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Cancer Research

माउस स्तन एपिथेलियल एचसी11 और ईपीएच 4 कोशिकाओं का भेदभाव

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60147
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

हम दो स्तन एपिथेलियल लाइनों, एचसी11 और ईपीएच 4 के भेदभाव प्रेरण के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं। जबकि दोनों को दूध प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए भ्रूण बछड़े सीरम, इंसुलिन और प्रोलैक्टिन की आवश्यकता होती है, EpH4 कोशिकाएं त्रि-आयामी संस्कृति में मैमोस्फीयर में पूरी तरह से अंतर कर सकती हैं। ये पूरक मॉडल भेदभाव और नियोप्लासिया के सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन अध्ययनके लिए उपयोगी हैं।

Abstract

कैथेरिन सेल भेदभाव के साथ-साथ नियोप्लासिया के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां हम दो माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइनों, एचसी11 और ईपीएच 4 के भेदभाव के शामिल होने की उत्पत्ति और तरीकों का वर्णन करते हैं, और स्तन ग्रंथि विकास और नियोप्लास्टिक परिवर्तन के पूरक चरणों का अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग का वर्णन करते हैं।

HC11 माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइन एक गर्भवती Balb/c माउस की स्तन ग्रंथि से उत्पन्न हुई । यह तब अंतर करता है जब भ्रूण बछड़े सीरम और एचydrocortisone युक्त माध्यम में एक प्लास्टिक पेट्री डिश सतह से जुड़े संगम से जुड़ा हुआ है, मैंnsulin और पीrolactin (हिप माध्यम) । इन परिस्थितियों में, एचसी11 कोशिकाएं दूध प्रोटीन का उत्पादन करती हैं, जो स्तनपान कराने वाली मैमरियल एपिथेलियल कोशिकाओं के समान दूध प्रोटीन और मट्टी अम्लीय प्रोटीन (WAP) का उत्पादन करती हैं, और प्रारंभिक स्तन ग्रंथि जैसी संरचनाएं बनाती हैं जिन्हें "गुंबद" कहा जाता है।

EpH4 सेल लाइन अनायास अमर माउस स्तन ग्रंथि एपिथेलियल कोशिकाओं एक गर्भवती Balb/c माउस से अलग से प्राप्त किया गया था । HC11 के विपरीत, EpH4 कोशिकाएं हिप माध्यम में त्रि-आयामी (3 डी) विकास की स्थिति के तहत सुसंस्कृत होने पर स्फेरॉइड (जिसे मैमोस्फेयर भी भी कहा जाता है) में पूरी तरह से अंतर कर सकती हैं। कोशिकाओं को ट्राइप्सिनकिया, 20% मैट्रिक्स में निलंबित किया जाता है जिसमें Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन का मिश्रण होता है, जो एक प्लास्टिक पेट्री डिश या मल्टीवेल प्लेट कोटिंग केंद्रित मैट्रिक्स कोटिंग की एक परत के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है, और 10% मैट्रिक्स युक्त हिप मीडियम की परत के साथ कवर किया जाता है। इन परिस्थितियों में, EpH4 कोशिकाएं खोखले स्फेरॉइड बनाती हैं जो एपिकल-बेसल ध्रुवता, एक खोखले लुमेन, और ए-कैसिन और WAP का उत्पादन करती हैं।

इन तकनीकों का उपयोग करते हुए, हमारे परिणामों ने दिखा दिया कि एचसी11 कोशिकाओं के भेदभाव के लिए कैथेरिन/आरएसी सिग्नल की तीव्रता महत्वपूर्ण है । जबकि Rac1 भेदभाव और सक्रिय आरएसीV12 के निम्न स्तर के लिए आवश्यक है भेदभाव में वृद्धि, उच्च आरएसीV12 स्तर ों में अंतर ब्लॉक जबकि नियोप्लासिया उत्प्रेरण । इसके विपरीत, EpH4 कोशिकाएं स्तन एपिथेलियल भेदभाव में पहले के चरण का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो आरएसीV12के निम्न स्तर से भी बाधित होती है।

Introduction

सामान्य ऊतकों या ट्यूमर में, कोशिकाओं में त्रि-आयामी संगठन में अपने पड़ोसियों के लिए आसंजन के व्यापक अवसर होते हैं, और यह उच्च घनत्व कोशिका विकास द्वारा संस्कृति में नकल की जाती है। सेल-टू-सेल आसंजन मुख्य रूप से कैथेरिन रिसेप्टर्स के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है, जो कोशिका और ऊतक वास्तुकला को परिभाषित करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि कैडेरिन सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन में भी एक शक्तिशाली भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से अस्तित्व संकेत1में। विडंबना यह है कि कैडेरिन से निकलने वाले इन सेल-टू-सेल आसंजन संकेतों में से कुछ को हाल ही में भेदभाव और नियोप्लासिया2दोनों द्वारा साझा किया गया था। यहां, हम दो प्रतिनिधि प्रकार के माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइनों, एचसी11 और ईपीएच 4 में भेदभाव के शामिल होने और मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन करते हैं।

