Summary
Nous décrivons des techniques pour l’induction de différenciation de deux lignes épithéliales de sein, HC11 et EpH4. Tandis que les deux exigent le sérum foetal de veau, l’insuline, et la prolactine pour produire des protéines de lait, les cellules d’EpH4 peuvent entièrement différencier dans les mammospheres dans la culture tridimensionnelle. Ces modèles complémentaires sont utiles pour les études de transduction de signal de différenciation et de néoplasie.
Abstract
Les cadhérines jouent un rôle important dans la régulation de la différenciation cellulaire ainsi que de la néoplasie. Nous décrivons ici les origines et les méthodes de l’induction de la différenciation de deux lignées épithéliales de sein de souris, HC11 et EpH4, et leur utilisation pour étudier des étapes complémentaires du développement de glande mammaire et de la transformation néoplastique.
La lignée épithéliale de cellules épithéliales de sein de souris de HC11 a provenu de la glande mammaire d’une souris enceinte de Balb/c. Il se différencie lorsqu’il est cultivé à la confluence attachée à une surface de plat Petri en plastique dans le milieu contenant le sérum foetal de veau et Hydrocortisone, insulin et Prolactin (hip medium). Dans ces conditions, les cellules HC11 produisent les protéines du lait et la protéine acide de lactosérum (WAP), semblables aux cellules épithéliales mammaires en lacactation, et forment des structures mammaires rudimentaires appelées « dômes ».
La lignée cellulaire EpH4 a été dérivée de cellules épithéliales de glande mammaire de souris spontanément immortalisées isolées d’une souris Enceinte de Balb/c. Contrairement à HC11, les cellules EpH4 peuvent se différencier entièrement en sphéroïdes (également appelés mammosphères) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de croissance tridimensionnelles (3D) dans le milieu HIP. Les cellules sont trypsinisées, suspendues dans une matrice de 20% composée d’un mélange de protéines de matrice extracellulaire produites par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), plaquées sur une couche de matrice concentrée recouvrant un plat Petri en plastique ou une plaque multiwell, et recouvertes d’une couche de 10% de milieu hip contenant une matrice de 10%. Dans ces conditions, les cellules EpH4 forment des sphéroïdes creux qui présentent une polarité apical-basale, un lumen creux, et produisent de la caséine et du WAP.
En utilisant ces techniques, nos résultats ont démontré que l’intensité du signal cadhérine/Rac est essentielle à la différenciation des cellules HC11. Alors que Rac1 est nécessaire pour la différenciation et de faibles niveaux de racV12 activé augmenter la différenciation, les niveaux élevés RacV12 bloquer la différenciation tout en induisant la néoplasie. En revanche, les cellules EpH4 représentent un stade précoce de la différenciation épithéliale mammaire, qui est inhibée par même de faibles niveaux de RacV12.
Introduction
Dans les tissus normaux ou les tumeurs, les cellules ont de vastes possibilités d’adhérence à leurs voisins dans une organisation tridimensionnelle, et cela est imité dans la culture par la croissance cellulaire de haute densité. L’adhérence de cellule à cellule est négociée principalement par des récepteurs de cadhérine, qui définissent l’architecture cellulaire et tissulaire. Fait intéressant, il a été récemment démontré que les cadhérines jouent également un rôle puissant dans la transduction du signal, en particulier dans la signalisation de survie1. Paradoxalement, certains de ces signaux d’adhérence cellulaire à cellule émanant de cadhérines se sont récemment avérés partagés à la fois par la différenciation et la néoplasie2. Ici, nous décrivons des méthodes d’induction et d’évaluation de la différenciation dans deux types représentatifs de lignées épithéliales de sein de souris, HC11 et EpH4.
