Summary
我们描述了两个乳房上皮线HC11和EpH4的分化诱导技术。虽然两者都需要胎儿小牛血清、胰岛素和乳素来产生牛奶蛋白，但EpH4细胞可以在三维培养中完全分化成乳腺球。这些互补模型对于分化和肿瘤的信号转导研究非常有用。
Abstract
卡塞林在细胞分化和肿瘤的调节中起着重要的作用。在这里，我们描述了两个小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的诱导诱导的起源和方法，以及它们用于研究乳腺发育和肿瘤转化的互补阶段。
HC11小鼠乳腺上皮细胞系源自怀孕的Balb/c小鼠的乳腺。当生长到附着在含有胎儿小牛血清和Hydrocortisone、I nsulin和Prolactin（HIP介质）的介质中附着在塑料培养皿表面时，它与众不同。 在这些条件下，HC11细胞产生乳蛋白β-酪蛋白和乳清酸性蛋白（WAP），类似于哺乳期乳腺上皮细胞，并形成称为"圆顶"的基本乳腺状结构。
EpH4细胞系来自从怀孕的Balb/c小鼠分离出来的自发不朽的小鼠乳腺上皮细胞。与HC11不同，EPH4细胞在HIP培养基的三维（3D）生长条件下培养时，可以完全分化成球体（也称为乳腺球体）。细胞被试模，悬浮在20%的基质中，由恩格尔布雷斯-霍尔姆-斯沃姆（EHS）小鼠肉瘤细胞产生的细胞外基质蛋白混合物组成，镀在一层浓缩基质层之上，涂有塑料培养皿或多孔板，并覆盖一层含有10%基质的HIP培养基。在这些条件下，EpH4细胞形成中空球体，表现出表基极性、空心流明，并产生β-酪蛋白和WAP。
利用这些技术，我们的结果表明，球红/Rac信号的强度对HC11细胞的分化至关重要。虽然 Rac1 是分化所必需的，低水平的激活 RacV12可增加分化，但高 RacV12水平会阻碍分化，同时诱发新奇。相反，EpH4细胞代表了乳腺上皮分化的早期阶段，即使低水平的RacV12也会抑制这种分化。
Introduction
在正常组织或肿瘤中，细胞在三维组织中具有大量粘附到邻居的机会，这在培养中被高密度细胞生长所模仿。细胞对细胞粘附主要通过细胞素受体进行介导，后者定义了细胞和组织结构。有趣的是，最近证明，球童在信号转导中也起着强大的作用，特别是在生存信号1中。矛盾的是，最近发现，分化和新发育不良2的细胞对细胞粘附信号中，有一些来自细胞对细胞的粘附信号。在这里，我们描述了两种具有代表性的小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的诱导和评估方法。
HC11小鼠乳腺上皮细胞系可为研究上皮细胞分化提供有用的模型。HC11细胞是一种COMMA-1D衍生的细胞系，起源于中孕巴尔布/c小鼠3的乳腺。与其他COMMA-1D衍生克隆相比，HC11克隆不需要外生添加细胞外基质或与其他细胞类型共增，以便通过乳原激素3体外诱导内源β-酪蛋白基因。这种细胞系在分化研究中被广泛使用，因为它保留了正常乳腺上皮的重要特征：HC11细胞可以在清除的乳腺脂肪垫4中部分重组导管上皮。此外，他们可以区分在二维（2D）培养，当成长为汇合附附在塑料培养皿表面，在类固醇的存在，如Hydrocortisone或德塞马塞松，除了Insulin和Prolactin（HIP介质）缺乏表皮生长因子（EGF），分化5，6，7的抑制剂。在这些条件下，HC11细胞产生β-酪蛋白和WAP等牛奶蛋白，在诱导后4天内通过西方印迹检测。同时，HC11细胞的一部分以随机方式形成基本乳腺状结构，称为"圆顶"。诱导后4~5天可见Domes，并在第10天逐渐增大，同时增加β-酪蛋白产量8。有趣的是，HC11细胞具有突变的p539，因此代表一种前塑性状态。因此，HC11 模型非常适合研究同一细胞系统中的异化信号网络与肿瘤。
