 플라스틱에 아주 잘 착착하지 않을 수 있는 세포의 분리를 피하기 위하여 주의를 기울여야 합니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 경험에서 3T3L123 또는 Balb/c3T3 유도체와 같은 차별화 된 preadipocytes와는 달리 좋은 분화 결과를 얻기 위해 섬유넥틴, 콜라겐 또는 CellTak으로 코팅 된 페트리 접시를 사용할 필요가 없습니다.
블로팅 실험에 대한 정확한 단백질 측정은 매우 중요합니다. 혈청 단백질은 조직 배양 등급 플라스틱에 부착되는 경향이 있기 때문에, 단백질을 유치하지 않는 1.5 mL 플라스틱 튜브에서 세포를 긁어 내고 세척하는 것이 중요하며, 페트리접시(24)에직접 세포를 포라이싱하는 대신 세포 펠릿에 포해 완충제를 추가하는 것이 중요하다.
단백질 추출과 관련하여 모든 세척 및 용해 용액을 얼음으로 차갑게 유지하고 페트리 접시 또는 EpH4 맘모스피어를 얼음 위에 보관하는 것이 매우 중요합니다. 이는 PBS에서 칼슘이 없는 상태에서 카데린이 관여하지 않고 그 결과 Stat3-ptyr705가 급속히 탈인되기 때문이다25.
HC11 세포에 대해 설명된 페트리 접시의 크기는 3-4 개의 웨스턴 블롯에 충분합니다 (즉, 페트리 접시 당 회수된 단백질의 양은 3cm 접시 당 약 50 μg입니다). 우리는 단백질 추출을 용이하게하기 위해 분화 실험에 3cm 페트리 접시를 사용하는 것을 선호합니다. 6 개의 우물 트레이를 대신 사용하면 나머지 우물을 멸균 상태로 유지하면서 추위에 잘 단백질을 추출하기가 어렵습니다. 게다가,CO2 농도는 분화에 중요하고 단백질이 벤치에서 잘 추출되기 때문에 우물의 나머지 부분에 대해 그것을 유지하기가 어렵습니다.
우리의 경험에서, preadipocytes의 분화와는 달리23,태아 송아지 혈청의 몇몇 제비는 HC11 또는 EpH4 세포의 분화 뿐만 아니라 성장을 지원할 수 있습니다. 테스트 된 신생아 송아지 혈청 의 한 많은 분화를 지원하지 않았다, 그것은 정상적인 성장을 지원할 수 있지만: 세포는 처음에 분화 하는 것처럼 보였지만 신생아 송아지 혈청에 세 구절 후 분화 하는 능력을 잃었다.
HC11 셀과 는 달리 EpH4 세포의 분화는 주변 3D 매트릭스 아키텍처와 밀접하게 연결됩니다. β-카제인 생성의 분석을 위한 이전 연구26,27,28 및 후속 단백질 추출으로부터 변형된 3D 배양에서 EpH4 분화에 필요한 단계를 설명한다. EHS 매트릭스는 저온(&10°C)에서 액체이며 더 높은 온도에서 고화됩니다. 일반적으로 -80 °C에서 저장되지만 작업 aliquots는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다. 사용 전날 밤 4°C에서 매트릭스를 해동하고 취급 하기 전에 -20°C에서 조직 배양 플레이트 및 파이펫 팁을 미리 냉각시. 단백질 농도의 정확한 평가를 위해 매트릭스가 단백질이 풍부하기 때문에 차가운 PBS 세척으로 추출하기 전에 매트릭스를 완전히 제거하는 것이 중요하며, 이는 단백질 측정 결과를 혼동시킬 수 있다.
분화를 위한 매트릭스에 대한 EpH4 의존성은 여러 실험 모델에서 입증되었다: Reichman등. 10은 래민 증착 및 강화된 시토케라틴 발현 영역 내에서 β-카제인을 생성한 락토겐 호르몬에 의해 유도된 EpH4 세포가 있음을 보여주었다. Somasiri 외11은 PI3-키나아제가 접합부 의존성 스페로이드 형성 및 분화우유 단백질 유전자 발현을 부착하기 위해 필요하다는 것을 입증하였다. 더욱이, Brinkmann 외21은 EpH4 세포에서 형질감염된 HGF cDNA의 발현이 3D 배양 모델에서 스페로이드의 분지 배분 배양을 유도한다는 것을 입증하였습니다, 여기서 본 관찰된 HGF 유도 tubule 형성과 유사합니다(도3A,C). 이 사실 인정은 유방 선 분화를 통제하는 신호 사건을 공부를 위한 EpH4 세포주 모형의 이점을 보여줍니다.