La lignée épithéliale du sein de souris HC11 peut fournir un modèle utile pour l’étude de la différenciation épithéliale des cellules. Les cellules HC11 sont une lignée cellulaire dérivée de COMMA-1D, provenant de la glande mammaire d’une souris Balb/c mi-enceinte3. Contrairement à d’autres clones dérivés de COMMA-1D, le clone HC11 n’a pas besoin d’ajouter exogènement la matrice extracellulaire ou la cocultivation avec d’autres types de cellules pour l’induction in vitro du gène endogène de la casémine par les hormones lactogéniques3. Cette lignée cellulaire a été largement utilisée dans les études de différenciation parce qu’elle a conservé des caractéristiques importantes de l’épithélium mammaire normal : les cellules HC11 peuvent reconstituer partiellement l’épithélium canalaire dans un coussinet de graisse mammaire dédouané4. En outre, ils peuvent se différencier dans une culture bidimensionnelle (2D) lorsqu’ils sont cultivés à la confluence attachée à une surface de plat Petri en plastique en présence d’un stéroïde comme Hydrocortisone ou Dexamethasone, en plus de insulin et Prolactin (HIP moyen) dépourvu de facteur de croissance épidermique (EGF), un inhibiteur de la différenciation5,6,7. Dans ces conditions, les cellules HC11 produisent des protéines de lait telles que la caséine et le WAP, qui sont détectables par le ballonnement occidental dans les 4 jours suivant l’induction. Dans le même temps, une partie des cellules HC11 forme des structures rudimentaires ressemblant à des glandes mammaires appelées « dômes » d’une manière stochastique. Les dômes sont visibles 4 à 5 jours après l’induction et augmentent graduellement en taille jusqu’au jour 10, concomitant avec une augmentation de la production de caséine8. Fait intéressant, les cellules HC11 possèdent mutant p539, et représentent donc un état prénéoplastique. Pour cette raison, le modèle HC11 est idéal pour étudier les réseaux de signalisation de différenciation en conjonction avec la néoplasie dans le même système cellulaire.
Les cellules EpH4, un dérivé des cellules IM-2, sont une lignée cellulaire nontumorigenic dérivée à l’origine de cellules épithéliales de glande mammaire de souris spontanément immortalisées isolées d’une souris Mi-enceinte de Balb/c10. Les cellules EpH4 forment des monocouches épithéliales continues dans la culture 2D, mais ne se différencient pas en structures glandulaires10,11. Cependant, après la croissance 3D dans un matériau composé d’un mélange de protéines de matrice extracellulaire produites par les cellules de sarcome de souris EHS12 (matrice EHS, matrice, ou Matrigel, voir Tableau des matériaux), en plus de la stimulation avec HIP, les cellules EpH4 peuvent récapituler les étapes initiales de la différenciation des glandes mammaires. Dans ces conditions, les cellules EpH4 forment des sphéroïdes (également appelés mammosphères) qui présentent une polarité apical-basale et un lumen creux, et sont capables de produire les protéines du lait- caséine et WAP, semblables aux cellules épithéliales mammaires. Contrairement aux cellules HC11, qui sont indifférenciées, et certains marqueurs mésenchymal express13, epH4 cellules présentent une morphologie purement lumineuse14. Les cellules EpH4 ont également été rapportées pour produire des protéines de lait dans la culture 2D par la stimulation avec la dexaméthasone, l’insuline, et la prolactine15. Cependant, cette approche empêche l’étude des effets réglementaires qui imitent le microenvironnement de glande mammaire dans la culture 3D.
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Protocol
1. Placage des cellules HC11
- Dans une hotte à débit laminaire utilisant des techniques stériles préparer une bouteille avec 50 ml de milieu cellulaire HC11: RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 5 g/mL d’insuline, et 10 ng/mL EGF (voir Tableau des matériaux).
- Assiette d’environ 400 000 cellules par plat Petri de 3 cm : Passez deux plats Petri de 10 cm et 50 % en confluents dans vingt plats de 3 cm en milieu HC11. Les cellules doivent être bien étalées, mais le séchage doit être évité.
- Aspirer le milieu dans un flacon à l’aide d’une pompe à vide.
- Ajouter 250 l de trypsine (voir Tableau des matériaux)par plaque de 10 cm. Tourbillonner et frapper la plaque des côtés tout en la gardant horizontale pour répandre la trypsine et pour déloger les cellules attachées
- Observez sous la microscopie de contraste de phase avec un objectif 4x pour s’assurer que les cellules ont commencé à se détacher des bords avant la pipetting.
- Aspirez environ 1,5 ml de milieu HC11 dans une pipette Pasteur stérile de 9 pouces et giclez-la verticalement contre les cellules. Faites pivoter le plat Petri tout en giclant pour déloger toutes les cellules. Vous devez travailler rapidement pour éviter le séchage des cellules.
- Transférer toutes les cellules à la bouteille avec le milieu HC11 et tourbillonner.
- Pipette 2 ml de suspension cellulaire dans chaque plat Petri de 3 cm. Rock les plats Petri en travers pour répartir uniformément. Placer les cellules dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
- Le lendemain, ou lorsque les cellules sont de 90 à 100% de confluents, aspirez le milieu, et remplacez-le par un moyen par du SF et de l’insuline, mais sans EGF.
