Summary
이 프로토콜은 피부에서 Malassezia-host 상호 작용을 공부하기위한 마우스 모델의 설립을 설명합니다. 그것은 시험관에서 Malassezia의 재배, Malassezia를가진 뮤린 피부의 감염 및 피부 조직에 있는 염증 그리고 곰팡이 부담의 후속 분석을 기술합니다.
Abstract
동물 모델은 전염병 연구에 매우 중요합니다. 그(것)들은 조직 특정 한 방식으로 생체 내에서 미생물과 그들의 호스트 사이 발생 하는 상호 작용의 전체 스펙트럼을 분석 하기 위한 중요 한 기초를 제공 합니다. 병원성 곰팡이는 점점 인간에게 심각한 위협으로 인식되고 있으며 이러한 감염 모델을 악용하면 곰팡이 병원성에 대한 우리의 이해가 크게 향상되었습니다. Malassezia 속의 종은 인간 피부 microbiota의 가장 풍부한 진균 이며 그들은 또한 지루성 피부염 과 아토피 성 피부염 등 심한 염증 성 피부 질환의 개발과 관련 된. 그러나 말라세지아와 질병 병인 사이의 원인 링크는 알려지지 않았으며, 피부 면역 계통을 가진 말라세지아의 복잡한 크로스토크에 대한 가난한 지식에 기인 할 수있는 사실. 이 프로토콜은 말라세지아와 포유류 피부의 상호 작용을 생체 내에서 연구할 수 있는 실험적인 마우스 모델의 확립을 설명합니다. 그것은 실험실 조건 하에서 Malassezia spp. 경작하는 방법, Malassezia spp로 뮤린 피부를 감염시키는 방법 및 피부 염증 및 곰팡이 부담 분석을 통해 감염 결과를 평가하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 모형은 완전한 면역적격 동물에서 작동하고 동물의 면역 억제 또는 항생제 전처리에 의존하지 않습니다. 또한 거의 모든 유전자 변형 마우스 균주에 적응할 수 있으며 다른 피부 질환 모델과 결합 될 수 있습니다. 이러한 특징은 이 감염 모형을 생체 내 피부에서 Malassezia에 대하여 호스트의 선천적이고 적응적인 면역 반응을 상세히 공부하기위한 매우 강력한 도구입니다.
Introduction
피부는 많은 다른 세균에 의해 채워집니다. microbiota에 피부의 지속적인 노출은 호스트의 면역 계통을 형성하고 교육에 기여합니다. 곰팡이는 점점 미생물의 중요한 부분으로 인식되고 그들은 박테리아 및 바이러스와 유사한 숙주 생리학 및 면역에 대한 중요한 역할을 수행1. Malassezia 속의 종은 지금까지 가장 풍부한 곰팡이가 온혈 척추 동물의 피부를 식민지화하고 그들은 인간의 피부 진균 의 90 % 이상을 구성2,3. 말라세지아의 18종은 지금까지 인간과 동물의 피부로부터 확인되었으며4.
피부의 다양한 병리학은 적어도 부분적으로 불균형 미생물 구성의 결과로 발생하는 것으로 생각됩니다. Dysbiosis는 기회 감염 및 질병5의결과로 병원성 잠재력을 가진 종의 과성장으로 이끌어 낼 수 있습니다. 일관되게, Malassezia는,그것의 공생 생활 양식 외에, 비듬과 동정에 구역 수색하는 각종 피부 병리의 발달에 기여한다는 것을 증가하는 기록이 있습니다 versicolor 더 가혹한 선동적인 무질서에 versicolor 지루성 피부염과 아토피 성피부염으로4,6. Malassezia와 동정론 versicolor 사이 원인 링크는 설치 되었습니다 하는 동안, 더 심각한 피부 병 리에 곰 팡이의 병 리 생리 적 역할 크게 알 수 없는 남아.
피부 항상성과 질병에서 Malassezia의 역할을 결정하는 것은 피부와 피부 면역 계통의 상호 작용에 관하여 더 심층적인 지식을 요구합니다. 참고로, Malassezia에 대한 연구는 다른 인간 곰팡이 병원균 (예 : 칸디다 알비칸스 또는 아스퍼질러스 훈증)과비교하여 아직 신생 단계에 있습니다. 이것은 실험실 조건하에서 Malassezia의 재배에 있는 어려움 및 생체 내 호스트와 접촉하는 곰팡이를 공부하기위한 적절한 실험 모델의 부족에 기인 할 수있다. 배양에서 단리된 세포를 가진 이전 실험은 Malassezia와 다양한 면역 및 비면역 세포 사이 직접 및 간접적인 상호 작용의 넓은 범위를표시7. 그러나, 이러한 시험관 내 실험은 곰팡이와 다양한 세포 유형 사이에 수많은 세포 및 분자 이벤트가 수반되는 생체 내 복합 피부 환경의 상황을 부분적으로 재현합니다.