EpH4细胞是IM-2细胞的衍生物，是一种非肿瘤细胞系，最初来自自发的细胞乳腺上皮细胞，从中孕的Balb/c小鼠10中分离出来。EpH4细胞在2D培养中形成连续的上皮单层，但不分化成腺状结构10，11。然而，在由EHS小鼠肉瘤细胞12（EHS基质、基质或Matrigel，见材料表）产生的细胞外基质蛋白混合物组成的材料中，经过3D生长后，EpH4细胞还可以重述乳腺分化的初始阶段。在这些条件下，EpH4细胞形成球体（也称为乳腺球体），表现出表基极性和空心流明，能够产生乳蛋白β-酪蛋白和WAP，类似于哺乳期乳腺上皮细胞。与HC11细胞相反，它们未分化，有些表达间质标记13，EpH4细胞表现出纯发光形态14。EpH4细胞也报告通过用地塞米松、胰岛素和泌乳素15的刺激在二维培养中产生牛奶蛋白。然而，这种方法排除了对模仿3D培养中乳腺微环境的调节效应的研究。
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Protocol
1. 电镀 HC11 电池
- 在使用无菌技术的层流罩中，制备一个装有50 mL HC11细胞培养基的瓶子：RPMI-1640，带10%胎儿牛血清（FBS）、5微克/mL胰岛素和10纳克/mL EGF（见材料表）。
- 每3厘米培养皿约400，000个细胞：通过两个10厘米，50%的康料培养皿进入203厘米的菜肴在HC11中等。细胞必须很好地分散，但必须避免干燥。
- 使用真空泵将介质吸入烧瓶。
- 每10厘米板加入250μL的胰蛋白酶（见材料表）。旋转并从侧面击中板，同时保持其水平，以传播胰蛋白酶和驱逐附加的细胞
- 使用 4 倍物镜观察相下对比显微镜，以确保细胞在移液前已开始从边缘分离。
- 在无菌的9英寸巴斯德移液器中吸气约1.5 mL的HC11介质，并垂直喷向细胞。旋转培养皿，同时喷出以清除所有细胞。你必须快速工作，以避免细胞干燥。
- 使用 HC11 介质和涡流将所有细胞转移到瓶子上。
- 移液器 2 mL 的细胞悬浮液在每个 3 厘米培养皿。将培养皿横向摇动，均匀分布。将细胞放入37°C，5%CO2培养箱。
- 第二天，或当细胞是+90~100%汇入，吸气培养基，并替换为介质与FBS和胰岛素，但缺乏EGF。
2. HC11细胞的分化诱导、监测和定量
- 在缺乏EGF的介质中生长24小时后，将分化介质（HIP介质）加入至10个3厘米板：RPMI-1640，辅以10%FBS、1μg/mL Hydrocortisone（见材料表）、5微克/mL Insulin和5μg/mL乳酸（见材料表）长达10天。
- 保持其他10个3厘米板作为对照：更改为10%FBS和5μg/mL胰岛素缺乏EGF和HIP的介质。
- 每 2⁄3 天将培养基更改为 HIP 处理的细胞和对照组。仔细移移介质，确保细胞不会分离。
- 为了监测分化（即"圆顶"的形成），观察相对比显微镜下的细胞（图1A，左侧面板）。如果细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），在荧光显微镜下观察（激励=485/20;发射=530/25;放大倍率240倍;20倍物位）（图1A，右侧面板）。
- 为了量化分化程度，从一个培养皿中抽取蛋白质，每个培养皿经过HIP处理的细胞和控制，每天一次，共10天，并探查西方的血红蛋白β-酪蛋白（见材料表）（图1B）。
- 用1.5毫升冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）将冰上细胞刮入1.8ml塑料离心管中。