2. Induction de différenciation, surveillance et quantitation des cellules HC11
- Après avoir fait pousser les cellules dans le milieu manquant d’EGF pendant 24 h, ajouter le milieu de différenciation (milieu de hip) à dix plaques de 3 cm : RPMI-1640 complété de 10 % de FBS, 1 g/mL Hydrocortisone (voir Tableau des matériaux), 5 g/mL Insulin et 5 og/mL Prolactin (voir Tableau des matériaux)pendant 10 jours.
- Gardez les dix autres plaques de 3 cm comme commandes : Changer à un milieu avec 10 % de FBS et 5 g/mL d’insuline dépourvud’EGF et de HIP.
- Changez le milieu tous les deux jours et tous les deux jours pour les cellules et les contrôles traités par HIP. Pipette le milieu soigneusement pour s’assurer que les cellules ne se détachent pas.
- Pour surveiller la différenciation (c.-à-d. la formation de « dômes »), observez les cellules sous microscopie de contraste de phase(figure 1A, panneau gauche). Si les cellules expriment la protéine de fluorescence verte (GFP), observez sous la microscopie de fluorescence (excitation 485/20 ; émission 530/25 ; grossissement 240x ; objectif 20x) (figure 1A, panneau droit).
- Pour quantifier le degré de différenciation, extraire les protéines d’un plat Petri chacune des cellules et des contrôles traités par HIP, une fois par jour pendant un total de 10 jours et sonder les taches occidentales pour la caséine (voir tableau des matériaux) (Figure 1B).
- Gratter les cellules sur la glace avec 1,5 ml de saline tamponnée de phosphate à froid (PBS) dans un tube de centrifugeuse en plastique de 1,8 ml.
- Pelleter les cellules à 350 x g,1 min, 4 oC.
- Laver rapidement les granulés 2x avec du PBS glacé. Égoutter les résidus.
- Faire un tampon de lyse : 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM phénylmethylsulphonyl fluorure (PMSF), 10 'g/mL aprotinin, 10 'g/mL leupeptin16. Ajouter 100 l par plat Petri de 3 cm.
- Clarifier le lysate par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min dans le froid.
- Déterminer la concentration en protéines (voir tableau des matériaux)et charger de 10 à 20 g de protéines de chaque échantillon sur un gel polyacrylamide-SDS de 10 %.
- Électrophorese pour 15 h à 45 V, ou à 100 V pour 2 à 2,5 h.
- Transférer sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF à l’aide d’un appareil de transfert électroblotting (voir Tableau des matériaux).
- Bloc avec 5% d’albumine de sérum bovin (BSA) en saline tamponnée tris avec 0,1% Tween-20 (TBST).
- Ajouter l’anticorps primaire, la chèvre anti-caséine diluée 1:2,000 ou la souris anti-actine diluée 1:1,000 (voir tableau des matériaux).
- Laver 3x avec tBST, 5 min à chaque fois.
- Ajoutez l’anticorps secondaire, le raifort peroxidase (HRP) lié à l’anti-chèvre d’âne dilué 1:2,500, ou HRP a lié l’anticorps anti-souris de cheval dilué 1:10.000.
- Laver 3x avec tBST, 5 min à chaque fois.
- Ajouter des réactifs ECL à la membrane selon les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).
3. Placage et croissance 3D des cellules EpH4 dans la matrice EHS
REMARQUE : La matrice est liquide à des températures de 10 oC et solide à des températures supérieures. Conserver à -80 oC. Décongeler à 4 oC la veille de l’utilisation. Pré-réfrigérer les plaques de culture tissulaire et les pointes de pipette à -20 oC avant la manipulation et garder la matrice, les plaques et les pointes de pipette sur la glace pour l’empêcher de se solidifier.
- Cultivez des cellules EpH4 en 2D dans le milieu RPMI-1640 avec 10% de FBS et 5 'g/mL d’insuline (EGF n’est pas nécessaire).
- Préparer le milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 10 % (v/v, 3 500 l) ou de 20 % (v/v 2 000 l) dans deux tubes coniques de 50 ml. Conserver sur la glace jusqu’au moment de l’utilisation.
- Enrober 10 puits (1 cm2 chacun) d’une plaque de 24 puits avec 150 l de matrice non diluée. Étendre la matrice à l’aide d’une pointe de pipette. Évitez de créer des bulles. Appuyez doucement sur les côtés de la plaque tout en la tenant horizontalement pour s’assurer que la matrice est répartie uniformément sur le fond du puits.
- Incuber la plaque de 24 puits à 37 oC pendant 1 h pour permettre à la matrice de se solidifier.