EpH4 세포는 또한 설명된 10% 보다 낮은 태아 송아지 혈청의 농도에서 도금될 때 유방구를 형성할 수 있다. 흥미롭게도, 그들은 100 % 매트릭스22,27의층 위에 도금 될 때 낮은 농도에서 또는 20 % 또는 10 % 매트릭스가없는 경우에도 매머스피어를 형성 할 수 있습니다. 셀 현탁액에 매트릭스가 없는 경우 세포를 냉각하는 것을 피할 수 있습니다. 추가 장점은 모든 세포가 단일 평면에서 발견되므로 촬영하기가 더 쉽다는 것입니다.
중요성: 생체 내 세포의 생리적 상태를 근사화하는 배양 된 세포에서 카데린 의 참여는 Rac / IL6 / Stat3 경로를 활성화 할 수 있습니다. 이것은 상피 세포 분화에서 특히 중요할 지도 모릅니다. 설명된 기술을 사용하여, 우리의 결과는 세포 증식 대 분화 사이의 균형에서 중심 결정자로서 이 통로로부터 방출되는 신호의 강도를 노출, 두 가지 근본적으로 반대되는 과정2. E-cadherin/Rac/Stat3 축의 심층 조사는 암 치료를 위한 표적으로 이용될 수 있는 표현의 수준에 따라서 통로의 새로운 양서류 분대를 밝힐 수 있습니다. 이러한 표적의 경우, 신생물 표현형을 되돌리기 위해 완전한 억제가 필요하지 않을 것이다. 부분적인 억제는 잔류량이 실제로 변형을 막고 분화를 촉진할 수 있기 때문에 유익할 것입니다. 이는 HC11 대 EpH4 세포2,20에서RacV12 대 Stat3C의 상이한 거동으로부터 도시된 바와 같이, 문제의 종양의 표적뿐만 아니라 종양의 종류와 함께 달라질 수 있다.
향후 응용 프로그램: 카데린/Rac/IL6/Stat3 통로는 인간 유방 MCF10A 또는 개 신장 MDCK29 세포주와 같은 다른 상피 세포의 분화뿐만 아니라 다른 유형의 종착역을 표현하는 패디포시테 및 근종30종과같은 세포 합류에 의존하는 다른 유형의 분화에 유사한 역할을 할 수 있다. 마지막으로, 이 기술은 Stat531의 역할과 차별화된 경로의 다른 구성 요소의 검사를 위해 이용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
HC11 세포주들은 D. 메디나 박사(휴스턴, 텍사스 주)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 저자는 많은 시약과 가치있는 제안에 대한 퀸즈 대학의 박사 앤드류 크레이그에 감사드립니다. EpH4 세포는 C. Roskelley 박사 (UBC, 밴쿠버)의 선물이었습니다. Colleen Schick은 3D 문화 연구를 위한 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR), 캐나다 유방암 재단 (CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 유방암 연구 연합의 재정 지원 , 우수의 온타리오 센터, 유방암 액션 킹스턴 (BCAK) 및 LR에 보조금을 통해 클레어 넬슨 유증 기금은 감사하게 인정된다. CIHR, CBCF, BCAK 및 암 연구 학회 Inc.의 보조금 지원을 받은 PTG는 캐나다 연구 위원장, 캐나다 혁신 재단, CIHR, NSERC 및 캐나다 암 학회가 후원합니다. MN은 NCIC에서 학제 암 연구에서 테리 폭스 교육 프로그램에서 학생, 대학원 상 (QGA), 그리고 여왕의 대학에서 학장상에 의해 지원되었다. MG는 미국 육군 유방암 프로그램, 온타리오 주 연구 혁신부 및 퀸즈 대학의 자문 연구위원회에서 박사 후 펠로우십을 지원받았습니다. VH는 CIHR과 협력하여 테리 폭스 재단 교육 프로그램에서 CBCF 박사 펠로우십과 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 하나드 아단은 NSERC 여름 학생의 수혜자였다. BS는 퀸즈 대학 대학원 상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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