Summary
Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.
Abstract
Cadherins desempenham um papel importante na regulação da diferenciação celular, bem como da neoplasia. Aqui descrevemos as origens e métodos da indução da diferenciação de duas linhas de células epiteliais do peito de camundongo, HC11 e EpH4, e seu uso para estudar estágios complementares de desenvolvimento de glândulas mamárias e transformação neoplástica.
A linha de células epiteliais do camundongo HC11 originou-se da glândula mamária de um rato Balb/c grávida. Diferencia-se quando cultivado à confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico em meio contendo soro fetal de bezerro e ydrocortisona H, insulin e Prolactin (meio QUADRIL). Nessas condições, as células HC11 produzem as proteínas de β-caseína e soroácido soro (WAP), semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes, e formam estruturas rudimentares de glândulam mamárias denominadas "cúpulas".
A linha celular EpH4 foi derivada de células epiteliais de glândula samárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida. Ao contrário do HC11, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente em esferoides (também chamados de mamografias) quando cultivadas condições tridimensionais (3D) de crescimento no meio HIP. As células são trippsinizadas, suspensas em uma matriz de 20% composta por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma de camundongos Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), banhadas em cima de uma camada de matriz concentrada que reveste uma placa de Petri de plástico ou placa multiwell, e coberta com uma camada de 10% de matricial contendo meio HIP. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides ocos que exibem polaridade apical-basal, um lúmen oco, e produzem β-caseína e WAP.
Utilizando essas técnicas, nossos resultados demonstraram que a intensidade do sinal cadherin/Rac é fundamental para a diferenciação das células HC11. Embora rac1 seja necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativado aumentam a diferenciação, altos níveis de RacV12 bloqueiam diferenciação ao induzir neoplasia. Em contraste, as células EpH4 representam um estágio anterior na diferenciação epitelial mamária, que é inibida por níveis ainda baixos de RacV12.
Introduction
Em tecidos normais ou tumores, as células têm extensas oportunidades de adesão aos seus vizinhos em uma organização tridimensional, e isso é imitado na cultura pelo crescimento celular de alta densidade. A adesão celular-célula é mediada principalmente através de receptores de cadherina, que definem arquitetura celular e tecidual. Curiosamente, foi demonstrado recentemente que os cadherins também desempenham um papel poderoso na transdução de sinais, especialmente na sinalização de sobrevivência1. Paradoxalmente, alguns desses sinais de adesão celular-célula emanando de cadherins foram recentemente encontrados para serem compartilhados tanto pela diferenciação quanto pela neoplasia2. Aqui, descrevemos métodos de indução e avaliação da diferenciação em dois tipos representativos de linhas celulares epiteliais do peito do camundongo, HC11 e EpH4.
A linha de células epiteliais do camundongo HC11 pode fornecer um modelo útil para o estudo da diferenciação celular epitelial. As células HC11 são uma linha celular derivada comma-1D, originária da glândula mamária de um rato Balb/c grávidamédia 3. Em contraste com outros clones derivados COMMA-1D, o clone do HC11 não tem exigência para matriz extracelular exógena adicionada ou cocultivo com outros tipos de células para a indução in vitro do gene de β-casein endógeno por hormônios lactogênicos3. Esta linha celular tem sido amplamente utilizada em estudos de diferenciação porque manteve características importantes do epitélio mamário normal: as células HC11 podem reconstituir parcialmente o epitélio ductal em uma almofada de gordura mamária limpa4. Além disso, eles podem diferenciar em uma cultura bidimensional (2D) quando cultivadas para confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico na presença de um esteroide como h ydrocortisona ou Dexamethasone, além de Insulin e Prolactin (meio HIP) sem fator de crescimento epidérmico (EGF), um inibidor de diferenciação5,6,7. Nessas condições, as células HC11 produzem proteínas lácteas, como β-caseína e WAP, que são detectáveis pela coagulação ocidental dentro de 4 dias após a indução. Ao mesmo tempo, uma parte das células HC11 forma estruturas rudimentares de glândulas mamárias denominadas "cúpulas" de forma estocástica. As cúpulas são visíveis de 4 a 5 dias após a indução e aumentam gradualmente de tamanho até o dia 10, concomitantes com um aumento na produção de β-casein8. Curiosamente, as células HC11 possuem mutantes p539, e, portanto, representam um estado préneoplástico. Por essa razão, o modelo HC11 é ideal para estudar redes de sinalização de diferenciação em conjunto com a neoplasia no mesmo sistema celular.