- Trypsiniser les cellules EpH4 comme décrit ci-dessus pour les cellules HC11 et les compter avec un hémocytomètre. Transférer 5 x 104 cellules par puits dans un tube de centrifugeure conique stérile de 1,5 ml et tourner à 250 x g pendant 5 min.
- Aspirez soigneusement le milieu et placez le tube sur la glace.
- Resuspendre les cellules dans 350 oL de milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 20% à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml tout en gardant le tube conique sur la glace. Évitez les bulles. Il est important d’assurer une suspension à cellule unique.
- Une fois que la matrice de couche inférieure s’est solidifiée (la matrice doit sembler translucide et plus claire par rapport au revêtement initial des puits), ajoutez les 350 l de suspension cellulaire à chaque puits enduit et placez-la dans un incubateur de CO2 à 37 oC pour 1 h pour permettre à la couche de matrice de 20 % de se solidifier.
- Observez les cellules microscopiquement sous contraste de phase avec un objectif 4x. Les cellules individuelles doivent être visibles.
- Ajouter 200 l de milieu EpH4 contenant 10% de matrice au-dessus des 350 l de cellules suspendues dans une matrice de 20%. Incuber à 37 oC.
4. Induction différenciation des cellules EpH4 cultivées en 3D (Figure 2)
REMARQUE : Outre la différenciation, les cellules EpH4 peuvent également subir la tubulogénèse lorsqu’elles sont stimulées par hGF (facteur de croissance des hépatocytes) dans la culture 3D. On peut voir des excroissances tubulaires après 10 jours de stimulation du HIP et du HGF.
- Commencer l’induction de différenciation des cellules EpH4 1 jour après le placage dans la matrice. Retirez soigneusement 150 l de milieu supérieur contenant 10 % de matrice des puits à l’aide d’une pointe de pipette en plastique. Ajouter 200 oL de milieu EpH4 contenant du HIP et une matrice de 10 %.
- Remplacez le milieu de 10 % de matrice-HIP tous les 2 jours pendant une durée pouvant aller jusqu’à 10 jours. Cultivez des cellules témoins dans le même milieu matricieux de 10 % sans HIP.
- Surveiller la formation de la mammosphère sous contraste de phase (Figure 3A, panneau inférieur).
5. Induction tubulogénèse des cellules EpH4 cultivées en 3D (Figure 3A et 3C)
- Préparer 24 plaques de puits et cellules EpH4 pour la croissance de la matrice comme détaillé dans les étapes 3.1-3.9. Le lendemain du placage des cellules dans la matrice, retirez 150 l de milieu EpH4 contenant 10 % de matrice des puits à l’aide d’une pointe de pipette en plastique. Ajouter 200 oL de milieu EpH4 contenant 10 % de matrice, HIP et 20 ng/mL HGF (voir Tableau des matériaux).
- Remplacez le milieu de matrice/HIP/HGF de 10 % tous les 2 jours pendant une journée allant jusqu’à 12 à 14 jours.
- Surveiller la formation de tubule au microscope à l’aide d’un objectif 20x ou 40x(figure 3A, panneau droit).
6. Quantitation de la différenciation : Blotting occidental pour la caséine
- Pipette soigneusement hors du milieu de matrice-HIP de 10% des puits. Rincer la couche de matrice de 20 % 2x avec 350 L de PBS glacé. Les sphéroïdes doivent toujours être présents dans la couche matricielle.
- Ajouter 700 à 1 000 l de PBS glacé avec 1 mM d’acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) directement dans les puits. Détachez délicatement la couche inférieure de la matrice de 100 % du puits avec une pointe de pipette pour récupérer les sphéroïdes présents dans cette couche. Agiter doucement pendant 30 min à 4 oC.
- Transférer soigneusement la suspension sphéroïde dans un tube conique. Rincer les puits avec 500 l de PBS-EDTA pour récupérer les sphéroïdes restants dans les puits et ajouter au tube conique.
- Roche sur la glace pendant 30 min supplémentaires. Assurez-vous que la matrice est complètement dissoute. Si des amas de matrice visibles sont observés, ajoutez plus de PBS-EDTA ou secouez plus longtemps.
- Centrifuger la solution pour granuler les sphéroïdes à 350 x g pendant 5 min.
- Aspirez le supernatant, lyser les sphéroïdes dans le tampon de lyse glacée, et sonder pour la caséine, la cycline D1, et p120RasGAP par le ballonnement occidental comme à l’étape 2.5 au-dessusde 16. Comme anticorps primaires, utilisez la chèvre anti-caséine diluée 1:2,000, lapin anti-cyclin D1 dilué 1:2,000, et souris anti-p120 dilué 1:2,000. Pour les anticorps secondaires, utilisez HRP lié âne anti-chèvre dilué 1:2,500, HRP lié âne anti-lapin dilué 1:2,500, et HRP lié cheval anti-souris dilué 1:10,000.
