Summary
We beschrijven technieken voor differentiatie-inductie van twee borstepitheellijnen, HC11 en EpH4. Terwijl beide foetale kalf serum, insuline, en prolacactine nodig om melkeiwitten te produceren, EpH4 cellen kunnen volledig onderscheiden in mammosferen in driedimensionale cultuur. Deze complementaire modellen zijn nuttig voor signaaltransductiestudies van differentiatie en neoplasie.
Abstract
Cadherinen spelen een belangrijke rol in de regulering van celdifferentiatie en neoplasie. Hier beschrijven we de oorsprong en methoden van de inductie van differentiatie van twee muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4, en het gebruik ervan om complementaire stadia van borstklierontwikkeling en neoplastische transformatie te bestuderen.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn is afkomstig van de borstklier van een zwangere Balb/c muis. Het onderscheidt wanneer gekweekt aan samenvloeiing die aan een plastic petrischaaloppervlak in middel met foetale kalfsserum en Hydrocortisone, Iknsulin en Prolactin (ship medium) wordt vastgemaakt. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen de melkeiwitten β-caseïne en weizuureiwit (WAP), vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen, en vormen rudimentaire borstklierachtige structuren die "koepels" worden genoemd.
De EpH4 cellijn is afgeleid van spontaan vereeuwigde muisborstklier epitheelcellen geïsoleerd van een zwangere Balb/c muis. In tegenstelling tot HC11 kunnen EpH4-cellen zich volledig onderscheiden in sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) wanneer ze worden gekweekt onder driedimensionale (3D) groeiomstandigheden in HIP medium. Cellen worden beproefd, opgehangen in een 20% matrix bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen, verguld op de top van een laag geconcentreerde matrix coating een plastic petrischaal of multiwell plaat, en bedekt met een laag van 10% matrix-bevattende HIP medium. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen holle sferoïden die apical-basale polariteit vertonen, een holle lumen, en β-caseine en WAP produceren.
Met behulp van deze technieken, onze resultaten aangetoond dat de intensiteit van de cadherin / Rac signaal is van cruciaal belang voor de differentiatie van HC11 cellen. Terwijl Rac1 is noodzakelijk voor differentiatie en lage niveaus van geactiveerde RacV12 verhoging differentiatie, hoge RacV12 niveaus blok differentiatie terwijl het induceren van neoplasie. EpH4-cellen daarentegen vertegenwoordigen een vroeger stadium in borstepitheeldifferentiatie, die wordt geremd door zelfs lage niveaus van RacV12.
Introduction
In normale weefsels of tumoren, cellen hebben uitgebreide mogelijkheden voor hechting aan hun buren in een driedimensionale organisatie, en dit wordt nagebootst in cultuur door hoge dichtheid celgroei. Cel-op-cel hechting wordt voornamelijk bemiddeld via cadherinreceptoren, die cel- en weefselarchitectuur definiëren. Interessant is dat onlangs werd aangetoond dat cadherinen ook een krachtige rol spelen bij signaaltransductie, vooral bij overlevingssignalering1. Paradoxaal genoeg bleken sommige van deze cel-op-cel hechtingssignalen afkomstig van cadherinen onlangs te worden gedeeld door zowel differentiatie als neoplasie2. Hier beschrijven we methoden voor inductie en beoordeling van differentiatie in twee representatieve soorten muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn kan een nuttig model voor de studie van epitheelceldifferentiatie. HC11 cellen zijn een COMMA-1D-afgeleide cellijn, afkomstig van de borstklier van een halfzwangere Balb/c muis3. In tegenstelling tot andere COMMA-1D afgeleide klonen, de HC11 kloon heeft geen behoefte aan exogene toegevoegde extracellulaire matrix of coteelt met andere celtypes voor de in vitro inductie van het endogene β-caseingen door lactogene hormonen3. Deze cellijn is op grote schaal gebruikt in differentiatiestudies omdat het belangrijke kenmerken van het normale borstepitheel heeft behouden: HC11-cellen kunnen het kanaalepitheel gedeeltelijk reconstrueren in een gewist borstvetpad4. Bovendien kunnen ze zich onderscheiden in een tweedimensionale (2D) cultuur wanneer ze worden gekweekt tot samenvloeiing aan een plastic petrischaaloppervlak in aanwezigheid van een steroïde zoals Hydrocortison of Dexamethason, naast Insulin en Prolactin (HIP medium) die epidermale groeifactor (EFG) missen, een remmer van differentiatie5,6,7. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen melkeiwitten zoals β-caseïne en WAP, die binnen 4 dagen na inductie door westerse vlekken kunnen worden gedetecteerd. Tegelijkertijd vormt een deel van hc11 cellen rudimentaire borstklierachtige structuren die op een stochastische manier "koepels" worden genoemd. Koepels zijn zichtbaar 4-5 dagen na inductie en geleidelijk toenemen in omvang tot dag 10, gelijktijdig met een toename van β-caseine productie8. Interessant is dat HC11 cellen bezitten mutant p539, en dus vertegenwoordigen een preneoplastic staat. Om deze reden is het HC11-model bij uitstek geschikt om signaleringsnetwerken van differentiatie te bestuderen in combinatie met neoplasie in hetzelfde celsysteem.