As células EpH4, um derivado das células IM-2, são uma linha celular não tumorigênica originalmente derivada de células epiteliais de glândula mamárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida10. As células EpH4 formam monocamadas epiteliais contínuas na cultura 2D, mas não se diferenciam em estruturas semelhantes a glandular10,11. No entanto, após o crescimento 3D em um material composto por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma do camundongo EHS12 (matriz, matriz ou Matrigel, ver Tabela de Materiais),além de estimulação com quadril, as células EpH4 podem recapitular os estágios iniciais da diferenciação da glândula mamária. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides (também chamados de mamografias) que exibem polaridade apical-basal e um lúmen oco, e são capazes de produzir as proteínas do leite β-caseína e WAP, semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes. Ao contrário das células HC11, que são indiferenciadas, e algumas expressam marcadores mesenquimicos13,as células EpH4 exibem uma morfologia puramente luminal14. As células EpH4 também foram relatadas para produzir proteínas leiteres na cultura 2D através da estimulação com dexametasona, insulina e prolactina15. No entanto, essa abordagem impede o estudo de efeitos regulatórios que imitam o microambiente da glândula mamária na cultura 3D.
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Protocol
1. Plating HC11 Células
- Em uma capa de fluxo laminar usando técnicas estéreis prepare uma garrafa com 50 mL de meio celular HC11: RPMI-1640 com soro bovino 10% fetal (FBS), 5 μg/mL insulina e 10 ng/mL EGF (ver Tabela de Materiais).
- Prato aproximadamente 400.000 células por 3 cm Placa de petri: Passe duas placas de Petri de 10 cm e 50% em vinte pratos de 3 cm no meio HC11. As células devem estar bem espalhadas, mas a secagem deve ser evitada.
- Aspirar o meio em um frasco usando uma bomba de vácuo.
- Adicione 250 μL de trippsina (ver Tabela de Materiais) por placa de 10 cm. Redemoinho e bata a placa das laterais, mantendo-a horizontal para espalhar a trippsina e desalojar as células anexadas
- Observe em fase de contraste microscopia com um objetivo de 4x para garantir que as células tenham começado a se desprender das bordas antes de encanar.
- Aspirar aproximadamente 1,5 mL de HC11 médio em uma pipeta pastelde estéril de 9 polegadas e esguichar-a verticalmente contra as células. Gire a placa de Petri enquanto esguicha para desalojar todas as células. Você deve trabalhar rápido para evitar a secagem das células.
- Transfira todas as células para a garrafa com o meio HC11 e redemoinho.
- Pipette 2 mL de suspensão celular em cada prato petri de 3 cm. Aça os pratos de Petri em sentido cruzado para se espalhar uniformemente. Coloque as células em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
- No dia seguinte, ou quando as células são ~90-100% confluentes, aspiram o meio, e substituam-no por meio por FBS e insulina, mas sem EGF.
2. Indução de diferenciação, monitoramento e quantitação de células HC11
- Depois de cultivar as células em média sem EGF por 24 h, adicione o meio de diferenciação (meio QUADRIL) a dez placas de 3 cm: RPMI-1640 complementado com 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisona (ver Tabela de Materiais),5 μg/mL Insulin e 5 μg/mL Pactrolin (ver Tabela de Materiais) por até 10 dias.
- Mantenha as outras dez placas de 3 cm como controles: Mude para um meio com 10% de FBS e 5 μg/mL insulina sem EGF e HIP.
- Mude o meio a cada 2 a 3 dias para células e controles tratados com QUADRIL. Pipette o meio cuidadosamente para garantir que as células não se desapegom.