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Representative Results
On sait depuis longtemps que la différenciation des cellules épithéliales et des adipocytes nécessite la confluence et l’engagement des cadhérines2. Nous et d’autres avons démontré que l’adhérence de cellule à cellule et l’engagement de E- ou N-cadherin et cadherin-11, comme cela se produit avec la confluence des cellules cultivées, déclenche une augmentation spectaculaire de l’activité de la petite protéine GTPases Rac et de contrôle de la division cellulaire 42 (Cdc42), et ce processus conduit à l’activation des cytokines de la famille interleukine 6 (IL6) et Stat3 (transducteur de signal et activateur de transcription-316,17)1,18,19. Étant donné que de nombreux composants de la voie cadhérine/Rac/IL6/Stat3 peuvent participer à la différenciation et à la transformation néoplastique, ils fournissent des poignées moléculaires pour l’étude de l’interconnexion de ces deux processus diamétralement opposés.
En utilisant les techniques décrites ci-dessus, nous avons démontré une dépendance frappante de différenciation sur la force du signal rac dans les cellules HC11: Alors que cRac1 endogène est nécessaire pour la différenciation, et à de faibles niveaux activés par mutation RacV12 provoque une augmentation distincte de la capacité de différenciation, les niveaux élevés RacV12 déclencher un bloc dramatique de différenciation tout en induisant la néoplasie (Figure 1B). En revanche, même de faibles niveaux d’expression RacV12 bloqué la différenciation dans les cellules EpH42. En outre, même si RacV12 active Stat3 dans de nombreux systèmes cellulaires, y compris HC1116, activé par mutation Stat3C bloqué la différenciation tout en induisant la transformation néoplastique20.
Nous avons exploré en outre les propriétés de différenciation des cellules EpH4 dans une culture de matrice 3D. Alors que la production de caséine a atteint un sommet de 8 à 10 jours, l’expression de la cycline D-1 était maximale à 4 à 6 jours après la stimulation de la HIP (figure 3B). Ces résultats soutiennent une relation inverse entre la prolifération et la différenciation dans le modèle EpH4. À l’aide de la coloration DAPI (nucléaire) et de la microscopie confocale pour déterminer le positionnement des cellules épithéliales individuelles, nous avons observé la mort cellulaire interne et la formation de lumens creux dans les mammosphères (Figure 3A,C). Nous avons en outre montré que l’ajout de HGF (20 ng/mL) à 48 h au milieu de HIP a eu comme conséquence la formation des structures tubulaires (figure 3A,C),compatibles aux études antérieures de microscopie électronique21. Ces approches utilisant le modèle EpH4 permettent la caractérisation des caractéristiques spécifiques de la différenciation épithéliale mammaire et leur association avec des voies de transduction de signal distinctes.
Figure 1 : Évaluation et quantitation de la différenciation des cellules HC11. (A) Un dôme formé dans les cellules HC11 exprimant de faibles niveaux de GFP-RacV12 à 10 jours suivant l’induction de la différenciation. Gauche : Contraste de phase; Droite : Fluorescence du même champ (photos non publiées auparavant). Barre d’échelle de 100 m; Agrandissement 240x; objectif 20x. (B) Effet de la différenciation De la racV12 sur le HC11 : Faible (voies 19-24), intermédiaire (voies 13-18) ou élevé (voies 7-12) des niveaux d’une fusion RacV12-GFP ont été exprimés dans les cellules HC11. Après la croissance dans l’absence de EGF pendant 24 h, les cellules ont été induites pour différencier avec l’addition de HIP, ou pas, comme indiqué. Des extraits de détergent ont été préparés au nombre indiqué de jours plus tard et sondés pour la caséine ou l’actine comme contrôle de chargement. Notez l’augmentation spectaculaire de la caséine de la carétine dans les cellules exprimant esclavagise racV12-GFP (voies 21-24 vs 3-6), et la réduction spectaculaire à l’expression de la haute RacV12-GFP (voies 9-12). NE - Cultures de contrôle, cultivées en l’absence d’EGF, mais non incitées à se différencier (Niit et al.2, reproduites avec permission). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Schéma de la méthode de superpose ment pour la croissance des cellules EpH4 dans la culture de matrice 3D. (A) Les puits d’une plaque de 6 puits ont d’abord été recouverts d’une matrice 100% EHS qui a été autorisée à se solidifier à 37 oC formant un lit gélifié de membrane de sous-sol mesurant environ 2 à 5 mm d’épaisseur. Les cellules EpH4 ont été ensemencées sur ce lit comme suspension de cellules simples dans le milieu de HIP avec la matrice de 20%. Ceci a été rectifié avec la matrice de 10% dans le milieu de HIP. Le milieu de matrice de 10 % a été remplacé tous les deux jours. Les cellules prolifèrent et commencèrent à former des mammosphères après 4 à 5 jours de culture (voir la section Protocoles). (B) Des images de contraste de phase des cellules EpH4 dans la culture 2D (monocouche) et 3D (mammosphère) ont été capturées à l’aide d’un microscope équipé d’un appareil photo numérique (grossissement de 300x). Des images représentatives à chaque étape sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Événements dans la morphogénèse acinar 3D d’EpH4 dans la culture 3D. (A) Les cellules EpH4 ont été cultivées dans des plaques de puits enduites de matrice s’est maintenue et maintenues dans un milieu 3D complet comme dans la figure 2. Pendant les premiers stades de la morphogénèse, les cellules prolifèrent, formèrent des grappes et s’organisèrent en deux groupes : (1) une couche externe de cellules polarisées et (2) un groupe interne de cellules désorganisées qui subitlait la mort cellulaire, correspondant à l’apoptose comme indiqué précédemment12. Ce dernier a conduit à la formation d’un lumen creux, caractérisé par l’assombrissement du centre des mammosphères comme on le voit par la microscopie de contraste de phase. L’ajout de HGF (20 ng/mL) au milieu a eu comme conséquence la formation des structures tubulaires. Plus de 60% des agrégats induits par HGF ont montré la tubulogénèse, comparée aux agrégats témoins non traités, qui n’ont pas. Une photographie de contraste de phase représentative des cellules à chaque étape a été capturée à l’aide d’un microscope équipé d’un appareil photo numérique (grossissement de 300x ; Barre d’échelle de 100 m). Les résultats sont représentatifs d’au moins trois expériences. Schematic a été adapté de Starova et coll.22. (B) Les cellules EpH4 cultivées en 3D ont été récoltées les jours indiqués. Les concentrations de protéines ont été normalisées et des quantités égales de protéines (20 g) ont été soumises au SDS-PAGE, suivies de ballonnements occidentaux et de sondages avec les anticorps indiqués. Une glande mammaire homogénéisée d’une souris allaitante (MGT) a été employée comme comparaison in vivo. p120RasGAP a été utilisé comme un contrôle de chargement indépendant. Cyclin D1 expression a augmenté transitoirement coïncidant avec les cellules proliférantes au cours des 3 à 4 premiers jours. En revanche, l’expression de la caséine a culminé entre 8 et 10 jours, ce qui correspond à la formation de mammosphères matures. Les résultats sont représentatifs de deux expériences. (C) La formation de Lumen et la tubulogenèse des mammospheres ont été confirmées utilisant la coloration DAPI de l’ADN nucléaire (bleu fluorescent) dans les agrégats cultivés sur des couvertures en verre recouvertes de matrice. Les cellules ont été fixées dans le paraformaldehyde de 3%, perméabilisées avec la numérisation de 25 'g/mL, et la liaison non spécifique a été bloquée avec 3% BSA. Les cellules ont ensuite été tachées pour l’ADN nucléaire avec DAPI (bleu). Des couvercles ont été montés sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage. Des photomicrographes ont été pris du plan central de l’axe XY à l’aide d’un microscope confocal multiphoton (barre d’échelle de 100 m). Les images des panneaux B et C sont adaptées de Starova et coll.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les cellules HC11 sont idéalement adaptées à l’étude de la différenciation en conjonction avec la transformation néoplastique. Un avantage supplémentaire est que les cellules HC11 sont facilement infectables avec des vecteurs rétroviraux à base de Mo-MLV pour exprimer une variété de gènes. Dans nos mains, les cellules EpH4 étaient plus difficiles à infecter avec les mêmes vecteurs rétroviraux que le HC112.
Le contact de cellule à cellule et l’arrêt de croissance sont des conditions préalables essentielles à la différenciation des cellules HC11. Ainsi, pour obtenir une différenciation uniforme entre la couche cellulaire, il est important d’obtenir une distribution uniforme des cellules dans le plat Petri au moment de l’ensemencement. Ceci est particulièrement important si la quantitation de la différenciation est désirée. La trypsinisation doit être optimisée de sorte qu’une suspension de cellule unique soit réalisée et que les cellules ne perdent pas leur viabilité à cause des manipulations.