HC11 माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइन एपिथेलियल सेल भेदभाव के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान कर सकती है। HC11 कोशिकाओं को एक अल्पा-1D-व्युत्पन्न सेल लाइन, एक मध्य गर्भवती Balb/c माउस3की स्तन ग्रंथि से उद्भव कर रहे हैं । अन्य कॉमा-1डी व्युत्पन्न क्लोन के विपरीत, एचसी11 क्लोन में लैक्टोजेनिक हार्मोनद्वाराएंडोजेनस-कैसिन जीन के इन विट्रो इंडक्शन के लिए अन्य सेल प्रकारों के साथ एक्सोजेनोस रूप से अतिरिक्त रूप से अतिरिक्त मैट्रिक्स या सहखेती के लिए कोई आवश्यकता नहीं है। इस सेल लाइन का उपयोग विभेदन अध्ययनों में बड़े पैमाने पर किया गया है क्योंकि इसने सामान्य स्तन एपिथेलियम की महत्वपूर्ण विशेषताओं को बनाए रखा है: एचसी11 कोशिकाएं एक स्पष्ट मैमेरी फैट पैड4में डक्टल एपिथेलियम का आंशिक रूप से पुनर्गठन कर सकती हैं। इसके अलावा, वे एक दो आयामी (2डी) संस्कृति में अंतर कर सकते हैं जब एकस्टेरॉयड जैसे एच ydrocortisone या Dexamethasone की उपस्थिति में प्लास्टिक पेट्री डिश सतह से जुड़े संगम के लिए हो, मैंnsulin और पीrolactin (हिप माध्यम) के अलावा एपिडर्मल विकास कारक (EGF), भेदभाव5,6,7के एक अवरोधक की कमी है । इन परिस्थितियों में, एचसी11 कोशिकाएं दूध प्रोटीन जैसे केसिन और WAP का उत्पादन करती हैं, जो प्रेरण के बाद 4 दिनों के भीतर पश्चिमी दाग द्वारा पता लगाने योग्य हैं। साथ ही, एचसी11 कोशिकाओं का एक हिस्सा प्रारंभिक मैममैरी ग्रंथि जैसी संरचनाओं का रूप है, जिन्हें स्टोचस्टिक तरीके से "गुंबद" कहा जाता है। डोम्स इंडक्शन के बाद 4-5 दिन दिखाई देते हैं और धीरे-धीरे 10 दिन तक आकार में वृद्धि करते हैं, उत्पादन8में वृद्धि के साथ सहवर्ती होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि एचसी11 कोशिकाओं में उत्परिवर्ती p539है, और इसलिए एक पूर्वनवजात राज्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस कारण से, एचसी11 मॉडल आदर्श रूप से एक ही सेल सिस्टम में नियोप्लासिया के साथ संयोजन के रूप में भेदभाव के सिग्नलिंग नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है।

EPH4 कोशिकाओं, आईएम-2 कोशिकाओं के एक व्युत्पन्न, एक nontumorigenic सेल लाइन मूल रूप से अनायास अमर माउस स्तन ग्रंथि एपिथेलियल कोशिकाओं से प्राप्त एक मध्य गर्भवती Balb/c माउस10से अलग कर रहे हैं । EpH4 कोशिकाएं 2 डी संस्कृति में निरंतर एपिथेलियल मोनोलेयर बनाती हैं, लेकिन ग्रंथि जैसी संरचनाओं10,11में अंतर नहीं करती हैं। हालांकि, ईएचएस माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एक्सपेरिसेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के मिश्रण से युक्त सामग्री में 3 डी वृद्धि के बाद12 (ईएचएस मैट्रिक्स, मैट्रिक्स, या मैट्रिक्स, सामग्री की तालिकादेखें), हिप के साथ उत्तेजना के अलावा, EpH4 कोशिकाएं मैरी ग्रंथि अंतर के प्रारंभिक चरणों को फिर से तैयार कर सकती हैं। इन परिस्थितियों में, EpH4 कोशिकाएं स्फेरॉइड (जिसे मैमोस्फीयर भी कहा जाता है) बनाती हैं जो एपिकल-बेसल ध्रुवता और एक खोखले लुमेन को प्रदर्शित करती हैं, और स्तनपान कराने वाली मैमेरी एपिथेलियल कोशिकाओं के समान दूध प्रोटीन को बनाने में सक्षम हैं। HC11 कोशिकाओं के विपरीत, जो अविभेदित हैं, और कुछ व्यक्त मेसेनचिमल मार्कर13,EpH4 कोशिकाओं को एक विशुद्ध रूप से चमकदार आकृति विज्ञान14प्रदर्शित करते हैं । ईपीएच4 कोशिकाओं को भी dexamethasone, इंसुलिन, और प्रोलैक्टिन15के साथ उत्तेजना के माध्यम से 2 डी संस्कृति में दूध प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सूचित किया गया है । हालांकि, यह दृष्टिकोण नियामक प्रभावों के अध्ययन को पहले से ही रोकता है जो 3 डी संस्कृति में स्तन ग्रंथि और माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करते हैं।

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Protocol

1. चढ़ाना HC11 कोशिकाओं

  1. बाँझ तकनीकों का उपयोग कर एक लैमिनार प्रवाह हुड में HC11 सेल माध्यम के ५० mL के साथ एक बोतल तैयार: RPMI-१६४० के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 μg/mL इंसुलिन, और 10 एनजी/mL EGF (सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. प्लेट प्रति 3 सेमी पेट्री डिश में लगभग 400,000 कोशिकाएं: एचसी11 माध्यम में बीस 3 सेमी व्यंजनों में दो 10 सेमी, 50% जलप्रवाह पेट्री व्यंजन पास करें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए लेकिन सुखाने से बचा जाना चाहिए।
    1. वैक्यूम पंप का उपयोग करके माध्यम को एक फ्लास्क में एस्पिरेट करें।
    2. प्रति 10 सेमी प्लेट 250 माइक्रोन (सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें। भंवर और पक्षों से थाली मारा, जबकि यह क्षैतिज रखने के लिए ट्रिप्सिन फैल और संलग्न कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना
    3. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत 4x उद्देश्य के साथ निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पाइपिंग से पहले किनारों से अलग करना शुरू कर दिया है ।
    4. एस्पिरेट लगभग 1.5 mL HC11 मध्यम एक बाँझ में, 9 इंच पाश्चर पिपेट और कोशिकाओं के खिलाफ खड़ी धार। सभी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए फुहार करते हुए पेट्री डिश को घुमाएं। कोशिकाओं के सूखने से बचने के लिए आपको तेजी से काम करना चाहिए।
    5. एचसी11 माध्यम और भंवर के साथ बोतल के लिए सभी कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    6. प्रत्येक 3 सेमी पेट्री डिश में सेल निलंबन के पिपेट 2 mL। रॉक पेट्री व्यंजन समान रूप से फैलने के लिए आड़े-तिरछे। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. अगले दिन, या जब कोशिकाएं ~ 90-100% अनुकूल होती हैं, तो मध्यम को एस्पिरेट करें, और इसे एफबीएस और इंसुलिन के साथ मध्यम से बदलें लेकिन ईजीएफ की कमी हो।