EpH4 cellen, een afgeleide van IM-2 cellen, zijn een niet-tumorigene cellijn oorspronkelijk afgeleid van spontaan vereeuwigde muis borstklier epitheelcellen geïsoleerd van een mid-zwangere Balb / c muis10. EpH4 cellen vormen continue epitheelmonolagen in de 2D-cultuur, maar onderscheiden zich niet in klierachtige structuren10,11. Echter, na 3D-groei in een materiaal bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door EHS muis sarcoom cellen12 (EHS matrix, matrix, of Matrigel, zie Tabel met materialen), in aanvulling op stimulatie met HIP, EpH4 cellen kunnen recapituleren de eerste stadia van borstklier differentiatie. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) die apical-basale polariteit en een holle lumen vertonen, en die in staat zijn de melkeiwitten β-caseïne en WAP te produceren, vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen. In tegenstelling tot HC11 cellen, die ongedifferentieerd zijn, en sommige uitdrukken mesenchymale markers13, EpH4 cellen vertonen een zuiver luminale morfologie14. EpH4 cellen zijn ook gemeld aan melkeiwitten te produceren in 2D-cultuur door stimulatie met dexamethason, insuline, en prolacactine15. Deze aanpak sluit echter de studie uit van regelgevende effecten die de borstkliermicroomgeving in de 3D-cultuur nabootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beplating HC11 Cellen
- In een laminaire stroomkap met behulp van steriele technieken bereiden een fles met 50 mL HC11 celmedium: RPMI-1640 met 10% foetaal runderserum (FBS), 5 μg/mL insuline en 10 ng/mL EGF (zie Tabel met materialen).
- Plaat ongeveer 400.000 cellen per 3 cm petrischaal: Pass twee 10 cm, 50% confluent Petri gerechten in twintig 3 cm gerechten in HC11 medium. De cellen moeten goed worden verspreid, maar drogen moet worden vermeden.
- Zuig het medium aan in een kolf met behulp van een vacuümpomp.
- Voeg 250 μL trypsine toe (zie Materiaaltabel)per plaat van 10 cm. Wervel en raak de plaat vanaf de zijkanten terwijl het horizontaal blijft om de trypsine te verspreiden en de aangesloten cellen te verjagen
- Observeer onder fase contrast microscopie met een 4x doel om ervoor te zorgen dat de cellen zijn begonnen los te maken van de randen voordat pipetteren.
- Aanzuigen ongeveer 1,5 mL hc11 medium in een steriele, 9 inch Pasteur pipet en spuit het verticaal tegen de cellen. Draai de petrischaal tijdens het spuiten om alle cellen los te maken. U moet snel werken om te voorkomen dat het drogen van de cellen.
- Breng alle cellen naar de fles met het HC11 medium en wervel.
- Pipetteer 2 mL celvering in elke 3 cm petrischaal. Rock de petrischaaltjes dwars om gelijkmatig te verspreiden. Plaats de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- De volgende dag, of wanneer cellen zijn ~ 90-100% confluent, aanzuigen van het medium, en vervang het met medium met FBS en insuline, maar ontbreekt EGF.
2. Differentiatie inductie, monitoring en kwantificering van HC11 Cellen
- Voeg na het kweken van de cellen in medium het ontbreken van EGF voor 24 uur toe, voeg het differentiatiemedium (HIP medium) toe tot tien platen van 3 cm: RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortison (zie Tabel met materialen), 5 μg/mL Insulin en 5 μg/mL Prolactin (zie Tabel met materialen) voor maximaal 10 dagen.
- Houd de andere tien platen van 3 cm als regelaars: Verander op een medium met 10% FBS en 5 μg/mL insuline zonder EGF en HIP.