- 在350 x g，1分钟，4°C下粒细胞。
- 用冰冷的PBS快速清洗颗粒2倍。排空所有残留物。
- 制作一个莱沙缓冲液：50 mM HEPES （pH = 7.4），150 mM NaCl， 10 mM EDTA， 10 mM Na4P2O7，1% NP-40， 100 mM NaF， 2 mM Na3VO4， 0.5m 苯基甲基硫酸盐 （PMSF）， 10 μg/mL 丙氨酸， 10 μg/mL 白蛋白16.每3厘米培养皿加入100 μL。
- 在寒冷中，在10，000 x g处通过离心来澄清分麦10分钟。
- 确定蛋白质浓度（见材料表），并将每个样品中的10-20μg蛋白质加载到10%的聚丙烯酰胺-SDS凝胶中。
- 电噬液在 45 V 时为 15 小时，在 100 V 时为 ±2~2.5 小时。
- 使用电镀转移装置转移到硝基纤维素或PVDF膜上（见材料表）。
- 在Tris缓冲盐水中含有5%牛血清白蛋白（BSA）的块状，含有0.1%补间-20（TBST）。
- 加入原抗体，山羊抗β-酪蛋白稀释1：2，000或小鼠抗β蛋白稀释1：1，000（见材料表）。
- 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
- 加入二级抗体，马萝卜过氧化物酶（HRP）链接驴抗山羊稀释1：2，500，或HRP链接马抗鼠抗体稀释1：10，000。
- 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
- 根据制造商的说明将 ECL 试剂添加到膜中（参见材料表）。
3. EHS矩阵中EpH4细胞的电镀和3D生长
注： 基质在温度 <10 °C 时为液体，在高于温度时为固体。储存在-80°C。使用前一天晚上在4°C下解冻。在操作前，在 -20°C 处将组织培养板和移液器吸头预冷，并将基质、板和移液器吸头保持在冰上，以防止其凝固。
- 在 RPMI-1640 培养基中2D细胞中生长EpH4细胞，使用10%FBS和5μg/mL胰岛素（不需要EGF）。
- 在两个 50 mL 锥形管中制备 EpH4 生长介质，辅以 10%（v/v、3，500 μL）或 20%（v/v 2，000 μL）基质。保持冰上，直到准备使用。
- 用 150 μL 未稀释的基质在 24 孔板上涂上 10 口孔（每口 1 厘米2）。使用移液器尖端铺开矩阵。避免产生气泡。轻轻敲击板的两侧，同时水平握住，以确保基质均匀地分布在井底。
- 在 37°C 孵育 24 孔板 1 小时，使基质凝固。
- 按上述所述对HC11细胞进行胰蛋白化，用血细胞计计数。将每孔5 x 104个细胞转移到1.5 mL无菌锥形离心管中，以250 x g旋转5分钟。
- 小心地吸进介质，并将管子放在冰上。
- 在 EpH4 生长培养基的 350 μL 中重新悬浮细胞，使用 1 mL 移液器尖端辅以 20% 基质，同时保持锥形管在冰上。避免气泡。确保单个细胞悬浮液非常重要。
- 一旦底层基质凝固（与油井的初始涂层相比，基质应呈半透明和较浅的颜色），将350μL的细胞悬浮液添加到每个涂布孔中，并在37°C的CO2培养箱中放置±1小时，使20%的基质层凝固。
- 用4倍物镜在相对比下微观观察细胞。单个单元格应可见。
- 在悬浮在20%基质中的350μL细胞顶部加入含有10%基质的EpH4培养基的200μL。在37°C孵育。
4. 3D生长的EpH4细胞的分化诱导（图2）
注：除了分化，EpH4细胞在3D培养中受HGF（肝细胞生长因子）刺激时，还可以进行输卵管生成。在10天的HIP和HGF刺激后，可以看到管状生长。