2. एचपीसीए 11 कोशिकाओं का भेदभाव प्रेरण, निगरानी और परिमाणीकरण

  1. 24 घंटे के लिए EGF की कमी मध्यम में कोशिकाओं को बढ़ाने के बाद, दस 3 सेमी प्लेटों के लिए भेदभाव माध्यम (हिप माध्यम) जोड़ें: RPMI-१६४० 10% FBS के साथ पूरक, 1 μg/mL एचydrocortisone (सामग्री की मेजदेखें), 5 μg/mL मैंnsulin और 5 μg/mL पीrolactin (सामग्री की तालिकादेखें) 10 दिनों के लिए ।
  2. नियंत्रण के रूप में अन्य दस 3 सेमी प्लेटें रखें: 10% एफबीएस और 5 μg/mL इंसुलिन के साथ एक माध्यम में बदलें EGF और कूल्हे की कमी है ।
  3. हिप-इलाज कोशिकाओं और नियंत्रण दोनों के लिए हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें। यह सुनिश्चित करने के लिए मध्यम को ध्यान से पिपेट करें कि कोशिकाएं अलग न करें।
  4. भेदभाव की निगरानी करने के लिए (यानी, "गुंबदों" का गठन), चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1ए,बाएं पैनल) के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। यदि कोशिकाएं हरे रंग की फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) व्यक्त कर रही हैं, तो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (उत्तेजना = 485/20; उत्सर्जन = 530/25; आवर्धन 240x; 20x उद्देश्य)(चित्रा 1ए,सही पैनल) के तहत निरीक्षण करें।
  5. भेदभाव की डिग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हिप-इलाज कोशिकाओं और नियंत्रणों में से प्रत्येक पेट्री डिश से प्रोटीन निकालें, कुल 10 दिनों के लिए दिन में एक बार और "कैसिन की तालिका देखें)(चित्रा 1बी)के लिए पश्चिमी धब्बों कीजांच करें।
    1. 1.5 एमएल बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ बर्फ पर कोशिकाओं को 1.8 मिलीलीटर प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में परिमार्जन करें।
    2. 350 x ग्राम,1 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को गोली।
    3. जल्दी से बर्फ ठंडा PBS के साथ गोली 2x धोने। किसी भी अवशेष को छान लें।
    4. एक lysis बफर बनाओ: 50 mM HEPES (पीएच = 7.4), 150 mM NaCl, 10 एमएम ईटीए, 10 एमएम एनए4पी2ओ7,1% एनपी-40, 100 एमएम एनएफ, 2 एमएम एनए3वीओ4,0.5 एमएम फिनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ), 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin16. प्रति 3 सेमी पेट्री डिश में 100 माइक्रोन डालें।
    5. ठंड में 10,000 x के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा लाइसेट को स्पष्ट करें।
    6. प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें (सामग्री की तालिकादेखें) और प्रत्येक नमूने से 10-20 माइक्रोन प्रोटीन को 10% पॉलीएक्रिलामाइड-एसडीएस जेल पर लोड करें।
    7. 45 वी पर 15 घंटे के लिए इलेक्ट्रोफोरीज़, या ~ 2-2.5 घंटे के लिए 100 वी पर।
    8. इलेक्ट्रोब्लोटिंग ट्रांसफर उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके एक नाइट्रोसेल्यूलोज या पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
    9. 0.1% ट्वीन-20 (एसटीएसटी) के साथ ट्रिस-बफर लवलाइन में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ ब्लॉक करें।
    10. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, बकरी विरोधी-केसिन पतला 1:2,000 या माउस विरोधी-एसीटीन पतला 1:1,000 (सामग्री की तालिकादेखें)।
    11. TBST के साथ 3x धोएं, हर बार 5 मिन।
    12. माध्यमिक एंटीबॉडी, सहिजन पेरोक्सिडेस (एचआरपी) से जुड़े गधे विरोधी बकरी पतला 1:2,500, या एचआरपी से जुड़े घोड़ा विरोधी माउस एंटीबॉडी पतला 1:10,000 जोड़ें ।
    13. TBST के साथ 3x धोएं, हर बार 5 मिन।
    14. निर्माता के निर्देशों के अनुसार झिल्ली में ईसीएल एजेंट जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।

3. ईएचएस मैट्रिक्स में EpH4 कोशिकाओं की चढ़ाना और 3 डी वृद्धि

नोट: मैट्रिक्स तापमान पर तरल है और 10 डिग्री सेल्सियस और ऊपर के तापमान पर ठोस है । -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से पहले रात 4 डिग्री सेल्सियस पर गल। ऊतक संस्कृति प्लेटों और पिपेट युक्तियों को संभालने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर प्री-चिल करें और बर्फ पर मैट्रिक्स, प्लेटें और पिपेट युक्तियां रखें ताकि इसे जमना से रोका जा सके।

  1. 10% एफबीएस और 5 μg/mL इंसुलिन (EGF की आवश्यकता नहीं है) के साथ RPMI-1640 मध्यम में 2D में EpH4 कोशिकाओं को विकसित करें।
  2. दो 50 मिलील शंकुई ट्यूबों में 10% (v/v, 3,500 μL) या 20% (v/v 2,000 μL) मैट्रिक्स के साथ पूरक EpH4 विकास माध्यम तैयार करें। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
  3. 10 कुएं (1 सेमी2 प्रत्येक) 24 अच्छी प्लेट के 150 माइक्रोक्स के साथ। पिपेट टिप का उपयोग करके मैट्रिक्स फैलाएं। बुलबुले बनाने से बचें। धीरे-धीरे प्लेट के किनारों को क्षैतिज रूप से पकड़ते समय टैप करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मैट्रिक्स समान रूप से कुएं के नीचे वितरित किया जाता है।
  4. मैट्रिक्स को जमना करने की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. HC11 कोशिकाओं के लिए ऊपर वर्णित EpH4 कोशिकाओं को ट्राइप्सिनाइज करें और उन्हें हीमोसाइटोमीटर के साथ गिनें। एक 1.5 mL बाँझ शंकुभाटा ट्यूब के लिए प्रति अच्छी तरह से 5 x 104 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए 250 x ग्राम पर स्पिन करें।
  6. ध्यान से माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  7. EpH4 विकास मध्यम के 350 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें 20% मैट्रिक्स के साथ पूरक एक 1 mL पिपेट टिप का उपयोग करते हुए बर्फ पर शंकुट्यूब रखते हुए। बुलबुले से बचें। सिंगल सेल सस्पेंशन सुनिश्चित करना जरूरी है।
  8. एक बार जब नीचे की परत मैट्रिक्स जम गया है (मैट्रिक्स कुओं के प्रारंभिक कोटिंग की तुलना में पारदर्शी और हल्के रंग में दिखाई देना चाहिए), प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से सेल निलंबन के 350 μL जोड़ें और ~ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में जगह के लिए 20% मैट्रिक्स परत जमना करने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. 4x उद्देश्य के साथ चरण विपरीत के तहत कोशिकाओं को सूक्ष्म रूप से देखें। एकल कोशिकाएं दिखाई देनी चाहिए।
  9. 20% मैट्रिक्स में निलंबित कोशिकाओं के 350 माइक्रोन के शीर्ष पर 10% मैट्रिक्स युक्त EpH4 माध्यम के 200 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