- Verander het medium om de 2-3 dagen in zowel HIP-behandelde cellen als besturingselementen. Pipeter het medium zorgvuldig om ervoor te zorgen dat cellen niet loskomen.
- Om differentiatie te controleren (d.w.z. de vorming van "koepels"), observeer de cellen onder fasecontrastmicroscopie(figuur 1A, linkerpaneel). Als de cellen groene fluorescentie-eiwit (GFP) uitdrukken, observeer dan fluorescentiemicroscopie (excitatie = 485/20; emissie = 530/25; vergroting 240x; 20x objectief) (figuur 1A, rechterpaneel).
- Om de mate van differentiatie te kwantificeren, extract eiwitten uit een petrischaaltje elk van HIP-behandelde cellen en controles, eenmaal per dag gedurende een totaal van 10 dagen en sonde westerse vlekken voor β-caseïne (zie Tabel met materialen) ( Figuur1B).
- Schraap de cellen op ijs met 1,5 mL ijskoude fosfaatbufferde zoutlijn (PBS) in een 1,8 ml plastic centrifugebuis.
- Pellet de cellen op 350 x g,1 min, 4 °C.
- Was de pellet snel 2x met ijskoude PBS. Giet eventuele resten af.
- Maak een lysisbuffer: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 μg/mL aprotinine, 10 μg/mL leeptupin16. Voeg 100 μL per petrischaal van 3 cm toe.
- Verhelder het lysaat door centrifugeren op 10.000 x g voor 10 min in de kou.
- Bepaal de eiwitconcentratie (zie Materiaaltabel)en laad 10-20 μg eiwit uit elk monster op een 10% polyacrylamide-SDS-gel.
- Elektrofore voor 15 uur bij 45 V, of bij 100 V voor ~2-2,5 uur.
- Breng over op een nitrocellulose of PVDF-membraan met behulp van een elektroblotting transfer-apparaat (zie Tabel met materialen).
- Blok met 5% runderserumalbumine (BSA) in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST).
- Voeg het primaire antilichaam, geit anti-β-caseinverdunde 1:2.000 of muis anti-β actine verdund 1:1.000 (zie Tabel met materialen).
- Was 3x met TBST, 5 min elke keer.
- Voeg het secundaire antilichaam, mierikswortel peroxidase (HRP) gekoppelde ezel anti-geit verdund 1:2.500, of HRP gekoppeld paard anti-muis antilichaam verdund 1:10.000.
- Was 3x met TBST, 5 min elke keer.
- Voeg ECL-reagentia toe aan het membraan volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
3. Beplating en 3D-groei van EpH4-cellen in EHS-matrix
LET OP: De matrix is vloeibaar bij temperaturen <10 °C en vast bij temperaturen boven. Bewaar bij -80 °C. Ontdooi bij 4 °C de nacht voor gebruik. Pre-chill de weefselkweekplaten en pipet tips bij -20 °C voorafgaand aan de behandeling en houd de matrix, platen en pipet tips op ijs om te voorkomen dat het stollen.
- Kweek EpH4-cellen in 2D in RPMI-1640 medium met 10% FBS en 5 μg/mL insuline (EFG is niet vereist).
- Bereid EpH4 groeimedium aangevuld met 10% (v/v, 3.500 μL) of 20% (v/v 2.000 μL) matrix in twee conische buizen van 50 mL. Blijf op ijs tot ze klaar zijn voor gebruik.
- Coat 10 putten (elk 1 cm2) van een 24-putplaat met 150 μL onverdunde matrix. Verdeel de matrix met een pipettip. Vermijd het creëren van bubbels. Tik voorzichtig op de zijkanten van de plaat terwijl u deze horizontaal houdt om ervoor te zorgen dat de matrix gelijkmatig over de onderkant van de put wordt verdeeld.
- Incubeer de 24 putplaat bij 37 °C gedurende 1 uur om de matrix te laten stollen.
- Trypsinize EpH4 cellen zoals hierboven beschreven voor HC11 cellen en tel ze met een hemocytometer. Breng 5 x 104 cellen per put over op een steriele conische centrifugebuis van 1,5 m L en draai op 250 x g gedurende 5 min.
- Trek het medium voorzichtig aan en plaats de buis op ijs.
- Hersuspendecellen in 350 μL EpH4 groeimedium aangevuld met 20% matrix met behulp van een 1 ML pipet tip terwijl de conische buis op ijs blijft. Vermijd bubbels. Het is belangrijk om een eencellige vering te garanderen.