- Para monitorar a diferenciação (ou seja, a formação de cúpulas), observe as células microscopia de contraste de fase (Figura 1A, painel esquerdo). Se as células estiverem expressando proteína de fluorescência verde (GFP), observe microscopia de fluorescência (excitação = 485/20; emissão = 530/25; ampliação 240x; 20x objetiva) (Figura 1A, painel direito).
- Para quantificar o grau de diferenciação, extrair proteínas de uma placa de Petri cada uma das células e controles tratados com QUADRIL, uma vez por dia por um total de 10 dias e sondar manchas ocidentais para β-caseína (ver Tabela de Materiais)(Figura 1B).
- Raspe as células no gelo com soro lona tampão de fosfato frio de 1,5 mL (PBS) em um tubo de centrífuga de plástico de 1,8 ml.
- Pelotas as células a 350 x g, 1 min, 4 °C.
- Lave rapidamente a pelota 2x com PBS gelado. Escorra qualquer resíduo.
- Faça um tampão de lise: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 μg/mL aprotinina, 10 μg/mL leupeptin1. Adicione 100 μL por 3 cm placa petri.
- Esclareça o lysato por centrífuga em 10.000 x g por 10 min no frio.
- Determine a concentração de proteínas (ver Tabela de Materiais)e carregue 10-20 μg de proteína de cada amostra para um gel de poliacrilamida-SDS 10%.
- Eletroforese por 15 h a 45 V, ou a 100 V por ~2-2,5 h.
- Transfira para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um aparelho de transferência de eletrocoagulante (ver Tabela de Materiais).
- Bloqueie com 5% de albumina de soro bovino (BSA) em soro fixo tris com 0,1% Tween-20 (TBST).
- Adicione o anticorpo primário, a cabra anti-β-casein diluída 1:2.000 ou mouse anti-β actin diluído 1:1.000 (ver Tabela de Materiais).
- Lave 3x com TBST, 5 min cada vez.
- Adicione o anticorpo secundário, peroxidase de rabanete (HRP) ligado ao burro anti-cabra diluído 1:2.500, ou anticorpo anti-rato ligado ao HRP diluído 1:10.000.
- Lave 3x com TBST, 5 min cada vez.
- Adicione reagentes eCL à membrana de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
3. Revestimento e Crescimento 3D de Células EpH4 em Matriz EHS
NOTA: A matriz é líquida a temperaturas <10 °C e sólida a temperaturas acima. Loja a -80 °C. Descongele a 4 °C na noite anterior ao uso. Pré-esfrie as placas de cultura do tecido e as pontas de pipeta a -20 °C antes de manusear e manter as pontas de matriz, placas e pipette no gelo para evitar que se solidifique.
- Cultivar células EpH4 em 2D em rpmi-1640 médio com 10% FBS e 5 μg/mL insulina (EGF não é necessário).
- Prepare o meio de crescimento EpH4 complementado com 10% (v/v, 3.500 μL) ou 20% (v/v 2.000 μL) em dois tubos cônicos de 50 mL. Mantenha o gelo até estar pronto para usar.
- Cubra 10 poços (1 cm2 cada) de uma placa de 24 poços com 150 μL de matriz não diluída. Espalhe a matriz usando uma dica de pipeta. Evite criar bolhas. Toque delicadamente nas laterais da placa enquanto a segura horizontalmente para garantir que a matriz seja distribuída uniformemente pela parte inferior do poço.
- Incubar a placa de 24 poços a 37 °C por 1h para permitir que a matriz se solidifique.
- Experimente as células EpH4 como descrito acima para as células HC11 e conte-as com um hemocímetro. Transfira 5 x 104 células por poço para um tubo de centrífuga círica cínica estéril de 1,5 mL e gire a 250 x g por 5 min.
- Atribua cuidadosamente o meio e coloque o tubo no gelo.
- Resuspender as células em 350 μL do meio de crescimento EpH4 complementado com matriz de 20% usando uma ponta de tubulata de 1 mL, mantendo o tubo cônico no gelo. Evite bolhas. É importante garantir uma suspensão de uma única célula.
