Summary
Descriviamo tecniche per l'induzione della differenziazione di due linee epiteliali mammarie, HC11 ed EpH4. Mentre entrambi richiedono siero di vitello fetale, insulina e prolattina per produrre proteine del latte, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in mammosfere in coltura tridimensionale. Questi modelli complementari sono utili per gli studi di trasduzione del segnale di differenziazione e neostrulasia.
Abstract
I cadherin svolgano un ruolo importante nella regolazione della differenziazione cellulare e della neoplasia. Qui descriviamo le origini e i metodi dell'induzione della differenziazione di due linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 ed EpH4, e il loro uso per studiare fasi complementari dello sviluppo della ghiandola mammaria e della trasformazione neoplastica.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 ha avuto origine dalla ghiandola mammaria di un topo balb/c incinta. Si differenzia quando viene coltivato alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto Petri di plastica in un mezzo contenente siero di vitello fetale e Hydrocortisone, Insulin e Prolactin (medium HIP). In queste condizioni, le cellule HC11 producono le proteine del latte proteina acida (WAP), simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano, e formano rudimentali strutture simili a ghiandole mammarie definite "cupole".
La linea cellulare EpH4 è stata derivata da cellule epiteliali mammarie topoimmortalizzate spontaneamente isolate da un topo balb/c incinta. A differenza dell'HC11, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in sferoidi (chiamati anche mammosferie) quando coltivate in condizioni di crescita tridimensionali (3D) nel mezzo HIP. Le cellule sono ortopsinizzate, sospese in una matrice del 20% costituita da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte da cellule di sarcoma tono Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), placcate sopra uno strato di matrice concentrata che riveste una piastra Petri di plastica o piastra multiwell, e coperte da uno strato di mezzo HIP composto da matrice del 10%. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi cavi che presentano polarità apicale-basale, un lume cavo, e producono la caseina e la WAP.
Utilizzando queste tecniche, i nostri risultati hanno dimostrato che l'intensità del segnale cadherin/Rac è fondamentale per la differenziazione delle cellule HC11. Mentre Rac1 è necessario per la differenziazione e bassi livelli di Attivato RacV12 aumentare la differenziazione, alti livelli di RacV12 bloccano la differenziazione mentre inducono neoplasia. Al contrario, le cellule EpH4 rappresentano una fase precedente nella differenziazione epiteliale mammaria, che è inibita anche da bassi livelli di RacV12.
Introduction
Nei tessuti normali o tumori, le cellule hanno ampie opportunità di adesione ai loro vicini in un'organizzazione tridimensionale, e questo è imitato nella coltura dalla crescita cellulare ad alta densità. L'adesione da cellula a cellula è mediata principalmente attraverso i recettori della cadherin, che definiscono l'architettura cellulare e tissutale. È interessante notare che è stato recentemente dimostrato che le cadherine svolgono anche un ruolo potente nella trasduzione del segnale, specialmente nella segnalazione di sopravvivenza1. Paradossalmente, alcuni di questi segnali di adesione da cellula a cellula provenienti da cadherins sono stati recentemente trovati per essere condivisi sia dalla differenziazione che dalla neoplasia2. Qui, descriviamo i metodi di induzione e valutazione della differenziazione in due tipi rappresentativi di linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 e EpH4.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 può fornire un modello utile per lo studio della differenziazione delle cellule epiteliali. Le cellule HC11 sono una linea cellulare derivata da COMMA-1D, proveniente dalla ghiandola mammaria di un topo Balb/c a metà gravidanza3. A differenza di altri cloni derivati COMMA-1D, il clone hC11 non ha alcun requisito per la matrice extracellulare aggiunta esogenao o la cocoltivazione con altri tipi di cellule per l'induzione in vitro del gene endogeno della caseina endogena dagli ormoni lattogenici3 . Questa linea cellulare è stata ampiamente utilizzata negli studi di differenziazione perché ha mantenuto importanti caratteristiche del normale epitelio mammario: le cellule HC11 possono parzialmente ricostituire l'epitelio duttale in un cuscinetto di grasso mammario eliminato4. Inoltre, possono differenziarsi in una coltura bidimensionale (2D) quando coltivati alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto di Petri di plastica in presenza di uno steroide come Hydrocortisone o Dexamethasone, oltre a Insulin e Prolactin (media HIP) privo di fattore di crescita epidermica (EGF), un inibitore della differenziazione5,6,7. In queste condizioni, le cellule HC11 producono proteine del latte come la caseina e la WAP, che sono rilevabili dalla gonfiore occidentale entro 4 giorni dall'induzione. Allo stesso tempo, una porzione di cellule HC11 forma strutture rudimentali simili alla ghiandola mammaria definite "cupole" in modo stocastico. Le cupole sono visibili 4-5 giorni dopo l'induzione e aumentano gradualmente di dimensioni fino al giorno 10, concomitanti con un aumento della produzione di banofaz 8. È interessante notare che le cellule HC11 possiedono p539mutanti e quindi rappresentano uno stato preneoplastico. Per questo motivo, il modello HC11 è ideale per studiare le reti di segnalazione di differenziazione in combinazione con la neoplasia nello stesso sistema cellulare.