- Zodra de onderste laag matrix is gestold (de matrix moet lijken doorschijnend en lichter van kleur in vergelijking met de eerste coating van de putten), voeg de 350 μL van de cel suspensie aan elke gecoate goed en plaats in een CO2 incubator op 37 ° C voor ~ 1 h om de 20% matrix laag te stollen.
- Observeer de cellen microscopisch in fasecontrast met een 4x doelstelling. Enkele cellen moeten zichtbaar zijn.
- Voeg 200 μL EpH4 medium met 10% matrix toe bovenop de 350 μL cellen die in 20% matrix zijn opgehangen. Incubeer bij 37 °C.
4. Differentiatie Inductie van EpH4-cellen geteeld in 3D (figuur 2)
OPMERKING: Naast differentiatie kunnen EpH4-cellen ook tubulogenese ondergaan wanneer ze worden gestimuleerd met HGF (hepatocyte groeifactor) in de 3D-cultuur. Buisvormige uitwassen kunnen worden gezien na 10 dagen van HIP en HGF stimulatie.
- Begin met differentiatie-inductie van EpH4 cellen 1 dag na beplating in de matrix. Verwijder voorzichtig 150 μL van het bovenste medium met 10% matrix uit de putten met behulp van een plastic pipet tip. Voeg 200 μL EpH4 medium met HIP en 10% matrix toe.
- Vervang het 10% matrix-HIP medium om de 2 dagen gedurende maximaal 10 dagen. Kweek controlecellen in hetzelfde 10% matrixmedium zonder HIP.
- Monitor de mammosfeervorming in fasecontrast(figuur 3A, onderste paneel).
5. Tubulogenese inductie van EpH4-cellen geteeld in 3D(figuur 3A en 3C)
- Bereid 24 putplaten en EpH4-cellen voor groei in matrix zoals beschreven in de stappen 3.1–3.9. De dag na het beplaten van de cellen in de matrix, verwijder 150 μL EpH4 medium met 10% matrix uit de putten met behulp van een plastic pipet tip. Voeg 200 μL EpH4-medium toe dat 10% matrix, HIP en 20 ng/mL HGF bevat (zie Tabel met materialen).
- Vervang het 10% matrix/HIP/HGF medium om de 2 dagen gedurende maximaal 12-14 dagen.
- Monitor tubulivorming microscopisch met behulp van een doelstelling van 20x of 40x(figuur 3A, rechterpaneel).
6. Kwantificering van differentiatie: westelijke blotting voor β-caseine
- Voorzichtig pipet uit de 10% matrix-HIP medium uit de putten. Spoel de 20% matrixlaag 2x af met 350 μL ijskoude PBS. De sferoïden moeten nog steeds aanwezig zijn in de matrixlaag.
- Voeg 700-1.000 μL ijskoude PBS met 1 mM ethyleenvormigetetraaminetetraacetic zuur (EDTA) direct in de putten. Maak de onderste laag van de 100% matrix voorzichtig los van de put met een pipettip om sferoïden in die laag terug te krijgen. Schud zachtjes gedurende 30 min bij 4 °C.
- Breng de sferoïde suspensie voorzichtig over op een conische buis. Spoel de putten met ~ 500 μL PBS-EDTA om eventuele resterende sferoïden in de putten te herstellen en toe te voegen aan de conische buis.
- Rock on ice voor nog eens 30 min. Zorg ervoor dat de matrix volledig is opgelost. Als zichtbare matrixklontjes worden gezien, voegt u meer PBS-EDTA toe of schudt u langer.
- Centrifugeer de oplossing om de sferoïden 5 min op 350 x g te pelleteren.
- Aanzuigen van de supernatant, lyse de sferoïden in ijskoude lysis buffer, en sonde voor β-casein, cyclische D1, en p120RasGAP door Westerse vlekken als in stap 2.5 boven16. Als primaire antilichamen gebruikt u de anti-β-caseine verdund van geiten anti-β-caseine verdund 1:2.000, konijn anti-cyclin D1 verdund 1:2.000, en muis anti-p120 verdund 1:2.000. Voor secundaire antilichamen, gebruik HRP gekoppeld ezel anti-geit verdund 1:2.500, HRP gekoppeld ezel anti-konijn verdund 1:2.500, en HRP gekoppeld paard anti-muis verdund 1:10.000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het is al lang bekend dat de differentiatie van epitheelcellen en adipocyten samenvloeiing en betrokkenheid van cadherinenvereist 2. Wij en anderen hebben aangetoond dat cel-op-cel hechting en betrokkenheid van E- of N-cadherine en cadherin-11, zoals gebeurt met de samenvloeiing van gekweekte cellen, leidt tot een dramatische toename van de activiteit van de kleine GTPases Rac en celdeling controle eiwit 42 (Cdc42), en dit proces leidt tot activering van interleukine-6 (IL6) familie cytokines en Stat3 (signaal transducer en activator van transcriptie-316,17)1,18,19. Omdat veel componenten van het cadherine/Rac/IL6/Stat3-traject kunnen deelnemen aan zowel differentiatie als neoplastische transformatie, bieden ze moleculaire handvatten voor de studie van de onderlinge verbondenheid van deze twee diametraal tegengestelde processen.