- Uma vez que a matriz de camada inferior tenha se solidificado (a matriz deve parecer translúcida e mais leve em cores em comparação com o revestimento inicial dos poços), adicione os 350 μL de suspensão celular a cada poço revestido e coloque em uma incubadora de CO2 a 37 °C para ~1h para permitir que a camada matricial de 20% se solidifique.
- Observe as células microscopicamente em contraste de fase com um objetivo 4x. Células únicas devem ser visíveis.
- Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo matriz de 10% em cima dos 350 μL de células suspensas em matriz de 20%. Incubar a 37 °C.
4. Indução de diferenciação de células EpH4 cultivadas em 3D (Figura 2)
NOTA: Além da diferenciação, as células EpH4 também podem sofrer tubulogênese quando estimuladas com HGF (fator de crescimento hepatocito) na cultura 3D. Os crescimentos tubulares podem ser vistos após 10 dias de estimulação hip e HGF.
- Comece a indução de diferenciação das células EpH4 1 dia após o revestimento na matriz. Remova cuidadosamente 150 μL do meio superior contendo matriz de 10% dos poços usando uma ponta de pipeta de plástico. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo QUADRIL e matriz de 10%.
- Substitua o meio matrix-HIP de 10% a cada 2 dias por até 10 dias. Cresça células de controle no mesmo meio de matriz de 10% sem quadril.
- Monitore a formação da mamografia em contraste de fase(Figura 3A,painel inferior).
5. Indução de tubulogênese de células EpH4 cultivadas em 3D (Figura 3A e 3C)
- Prepare 24 placas de poço e células EpH4 para crescimento em matriz conforme detalhado nas etapas 3.1-3.9. No dia seguinte ao revestimento das células na matriz, remova 150 μL de médio EpH4 contendo 10% de matriz dos poços usando uma ponta de pipeta de plástico. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo 10% de matriz, QUADRIL e 20 ng/mL HGF (ver Tabela de Materiais).
- Substitua o meio matriz/QUADRIL/HGF de 10% a cada 2 dias por até 12 a 14 dias.
- Monitorar a formação de túbulos microscopicamente usando um objetivo de 20x ou 40x (Figura 3A, painel direito).
6. Quantitação da Diferenciação: Loteamento Ocidental para β-casein
- Cuidadosamente pipette fora do meio 10% matrix-HIP dos poços. Enxágüe a camada matricial de 20% 2x com 350 μL de PBS gelado. Os esferoides ainda devem estar presentes na camada matricial.
- Adicione 700-1.000 μL de PBS gelado com 1 mM ácido etilenodiaminatetratetracético (EDTA) diretamente nos poços. Retire delicadamente a camada inferior da matriz de 100% do poço com uma ponta de pipeta para recuperar esferoides presentes nessa camada. Agite suavemente por 30 min a 4°C.
- Transfira cuidadosamente a suspensão esferoide para um tubo cônico. Enxágüe os poços com ~500 μL de PBS-EDTA para recuperar quaisquer esferoides restantes nos poços e adicionar ao tubo cônico.
- Rocha no gelo por mais 30 min. Certifique-se de que a matriz se dissolveu completamente. Se os aglomerados de matriz visíveis forem vistos, adicione mais PBS-EDTA ou agite mais.
- Centrífuga a solução para pelotas os esferoides em 350 x g por 5 min.
- Aspirar o supernatant, lise os esferoides em tampão de lise gelada, e sonda para β-caseína, cyclin D1 e p120RasGAP por manchas ocidentais como na etapa 2.5 acimade 16. Como anticorpos primários, use cabra anti-β-casein diluída 1:2.000, o coelho anti-ciclina D1 diluído 1:2.000, e o rato anti-p120 diluído 1:2.000. Para anticorpos secundários, use o burro anti-cabra ligado ao HRP diluído 1:2.500, o burro ligado ao HRP anti-coelho diluído 1:2.500, e o anti-rato ligado ao HRP diluído 1:10.000.