- 在基质电镀1天后开始分化诱导EpH4细胞。使用塑料移液器尖端小心地从井中取出含有 10% 基质的 150 μL 顶部介质。加入含有HIP和10%基质的EPH4介质200μL。
- 每 2 天更换 10% 矩阵-HIP 介质，最多 10 天。在没有 HIP 的情况下，在同一 10% 矩阵培养基中生长控制细胞。
- 监测相对比度下的乳腺圈形成（图3A，下面板）。
5. 在3D中生长的EpH4细胞的结管诱导（图3A和3C）
- 准备24个孔板和EpH4细胞，用于基质生长，步骤3.1~3.9中详细。在基质中电镀细胞的第二天，使用塑料移液器尖端从井中取出含有10%基质的EpH4介质的150μL。添加含有 10% 基质、HIP 和 20 纳克/mL HGF 的 EpH4 介质 200 μL（参见材料表）。
- 每 2 天更换 10% 矩阵/HIP/HGF 介质，最多 12-14 天。
- 使用20x或40x物镜（图3A，右侧面板）微观监测小管的形成。
6. 差别化的量化：β-酪蛋白的西方印迹
- 小心地从井中移掉 10% 的矩阵-HIP 介质。用 350 μL 的冷型 PBS 冲洗 20% 矩阵层 2x。球体应仍存在于矩阵层中。
- 将700~1，000 μL的冰冷的PBS与1mM乙烯二甲酸（EDTA）直接加入井中。用移液器尖端轻轻地从井中分离出 100% 基质的底层，以恢复该层中的球形。在 4°C 下轻轻摇动 30 分钟。
- 小心地将球形悬浮液转移到锥形管中。用 +500 μL 的 PBS-EDTA 冲洗孔，以回收井中剩余的球形，并添加到锥形管中。
- 在冰上再摇滚30分钟，确保基质已经完全溶解。如果看到可见的矩阵块，则添加更多 PBS-EDTA 或摇动更长时间。
- 将溶液离心，以350 x g颗粒球体5分钟。
- 吸气上清液，在冰冷的裂变缓冲液中裂变球体，并探针β-酪蛋白，环素D1，p120RasGAP由西方印迹，如步骤2.5以上16。作为原抗体，使用山羊抗β-酪蛋白稀释1：2，000，兔抗环素D1稀释1：2，000，小鼠抗p120稀释1：2，000。对于二次抗体，使用HRP链接驴抗山羊稀释1：2，500，HRP链接驴抗兔稀释1：2，500，和HRP链接马抗鼠稀释1：10，000。
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Representative Results
人们早就知道，上皮细胞和脂肪细胞的分化需要汇合和结合的球形细胞2。我们和其他人证明，细胞对细胞粘附和参与的E-或N-卡塞林和卡塞林-11， 与培养细胞的汇合一样，触发小GTPases Rac和细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）的活性急剧增加，这一过程导致白细胞介素+6（IL6）家族细胞因子和Stat3（信号传感器和转录激活器）1，18，19的激活。由于 cadherin/Rac/IL6/Stat3 通路的许多成分可以同时参与分化和肿瘤转化，因此它们为研究这两个截然相反的过程的相互关联性提供了分子处理。
使用上述技术，我们证明了对HC11细胞中Rac信号强度的差别化的显著依赖性：虽然分化需要内源性cRac1，而在低水平突变激活的RacV12会导致分化能力明显增加，而高RacV12水平在诱发新发性时触发了戏剧性的分化块（图1B）。相比之下，即使是低水平的RacV12表达也阻止了EpH4细胞2的分化。此外，即使RacV12在许多细胞系统中激活Stat3，包括HC1116，突变激活的Stat3C阻止分化，同时诱导肿瘤转化20。