Les cellules trypsinisées doivent être sous-confluentes (50 à 70 %), parce que les cellules cultivées à des densités élevées ont tendance à adhérer fortement les unes aux autres, et les séparer est difficile. Pour éviter de sécher les cellules, aspirez avec le plat Petri plat sur le sol de la hotte à débit laminaire, puis inclinez pour égoutter rapidement. Couvrir le plat Petri avec le couvercle. Si nécessaire, vous pouvez accélérer l’action de la trypsine en plaçant le plat Petri dans un incubateur de 37 oC.
Étant donné que les cellules sont très confluentes pendant les 10 jours suivant l’induction, il est important de remplacer les nutriments qui sont épuisés. Lorsque le milieu est changé, il faut également prendre soin d’éviter le détachement des cellules, qui peuvent ne pas adhérer très bien au plastique en raison de la densité cellulaire élevée. Pourtant, dans notre expérience, il n’est pas nécessaire d’utiliser des plats Petri enduits de fibronectin, collagène, ou CellTak pour obtenir de bons résultats de différenciation, contrairement à la différenciation des préadipocytes tels que 3T3L123 ou Balb/c3T3 dérivés.
La détermination précise des protéines pour les expériences de ballonnement est essentielle. Puisque les protéines de sérum tendent à attacher au plastique de catégorie de culture de tissu, il est important de gratter et laver les cellules dans un tube en plastique de 1.5 ml qui n’attire pas des protéines et pour ajouter le tampon de lyse sur le granule de cellules plutôt que de lysing les cellules directement sur le plat de Petri24.
En ce qui concerne l’extraction des protéines, il est très important de garder toutes les solutions de lavage et de lyse glacée et les plats Petri ou mammosphères EpH4 sur la glace tout au long. C’est parce qu’en l’absence de calcium dans le lavage PBS les cadhérines ne sont pas engagés et, par conséquent Stat3-ptyr705 est rapidement déphosphoryé25.
La taille des plats Petri décrits pour les cellules HC11 est suffisante pour les taches occidentales de 3 à 4 (c.-à-d., la quantité de protéines récupérées par plat Petri est d’environ 50 g par plat de 3 cm). Nous préférons utiliser des plats Petri de 3 cm pour des expériences de différenciation pour faciliter l’extraction des protéines. Si un plateau de 6 puits est utilisé à la place, il est difficile d’extraire les protéines d’un puits dans le froid tout en gardant le reste des puits stériles. En outre, la concentration de CO2 est importante pour la différenciation et il est difficile de la maintenir pour le reste des puits car les protéines sont extraites d’un puits sur le banc.
Dans notre expérience, contrairement à la différenciation des préadipocytes23,plusieurs lots de sérum foetal de veau sont en mesure de soutenir la croissance ainsi que la différenciation des cellules HC11 ou EpH4. Un sort de sérum de veau nouveau-né testé n’a pas supporté la différenciation, bien qu’il puisse soutenir la croissance normale : les cellules ont semblé différencier au début mais ont perdu leur capacité de différencier après trois passages dans le sérum nouveau-né de veau.
Contrairement aux cellules HC11, la différenciation des cellules EpH4 est étroitement liée à l’architecture de la matrice 3D environnante. Nous décrivons les étapes requises pour la différenciation d’EpH4 dans la culture 3D modifiées des études précédentes26,27,28 et l’extraction suivante de protéine pour l’analyse de la production de caséine de l’A. La matrice EHS est liquide à basse température (10 oC) et se solidifie à des températures plus élevées. Il est normalement stocké à -80 oC, mais les aliquots de travail peuvent être stockés à -20 oC. Décongeler la matrice à 4 oC la veille de l’utilisation et pré-réfrigérer les plaques de culture des tissus et les pointes de pipette à -20 oC avant la manipulation. Pour une évaluation précise de la concentration de protéines, il est important d’éliminer complètement la matrice avant l’extraction avec le lavage à froid PBS parce que la matrice est riche en protéines, ce qui peut confondre les résultats de détermination des protéines.
La dépendance d’EpH4 à la matrice pour la différenciation a été démontrée dans de multiples modèles expérimentaux : Reichman et autres10 ont prouvé que les cellules d’EpH4 induites par des hormones lactogenic ont produit la caséine dans les secteurs du dépôt de laminin et de l’expression intensifiée de cytokeratin. Somasiri et coll.11 ont démontré que le PI3-kinase est nécessaire pour la formation sphéroïde dépendante de la jonction des adhérents et l’expression différente du gène des protéines du lait. En outre, Brinkmann et coll.21 ont démontré que l’expression de l’ADNC HGF transfectédans les cellules EpH4 a induit la tubulogenèse ramifiée des sphéroïdes dans un modèle de culture 3D, analogue à la formation observée de tubule induite par HGF observée ici (Figure 3A,C). Ces résultats illustrent les avantages du modèle de ligne cellulaire d’EpH4 pour étudier des événements de signalisation qui règlent la différenciation de glande mammaire.