Met behulp van de hierboven beschreven technieken, toonden we een opvallende afhankelijkheid van differentiatie op de sterkte van het Rac-signaal in HC11-cellen: Terwijl endogene cRac1 nodig is voor differentiatie, en op lage niveaus mutatiegeactiveerdracV12 veroorzaakt een duidelijke toename van differentiatie capaciteit, hoge RacV12 niveaus leiden tot een dramatisch blok van differentiatie, terwijl inducerende neoplasie (Figuur 1B). In tegenstelling, zelfs lage niveaus van RacV12 expressie geblokkeerd differentiatie in EpH4 cellen2. Bovendien, hoewel RacV12 Stat3 activeert in veel celsystemen, waaronder HC1116,blokkeerde mutatiegeactiveerde Stat3C differentiatie terwijl neoplastische transformatie20wordt veroorzaakt.
We onderzochten verder de differentiatieeigenschappen van EpH4 cellen in een 3D matrix cultuur. Terwijl de β-caseineproductie piekte op 8-10 dagen, was de cyclire D-1-expressie maximaal op 4-6 dagen na HIP stimulatie (figuur 3B). Deze bevindingen ondersteunen een omgekeerd verband tussen proliferatie en differentiatie in het EpH4-model. Met behulp van DAPI (nucleaire) kleuring en confocale microscopie om de positionering van individuele epitheelcellen te bepalen, zagen we de dood van de binnenste cel en de vorming van holle lumen in mammosferen(figuur 3A,C). Verder toonden we aan dat toevoeging van HGF (20 ng/mL) bij 48 uur aan het HIP-medium resulteerde in de vorming van buisstructuren(figuur 3A,C),in overeenstemming met eerdere elektronenmicroscopiestudies21. Deze benaderingen met behulp van de EpH4 model maken het mogelijk de karakterisering van specifieke kenmerken van borstepitheel eferische differentiatie en hun associatie met duidelijke signaal transductie trajecten.
Figuur 1: Beoordeling en kwantificering van HC11 celdifferentiatie. (A) Een koepel gevormd in HC11 cellen uitdrukken lage niveaus van GFP-RacV12 op 10 dagen na inductie van differentiatie. Links: Fasecontrast; Rechts: Fluorescentie van hetzelfde veld (foto's niet eerder gepubliceerd). Schaalbalk = 100 μm; Vergroting = 240x; 20x objectief. (B) Effect van RacV12 op HC11 differentiatie: Laag (rijstroken 19-24), tussenliggende (rijstroken 13-18), of hoge (rijstroken 7-12) niveaus van een RacV12-GFP fusie constructie werden uitgedrukt in HC11 cellen. Na de groei in de afwezigheid van EGF voor 24 uur, werden cellen geïnduceerd om te differentiëren met HIP toevoeging, of niet, zoals aangegeven. Detergentextracten werden op het aangegeven aantal dagen later bereid en onderzocht op β-casein e. of β-actine als belastingscontrole. Let op de dramatische toename van β-casein in lage RacV12-GFP uitdrukken cellen (rijstroken 21-24 vs. 3-6), en de dramatische vermindering bij expressie van hoge RacV12-GFP (rijstroken 9–12). NE = Controleculturen, gekweekt in afwezigheid van EGF, maar niet geïnduceerd om te differentiëren (Niit et al.2, gereproduceerd met toestemming). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Schematisch van overlaymethode voor het kweken van EpH4-cellen in 3D-matrixcultuur. (A) De putten van een 6 put plaat waren in eerste instantie bekleed met 100% EHS matrix die mocht stollen bij 37 °C vormen van een gelled bed van kelder membraan van ongeveer 2-5 mm in dikte. EpH4 cellen werden gezaaid op dit bed als een enkele cel suspensie in HIP medium met 20% matrix. Dit werd bedekt met 10% matrix in HIP medium. Het 10% matrixmedium werd om de dag vervangen. Cellen prolifeerden en begonnen na 4-5 dagen in cultuur mammosferen te vormen (zie De sectie protocollen). (B) Fase contrast beelden van EpH4 cellen in 2D (monolayer) en 3D (mammosfeer) cultuur werden vastgelegd met behulp van een microscoop uitgerust met een