我们进一步探讨了EpH4细胞在3D矩阵培养中的分化特性。β-酪蛋白的产生在8~10天达到峰值，而环素D-1表达在HIP刺激后4~6天最大（图3B）。这些发现支持了EpH4模型中增殖和分化之间的反比关系。利用DAPI（核）染色和共聚焦显微镜来确定单个上皮细胞的定位，我们观察到了内细胞死亡和乳腺球中空心流明的形成（图3A，C）。我们进一步表明，在48小时时在HIP介质中加入HGF（20纳克/mL）导致形成管状结构（图3A，C），与早期的电子显微镜研究21一致。这些方法使用EpH4模型允许描述乳腺上皮分化的特定特征及其与不同信号转导途径的联系。
图1：HC11细胞分化的评估和定量。（A） 在诱导分化后10天内，在HC11细胞中形成一个圆顶，表达低水平的GFP-RacV12。左图：相位对比;右图：同一场的荧光（之前未发布的照片）。刻度条 = 100 μm;放大率 = 240 倍;20 倍目标。（B） RacV12对 HC11 分化的影响：在 HC11 细胞中表示低（通道 19-24）、中间（通道 13-18）或高（通道 7-12）水平的 RacV12-GFP 融合结构。在24小时没有EGF的情况下生长后，细胞被诱导与HIP添加进行分化，或者不如所示。洗涤剂提取物在显示的天数后制备，并探测β-酪蛋白或β-actin作为载荷控制。请注意，低 RacV12-GFP表达细胞中的 β-酪蛋白显著增加（通道 21-24 vs. 3⁄6），以及高 RacV12-GFP（通道 9+12）表达时显著减少。NE = 控制培养物，在没有EGF的情况下生长，但不诱导分化（Niit等人2，经许可转载）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在3D矩阵培养中生长EpH4细胞的叠加方法原理图。（A） 6井板的井最初涂有100%EHS基质，允许在37°C下凝固，形成厚度约2~5毫米的基底膜凝胶床。EpH4细胞被播种到这个床上，作为一个单细胞悬浮在HIP培养基具有20%基质。这在 HIP 介质中与 10% 矩阵叠加。每隔一天更换一次 10% 矩阵介质。细胞在培养4~5天后增殖并开始形成乳腺球体（见协议部分）。（B） 使用配备数码相机的显微镜（300倍放大倍数）捕获2D（单层）和3D（乳腺球）培养的EpH4细胞相对比图像。显示每个阶段的代表性图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：EpH4在3D文化中的3D变异形态发生。（A） EpH4细胞生长在基质涂层的6孔板中，并维持在完整的三维介质中，如图2所示。在形态形成的早期阶段，细胞增殖，形成簇，并组织成两组：（1）极化细胞的外层和（2）细胞死亡的无序细胞内部簇，对应于细胞凋亡，如前12所示。后者导致形成空心流明，其特征是相对比显微镜看到的乳腺球中心变暗。在介质中加入HGF（20纳克/mL）导致形成管状结构。超过60%的HGF诱导的聚集体表现出结管发生，而未经处理的控制聚集体则没有。使用配备数码相机的显微镜（300倍放大倍数）拍摄了每个阶段细胞的代表性相间对比照片;刻度条 = 100 μm）。结果至少代表三个实验。《图解》改编自斯塔罗娃等人22日。（B） 在3D中生长的EpH4细胞在指定日期被收获。蛋白质浓度被标准化，相等的蛋白质量（20μg）受到SDS-PAGE的影响，然后进行西方印迹和与指示抗体的探测。乳化小鼠（MGT）的均质乳腺用作体内比较。p120RasGAP 用作独立的装载控制。Cyclin D1表达在前3~4天中与增殖细胞短暂发生时间性增加。相比之下，β-酪蛋白表达在8~10天达到峰值，与成熟乳腺球的形成相对应。结果代表了两个实验。