Les cellules EpH4 peuvent également former des mammosphères lorsqu’elles sont plaquées à des concentrations de sérum fœtal du veau inférieures aux 10 % décrits. Fait intéressant, ils peuvent former des mammosphères à des concentrations plus faibles, ou même en l’absence de 20% ou 10% matrice, lorsqu’il est plaqué sur une couche de 100% matrice22,27. En l’absence de matrice dans la suspension cellulaire, le refroidissement des cellules est évité. Un avantage supplémentaire est que toutes les cellules se trouvent dans un seul plan, de sorte qu’ils sont plus faciles à photographier.
Importance: L’engagement de Cadherin dans les cellules cultivées, qui se rapproche de l’état physiologique d’une cellule in vivo, peut activer la voie Rac/IL6/Stat3. Ceci peut être particulièrement important dans la différenciation épithéliale de cellules. En utilisant les techniques décrites, nos résultats ont exposé l’intensité du signal émanant de cette voie comme déterminant central dans l’équilibre entre la prolifération cellulaire et la différenciation, deux processus fondamentalement opposés2. L’étude approfondie de l’axe E-cadherin/Rac/Stat3 peut découvrir de nouvelles composantes amphiboleuses de la voie selon le niveau d’expression, qui pourraient être exploitées comme cibles pour le traitement du cancer. Pour de telles cibles, l’inhibition complète ne serait pas nécessaire pour renverser le phénotype néoplastique. L’inhibition partielle serait même bénéfique, parce que les quantités résiduelles peuvent en fait bloquer la transformation et favoriser la différenciation. Cela peut varier avec la cible ainsi que le type de tumeur en question, comme le montre le comportement différent de RacV12 vs Stat3C, dans HC11 vs EpH4 cellules2,20.
Applications futures : La voie cadhérine/Rac/IL6/Stat3 peut jouer un rôle similaire dans la différenciation d’autres cellules épithéliales, telles que le sein humain MCF10A ou le rein canin MDCK29 lignées cellulaires, ainsi que d’autres types de différenciation qui dépendent de la confluence cellulaire, tels que les préadipocytes et les myoblastes30, qui expriment différents types de cadhérines. Enfin, cette technique peut être exploitée pour l’examen du rôle de Stat531 et d’autres composantes des voies différenciantes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.
Acknowledgments
La lignée cellulaire HC11 a été gentiment fournie par le Dr D. Medina (Houston, TX). Les auteurs sont reconnaissants au Dr Andrew Craig de l’Université Queen’s pour de nombreux réactifs et suggestions précieuses. Les cellules EpH4 étaient un cadeau du Dr C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick a fourni une excellente assistance technique pour les études de culture 3D.
L’aide financière du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG), des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), de la Fondation canadienne du cancer du sein (CBCF, section de l’Ontario), de l’Alliance canadienne de recherche sur le cancer du sein , les Centres d’excellence de l’Ontario, le Breast Cancer Action Kingston (BCAK) et le fonds de legs Clare Nelson par le biais de subventions à LR sont reconnaissants. BE a reçu un soutien de subvention des IRSC, de la FCCS, de la BCAK et de la Société de recherche sur le cancer inc. PTG est appuyé par une chaire de recherche du Canada, la Fondation canadienne pour l’innovation, les IRSC, le CRSR et la Société canadienne du cancer. MN a reçu l’appui d’un programme de formation Terry Fox en recherche transdisciplinaire sur le cancer de l’INCC, d’un prix d’études supérieures (QGA) et d’un prix du doyen de l’Université Queen’s. MG a reçu des bourses postdoctorales du Programme du cancer du sein de l’armée américaine, du ministère de la Recherche et de l’Innovation de la province de l’Ontario et du Comité consultatif de recherche de l’Université Queen’s. VH a reçu l’appui d’une bourse de doctorat de la FCCS et d’une bourse postdoctorale du Programme de formation de la Fondation Terry Fox en recherche transdisciplinaire sur le cancer, en partenariat avec les IRSC. Hanad Adan a reçu un stage d’été du CRSN. BS a reçu un prix d’études supérieures de l’Université Queen’s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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