Le cellule EpH4, un derivato delle cellule IM-2, sono una linea cellulare non tumorale originariamente derivata da cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo immortalate spontaneamente isolate da un topo balb/c medio-gravidanza10. Le cellule EpH4 formano monostrati epiteliali continui in coltura 2D, ma non si differenziano in strutture simili alla ghiandaia10,11. Tuttavia, a seguito della crescita 3D in un materiale costituito da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte dalle cellule sarcoma del topo EHS12 (matrice EHS, matrice o Matrigel, vedi Tabella dei materiali), oltre alla stimolazione con HIP, le cellule EpH4 possono ricapitolare le fasi iniziali della differenziazione della ghiandola mammaria. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi (chiamati anche mammosferie) che presentano polarità apicale-basale e un lume cavo, e sono in grado di produrre le proteine del latte, la caseina e la WAP, simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano. Contrariamente alle cellule HC11, che sono indifferenziate, e alcuni esprimono marcatori mesenchymal13, cellule EpH4 mostrano una morfologia puramente luminale14. Cellule EpH4 sono stati segnalati anche per produrre proteine del latte nella coltura 2D attraverso la stimolazione con dexamethasone, insulina, e prolattina15. Tuttavia, questo approccio preclude lo studio degli effetti normativi che imitano il microambiente della ghiandola mammaria nella coltura 3D.
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Protocol
1. Placcatura delle cellule HC11
- In una cappa a flusso laminare utilizzando tecniche sterili preparare una bottiglia con 50 mL di HC11 mezzo cellulare: RPMI-1640 con 10% siero bovino fetale (FBS), 5 insulina g/mL, e 10 ng/mL EGF (vedi Tabella dei materiali).
- Piatto di circa 400.000 cellule per piatto Petri da 3 cm: Passare due piatti Petri 10 cm, 50% confluenti in venti piatti 3 cm in mezzo HC11. Le cellule devono essere ben distribuite, ma l'essiccazione deve essere evitata.
- Aspirare il mezzo in un pallone utilizzando una pompa a vuoto.
- Aggiungete 250 di cfrina (vedi Tabella dei materiali)per piastra da 10 cm. Swirl e colpire la piastra dai lati mantenendolo orizzontale per diffondere la trypsin e per spostare le celle collegate
- Osservare la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 4x per assicurarsi che le cellule abbiano iniziato a staccarsi dai bordi prima del pipettaggio.
- Aspirata circa 1,5 mL di HC11 medio in uno sterile, 9 pollici Pasteur pipetta e schizzare verticalmente contro le cellule. Ruotare il piatto Petri mentre si schizza per spostare tutte le cellule. È necessario lavorare velocemente per evitare l'essiccazione delle cellule.
- Trasferire tutte le celle alla bottiglia con il mezzo HC11 e il vortice.
- Pipette 2 mL di sospensione cellulare in ogni piatto Petri di 3 cm. Rock i piatti Petri trasversalmente per diffondersi in modo uniforme. Collocare le cellule in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi.
- Il giorno successivo, o quando le cellule sono confluenti del 90-100%, aspirano il mezzo e sostituirlo con mezzo con FBS e insulina ma manca di EGF.
2. Induzione della differenziazione, monitoraggio e quantitazione delle cellule HC11
- Dopo aver fatto crescere le cellule in media privo EGF per 24 h, aggiungere il mezzo di differenziazione (medium HIP) a dieci piastre da 3 cm: RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1 g/mL Hydrocortisone (vedi Tabella dei materiali),5 g/mL Insulin e 5 g/mL Prolactin (vedi Tabella dei Materiali) per un massimo di 10 giorni.