（C） 使用 DAPI 染色核DNA（荧光蓝色）在基质涂层玻璃盖玻片上生长的骨质中，确认乳腺的形成和黄体生成。细胞固定在3%的甲醛中，用25μg/mL数字宁渗透，非特异性结合被3%BSA阻断。然后，细胞被染色为核DNA与DAPI（蓝色）。使用安装介质将盖玻片安装在玻璃滑轨上。使用多光子共聚焦显微镜（比例尺 = 100μm）对中央 XY 轴平面进行显微照片。面板B和C的图像改编自Starova等人22。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
HC11细胞非常适合与肿瘤转化一起进行分化研究。一个额外的优点是HC11细胞很容易感染基于Mo-MLV的抗逆转录病毒载体来表达各种基因。在我们手中，EpH4细胞比HC112更难感染相同的逆转录病毒载体。
细胞与细胞接触和生长抑制是HC11细胞分化的关键先决条件。因此，要在细胞层之间实现均匀的分化，在播种时实现培养皿中细胞的统一分布非常重要。如果需要区分的量化，这一点尤其重要。胰蛋白酶化必须优化，以便实现单个细胞悬浮，并且细胞不会因为操作而失去生存能力。
被试穿的细胞必须分康（50-70%），因为生长到高密度的细胞往往彼此强烈粘附，并且很难分离它们。为了避免干燥细胞，吸气与培养皿平放在地板的层流罩，然后倾斜迅速排空。用盖子盖住培养皿。如有必要，您可以通过将培养皿放入 37°C 培养箱来加速胰蛋白酶的作用。
由于诱导后的10天内细胞非常共通，因此更换耗尽的营养物质非常重要。当介质改变时，也要注意避免细胞分离，因为细胞密度高，细胞可能不会很好地粘附在塑料上。然而，根据我们的经验，没有必要使用涂有纤维素、胶原蛋白或CellTak的培养皿来获得良好的分化结果，这与区分preadipo细胞（如3T3L123 23或Balb/c3T3衍生物）不同。
准确的蛋白质测定对于印迹实验至关重要。由于血清蛋白往往附着在组织培养级塑料上，因此重要的是在1.5 mL的塑料管中刮擦和清洗细胞，这种塑料管不会吸引蛋白质，并在细胞颗粒上添加利沙缓冲液，而不是直接在培养皿24上对细胞进行冲洗。
关于蛋白质提取，保持所有洗涤和溶液溶液冰冷和培养皿或EpH4乳腺球在冰上是非常重要的。这是因为在PBS洗涤中缺乏钙的情况下，镉不参与，因此Stat3-ptyr705被迅速脱磷化25。
HC11细胞描述的培养皿的大小足以用于3⁄4个西式血泡（即，每3厘米盘回收的蛋白质量约为50微克）。我们更喜欢使用3厘米培养皿进行分化实验，以方便蛋白质提取。如果改为使用6口井托盘，则很难在寒冷中从一口井中提取蛋白质，同时使其余油井保持无菌。此外，CO2浓度对分化很重要，由于蛋白质是从工作台上的一口井中提取的，因此很难在水井的其他部分保持它。
根据我们的经验，与23细胞的分化不同，几个胎儿小牛血清能够支持HC11或EpH4细胞的生长和分化。一批新生儿小牛血清测试不支持分化，尽管它可以支持正常生长：细胞起初似乎分化，但在新生儿小牛血清中三次通过后失去了分化能力。
与 HC11 单元相比，EpH4 细胞的分化与周围的 3D 矩阵架构紧密相连。我们描述了EpH4在3D培养中分化所需的步骤，这些步骤从以前的研究26、27、28和随后的蛋白质提取中进行了修改，用于分析β-酪蛋白的产生。EHS 基质在低温（<10 °C）下是液体，在较高温度下凝固。它通常储存在-80°C，但工作等分可以储存在-20°C。使用前一天晚上在4°C下解冻基质，在处理前在-20°C下将预冷组织培养板和移液器尖端解冻。为了准确评估蛋白质浓度，在用冷PBS洗涤提取之前完全消除基质是很重要的，因为基质富含蛋白质，这可能会混淆蛋白质的测定结果。