digitale camera (300x vergroting). Representatieve beelden in elke fase worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Gebeurtenissen in 3D acinaire morfogenese van EpH4 in 3D-cultuur. (A) EpH4-cellen werden geteeld in matrixgecoate 6 putplaten en onderhouden in volledig 3D-medium zoals in figuur 2. Tijdens de vroege stadia van morfogenese, cellen vermenigvuldigen, gevormd clusters, en georganiseerd in twee groepen: (1) een buitenste laag van gepolariseerde cellen en (2) een innerlijke cluster van ongeorganiseerde cellen die celdood onderging, die overeenkomt met apoptose zoals eerder aangetoond12. De laatste leidde tot de vorming van een holle lumen, gekenmerkt door de verduistering van het centrum van de mammosferen zoals gezien door fase contrast microscopie. Toevoeging van HGF (20 ng/mL) aan het medium resulteerde in de vorming van buisstructuren. Meer dan 60% van de door HGF geïnduceerde aggregaten vertoonde tubulogenese, vergeleken met onbehandelde controleaggregaten, wat niet het ed. Een representatieve fase contrast foto van cellen in elke fase werd vastgelegd met behulp van een microscoop uitgerust met een digitale camera (300x vergroting; Schaalbalk = 100 μm). De resultaten zijn representatief voor ten minste drie experimenten. Schemawerd aangepast van Starova et al.22. (B) EpH4 cellen geteeld in 3D werden geoogst op de aangegeven dagen. Eiwitconcentraties werden genormaliseerd en gelijke eiwithoeveelheden (20 μg) werden onderworpen aan SDS-PAGE, gevolgd door westerse vlekken en indringende met de aangegeven antilichamen. Een gehomogeniseerde borstklier van een zogende muis (MGT) werd gebruikt als een in vivo vergelijking. p120RasGAP werd gebruikt als onafhankelijke laadregeling. Cyclische D1 expressie toegenomen voorbijgaand samenvallen met vermenigvuldigende cellen over de eerste 3-4 dagen. In tegenstelling, β-casein expressie piekte op 8-10 dagen, wat overeenkomt met de vorming van volwassen mammosferen. De resultaten zijn representatief voor twee experimenten. (C) Lumenformatie en tubulogenese van mammosferen werd bevestigd met behulp van DAPI-kleuring van nucleair DNA (fluorescerend blauw) in aggregaten die werden geteeld op met matrix bedekte glazen afdekkingen. Cellen werden gefixeerd in 3% paraformaldehyde, permeabilized met 25 μg/mL digitonine, en niet-specifieke binding werd geblokkeerd met 3% BSA. Cellen werden vervolgens gekleurd voor nucleair DNA met DAPI (blauw). Coverslips werden met behulp van een montagemedium op glazen platen gemonteerd. Fotomicrografen werden genomen van het centrale XY-asvlak met behulp van een multiphoton confocale microscoop (Scale bar = 100μm). Afbeeldingen in de panelen B en C zijn aangepast van Starova et al.22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HC11 cellen zijn bij uitstek geschikt voor de studie van differentiatie in combinatie met neoplastische transformatie. Een bijkomend voordeel is dat HC11-cellen gemakkelijk te infecteren zijn met Mo-MLV-gebaseerde retrovirale vectoren om een verscheidenheid aan genen uit te drukken. In onze handen, EpH4 cellen waren moeilijker te infecteren met dezelfde retrovirale vectoren dan HC112.
Cell-to-cell contact en groeiarrestatie zijn belangrijke voorwaarden voor HC11 celdifferentiatie. Om een uniforme differentiatie over de cellaag te bereiken, is het dus belangrijk om een uniforme verdeling van cellen in de petrischaal te bereiken op het moment van zaaien. Dit is vooral belangrijk als het kwantificeren van differentiatie gewenst is. Trypsinisatie moet zo worden geoptimaliseerd dat een enkele cel suspensie wordt bereikt en cellen hun levensvatbaarheid niet verliezen door de manipulaties.