- Mantenere le altre dieci piastre da 3 cm come controlli: passare a un mezzo con 10% FBS e 5 insulina sg/mL privo di EGF e HIP.
- Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni in sia cellule trattate con HIP che con controlli. Pipette il mezzo con attenzione per assicurarsi che le cellule non si stacchino.
- Per monitorare la differenziazione (cioè la formazione di "cupole"), osservare le cellule in microscopia a contrasto di fase (Figura 1A, pannello sinistro). Se le cellule esprimono proteine a fluorescenza verde (GFP), osservate sotto microscopia a fluorescenza (eccitazione - 485/20; emissione - 530/25; ingrandimento 240x; obiettivo 20x) (Figura 1A, pannello destro).
- Per quantificare il grado di differenziazione, estrarre le proteine da un piatto Petri ciascuna delle cellule e dei controlli trattati con HIP, una volta al giorno per un totale di 10 giorni e sondare le macchie occidentali per la caseina (vedi Tabella dei materiali)(Figura 1B).
- Raschiare le cellule sul ghiaccio con una salina con buffer di fosfato a freddo ghiaccio da 1,5 ml in un tubo di centrifuga in plastica da 1,8 ml.
- Pellele cellule a 350 x g, 1 min, 4 gradi centigradi.
- Lavare rapidamente il pellet 2x con PBS ghiacciato. Scolare i residui.
- Creare un buffer di lisi: 50 mHE HEPES (pH - 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 g/mL di aprotinina, 10 g/mL leupeptina16. Aggiungere 100 l per 3 cm di piatto Petri.
- Chiarire il lisato dalla centrifugazione a 10.000 x g per 10 min al freddo.
- Determinare la concentrazione di proteine (vedi Tabella dei materiali)e caricare da 10 a 20 g di proteine da ciascun campione su un gel poliacrilamitilminismo-SDS del 10%.
- Elettroforo per 15 h a 45 V, o a 100 V per 2–2,5 h.
- Trasferire su una membrana di nitrocellulosa o PVDF utilizzando un apparato di trasferimento elettroblotting (vedere Tabella dei materiali).
- Blocco con 5% di albumina di siero bovino (BSA) in salina con 0,1% Tween-20 (TBST).
- Aggiungere l'anticorpo primario, capra anti-caseina diluita 1:2,000 o topo anti-atto diluito 1:1,000 (vedi Tabella dei materiali).
- Lavare 3x con TBST, 5 min ogni volta.
- Aggiungere l'anticorpo secondario, il rafano perossidasi (HRP) legato asino anti-capra diluito 1:2.500, o HRP collegato cavallo anti-tono anticorpo diluito 1:10,000.
- Lavare 3x con TBST, 5 min ogni volta.
- Aggiungere reagenti ECL alla membrana secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
3. Placcatura e crescita 3D delle cellule EpH4 nella matrice EHS
NOTA: La matrice è liquida a temperature <10 gradi centigradi e solida a temperature superiori. Conservare a -80 gradi centigradi. Scongelare a 4 gradi centigradi la sera prima dell'uso. Pre-raffreddare le piastre di coltura dei tessuti e punte di pipetta a -20 gradi centigradi prima di maneggiare e mantenere la matrice, le piastre e le punte di pipetta sul ghiaccio per evitare che si solidifica.
- Crescere le cellule EpH4 in 2D nel mezzo RPMI-1640 con 10% FBS e 5 insulina g/mL (l'EGF non è richiesto).
- Preparare il mezzo di crescita EpH4 integrato con una matrice del 10% (v/v, 3.500 ) o del 20% (v/v 2.000 ) in due tubi conici da 50 ml. Tenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'uso.
- Cappotto 10 pozze (1 cm2 ciascuno) di un pozzo 24 con 150 l di matrice non diluita. Stendere la matrice utilizzando una punta pipetta. Evitare di creare bolle. Toccare delicatamente i lati della piastra tenendola orizzontalmente per assicurarsi che la matrice sia distribuita uniformemente sul fondo del pozzo.
- Incubare la piastra 24 pozza a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice di solidificarsi.
- Provaa le cellule EpH4 come descritto sopra per le cellule HC11 e contale con un emocitometro. Trasferire 5 x 104 cellule per pozzo in un tubo di centrifuga conica sterile da 1,5 mL e girare a 250 x g per 5 min.