4. EpH4 कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरण 3 डी में उगाया(चित्रा 2)

नोट: भेदभाव के अलावा, EpH4 कोशिकाओं को भी tubulogenesis से गुजरना कर सकते है जब 3 डी संस्कृति में HGF (हेपेटोसाइट विकास कारक) के साथ उत्तेजित । कूल्हे और एचजीएफ उत्तेजना के 10 दिनों के बाद ट्यूबलर आउटग्रोथ देखी जा सकती है।

  1. मैट्रिक्स में चढ़ाना के 1 दिन बाद EpH4 कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरण शुरू करते हैं। प्लास्टिक पिपेट टिप का उपयोग करके कुओं से 10% मैट्रिक्स युक्त शीर्ष माध्यम के 150 माइक्रोन को ध्यान से हटा दें। EpH4 माध्यम के 200 μL जोड़ें जिसमें हिप और 10% मैट्रिक्स होते हैं।
  2. 10 दिनों तक के लिए हर 2 दिन में 10% मैट्रिक्स-हिप मीडियम को बदलें। हिप के बिना एक ही 10% मैट्रिक्स माध्यम में नियंत्रण कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  3. चरण विपरीत(चित्रा 3ए,निचले पैनल) के तहत मैमोस्फीयर गठन की निगरानी करें।

5. 3 डी में उगाई गई EpH4 कोशिकाओं का ट्यूबलोजेनेसिस प्रेरण(चित्रा 3ए और 3 C)

  1. मैट्रिक्स में वृद्धि के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटें और EpH4 कोशिकाओं को तैयार करें, जैसा कि चरण 3.1-3.9 में विस्तृत है। मैट्रिक्स में कोशिकाओं चढ़ाना के बाद दिन, एक प्लास्टिक पिपेट टिप का उपयोग कर कुओं से 10% मैट्रिक्स युक्त EpH4 माध्यम के १५० μL हटा दें । EpH4 माध्यम के २०० μL जोड़ें जिसमें 10% मैट्रिक्स, हिप, और 20 एनजी/एमएल एचजीएफ (सामग्री की तालिकादेखें) शामिल हैं ।
  2. 12-14 दिनों तक के लिए हर 2 दिन में 10% मैट्रिक्स/हिप/एचजीएफ मीडियम को बदलें ।
  3. 20x या 40x उद्देश्य(चित्रा 3ए,सही पैनल) का उपयोग करके ट्यूबल गठन की माइक्रोस्कोपिक रूप से निगरानी करें।

6. भेदभाव की मात्रा: पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए

  1. कुओं से 10% मैट्रिक्स-हिप माध्यम को ध्यान से पिपेट करें। बर्फ-ठंडा पीबीएस के 350 माइक्रोन के साथ 20% मैट्रिक्स लेयर 2x कुल्ला करें। स्फेरॉइड अभी भी मैट्रिक्स परत में मौजूद होना चाहिए।
  2. कुओं में सीधे 1 mM एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड (EDTA) के साथ बर्फ-ठंडे पीबीएस के 700-1,000 माइक्रोन जोड़ें। धीरे से 100% मैट्रिक्स के नीचे की परत को कुएं से एक पिपेट टिप के साथ अलग करें ताकि उस परत में मौजूद स्फेरॉइड को ठीक किया जा सके। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए धीरे हिलाएं।
  3. स्फेरॉइड निलंबन को एक शंकुई ट्यूब पर सावधानीसे स्थानांतरित करें। कुओं में किसी भी शेष स्फेरॉइड को ठीक करने और शंकुई ट्यूब में जोड़ने के लिए पीबीएस-ईडीटीए के ~ 500 माइक्रोन के साथ कुओं को कुल्ला करें।
  4. एक अतिरिक्त 30 min के लिए बर्फ पर रॉक सुनिश्चित करें मैट्रिक्स पूरी तरह से भंग कर दिया है । यदि दिखाई देने वाले मैट्रिक्स झुरमुट देखे जाते हैं, तो अधिक पीबीएस-EDTA जोड़ें या लंबे समय तक हिलाएं।
  5. 5 मिन के लिए 350 x ग्राम पर स्फेरॉइड को गोली देने का समाधान केंद्राधीक्षक।
  6. सुपरनेटेंट को सुपर्रेट करें, बर्फ-ठंडा लिसिस बफर में स्फेरॉइड को बढ़ा दें, और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा पश्चिमी दाग द्वारा16से ऊपर के चरण 2.5 के रूप में जांच करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में, बकरी विरोधी-केसिन पतला 1:2,000, खरगोश विरोधी साइक्लिन डी 1 पतला 1:2,000, और माउस एंटी-पी120 पतला 1:2,000 का उपयोग करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, एचआरपी से जुड़े गधे विरोधी बकरी पतला 1:2,500 का उपयोग करें, एचआरपी से जुड़े गधे विरोधी खरगोश पतला 1:2,500, और एचआरपी से जुड़े घोड़ा विरोधी माउस पतला 1:10,000 ।

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Representative Results

यह लंबे समय से ज्ञात है कि एपिथेलियल कोशिकाओं और आदिपोसाइट्स के विभेदन के लिए कैथेरिन2के संगम और जुड़ाव की आवश्यकता होती है । हमने और अन्य लोगों ने यह प्रदर्शित किया कि सेल-टू-सेल आसंजन और ई-या एन-कैथेरिन और कैथेरिन-11 की सगाई, जैसा कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के संगम के साथ होता है, छोटे GTPases आरएसी और सेल डिवीजन नियंत्रण प्रोटीन 42 (Cdc42) की गतिविधि में नाटकीय वृद्धि को ट्रिगर करता है, और इस प्रक्रिया से इंटरल्यूकिन-6 (आईएल6) परिवार साइटोकिन्स और स्टेट3 (सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन-316,17)1,18,19की सक्रियता होती है। क्योंकि कैथेरिन/आरएसी/आईएल6/स्टेट3 मार्ग के कई घटक भेदभाव और नियोप्लास्टिक परिवर्तन दोनों में भाग ले सकते हैं, वे इन दो बिल्कुल विरोध प्रक्रियाओं के परस्पर संबंधितता के अध्ययन के लिए आणविक हैंडल प्रदान करते हैं ।