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Representative Results
Há muito se sabe que a diferenciação de células epiteliais e adipócitos requer confluência e engajamento de cadherins2. Nós e outros demonstramos que a adesão celular-célula e o engajamento de E- ou N-cadherin e cadherin-11, como ocorre com a confluência das células cultivadas, desencadeia um aumento dramático na atividade do pequeno GTPases Rac e da proteína de controle da divisão celular 42 (Cdc42), e esse processo leva à ativação de citocinas familiares interleucinas-6 (IL6) e Stat3 (transdutor de sinal e ativador de transcrição-316,17)1,18,19. Como muitos componentes da via cadherin/Rac/IL6/Stat3 podem participar tanto da diferenciação quanto da transformação neoplástica, fornecem alças moleculares para o estudo da inter-relação desses dois processos diametralmente opostos.
Usando as técnicas descritas acima, demonstramos uma dependência marcante da diferenciação sobre a força do sinal Rac nas células HC11: Enquanto o cRac1 endógeno é necessário para diferenciação, e em baixos níveis ativados pela RacV12 causa um aumento distinto na capacidade de diferenciação, altos níveis deRac V12 desencadeiam um bloco dramático de diferenciação ao induzir neoplasia(Figura 1B). Em contraste, mesmo baixos níveis de expressão RacV12 bloquearam a diferenciação nas células EpH42. Além disso, embora racV12 ative o Stat3 em muitos sistemas celulares, incluindo HC1116, ativado mutaçãomente Stat3C bloqueou diferenciação ao induzir a transformação neoplástica20.
Exploramos ainda as propriedades de diferenciação das células EpH4 em uma cultura matricial 3D. Enquanto a produção de β-casein atingiu o pico de 8 a 10 dias, a expressão cyclin D-1 foi máxima em 4-6 dias após a estimulação hip (Figura 3B). Esses achados apoiam uma relação inversa entre proliferação e diferenciação no modelo EpH4. Utilizando a coloração da DAPI (nuclear) e a microscopia confocal para determinar o posicionamento de células epiteliais individuais, observamos a morte celular interna e a formação de lúmens ocos nas mamosferas(Figura 3A,C). Mostramos ainda que a adição de HGF (20 ng/mL) a 48 h ao meio HIP resultou na formação de estruturas tubulares(Figura 3A,C),consistente com estudos anteriores de microscopia eletrônica21. Essas abordagens utilizando o modelo EpH4 permitem a caracterização de características específicas da diferenciação epiteliacional mamária e sua associação com caminhos distintos de transdução de sinal.
Figura 1: Avaliação e quantitação da diferenciação celular HC11. (A)Uma cúpula formada em células HC11 expressando baixos níveis de GFP-RacV12 em 10 dias após indução da diferenciação. Esquerda: Contraste de fase; Direito: Fluorescência do mesmo campo (fotos não publicadas antes). Barra de escala = 100 μm; Ampliação = 240x; 20x objetivo. (B) Efeito da RacV12 sobre a diferenciação do HC11: Baixa (faixas 19-24), intermediária (faixas 13-18) ou altas (pistas 7-12) de uma construção de fusão RacV12-GFP foram expressas em células HC11. Após o crescimento da ausência de EGF por 24 h, as células foram induzidas a diferenciar-se com a adição hip, ou não, como indicado. Extratos de detergente foram preparados no número indicado de dias depois e sondados para β-casein ou β-actin como um controle de carregamento. Observe o aumento dramático da β-casein em células expressas de racv12-GFP baixas (faixas 21-24 vs. 3-6), e a redução dramática na expressão de alta RacV12-GFP (faixas 9-12). NE = Culturas de controle, cultivadas na ausência de EGF, mas não induzidas a diferenciar (Niit et al.2, reproduzidas com permissão). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Esquema de sobreposição para o cultivo de células EpH4 na cultura matricial 3D. (A)Os poços de uma placa de 6 poços foram inicialmente revestidos com matriz 100% EHS que foi permitido solidificar a 37 °C formando um leito gelado de membrana do porão medindo aproximadamente 2-5 mm de espessura. As células EpH4 foram semeadas nesta cama como uma suspensão de uma única célula em meio HIP com matriz de 20%. Isso foi exagerado com matriz de 10% no meio hip. O meio-matricial de 10% foi substituído a cada dois dias. As células proliferaram e começaram a formar mamografias após 4-5 dias na cultura (ver protocoles). (B) Imagens de contraste de fase das células EpH4 na cultura 2D (monocamada) e 3D (mamografia) foram capturadas usando um microscópio equipado com uma câmera digital (ampliação de 300x). Imagens representativas em cada estágio são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Eventos na morfogênese acinar 3D de EpH4 na cultura 3D. (A) As células EpH4 foram cultivadas em 6 placas de poço revestidas em matriz e mantidas em meio 3D completo como na Figura 2. Durante os estágios iniciais da morfogênese, as células proliferaram, formaram aglomerados e organizaram-se em dois grupos: (1) uma camada externa de células polarizadas e (2) um aglomerado interno de células desorganizadas que sofreram a morte celular, correspondendo à apoptose, como mostrado anteriormente12. Este último levou à formação de um lúmen oco, caracterizado pelo escurecamento do centro das mamografias como visto pela microscopia de contraste de fase. A adição de HGF (20 ng/mL) ao médio resultou na formação de estruturas tubulares. Mais de 60% dos agregados induzidos pelo HGF apresentaram tubulogênese, em comparação com agregados de controle não tratados, o que não aconteceu. Uma fotografia representativa de contraste de fase de células em cada estágio foi capturada usando um microscópio equipado com uma câmera digital (ampliação de 300x; Barra de escala = 100 μm). Os resultados são representativos de pelo menos três experimentos. Schematic foi adaptado de Starova et al.22. (B) As células EpH4 cultivadas em 3D foram colhidas nos dias indicados. As concentrações proteicas foram normalizadas e as quantidades de proteínaigualitas (20 μg) foram submetidas à SDS-PAGE, seguidas por manchas ocidentais e sondagem com os anticorpos indicados. Uma glândula mamária homogeneizada de um rato lactante (MGT) foi usada como comparação in vivo. p120RasGAP foi usado como um controle de carregamento independente. A expressão cyclin D1 aumentou transitóriamente coincidindo com células proliferantes nos primeiros 3-4 dias. Em contrapartida, a expressão β-casein atingiu o pico de 8 a 10 dias, correspondendo à formação de mamografias maduras. Os resultados são representativos de dois experimentos. (C)A formação de lúmen e a tubulogênese das mamografias foi confirmada usando a coloração DAPI de DNA nuclear (azul fluorescente) em agregados cultivados em tampas de vidro revestidas de matriz. As células foram fixadas em paraformaldeído de 3%, permeabilizadacom com 25 μg/mL digitonin, e a ligação inespecífica foi bloqueada com 3% de BSA. As células foram então manchadas para DNA nuclear com DAPI (azul). Os deslizamentos de cobertura foram montados em slides de vidro usando um meio de montagem. Fotomicrografos foram tirados do plano central xy-eixo usando um microscópio confocal multifófono (barra de escala = 100μm). As imagens nos painéis B e C são adaptadas de Starova et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
As células HC11 são idealmente adequadas para o estudo da diferenciação em conjunto com a transformação neoplástica. Uma vantagem adicional é que as células HC11 são facilmente infectáveis com vetores retrovirais baseados em Mo-MLV para expressar uma variedade de genes. Em nossas mãos, as células EpH4 eram mais difíceis de infectar com os mesmos vetores retrovirais do que o HC112.
Contato celular-celular e prisão de crescimento são pré-requisitos fundamentais para diferenciação celular HC11. Assim, para alcançar diferenciação uniforme em toda a camada celular, é importante conseguir uma distribuição uniforme de células na placa de Petri no momento da semeação. Isso é especialmente importante se a quantitação da diferenciação for desejada. A experimentação deve ser otimizada para que uma suspensão celular única seja alcançada e as células não percam viabilidade por causa das manipulações.