EpH4对基质分化的依赖已在多个实验模型中得到证明：Reichman等人10表明，由乳原激素诱导的EpH4细胞在层蛋白沉积和强化细胞角蛋白表达区内产生β-酪蛋白。Somasiri等人11日证明，PI3激酶是粘结依赖球体形成和差异化乳蛋白基因表达所必需的。此外，Brinkmann等人21日证明，在EpH4细胞中转染HGF cDNA的表达在3D培养模型中诱导球体的分枝，类似于此处观察到的HGF诱导小管形成（图3A，C）。这些发现说明了EpH4细胞系模型在研究调节乳腺分化的信号事件方面的优势。
EpH4细胞在胎儿小牛血清浓度低于所述10%的浓度时，也可以形成乳腺球。有趣的是，当在100%矩阵22、27的层上镀层时，它们可以在较低的浓度下形成乳腺球，甚至在没有20%或10%矩阵的情况下形成。在细胞悬浮液中没有基质的情况下，避免细胞冷却。一个额外的优点是，所有细胞都位于单个平面上，因此更容易拍摄。
意义：Cadherin 参与培养细胞，接近体内细胞的生理状态，可以激活 Rac/IL6/Stat3 通路。这在上皮细胞分化中可能特别重要。使用所述技术，我们的结果揭示了来自该途径的信号强度，作为细胞增殖与分化之间平衡的核心决定因素，两个根本对立的过程2。对E-cadherin/Rac/Stat3轴的深入调查可能会发现途径的新型两极成分，这取决于表达水平，这些成分可以作为癌症治疗的目标。对于此类目标，完全抑制是没有必要的，以扭转肿瘤表型。部分抑制甚至是有益的，因为剩余量实际上可能阻止转化和促进分化。这可能随目标以及肿瘤类型的不同而变化，如 RACV12 vs. Stat3C 的不同行为所示，在 HC11 vs. EpH4 细胞2，20中。
未来应用：cadherin/Rac/IL6/Stat3通路在其他上皮细胞（如人类乳腺MCF10A或通道肾MDCK29细胞系）的分化方面可能起类似作用，以及依赖于细胞汇合的其他类型的分化，如preadipo细胞和表细胞30，这些细胞表示不同类型的球菌。最后，可以利用该技术来检验Stat531的作用和不同通路的其他组成部分。
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Disclosures
作者没有冲突要披露。
Acknowledgments
HC11细胞系由D.Medina博士（德克萨斯州休斯敦）提供。作者感谢女王大学的安德鲁·克雷格博士提供许多试剂和有价值的建议。EpH4细胞是罗斯凯利博士（温哥华UBC）的礼物。科琳·希克为3D文化研究提供了出色的技术援助。
加拿大自然科学和工程研究理事会、加拿大卫生研究院、加拿腺癌基金会（加拿腺癌基金会，安大略省分会）、加拿腺癌研究联盟）的财政援助，安大略省英才中心、乳腺癌行动金斯敦（BCAK）和克莱尔·纳尔逊遗赠基金通过向LR提供赠款，对此表示感谢。BE获得CIHR、CBCF、BCAK和癌症研究协会的资助。PTG由加拿大研究主席、加拿大创新基金会、CIHR、NSERC和加拿大癌症协会提供支持。MN得到了NCIC的特里·福克斯跨学科癌症研究培训项目、研究生奖（QGA）和皇后大学院长奖的支持。MG得到了美国陆军乳腺癌项目、安大略省研究与创新部以及皇后大学咨询研究委员会博士后奖学金的支持。VH得到了CBCF博士奖学金和特里·福克斯基金会跨学科癌症研究培训计划的博士后奖学金的支持，并与CIHR合作。哈纳德·阿丹是NSERC暑期学生班的获得者。BS获得女王大学研究生奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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