ऊपर वर्णित तकनीकों का उपयोग करते हुए, हमने एचसी11 कोशिकाओं में आरएसी सिग्नल की ताकत पर भेदभाव की एक हड़ताली निर्भरता का प्रदर्शन किया: जबकि अंतर के लिए एंडोजेनस क्रे1 की आवश्यकता होती है, और निम्न स्तर पर उत्परिवर्तनीय रूप से सक्रिय आरएसीV12 अंतर क्षमता में एक अलग वृद्धि का कारण बनता है, उच्च आरएसीV12 स्तर नियोप्लासिया(चित्रा 1बी)को प्रेरित करते हुए भेदभाव के नाटकीय ब्लॉक को ट्रिगर करता है। इसके विपरीत, आरएसीV12 अभिव्यक्ति के निम्न स्तर ने ईपीएच 4 कोशिकाओं2में भेदभाव को अवरुद्ध कर दिया। इसके अलावा, भले ही आरएसीV12 एचसी1116सहित कई सेल सिस्टम में Stat3 को सक्रिय करता है, उत्परिवर्तनीय रूप से सक्रिय Stat3C ने नियोप्लास्टिक परिवर्तन20को प्रेरित करते हुए भेदभाव को अवरुद्ध कर दिया।

हमने 3डी मैट्रिक्स संस्कृति में EpH4 कोशिकाओं के भेदभाव गुणों का पता लगाया। जबकि-कैसिन उत्पादन 8-10 दिनों में नुकीला, साइक्लिन डी-1 अभिव्यक्ति कूल्हे उत्तेजना के बाद 4-6 दिनों में अधिकतम था(चित्रा 3बी)। ये निष्कर्ष EpH4 मॉडल में प्रसार और भेदभाव के बीच एक व्युत्क्रम संबंध का समर्थन करते हैं । व्यक्तिगत एपिथेलियल कोशिकाओं की स्थिति निर्धारित करने के लिए डीएपीआई (परमाणु) धुंधला और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने आंतरिक कोशिका मृत्यु और मैमोस्फीयर(चित्रा 3ए, सी)में खोखले लुमेंस के गठन का अवलोकन किया। हमने आगे दिखाया कि कूल्हे के माध्यम से ४८ घंटे में एचजीएफ (20 एनजी/एमएल) के अलावा ट्यूबलर संरचनाओं(चित्रा 3ए, सी),पहले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन21के अनुरूप के गठन के परिणामस्वरूप । EpH4 मॉडल का उपयोग कर ये दृष्टिकोण स्तन एपिथेलियल भेदभाव की विशिष्ट विशेषताओं और अलग संकेत ट्रांसड्यूक्शन रास्तों के साथ उनके सहयोग के लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एचसी11 सेल भेदभाव का मूल्यांकन और मात्रा। (A)अंतर के शामिल होने के बाद 10 दिनों में जीएफपी-आरएसीवी 12 के निम्न स्तर को व्यक्त करने वाली एचसी11 कोशिकाओं में गठित एक गुंबद। बाएं: चरण-विपरीत; सही: एक ही क्षेत्र के Fluorescence (तस्वीरें पहले प्रकाशित नहीं) । स्केल बार = 100 माइक्रोन; आवर्धन = 240x; 20x उद्देश्य। (ख)एचसी11 विभेदन पर आरएसीV12 का प्रभाव: कम (लेन 19-24), मध्यवर्ती (लेन 13-18), या उच्च (लेन 7-12) एक आरएसीV12के स्तर-GFP संलयन निर्माण HC11 कोशिकाओं में व्यक्त किए गए । 24 घंटे के लिए EGF की अनुपस्थिति में वृद्धि के बाद, कोशिकाओं को हिप इसके अलावा, या नहीं, के रूप में संकेत के साथ अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया । डिटर्जेंट अर्क दिनों की इंगित संख्या में तैयार किए गए थे और लोडिंग नियंत्रण के रूप में केसिन या ऐक्टिन के लिए जांच की गई थी। कम आरएसीV12में केसिन में नाटकीय वृद्धि पर ध्यान दें -GFP कोशिकाओं (लेन 21-24 बनाम 3-6) व्यक्त करते हैं, और उच्च आरएसीV12-GFP (लेन 9-12) की अभिव्यक्ति पर नाटकीय कमी। NE = नियंत्रण संस्कृतियों, EGF की अनुपस्थिति में उगाया जाता है, लेकिन अंतर करने के लिए प्रेरित नहीं (Niit एट अल2,अनुमति के साथ पुन: पेश) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 3 डी मैट्रिक्स संस्कृति में EpH4 कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए ओवरले विधि की योजनाबद्ध । (A)6 अच्छी प्लेट के कुओं को शुरू में 100% ईएचएस मैट्रिक्स के साथ लेपित किया गया था जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर जमना करने की अनुमति दी गई थी, जिससे बेसमेंट झिल्ली का एक जेल्ड बिस्तर बन गया था जो मोटाई में लगभग 2-5 मिमी मापता था। EpH4 कोशिकाओं को 20% मैट्रिक्स के साथ हिप माध्यम में एक सेल निलंबन के रूप में इस बिस्तर पर वरीयता प्राप्त थे । यह हिप माध्यम में 10% मैट्रिक्स के साथ ओवरले किया गया था। हर दूसरे दिन 10% मैट्रिक्स मीडियम को बदला गया। कोशिकाएं बढ़ी और संस्कृति में 4-5 दिनों के बाद मैमोस्फीयर बनाना शुरू किया (प्रोटोकॉल अनुभाग देखें)। (ख)2डी (मोनोलेयर) और 3डी (मैमोस्फीयर) संस्कृति में EpH4 कोशिकाओं की चरण विपरीत छवियों को डिजिटल कैमरे (300x आवर्धन) से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। प्रत्येक चरण में प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 3 डी संस्कृति में EpH4 के 3D acinar morphogenesis में घटनाओं । (A) ईपीएच 4 कोशिकाओं को मैट्रिक्स-लेपित 6 अच्छी प्लेटों में उगाया गया था और चित्र ा 2में पूर्ण 3 डी माध्यम में बनाए रखा गया था । मॉर्फोजेनेसिस के शुरुआती चरणों के दौरान, कोशिकाओं ने दो समूहों का गठन किया, और दो समूहों में संगठित किया: (1) ध्रुवीकृत कोशिकाओं की एक बाहरी परत और (2) अव्यवस्थित कोशिकाओं का एक आंतरिक समूह जो कोशिका मृत्यु से गुजरा, जैसा कि पहले12दिखाया गया है। उत्तरार्द्ध ने एक खोखले लुमेन के गठन का नेतृत्व किया, जो मैमोस्फीयर के केंद्र के अंधेरे की विशेषता है जैसा कि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया है। माध्यम के लिए एचजीएफ (20 एनजी/एमएल) के अलावा ट्यूबलर संरचनाओं का गठन हुआ । एचजीएफ-प्रेरित समुचेश के 60% से अधिक ने अनुपचारित नियंत्रण समुचेग्यास की तुलना में ट्यूबलोजेनेसिस दिखाया, जो नहीं हुआ। प्रत्येक चरण में कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि चरण विपरीत तस्वीर को डिजिटल कैमरे (300x आवर्धन) से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था; स्केल बार = 100 माइक्रोन)। परिणाम कम से कम तीन प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। योजनाबद्ध स्टारोवा एट अल22से अनुकूलित किया गया था । (ख)3 डी में उगाई गई ईपीएच4 कोशिकाओं को संकेत ित दिनों में काटा गया था । प्रोटीन सांद्रता सामान्यीकृत किया गया और समान प्रोटीन मात्रा (20 μg) SDS-पेज के अधीन थे, पश्चिमी दाग और संकेत एंटीबॉडी के साथ जांच के बाद । स्तनपान कराने वाले माउस (एमजीटी) से एक समरूप स्तन ग्रंथि का उपयोग वीवो तुलना में किया जाता था। p120RasGAP एक स्वतंत्र लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। साइक्लिन डी 1 अभिव्यक्ति पहले 3-4 दिनों में कोशिकाओं को बढ़ाने के साथ क्षणिक रूप से बढ़ी। इसके विपरीत, परिपक्व मैमोस्फीयर के गठन के अनुरूप, 8-10 दिनों में अभिव्यक्ति में गिरावट आई। परिणाम दो प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । (ग)मैमोस्फीयर के लुमेन गठन और ट्यूबलोजेनेसिस की पुष्टि मैट्रिक्स-कोटेड ग्लास कवरस्लिप पर उगाए गए समुच्य में परमाणु डीएनए (फ्लोरोसेंट ब्लू) के डीएपीआई धुंधला का उपयोग करके की गई थी । कोशिकाओं को 3% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था, जो 25 μg/mL डिजिटोनिन के साथ परमीबिलाइज्ड था, और 3% बीएसए के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध किया गया था । इसके बाद कोशिकाओं को DAPI (नीले) के साथ परमाणु डीएनए के लिए दाग दिया गया । एक बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर कवरस्लिप मुहिम शुरू की गई थी । मल्टीफोर्न कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (स्केल बार = 100μm) का उपयोग करके केंद्रीय XY-एक्सिस विमान के फोटोमाइक्रोग्राफ लिए गए थे। पैनल बी और सी में छवियों Starova एट अल22से अनुकूलित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