본 명세서에서, 우리는 우리가 최근에 설립한 마우스에서 Malassezia 피부 감염의 실험 모델에 대한 프로토콜을 설명하고, 생체 내 곰팡이 숙주 상호작용을연구한다 7. 여기에는 (1) 시험관내 말라세지아의 성공적인 재배 절차, (2) 말라세지아를 뮤린 귀 피부에 의한 경피적 적용, (3) 말라세치아-유도피부를 분석하는 방법에 대한 기술적 세부 사항이 포함됩니다. 염증과 감염된 피부의 곰팡이 부담. 중요한 것은, 이 모델은 곰팡이 감염의 다른 마우스 모델에서 실행되는 바와 같이 면역 억제(예를 들어, 코르티코스테로이드에 의한) 또는 감염 전에 마우스의 항생제 치료에 의존하지 않는다는 것이다 8,9. 차례로, 그것은 정상적인 피부에 Malassezia에 대 한 타고난 적응 면역 반응의 전체 스펙트럼을 공부 할 수 있습니다. 참고로, 특정 병원균이 없는 (SPF) 조건 하에서 유지된 근친 야생 형 마우스는 Malassezia로 자연적으로 식민지화되지 않으며, 따라서 곰팡이에 노출되면 지속적인 식민지화로 이어지지 않지만 호스트 내에서 제거됩니다. 약 1.5 주. 그러나, 모형은 항진균호스트 반응 개시 및 규칙의 기계장치를 공부하기 위하여 허용합니다, 차례차례로, 면역 기억이 생성되는 방법의 기초입니다. 이 모델은 다양한 유전자 변형 마우스 균주에 쉽게 적용 할 수 있으며 장벽 결핍 모델과 같은 다른 기존 피부 질환 모델과 결합하여 Malassezia의 영향을 연구 할 수 있다는 점에서 다재다능합니다. 병리학 및 염증성 피부 상태7. 따라서, 마우스에서 실험적인 Malassezia 피부 감염의 모델은 항상성 및 질병의 맥락에서 피부 면역 계통과 곰팡이의 상호 작용을 조사하는 높은 수준의 유연성을 제공한다.
이 프로토콜은 Malassezia 종으로 마우스의 실험적인 피부 감염을 기술합니다. 현지 가이드라인을 확인하고 현지 당국의 규정을 준수하시기 바랍니다. BSL2 분류 유기체는 BSL2 인증 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 훈련 된 직원에 의해 처리되어야한다. BSL2 분류 된 유기체로 오염 된 생물학적 폐기물뿐만 아니라, 이러한 유기체에 감염된 마우스의 시체는 폐기 전에 오토클레이브되어야합니다. 마우스를 가진 실험을 위해, 모든 노력은 고통을 극소화하고 3R 원리에 따라 가장 높은 윤리적이고 인도적인 기준을 보장하기 위하여 이루어져야 한다 (교체, 정제, 감소)10. 본 프로토콜에 기재된 실험은 M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) 및 M. 심포디얼리스(ATCC 42132)7로수행되었다.
Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 스위스 연방 환경 청(www.bafu.admin.ch)의 포함된 시스템에서 유기체 취급에 관한 조례에 따라 수행되었습니다. 마우스 실험은 스위스 동물 보호법의 지침에 따라 엄격하게 수행되었으며 스위스 취리히 주 수의청에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다(라이센스 번호 168/2018).
1. 실험실 조건하에서 말라세지아 재배
참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약과 매체를 실온(RT, 20 – 25°C)에 보관하십시오.
- 말라세지아 성장을 위해 액체 변형 딕슨(mDixon) 배지를 준비한다. 액체 mDixon 배지 의 500 mL을 준비하려면, 용해 18 g 맥아 추출물, 10 g 건조 옥스 담즙, 5 mL 트웬- 40, 3 g 페톤, 1 mL 글리세롤 과 1 mL 올레산 500 mL 증류H2O (dH2O). HCl 및 오토클레이브로 배지를 pH 6으로 조정합니다. 매체를 RT에 저장합니다.
- 오토클레이브 전에 500 mDixon 배지에 7.5 g의 한천을 추가하여 mDixon 한천 플레이트를 준비합니다. 천천히 냉각하는 동안 매체의 부분 응고를 방지하기 위해 스티어링 바와 자기 가열 플레이트를 사용하여 오토 클레이브 후 mDixon 한천을 냉각.
- 한천을 50 -60 °C로 식히면 액체를 페트리 접시에 넣고 층류 후드에 넣고 RT에서 하룻밤 동안 건조시십시오.