- Aspirare con attenzione il mezzo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Risospendere le cellule in 350 -L di EpH4 growth medium integrata con una matrice del 20% utilizzando una punta di pipetta da 1 mL, mantenendo il tubo conico sul ghiaccio. Evitare le bolle. È importante garantire una sospensione a cella singola.
- Una volta che la matrice dello strato inferiore si è solidificata (la matrice dovrebbe apparire di colore traslucido e più chiaro rispetto al rivestimento iniziale dei pozze), aggiungere la 350 l di sospensione cellulare ad ogni pozzo rivestito e posizionare in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice del 20% di solidificarsi.
- Osservare le cellule microscopicamente in fase contrasto con un obiettivo 4x. Le celle singole devono essere visibili.
- Aggiungere 200 L di epH4 di supporto contenente 10% matrice sopra il 350 - L di celle sospese in 20% matrice. Incubare a 37 gradi centigradi.
4. Induzione differenziazione delle cellule EpH4 cresciute in 3D (Figura 2)
NOTA: Oltre alla differenziazione, le cellule EpH4 possono anche subire tubulogenesi quando stimolate con HGF (fattore di crescita epatocite) nella coltura 3D. Le escrescenze tubolari possono essere viste dopo 10 giorni di stimolazione HIP e HGF.
- Iniziare l'induzione della differenziazione delle cellule EpH4 1 giorno dopo la placcatura nella matrice. Rimuovere con cura 150 -L di mezzo superiore contenente 10% matrice dai pozzi utilizzando una punta di pipetta di plastica. Aggiungere 200 l di epH4 media contenente HIP e 10% di matrice.
- Sostituire il mezzo 10% matrix-HIP ogni 2 giorni per un massimo di 10 giorni. Crescere le celle di controllo nello stesso mezzo a matrice 10% senza HIP.
- Monitorare la formazione della mammosfera in contrasto di fase (Figura 3A,pannello inferiore).
5. Tubulogenesi Induzione delle cellule EpH4 cresciute in 3D (Figura 3A e 3C)
- Preparare 24 lastre e celle EpH4 per la crescita in matrix, come descritto nei passaggi da 3.1 a 3,9. Il giorno dopo aver placcato le cellule nella matrice, rimuovere 150 L di epH4 medio contenente 10% matrice dai pozzi utilizzando una punta di pipetta di plastica. Aggiungere 200 l di supporto EpH4 contenente 10% matrice, HIP e 20 ng/mL HGF (vedere Tabella dei materiali).
- Sostituire il supporto 10% matrix/HIP/HGF ogni 2 giorni per un massimo di 12-14 giorni.
- Monitorare la formazione di tubuli al microscopio utilizzando un obiettivo 20x o 40x(Figura 3A, pannello destro).
6. Quantitazione della differenziazione: Blotting occidentale per la caseina z
- Con attenzione pipetta fuori il 10% matrice-HIP mezzo dai pozzi. Risciacquare lo strato di 20% a matrice 2x con 350 gradi di PBS ghiacciato. Gli sferoidi dovrebbero essere ancora presenti nel livello della matrice.
- Aggiungere 700-1.000 gradi di PBS ghiacciato con 1 mM di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) direttamente nei pozzi. Staccare delicatamente lo strato inferiore della matrice 100% dal pozzo con una punta di pipette per recuperare gli sferoidi presenti in quel livello. Agitare delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.
- Trasferire con attenzione la sospensione sferoide in un tubo conico. Sciacquare i pozzetti con 500 dollari loff di PBS-EDTA per recuperare gli sferoidi rimanenti nei pozzetti e aggiungerli al tubo conico.
- Roccia sul ghiaccio per altri 30 min. Assicurarsi che la matrice si sia completamente dissolta. Se si osservano grumi a matrice visibile, aggiungere più PBS-EDTA o scuotere più a lungo.
- Centrifugare la soluzione per pellet gli sferoidi a 350 x g per 5 min.
- Aspirati il superatante, lividi gli sferoidi nel tampone di lisi ghiacciato e sondano per la caseina, la ciclica D1 e la p120RasGAP dal gonfiore occidentale come nel punto 2,5 sopra16. Come anticorpi primari, utilizzare capra anti-s-casein diluito 1:2,000, coniglio anti-ciclone D1 diluito 1:2,000, e topo anti-p120 diluito 1:2,000. Per gli anticorpi secondari, utilizzare HRP collegato anti-capra anti-capra diluito 1:2,500, HRP collegato asino anti-coniglio diluito 1:2,500, e HRP collegato cavallo anti-topo diluito 1:10,000.