HC11 कोशिकाएं आदर्श रूप से नियोप्लास्टिक परिवर्तन के साथ भेदभाव के अध्ययन के लिए अनुकूल हैं। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एचसी11 कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के जीन व्यक्त करने के लिए मो-एमएलवी-आधारित रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ आसानी से संक्रमित होती हैं। हमारे हाथों में, EpH4 कोशिकाओं को एचसी112की तुलना में एक ही रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ संक्रमित करने के लिए और अधिक कठिन थे ।

सेल-टू-सेल संपर्क और विकास गिरफ्तारी एचसी11 सेल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताएं हैं। इस प्रकार, सेल परत में एक समान भेदभाव प्राप्त करने के लिए, सीडिंग के समय पेट्री डिश में कोशिकाओं का एक समान वितरण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। यदि भेदभाव की मात्रा वांछित है तो यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। ट्राइप्सिनाइजेशन को अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि एक भी सेल निलंबन प्राप्त हो और कोशिकाएं जोड़तोड़ के कारण व्यवहार्यता खो न दें।

कोशिकाओं को ट्राइप्सिनकिया जा रहा है सबकॉन्शुएंट (50-70%), क्योंकि उच्च घनत्व के लिए उगाई जाने वाली कोशिकाएं एक दूसरे का दृढ़ता से पालन करती हैं, और उन्हें अलग करना मुश्किल है। कोशिकाओं को सुखाने से बचने के लिए, लैमिनार प्रवाह हुड के फर्श पर पेट्री डिश फ्लैट के साथ एस्पिरेट, फिर जल्दी से छानने के लिए झुकाएं। पेट्री डिश को ढक्कन से ढक दें। जरूरत पड़ी तो पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखकर ट्राइप्सिन की क्रिया में तेजी आ सकती है।

क्योंकि कोशिकाओं को शामिल करने के बाद 10 दिनों के दौरान बहुत अनुकूल हैं, यह पोषक तत्वों है कि समाप्त कर रहे है की जगह महत्वपूर्ण है । जब माध्यम बदल जाता है, तो कोशिकाओं की टुकड़ी से बचने के लिए देखभाल भी की जानी चाहिए, जो उच्च कोशिका घनत्व के कारण प्लास्टिक का बहुत अच्छी तरह से पालन नहीं कर सकती है। फिर भी, हमारे अनुभव में अच्छे भेदभाव परिणाम प्राप्त करने के लिए फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन या सेलटाक के साथ लेपित पेट्री व्यंजनों का उपयोग करना आवश्यक नहीं है, 3T3L123 या Balb/c3T3 डेरिवेटिव जैसे अंतर परडिफाइड पेडिपोसाइट्स के विपरीत ।

दाग प्रयोगों के लिए सटीक प्रोटीन निर्धारण महत्वपूर्ण है। क्योंकि सीरम प्रोटीन ऊतक संस्कृति ग्रेड प्लास्टिक के लिए संलग्न करने के लिए करते हैं, यह परिमार्जन और एक १.५ mL प्लास्टिक ट्यूब है कि प्रोटीन को आकर्षित नहीं करता है और सेल गोली पर lysis बफर जोड़ने के बजाय सीधे पेट्री डिश24पर कोशिकाओं को ले जाता है में कोशिकाओं को धोने के लिए महत्वपूर्ण है ।