As células que estão sendo tripizadas devem ser subconfluentes (50-70%), porque as células cultivadas a altas densidades tendem a aderir fortemente umas às outras, e separá-las é difícil. Para evitar a secagem das células, aspirar com a placa de Petri plana no chão do capô de fluxo laminar, em seguida, inclinar-se para drenar rapidamente. Cubra a placa de Petri com a tampa. Se necessário, você pode acelerar a ação da trippsina colocando a placa de Petri em uma incubadora de 37 °C.
Como as células são muito confluentes durante os 10 dias seguintes à indução, é importante substituir os nutrientes que estão esgotados. Quando o meio é alterado, também deve-se tomar cuidado para evitar o desprendimento das células, que podem não aderir muito bem ao plástico devido à alta densidade celular. Ainda assim, em nossa experiência não é necessário usar pratos petri revestidos com fibronectina, colágeno ou CellTak para obter bons resultados de diferenciação, ao contrário de preadipocitos diferenciados como 3T3L123 ou derivados Balb/c3T3.
A determinação precisa da proteína para os experimentos de manchas é fundamental. Como as proteínas soro tendem a se ligar ao plástico de grau de cultura do tecido, é importante raspar e lavar as células em um tubo plástico de 1,5 mL que não atrai proteínas e adicionar o tampão de lise na pelota celular em vez de limpar as células diretamente na placa de Petri24.
Em relação à extração de proteínas, é muito importante manter todas as soluções de lavagem e lise gelada e as placas de Petri ou mamografias EpH4 no gelo por toda parte. Isso porque na ausência de cálcio na lavagem da PBS os cadherins não estão engajados e, como resultado, stat3-fortyr705 é rapidamente defosforlado25.
O tamanho das placas de Petri descritas para células HC11 é suficiente para 3-4 manchas ocidentais (ou seja, a quantidade de proteína recuperada por prato petri é de aproximadamente 50 μg por prato de 3 cm). Preferimos usar pratos petri de 3 cm para experimentos de diferenciação para facilitar a extração de proteínas. Se uma bandeja de 6 poços é usada em vez disso, é difícil extrair proteínas de um poço no frio, mantendo o resto dos poços estéreis. Além disso, a concentração de CO2 é importante para a diferenciação e é difícil mantê-la para o resto dos poços, pois as proteínas estão sendo extraídas de um poço no banco.
Em nossa experiência, ao contrário da diferenciação dos preadipócitos23,vários lotes de soro fetal de bezerro são capazes de apoiar o crescimento, bem como a diferenciação das células HC11 ou EpH4. Um monte de soro de bezerro recém-nascido testado não suportava diferenciação, embora pudesse suportar o crescimento normal: as células pareciam diferenciar no início, mas perderam sua capacidade de diferenciar após três passagens no soro de bezerro recém-nascido.
Em contraste com as células HC11, a diferenciação das células EpH4 está fortemente ligada à arquitetura matricial 3D circundante. Descrevemos as etapas necessárias para a diferenciação epH4 na cultura 3D modificada a partir de estudos anteriores26,27,28 e extração proteica subsequente para análise da produção de β-casein. A matriz EHS é líquida a baixas temperaturas (<10 °C) e se solidifica a temperaturas mais altas. Normalmente é armazenado a -80 °C, mas o funcionamento das alíquotas pode ser armazenado a -20 °C. Descongele a matriz a 4 °C na noite anterior ao uso e placas de cultura do tecido pré-frio e pontas de pipeta a -20 °C antes do manuseio. Para uma avaliação precisa da concentração de proteínas é importante eliminar completamente a matriz antes da extração com lavagem de PBS fria, pois a matriz é rica em proteínas, o que pode confundir os resultados da determinação da proteína.