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Representative Results
È noto da tempo che la differenziazione delle cellule epiteliali e degli adipociti richiede confluenza e impegno di cadherins2. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'adesione cellulare-cellulare e l'impegno di E- o N-cadherin e cadherin-11, come avviene con la confluenza di cellule coltivate, innesca un drammatico aumento dell'attività del piccolo GTPases Rac e della divisione cellulare controlla la proteina di controllo 42 (Cdc42), e questo processo porta all'attivazione di interleuchina-6 (IL6) citochine della famiglia e Stat3 (trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione-316,17)1,18,19. Poiché molti componenti del percorso cadherin/Rac/IL6/Stat3 possono partecipare sia alla differenziazione che alla trasformazione neoplastica, forniscono maniglie molecolari per lo studio dell'interrelazione di questi due processi diametralmente opposti.
Utilizzando le tecniche descritte in precedenza, abbiamo dimostrato una sorprendente dipendenza dalla differenziazione sulla forza del segnale Rac nelle cellule HC11: Mentre il cRac1 endogeno è necessario per la differenziazione, e a bassi livelli di Neoplasia attivata mutazionalmente, provoca un netto aumento della capacità di differenziazione, alti livelli di RacV12 innescano un drammatico blocco di differenziazione durante l'induzione della neoplasia ( Figura1B). Al contrario, anche bassi livelli di espressione RacV12 bloccavano la differenziazione nelle celle EpH42. Inoltre, anche se RacV12 attiva Stat3 in molti sistemi cellulari, tra cui HC1116, Stat3C attivato mutazionalmente ha bloccato la differenziazione mentre induce la trasformazione neoplastica20.
Abbiamo esplorato ulteriormente le proprietà di differenziazione delle cellule EpH4 in una coltura di matrice 3D. Mentre la produzione di testina z ha raggiunto il picco di 8-10 giorni, l'espressione della ciclona D-1 è stata massima a 4-6 giorni dopo la stimolazione HIP (Figura 3B). Questi risultati supportano una relazione inversa tra proliferazione e differenziazione nel modello EpH4. Utilizzando la colorazione DAPI (nucleare) e la microscopia confocale per determinare il posizionamento delle singole cellule epiteliali, abbiamo osservato la morte delle cellule interne e la formazione di lumen cavi nelle mammosfere (Figura 3A,C). Abbiamo inoltre dimostrato che l'aggiunta di HGF (20 ng/mL) a 48 h al mezzo HIP ha portato alla formazione di strutture tubolari (Figura 3A,C), coerente con precedenti studi di microscopia elettronica21. Questi approcci utilizzando il modello EpH4 consentono la caratterizzazione di caratteristiche specifiche della differenziazione epiteliale mammaria e la loro associazione con percorsi di trasduzione del segnale distinti.
Figura 1: valutazione e quantificazione della differenziazione cellulare HC11. (A) Una cupola formata in cellule HC11 che esprime bassi livelli di GFP-RacV12 a 10 giorni dopo l'induzione della differenziazione. Sinistra: Contrasto di fase; A destra: fluorescenza dello stesso campo (foto non pubblicate prima). Barra della scala: 100 m; Ingrandimento : 240x; Obiettivo 20x. (B) Effetto del RacV12 sulla differenziazione HC11: Bassi (corsie 19-24), livelli intermedi (corsie 13–18) o alti (corsie 7–12) di un costrutto di fusione RacV12-GFPsono stati espressi in celle HC11. A seguito della crescita in assenza di EGF per 24 h, le cellule sono state indotte a differenziarsi con l'aggiunta HIP, o meno, come indicato. Gli estratti di detersivo sono stati preparati al numero indicato di giorni dopo e sondati per la caseina a z o a z come controllo di carico. Si noti il drammatico aumento della caseina a z nel basso RacV12-GFP che esprime le celle (corsie 21–24 vs 3–6), e la drastica riduzione rispetto all'espressione dell'elevato RacV12-GFP (lane 9–12). NE - Cultura di controllo, cresciuta in assenza di EGF, ma non indotta a differenziarsi (Niit et al.2, riprodotta con permesso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schematico del metodo di sovrapposizione per la crescita di celle EpH4 nella coltura di matrici 3D. (A) I pozzi di una piastra di 6 pozze erano inizialmente rivestiti con matrice EHS al 100% che era autorizzata a solidificare a 37 gradi centigradi formando un letto gelido di membrana sotterranea di circa 2-5 mm di spessore. Le cellule EpH4 sono state semiate su questo letto come una sospensione a cella singola nel mezzo HIP con una matrice del 20%. Questo è stato sovrapposto con 10% matrice nel mezzo HIP. Il mezzo a matrice del 10% è stato sostituito a giorni alterni. Le cellule proliferarono e cominciarono a formare mammosfere dopo 4-5 giorni di cultura (vedi sezione Protocolli). (B) Le immagini a contrasto di fase delle cellule EpH4 nella coltura 2D (momolo) e 3D (mammosfera) sono state catturate utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera digitale (ingrandimento 300x). Vengono mostrate immagini rappresentative in ogni fase. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Eventi nella morfogenesi acinara 3D di EpH4 nella cultura 3D. (A) Le cellule EpH4 sono state coltivate in lastre di 6 pozze rivestite a matrice e mantenute in un mezzo 3D completo come illustrato nella Figura 2. Durante le prime fasi della morfogenesi, le cellule proliferarono, formarono cluster e organizzati in due gruppi: (1) uno strato esterno di cellule polarizzate e (2) un ammasso interno di cellule disorganizzate che subirono la morte cellulare, corrispondente all'apoptosi come mostrato in precedenza12. Quest'ultimo ha portato alla formazione di un lume cavo, caratterizzato dall'oscuramento del centro delle mammosfere visto dalla microscopia a contrasto di fase. L'aggiunta di HGF (20 ng/mL) al mezzo ha portato alla formazione di strutture tubolari. Più del 60% degli aggregati indotti da HGF ha mostrato la tubulogenesi, rispetto agli aggregati di controllo non trattati, che non lo hanno fatto. Una fotografia a contrasto di fase rappresentativa delle cellule in ogni fase è stata catturata utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera digitale (300 volte l'ingrandimento; Barra della scala: 100 m). I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti. Schematica è stato adattato da Starova et al.22. (B) Le cellule EpH4 coltivate in 3D sono state raccolte nei giorni indicati. Le concentrazioni proteiche sono state normalizzate e le pari quantità proteiche (20 g) sono state sottoposte a SDS-PAGE, seguite da gonfiore occidentale e sonda con gli anticorpi indicati. Una ghiandola mammaria omogeneizzata proveniente da un topo che allatta (MGT) è stata usata come confronto in vivo. p120RasGAP è stato utilizzato come controllo di carico indipendente. L'espressione di Cyclin D1 ha aumentato la coincidenza transitoria con le cellule che proliferano nei primi 3-4 giorni. Al contrario, l'espressione della caseina z ha raggiunto il picco di 8-10 giorni, corrispondente alla formazione di mammosfere mature. I risultati sono rappresentativi di due esperimenti. (C) La formazione di Lumen e la tubulogenesi delle mammosfere è stata confermata utilizzando la colorazione DAPI del DNA nucleare (blu fluorescente) in aggregati coltivati su coperture in vetro rivestito a matrice. Le cellule sono state fissate nel 3% di paraformaldeide, permeaabilizzate con una digitalizzazione di 25 g/mL, e l'associazione non specifica è stata bloccata con il 3% di BSA. Le cellule sono state poi macchiate per il DNA nucleare con DAPI (blu). I coverlips erano montati su vetrini di vetro utilizzando un supporto di montaggio. Sono state scattate fotomicrografie del piano dell'asse XY centrale utilizzando un microscopio confocale multifotone (barra di scala 100 m). Le immagini nei pannelli B e C sono adattate da Starova et al.22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le cellule HC11 sono ideali per lo studio della differenziazione in combinazione con la trasformazione neoplastica. Un ulteriore vantaggio è che le cellule HC11 sono facilmente infettivabili con vettori retrovirali basati su Mo-MLV per esprimere una varietà di geni. Nelle nostre mani, le cellule EpH4 erano più difficili da infettare con gli stessi vettori retrovirali di HC112.
Il contatto tra celle e l'arresto della crescita sono i prerequisiti fondamentali per la differenziazione delle cellule HC11. Pertanto, per ottenere una differenziazione uniforme attraverso lo strato cellulare, è importante ottenere una distribuzione uniforme delle cellule nella parabola Petri al momento della semina. Ciò è particolarmente importante se si desidera la quantificazione della differenziazione. La prova deve essere ottimizzata in modo da ottenere una sospensione a singola cella e le cellule non perdono vitalità a causa delle manipolazioni.