참고 : 한천 플레이트는 증발을 피하기 위해 포장하고 거꾸로 보관 할 때 몇 주 동안 4 °C에서 보관 할 수 있습니다. - 공급자가 얻은 지침에 따라 말라세지아를 분리하고 말라세지아의 동구형 주식을 부활시.
- 공급자가 얻은 지침에 따라 부활된 말라세지아 현탁액과 함께 멸균 된 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 액체 mDixon 배지10 mDixon 배지를 접종하십시오. 30°C 및 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 배양한다.
- 크림 색과 탁도의 모양을 확인하여 정기적으로 말라세지아 문화의 성장을 검사합니다. 성장 역학은 말라세지아의 종과 균주에 따라 달라지며 말라세지아가 동약증으로 된 주식에서 신선하게 부활할 때 특히 느릴 수 있습니다. (그림1A).
- mDixon 배지에 조밀하게 자란 말라세지아 배양물의 3부분을 멸균 99% 글리세롤의 1부분과 혼합하여 글리세롤 주식을 준비합니다. Malassezia/글리세롤혼합물을 멸균 스크류 캡 튜브에 넣고 -80°C에 보관합니다.
- 시험관 내 전파를 위해, 접종 루프를 사용하여 mDixon 또는 냉동 글리세롤 스톡으로부터 mDixon 한천 플레이트(4°C로부터 RT로 가져온)에서 액체 배양으로부터 Malassezia 플레이트를 접종루프를 사용한다.
참고: mDixon 한천 플레이트를 사용 전에 4°C에서 RT로 옮기면, 차가운 mDixon 한천은 곰팡이 성장을 억제합니다. - 30°C에서 (비흔들림) 인큐베이터에서 말라세지아와 함께 한천판을 거꾸로 인큐베이션한다. 정기적으로 말라세지아 식민지의 성장을 검사합니다.
참고 : mDixon 한천 접시에 Malassezia 식민지는 3 - 5 일 이내에 나타나고 크림 색의 칙칙하고 볼록한 고도가 부드럽습니다(그림 1B). - 말라세지아 식민지를 mDixon 한천 접시에 RT에서 ~ 2주 동안 보관하십시오. 그 후, 1.7에 설명된 바와 같이 냉동 글리세롤 스톡으로부터 말라세지아를 줄무늬로 새로운 mDixon 한천 플레이트를 준비한다.
2. 마우스의 실험 말라세지아 감염에 대한 접종의 준비
- 10 mDixon 배지의 액체 mDixon 배지를 멸균 된 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 3 - 5 개별 말라세지아 콜로니를 mDixon 한천 플레이트에서 접종합니다 (단계 1, 그림 1B참조).
- 30°C 및 180 rpm에서 ~ 48~96h에 대해 말라세지아 배양을 배양하고 배양할 때까지 크림색 및 탁한 배양(도1A).
참고 : 말라세지아 성장에 필요한 시간은 말라세지아 종과 균주 및 접종에 사용되는 곰팡이의 양에 달려 있습니다. - 말라세지아 배양액의 2 mL을 멸균 된 2 mL 미세 원심 분리튜브 및 원심 분리기를 10, 000 x g에서 1 분 동안 옮김.
- 상급체를 버리고 인산완제 염용액(PBS)의 1 mL에 펠릿을 일시 중단하여 세척합니다. 원심 분리기 10, 000 x g에서1 분 동안 다시 .
- 세척 후, 활발한 파이펫팅에 의해 PBS의 1 mL에서 펠릿을 중단하고 분광계를 사용하여 600 nm (ODA600)에서용액의 광학 밀도를 측정합니다. OD 측정을 위해 PBS로 Malassezia 서스펜션 20 - 50 x를 희석하여 판독값이 0.1과 1 사이임을 확인합니다.
참고 : 말라세지아의 3 일 배양의 밀도는 일반적으로 Malassezia 종과 균주에 따라 배양 접종에 사용되는 효모 세포의 수에 따라 15 및 30 ODA600사이에서 다릅니다 (단계 2.1). Malassezia는 응집체를 형성하는 경향이, 따라서, 활발한 파이펫팅은 현탁액의 균질성을 보장하기 위해 필요하다. - 멸균 2 mL 튜브내로 4 ODA600의 밀도에 해당하는 PBS에서 Malassezia 현탁액의 부피를 Aliquot. 감염될 동물 당 튜브 1개준비합니다.
- 10, 000 x g에서 1 분 동안 말라세지아를 포함하는 튜브를 원심 분리기.
- 상류를 버리고 200 μL의 천연 올리브 오일 (2 ODA600 효모 세포 / 100 μl 올리브 오일에 해당)에 Malassezia 펠릿을 일시 중단하십시오.