A dependência epH4 da matriz para diferenciação tem sido demonstrada em múltiplos modelos experimentais: Reichman et al.10 mostraram que as células EpH4 induzidas por hormônios lactogênicos produziram β-casein dentro de áreas de deposição de laminina e expressão intensificada de citoqueratina. Somasiri et al.11 demonstraram que pi3-quinase é necessário para aderentes formação esferoide dependente de junção e expressão genética diferencial de proteína do leite. Além disso, Brinkmann et al.21 demonstraram que a expressão do CDNA HGF transfeccionado em células EpH4 induziu a tubulogênese ramificada de esferoides em um modelo de cultura 3D, análogo à formação de túbulos induzidas pelo HGF vista aqui(Figura 3A,C). Esses achados ilustram as vantagens do modelo de linha celular EpH4 para estudar eventos de sinalização que regulam a diferenciação da glândula mamária.
As células EpH4 também podem formar mamografias quando banhadas em concentrações de soro fetal inferior aos 10% descritos. Curiosamente, eles podem formar mamografias em concentrações mais baixas, ou mesmo na ausência de 20% ou 10% de matriz, quando emplacados em cima de uma camada de matriz 100%22,27. Na ausência de matriz na suspensão celular, é evitado o resfriamento das células. Uma vantagem adicional é que todas as células são encontradas em um único avião, então elas são mais fáceis de fotografar.
Significado: O engajamento de cadherin em células cultivadas, que aproxima o estado fisiológico de uma célula in vivo, pode ativar a via Rac/IL6/Stat3. Isso pode ser especialmente importante na diferenciação de células epiteliais. Utilizando as técnicas descritas, nossos resultados expuseram a intensidade do sinal emanando a partir desse caminho como determinante central no equilíbrio entre proliferação celular versus diferenciação, dois processos fundamentalmente opostos2. A investigação aprofundada do eixo E-cadherin/Rac/Stat3 pode descobrir novos componentes anfíbolous da via, dependendo do nível de expressão, que poderiam ser explorados como alvos para a terapia do câncer. Para tais alvos, a inibição completa não seria necessária para reverter o fenótipo neoplástico. A inibição parcial seria até benéfica, pois os valores residuais podem realmente bloquear a transformação e promover a diferenciação. Isso pode variar tanto com o alvo quanto com o tipo de tumor em questão, como mostra o comportamento diferente de RacV12 vs. Stat3C, nas células HC11 vs. EpH42,20.
Aplicações futuras: A via cadherin/Rac/IL6/Stat3 pode desempenhar um papel semelhante na diferenciação de outras células epiteliais, como o MCF10A da mama humana ou as linhas celulares MDCK29 rim canino, bem como outros tipos de diferenciação que dependem da confluência celular, como preadipócitos e mioblastos30, que expressam diferentes tipos de cadherins. Finalmente, essa técnica pode ser explorada para o exame do papel do Stat531 e outros componentes de vias diferenciais.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos para divulgar.
Acknowledgments
A linha celular HC11 foi gentilmente fornecida pelo Dr. D. Medina (Houston, TX). Os autores são gratos ao Dr. Andrew Craig da Queen's University por muitos reagentes e sugestões valiosas. As células EpH4 foram um presente do Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick prestou excelente assistência técnica para estudos culturais 3D.
A assistência financeira do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), da Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontário Chapter), da Canadian Breast Cancer Research Alliance , os Centros de Excelência de Ontário, a Ação contra o Câncer de Mama Kingston (BCAK) e o fundo de legado Clare Nelson através de subsídios à LR são reconhecidos com gratidão. Be recebeu apoio de subvenção da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. A PTG é apoiada por um presidente de pesquisa do Canadá, Fundação Canadense para Inovação, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN foi apoiado por uma estudante do Terry Fox Training Program em Pesquisa Transdisciplinar de Câncer da NCIC, um prêmio de pós-graduação (QGA), e um Prêmio Reitor da Queen's University. Mg foi apoiado por bolsas de pós-doutorado do Programa de Câncer de Mama do Exército dos EUA, do Ministério da Pesquisa e Inovação da Província de Ontário e do Comitê de Pesquisa Consultiva da Universidade da Rainha. A VH foi apoiada por uma bolsa de doutorado da CBCF e uma bolsa de pós-doutorado do Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research em parceria com a CIHR. Hanad Adan foi o destinatário de uma estudante de verão da NSERC. BS foi apoiado por um prêmio de pós-graduação da Queen's University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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