Le cellule che vengono ritentate devono essere subconfluenti (50-70%), perché le cellule cresciute ad alta densità tendono ad aderire fortemente l'una all'altra, e separarle è difficile. Per evitare di asciugare le cellule, aspirare con il piatto Petri piatto piatto sul pavimento del cofano flusso laminare, quindi inclinare per drenare rapidamente. Coprire il piatto Petri con il coperchio. Se necessario, è possibile accelerare l'azione della trypsin mettendo la piastra Petri in un'incubatrice a 37 gradi centigradi.
Poiché le cellule sono molto confluenti durante i 10 giorni successivi all'induzione, è importante sostituire i nutrienti che si esauriscono. Quando il mezzo viene cambiato, occorre anche prestare attenzione per evitare il distacco delle cellule, che potrebbe non aderire molto bene alla plastica a causa dell'alta densità cellulare. Ancora, nella nostra esperienza non è necessario utilizzare piatti Petri rivestiti con fibronectina, collagene, o CellTak per ottenere buoni risultati di differenziazione, a differenza di differenziare preadipociti come 3T3L123 o Balb/c3T3 derivati.
Una determinazione accurata delle proteine per gli esperimenti di gonfiore è fondamentale. Poiché le proteine del siero tendono ad attaccarsi alla coltura dei tessuti di grado plastica, è importante raschiare e lavare le cellule in un tubo di plastica da 1,5 mL che non attira le proteine e per aggiungere il buffer di lisi sul pellet cellulare piuttosto che lising le cellule direttamente sul piatto Petri24.
Per quanto riguarda l'estrazione delle proteine, è molto importante mantenere tutte le soluzioni di lavaggio e lisi ghiacciate e i piatti Petri o mammosfere EpH4 sul ghiaccio in tutto. Questo perché in assenza di calcio nel lavaggio PBS le cadherine non sono impegnate e di conseguenza Stat3-ptyr705 è rapidamente depfororylated25.
La dimensione dei piatti Petri descritti per le cellule HC11 è sufficiente per 3-4 macchie occidentali (cioè, la quantità di proteine recuperate per piatto Petri è di circa 50 g per piatto da 3 cm). Preferiamo utilizzare piatti Petri da 3 cm per esperimenti di differenziazione per facilitare l'estrazione delle proteine. Se invece si utilizza un vassoio 6 pozzo, è difficile estrarre le proteine da un pozzo al freddo mantenendo sterile il resto dei pozzi. Inoltre, la concentrazione di CO2 è importante per la differenziazione ed è difficile mantenerla per il resto dei pozzi poiché le proteine vengono estratte da un pozzo in panchina.
Nella nostra esperienza, a differenza della differenziazione dei preadipociti23, diversi lotti di siero di vitello fetale sono in grado di sostenere la crescita così come la differenziazione delle cellule HC11 o EpH4. Un sacco di siero di vitello appena nato testato non ha supportato la differenziazione, anche se potrebbe sostenere la crescita normale: le cellule sembravano differenziarsi in un primo momento, ma hanno perso la loro capacità di differenziarsi dopo tre passaggi nel siero di vitello appena nato.
A differenza delle cellule HC11, la differenziazione delle cellule EpH4 è strettamente legata all'architettura a matrice 3D circostante. Descriviamo i passaggi necessari per la differenziazione dell'EpH4 nella coltura 3D modificata da studi precedenti26,27,28 e la successiva estrazione di proteine per l'analisi della produzione di caseina. La matrice EHS è liquida a basse temperature (<10 ) e si solidifica a temperature più elevate. Normalmente è immagazzinato a -80 gradi centigradi, ma l'aliquota di lavoro può essere immagazzinata a -20 gradi centigradi. Scongelare la matrice a 4 gradi centigradi la sera prima dell'uso e pre-freddo piastre di coltura dei tessuti e punte di pipetta a -20 gradi centigradi prima della manipolazione. Per una valutazione accurata della concentrazione proteica è importante eliminare completamente la matrice prima dell'estrazione con il lavaggio raffreddore pbS perché la matrice è ricca di proteine, che possono confondere i risultati della determinazione della proteina.