प्रोटीन निष्कर्षण के बारे में, यह बहुत महत्वपूर्ण है सभी धोने और lysis समाधान बर्फ ठंड और पेट्री व्यंजन या EpH4 मैमोस्फीयर भर में बर्फ पर रखने के लिए । इसका कारण यह है कि पीबीएस धोने में कैल्शियम की अनुपस्थिति में कैथेरिन नहीं लगे हुए हैं और परिणामस्वरूप स्टेट3-ptyr705 तेजी से25का अपमान होता है।

HC11 कोशिकाओं के लिए वर्णित पेट्री व्यंजनों का आकार 3-4 पश्चिमी धब्बों के लिए पर्याप्त है (यानी, प्रति पेट्री डिश बरामद प्रोटीन की मात्रा लगभग 50 माइक्रोग्राम प्रति 3 सेमी डिश है)। हम प्रोटीन निष्कर्षण की सुविधा के लिए भेदभाव प्रयोगों के लिए 3 सेमी पेट्री व्यंजन का उपयोग करना पसंद करते हैं। यदि इसके बजाय 6 अच्छी तरह से ट्रे का उपयोग किया जाता है, तो बाकी कुओं को बाँझ रखते हुए ठंड में एक अच्छी तरह से प्रोटीन निकालना मुश्किल है। इसके अलावा, सीओ2 एकाग्रता भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है और बाकी कुओं के लिए इसे बनाए रखना मुश्किल है क्योंकि बेंच पर एक कुएं से प्रोटीन निकाला जा रहा है ।

हमारे अनुभव में, preadipocytes23के भेदभाव के विपरीत, भ्रूण बछड़े सीरम के कई बहुत से विकास के साथ ही HC11 या EpH4 कोशिकाओं के भेदभाव का समर्थन करने में सक्षम हैं । नवजात बछड़े सीरम परीक्षण के एक बहुत भेदभाव का समर्थन नहीं किया, हालांकि यह सामांय विकास का समर्थन कर सकता है: कोशिकाओं को पहली बार में अंतर दिखाई दिया, लेकिन नवजात बछड़े सीरम में तीन मार्ग के बाद अंतर करने की क्षमता खो दिया है ।

HC11 कोशिकाओं के विपरीत, EpH4 कोशिकाओं का भेदभाव कसकर आसपास के 3 डी मैट्रिक्स वास्तुकला से जुड़ा हुआ है। हम पिछले अध्ययनों26,27,28 और बाद में प्रोटीन निष्कर्षण से संशोधित 3 डी संस्कृति में EpH4 भेदभाव के लिए आवश्यक कदम का वर्णन करते हैं। ईएचएस मैट्रिक्स कम तापमान (<10 डिग्री सेल्सियस) पर तरल होता है और उच्च तापमान पर जम जाता है। यह सामान्य रूप से -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, लेकिन काम करने वाले एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। उपयोग से पहले रात 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स गल और पूर्व ठंडा ऊतक संस्कृति प्लेटों और हैंडलिंग से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर पिपेट युक्तियां। प्रोटीन एकाग्रता के सटीक आकलन के लिए ठंडे पीबीएस धोने के साथ निष्कर्षण से पहले मैट्रिक्स को पूरी तरह से खत्म करना महत्वपूर्ण है क्योंकि मैट्रिक्स प्रोटीन से भरपूर है, जो प्रोटीन निर्धारण परिणामों को चकित कर सकता है।

भेदभाव के लिए मैट्रिक्स पर EpH4 निर्भरता कई प्रयोगात्मक मॉडलों में प्रदर्शित किया गया है: Reichman एट अल.10 से पता चला है कि लैक्टोजेनिक हार्मोन द्वारा प्रेरित EpH4 कोशिकाओं टुकड़े टुकड़ा करने की स्थिति और तेज साइटोकेराटिन अभिव्यक्ति के क्षेत्रों के भीतर केसिन का उत्पादन किया । सोमासिरी एट अल11 ने दिखादिया कि जंक्शन पर निर्भर स्फेरॉइड गठन और अंतर दूध प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए PI3-kinase की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, ब्रिंकमैन एट अल.21 ने ईपीएच 4 कोशिकाओं में ट्रांससंक्रमित एचजीएफ सीडीएनए की अभिव्यक्ति को 3 डी संस्कृति मॉडल में स्फेरॉइड के ट्यूबोजेनेसिस को शाखामें बंटी प्रेरित किया, जो यहां देखे गए एचजीएफ-प्रेरित ट्यूबल गठन के अनुरूप है(चित्रा 3ए,सी)। ये निष्कर्ष सिग्नलिंग घटनाओं का अध्ययन करने के लिए EpH4 सेल लाइन मॉडल के फायदे को दर्शाते हैं जो स्तन ग्रंथि भेदभाव को विनियमित करते हैं।

EpH4 कोशिकाओं को भी मैमोस्फीयर बना सकते है जब भ्रूण बछड़े सीरम की सांद्रता पर चढ़ाया 10% से कम वर्णित है । दिलचस्प बात यह है कि वे कम सांद्रता पर मैमोस्फीयर बना सकते हैं, या यहां तक कि 20% या 10% मैट्रिक्स की अनुपस्थिति में, जब 100% मैट्रिक्स22,27की परत के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है। सेल निलंबन में मैट्रिक्स के अभाव में, कोशिकाओं को ठंडा करने से बचा जाता है। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि सभी कोशिकाएं एक ही विमान में पाई जाती हैं, इसलिए उन्हें तस्वीर बनाना आसान होता है।

महत्व: सुसंस्कृत कोशिकाओं में Cadherin सगाई, जो वीवो में एक सेल के शारीरिक राज्य का अनुमान है, आरएसी/IL6/Stat3 मार्ग को सक्रिय कर सकते हैं । यह विशेष रूप से एपिथेलियल सेल भेदभाव में महत्वपूर्ण हो सकता है। वर्णित तकनीकों का उपयोग करते हुए, हमारे परिणामों ने सेल प्रसार बनाम भेदभाव, दो मौलिक रूप से विरोध की गई प्रक्रियाओं2के बीच संतुलन में एक केंद्रीय निर्धारक के रूप में इस मार्ग से निकलने वाले संकेत की तीव्रता को उजागर किया। ई-कैथेरिन/आरएसी/स्टेट3 धुरी की गहन जांच अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर मार्ग के उपन्यास उभयचर घटकों को उजागर कर सकती है, जिसका कैंसर थेरेपी के लिए लक्ष्य के रूप में शोषण किया जा सकता है । ऐसे लक्ष्यों के लिए, नियोप्लास्टिक फेनोटाइप को रिवर्स करने के लिए पूर्ण अवरोध आवश्यक नहीं होगा। आंशिक अवरोध भी फायदेमंद होगा, क्योंकि अवशिष्ट मात्रा वास्तव में परिवर्तन को अवरुद्ध कर सकती है और भेदभाव को बढ़ावा दे सकती है। यह लक्ष्य के साथ-साथ प्रश्न में ट्यूमर के प्रकार के साथ भिन्न हो सकता है, जैसा कि आरएसीV12 बनाम Stat3C के विभिन्न व्यवहार से दिखाया गया है, एचसी11 बनाम EpH4 कोशिकाओं2,20में।