Cellen die worden geprobeerd moeten subconfluent zijn (50-70%), omdat cellen die tot hoge dichtheden worden gekweekt, vaak sterk aan elkaar hechten, en ze scheiden is moeilijk. Om te voorkomen dat het drogen van de cellen, aanzuigen met de petrischaal plat op de vloer van de laminaire flow hood, dan kantelen om snel af te voeren. Bedek de petrischaal met het deksel. Indien nodig u de werking van de trypsinversnellen door de petrischaal in een 37 °C incubator te plaatsen.
Omdat de cellen zeer confluent zijn tijdens de 10 dagen na inductie, is het belangrijk om de voedingsstoffen die uitgeput zijn te vervangen. Wanneer het medium wordt veranderd, moet ook worden gezorgd voor het vermijden van onthechting van de cellen, die niet erg goed aan het plastic kunnen hechten als gevolg van hoge celdichtheid. Toch is het in onze ervaring niet nodig om petrischaaltjes te gebruiken die zijn bekleed met fibronectine, collageen of CellTak om goede differentiatieresultaten te verkrijgen, in tegenstelling tot differentiërende preadipocyten zoals 3T3L123 of Balb/c3T3 derivaten.
Nauwkeurige eiwitbepaling voor de blotting experimenten is van cruciaal belang. Omdat serumeiwitten de neiging hebben om zich aan de weefselkweek van plastic te hechten, is het belangrijk om de cellen te schrapen en te wassen in een 1,5 mL plastic buis die geen eiwitten aantrekt en de lysisbuffer op de celpellet toe te voegen in plaats van de cellen direct op de petrischaal te bewerken24.
Wat eiwitextractie betreft, is het erg belangrijk om alle was- en lysisoplossingen ijskoud te houden en de petrischaaltjes of EpH4 mammosferen overal op ijs te houden. Dit komt omdat bij afwezigheid van calcium in de PBS was de cadherines niet worden ingeschakeld en als gevolg Stat3-ptyr705 is snel defosforylated25.
De grootte van de petrischalen beschreven voor HC11 cellen is voldoende voor 3-4 westerse vlekken (dat wil zeggen, de hoeveelheid eiwit teruggewonnen per petrischaal is ongeveer 50 μg per 3 cm schotel). We gebruiken de voorkeur om 3 cm petrischaaltjes te gebruiken voor differentiatie-experimenten om eiwitextractie te vergemakkelijken. Als een 6 goed lade wordt gebruikt in plaats daarvan, is het moeilijk om eiwitten te extraheren uit een goed in de kou, terwijl het houden van de rest van de putten steriel. Bovendien is de CO2-concentratie belangrijk voor differentiatie en is het moeilijk om deze te handhaven voor de rest van de putten, omdat eiwitten uit één put op de bank worden gewonnen.
In onze ervaring, in tegenstelling tot de differentiatie van preadipocyten23,zijn verschillende partijen foetale kalfserum in staat om de groei en de differentiatie van HC11- of EpH4-cellen te ondersteunen. Een heleboel geteste pasgeboren kalfsserum steunde geen differentiatie, hoewel het de normale groei kon ondersteunen: de cellen bleken zich eerst te onderscheiden, maar verloren hun vermogen om te differentiëren na drie passages in pasgeboren kalfsserum.
In tegenstelling tot HC11 cellen is differentiatie van EpH4-cellen nauw verbonden met de omringende 3D matrixarchitectuur. We beschrijven de stappen die nodig zijn voor EpH4 differentiatie in 3D-cultuur gewijzigd uit eerdere studies26,27,28 en de daaropvolgende eiwitextractie voor de analyse van β-caseïneproductie. De EHS matrix is vloeibaar bij lage temperaturen (<10 °C) en stolt bij hogere temperaturen. Het wordt normaal bewaard bij -80 °C, maar werkende aliquots kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. Ontdooi de matrix bij 4 °C de nacht voor gebruik en pre-chill weefsel kweekplaten en pipet tips op -20 °C voorafgaand aan de behandeling. Voor een nauwkeurige beoordeling van de eiwitconcentratie is het belangrijk om de matrix volledig te elimineren voordat extractie met koude PBS wassen omdat de matrix rijk is aan eiwitten, wat de eiwitbepalingsresultaten kan verwarren.