La dipendenza da EpH4 dalla matrice per la differenziazione è stata dimostrata in più modelli sperimentali: Reichman et al.10 hanno mostrato che le cellule EpH4 indotte da ormoni lactogenici producevano la caseina all'interno di aree di deposizione di laminina e l'espressione di citokertina intensificata. Somasiri et al.11 ha dimostrato che la PI3-kinase è necessaria per la formazione di sferoidi dipendenti dall'giunzione e l'espressione genica della proteina del latte differenziante. Inoltre, Brinkmann et al.21 ha dimostrato che l'espressione di cDNA HGF transconfettata nelle cellule EpH4 ha indotto la tubulogenesi ramificata degli sferici in un modello di coltura 3D, analoga alla formazione osservata di tubuli indotta da HGF vista qui (Figura 3A,C). Questi risultati illustrano i vantaggi del modello della linea cellulare EpH4 per studiare gli eventi di segnalazione che regolano la differenziazione della ghiandola mammaria.
Le cellule EpH4 possono anche formare mammosfere quando placcate a concentrazioni di siero di vitello fetale inferiori al 10% descritto. È interessante notare che possono formare mammosfere a concentrazioni più basse, o anche in assenza di 20% o 10% matrice, quando placcato sopra uno strato di 100% matrice22,27. In assenza di matrice nella sospensione cellulare, si evita il raffreddamento delle cellule. Un ulteriore vantaggio è che tutte le celle si trovano in un unico piano, quindi sono più facili da fotografare.
Significato: L'impegno di Cadherin nelle cellule coltivate, che approssima lo stato fisiologico di una cellula in vivo, può attivare il percorso Rac/IL6/Stat3. Questo può essere particolarmente importante nella differenziazione delle cellule epiteliali. Utilizzando le tecniche descritte, i nostri risultati hanno esposto l'intensità del segnale ematoso da questo percorso come determinante centrale nell'equilibrio tra proliferazione cellulare e differenziazione, due processi fondamentalmente opposti2. L'indagine approfondita dell'asse E-cadherin/Rac/Stat3 può scoprire nuovi componenti anfiboli del percorso a seconda del livello di espressione, che potrebbero essere sfruttati come bersagli per la terapia del cancro. Per tali obiettivi, l'inibizione completa non sarebbe necessaria per invertire il fenotipo neoplastico. L'inibizione parziale sarebbe anche utile, perché gli importi residui possono effettivamente bloccare la trasformazione e promuovere la differenziazione. Questo può variare con il bersaglio così come il tipo di tumore in questione, come mostrato dal diverso comportamento di RacV12 vs Stat3C, nelle cellule HC11 vs EpH42,20.
Applicazioni future: La via cadherin/Rac/IL6/Stat3 può svolgere un ruolo simile nella differenziazione di altre cellule epiteliali, come il seno umano MCF10A o il rene canino MDCK29 linee cellulari, così come altri tipi di differenziazione che dipendono dalla confluenza cellulare, come i preadipociti e i mioblasti30, che esprimono diversi tipi di cadherin. Infine, questa tecnica può essere sfruttata per l'esame del ruolo di Stat531 e di altri componenti dei percorsi differenzianti.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da divulgare.
Acknowledgments
La linea cellulare HC11 è stata gentilmente fornita dal Dr. D. Medina (Houston, TX). Gli autori sono grati al Dr. Andrew Craig della Queen's University per molti reagenti e preziosi suggerimenti. Le cellule EpH4 sono state un dono del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ha fornito un'eccellente assistenza tecnica per gli studi di cultura 3D.
L'assistenza finanziaria del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), dei Canadian Institutes of Health Research (CIHR), della Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), della Canadian Breast Cancer Research Alliance , i Centri di Eccellenza dell'Ontario, il Breast Cancer Action Kingston (BCAK) e il fondo di lascile Clare Nelson attraverso sovvenzioni a LR sono riconosciuti con gratitudine. BE ha ricevuto il sostegno da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. PTG è supportato da un presidente di ricerca canadese, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN è stato supportato da una nave da uno studente del Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research di NCIC, un Graduate Award (QGA) e un Dean's Award della Queen's University. MG è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato del Programma per il cancro al seno dell'esercito degli Stati Uniti, del Ministero della Ricerca e dell'Innovazione della Provincia dell'Ontario e del Comitato consultivo di ricerca della Queen's University. VH è stata sostenuta da una borsa di dottorato CBCF e da una borsa di studio post-dottorato del Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in collaborazione con CIHR. Hanad Adan è stato il destinatario di uno studio estivo NSERC. LA BS è stata sostenuta da un premio di laurea della Queen's University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
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