भविष्य के अनुप्रयोग: कैथेरिन/आरएसी/आईएल6/स्टेट3 पाथवे अन्य एपिथेलियल कोशिकाओं के भेदभाव में इसी तरह की भूमिका निभा सकता है, जैसे मानव स्तन MCF10A या कैनाइन किडनी एमडीकेसी29 सेल लाइनें, साथ ही अन्य प्रकार के अंतर जो सेल संगम पर निर्भर करते हैं, जैसे कि प्रांडिसिट्स और मायोब्लास्ट30,जो विभिन्न प्रकार के कैडिफायर्स व्यक्त करते हैं । अंत में, इस तकनीक का फायदा Stat531 की भूमिका और अंतर मार्गों के अन्य घटकों की जांच के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

एचसी11 सेल लाइन कृपया डॉ डी मदीना (ह्यूस्टन, TX) द्वारा प्रदान की गई थी । लेखक कई अभिकर्मकों और मूल्यवान सुझावों के लिए रानी विश्वविद्यालय के डॉ एंड्रयू क्रेग के आभारी हैं । EpH4 कोशिकाओं डॉ सी Roskelley (UBC, वैंकूवर) से एक उपहार थे । कोलीन Schick 3 डी संस्कृति अध्ययन के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है।

कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), कनाडा के स्तन कैंसर फाउंडेशन (CBCF, ओंटारियो अध्याय), कनाडा के स्तन कैंसर अनुसंधान एलायंस की वित्तीय सहायता , ओंटारियो उत्कृष्टता के केंद्रों, स्तन कैंसर कार्रवाई किंग्स्टन (BCAK) और CLARE नेल्सन वसीयत कोष एलआर को अनुदान के माध्यम से कृतज्ञता से स्वीकार किया है । CIHR, CBCF, BCAK और कैंसर रिसर्च सोसायटी इंक PTG से अनुदान समर्थन प्राप्त हो एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी, कनाडा के फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, CIHR, NSERC और कनाडा के कैंसर सोसायटी द्वारा समर्थित है । एमएन को एनएससी से ट्रांसडिसिप्लिनरी कैंसर रिसर्च में टेरी फॉक्स ट्रेनिंग प्रोग्राम से एक छात्रता और क्वीन यूनिवर्सिटी से डीन अवार्ड का समर्थन मिला था । एमजी अमेरिकी सेना स्तन कैंसर कार्यक्रम, ओंटारियो प्रांत के अनुसंधान और नवाचार मंत्रालय और रानी विश्वविद्यालय की सलाहकार अनुसंधान समिति से पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित था । VH एक CBCF डॉक्टरेट फैलोशिप और CIHR के साथ साझेदारी में ट्रांसडिसिप्लिनरी कैंसर रिसर्च में टेरी फॉक्स फाउंडेशन प्रशिक्षण कार्यक्रम से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित था । Hanad Adan एक NSERC ग्रीष्मकालीन छात्रता के प्राप्तकर्ता थे । बी एस को क्वीन यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट अवॉर्ड का सपोर्ट मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution Bio Rad 1610154 Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibody rabbit, Santa Cruz sc-717 Western Blotting
Anti-p120 antibody mouse, Santa Cruz sc-373751 Western Blotting
Anti-β actin antibody mouse, Cell Signalling technology 3700 Western Blotting
Anti-β casein antibody goat, Santa Cruz Biotechnology sc-17971 Western Blotting
Aprotinin Bio Shop APR600 Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid Solution Sigma B9643-1L-KC Protein Determination
Bovine serum albumin Bio Shop ALB007.500 Protein Determination
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad 170-5061 Western Blotting
Copper(II) sulphate Sigma C2284-25ML Protein Determination
DAPI Thermofisher Scientific D1306 Staining
Digitonin Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd 14952-500 Staining
EDTA Bio Shop EDT001.500
Epidermal Growth Factor Sigma E9644 Medium for HC11 Cells
Fetal calf serum PAA A15-751 Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRP Santa Cruz SC-2004 Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinant Gibco PHG0321
Hepes Sigma 7365-45-9 Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRP Cell Signalling Technology 7076 Western Blotting
Hydrocortisone Sigma H0888 HIP Medium
insulin Sigma I6634 HIP Medium
Laminar-flow hood BioGard Hood Cell Culture
Leupeptin Bio Shop LEU001.10 Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) Corning CACB 354230
Mouse Anti-Goat HRP Santa Cruz sc-8360 Western Blotting
Mowiol 4-88 Reagent Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd 475904-100GM Staining
Multi-photon confocal microscope Leica TCS SP2
Na3VO4 Bio Shop SOV850 Lysis Buffer
Na4P207 Sigma 125F-0262 Lysis Buffer
NaCl Bio Shop SOD001.1 Western Blotting
NaF Fisher Scientific 7681-49-4 Lysis Buffer
Nikon digital Camera Coolpix 995
Nitrocellulose Bio Rad 1620112 Western Blotting
NP-40 Sigma 9016-45-9
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 Staining
Phase Contrast Microscope Olympus IX70 Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluoride Sigma 329-98-6 Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12V Addgene 14567
Prolactin Sigma L6520 HIP Medium
RPMI-1640 Sigma R8758 Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35 Sarstedt 83.3900. Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 well Sarstedt 83.1836.300 Cell Culture
Transfer Apparatus CBS Scientific Co EBU-302 Western Blotting
Tris Acetate Bio Shop TRA222.500 Western Blotting
Trypsin Sigma 9002-07-7. Cell Culture
Tween-20 Bio Shop TWN510.500 Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis System CBS Scientific Co MGV-202-33 Western Blotting

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Geletu, M., Hoskin, V., Starova, B., Niit, M., Adan, H., Elliott, B., Gunning, P., Raptis, L. Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells. J. Vis. Exp. (156), e60147, doi:10.3791/60147 (2020).

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