De EpH4 afhankelijkheid van de matrix voor differentiatie is aangetoond in meerdere experimentele modellen: Reichman et al.10 toonde aan dat EpH4 cellen veroorzaakt door lactogene hormonen geproduceerd β-caseine binnen gebieden van laminine depositie en geïntensiveerd cytokeratine expressie. Somasiri et al.11 toonden aan dat PI3-kinase nodig is voor kruisingsafhankelijke sferoïdevorming en differentiërende melkeiwitgenexpressie. Bovendien toonden Brinkmann et al.21 aan dat expressie van getransfected HGF cDNA in EpH4-cellen vertakking tubulogenese van sferoïden veroorzaakte in een 3D-kweekmodel, analoog aan de waargenomen HGF-geïnduceerde tubulevorming die hier wordt gezien (figuur 3A,C). Deze bevindingen illustreren de voordelen van de EpH4 cellijn model voor het bestuderen van signalering gebeurtenissen die borstklier differentiatie reguleren.
EpH4-cellen kunnen ook mammosferen vormen wanneer ze worden verguld bij concentraties foetaal kalfsserum lager dan de 10% beschreven. Interessant is dat ze mammosferen kunnen vormen bij lagere concentraties, of zelfs bij afwezigheid van 20% of 10% matrix, wanneer verguld op de top van een laag van 100% matrix22,27. Bij afwezigheid van matrix in de celsuspensie wordt het afkoelen van de cellen vermeden. Een bijkomend voordeel is dat alle cellen in één vlak worden gevonden, zodat ze gemakkelijker te fotograferen zijn.
Betekenis: Cadherinengagement in gekweekte cellen, die de fysiologische toestand van een cel in vivo benadert, kan de Rac/IL6/Stat3-route activeren. Dit kan vooral belangrijk zijn bij epitheelceldifferentiatie. Met behulp van de beschreven technieken, onze resultaten blootgesteld de intensiteit van het signaal afkomstig van deze route als een centrale determinant in het evenwicht tussen celproliferatie versus differentiatie, twee fundamenteel tegengestelde processen2. Het diepgaande onderzoek van de E-cadherin/Rac/Stat3-as kan nieuwe amfiboleuze componenten van het pad blootleggen, afhankelijk van het expressieniveau, dat kan worden benut als doelwit voor kankertherapie. Voor dergelijke doelen zou volledige remming niet nodig zijn om het neoplastische fenotype om te keren. Gedeeltelijke remming zou zelfs gunstig zijn, omdat de resterende hoeveelheden daadwerkelijk transformatie kunnen blokkeren en differentiatie kunnen bevorderen. Dit kan variëren met het doel en het type tumor in kwestie, zoals blijkt uit het verschillende gedrag van RacV12 vs. Stat3C, in HC11 vs. EpH4 cellen2,20.
Toekomstige toepassingen: De kadherine / Rac / IL6/Stat3 traject kan een soortgelijke rol spelen in de differentiatie van andere epitheelcellen, zoals de menselijke borst MCF10A of de hond nier MDCK29 cellijnen, evenals andere soorten differentiatie die afhankelijk zijn van celsamenvloeiing, zoals van preadipocyten en myoblasten30, die verschillende soorten cadherinen uitdrukken. Ten slotte kan deze techniek worden benut voor het onderzoek van de rol van Stat531 en andere componenten van differentiërende trajecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
De HC11 cellijn werd vriendelijk verstrekt door Dr. D. Medina (Houston, TX). De auteurs zijn dr. Andrew Craig van Queen's University dankbaar voor vele reagentia en waardevolle suggesties. EpH4 cellen waren een geschenk van Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leverde uitstekende technische ondersteuning voor 3D-cultuurstudies.
De financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), de Canadian Breast Cancer Research Alliance , de Ontario Centres of Excellence, de Breast Cancer Action Kingston (BCAK) en de Clare Nelson legaat fonds door middel van subsidies aan LR is dankbaar erkend. BE ontving subsidiesteun van CIHR, CBCF, BCAK en Cancer Research Society Inc. PTG wordt ondersteund door een Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC en Canadian Cancer Society. MN werd ondersteund door een studentenschap van het Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research van NCIC, een Graduate award (QGA), en een Dean's Award van Queen's University. MG werd ondersteund door postdoctorale beurzen van het Us Army Breast Cancer Program, het Ministerie van Onderzoek en Innovatie van de provincie Ontario en de Advisory Research Committee van Queen's University. VH werd ondersteund door een CBCF doctoraatsbeurs en een postdoctorale beurs van de Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinaire Cancer Research in samenwerking met CIHR. Hanad Adan ontving een NSERC zomerstudentenschip. BS werd ondersteund door een Queen's University graduate award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