참고 : 올리브 오일은 말라세지아가 친유성 및 지질 의존 효모이기 때문에 말라세지아와의한 피상적 감염에 좋은 수단으로 밝혀졌습니다. 올리브 오일은 PBS보다 피부에 더 잘 흡수됩니다. 그러나 올리브 오일에 말라세지아를 중단시키는 것은 쉽지 않다는 점에 유의하십시오. 소용돌이에 의해 말라세지아/ 올리브 오일 현탁액을 개선하십시오. 감염에 사용될 때까지 RT에서 현탁액을 유지하십시오. - 제어 동물의 모의 감염에 대한 혼자 올리브 오일 튜브를 준비합니다.
3. 말라세치아와 쥐를 감염
- 6-8주 된 생쥐를 6-8주 에 주문하고 적어도 1주일 동안 실험 동물 시설에서 적응할 수 있도록 하십시오. 감염되지 않은 대조군을 포함하여 그룹당 3-5개의 마우스를 계산합니다.
- PBS에서 1.3 mg/mL 자일라진과 6.5 mg/mL 케타민을 함유한 멸균 마취 칵테일을 준비합니다. 5 mL의 마취 칵테일은 20 마리의 동물을 마취시키기에 충분합니다. 마취될 동물의 수에 따라 칵테일의 부피를 조정한다.
- 마취 칵테일의 10 μL/g 체중을 복강 내 (킬로그램 체중 당 65 mg 케타민 및 13 mg 자일라진에 해당)를 주입하여 동물을 마취시키고 마취 된 동물을 37 °C의 가열 패드에 놓습니다.
참고 : 표시된 복용량에서 동물은 보통 ~ 30 - 60 분 동안 마취 된 상태로 유지됩니다.
- 마취 칵테일의 10 μL/g 체중을 복강 내 (킬로그램 체중 당 65 mg 케타민 및 13 mg 자일라진에 해당)를 주입하여 동물을 마취시키고 마취 된 동물을 37 °C의 가열 패드에 놓습니다.
- 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 집게로 뒷발을 꼬집어 반사 신경을 확인하십시오.
- 마취 중 탈수증을 방지하기 위해 눈위에 아이크림을 바르고 있습니다.
- 선택적으로 캘리퍼스(0 - 5mm 범위)를 사용하여 양쪽 귀의 귀 두께를 측정합니다. 각 귀의 두 개의 서로 다른 영역을 측정하고 귀당 평균 귀 두께를 계산합니다.
참고: 귀 두께를 측정하는 것은 선택 사항이며 연구 질문에 따라 다릅니다. 그러나, 귀 두께가 피부 염증에 대한 판독값으로 사용되는 경우, 감염 전에 기준선 귀 두께를 측정 할 필요가있다. (4단계 참조). - 선택적으로, 가벼운 테이프 스트리핑에 의해 등쪽 귀 피부의 표피 장벽을 방해 : 수동으로 피부에 테이프의 작은 조각을 적용하고 다시 제거. 각 라운드에 신선한 테이프를 사용하여 5 회 연속 반복합니다.
참고: Malassezia는 교란되지 않은 피부에 비해 장벽이 붕괴된 피부에서 더 뚜렷한 피부 염증을 유발합니다(그림 2A)7. - 멸균 피펫을 사용하여 각 귀의 등쪽 면에 Malassezia/올리브오일 현탁액의 100 μL(2 ODA600)을국소적으로 적용합니다. 올리브 오일만으로 처리되는 동물의 대조군을 포함한다(비차량 처리 대조군).
참고: 말라세지아/올리브오일 현탁액을 소용돌이치며 적용 직전에 균일한 말라세지아 현탁액을 보장합니다. - 마취 된 동물을 가열 패드에 두어 저체온증을 피하십시오 (수염 운동, 호흡 속도 증가 등)이 나타날 때까지.
- 200 μL의 멸균 및 사전 데운 2% 포도당 용액을 nuchal fold에 피하주사하여 신진대사와 재수화를 지원합니다.
참고: 멸균 2% 포도당 용액을 준비하려면 50 mL PBS에 1 mg의 포도당을 용해시키고 0.2 μm 필터를 사용하여 여과하십시오. 용액은 4°C에서 보관할 수 있다. - 동물을 케이지로 다시 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김.
4. 말라세지아-유도 피부 염증의 분석
참고 :이 절차는 피부 염증의 매개 변수 역할을 감염 중 Malassezia-유도 귀 붓기의 분석을 설명합니다. 곰팡이 유발 귀 부종을 분석하기위한 전제 조건은 테이프 스트리핑 및 / 또는 감염 전에 기준선 귀 두께를 측정하는 것입니다 (단계 3.5).
- 말라세지아의단기 마취를위한 이소플루란 챔버를 준비 -감염 및 제어 동물.
- 한 번에 한 개의 동물을 챔버로 옮기고 동물이 완전히 마취될 때까지 기다립니다.
참고 : 적절한 마취의 징후는 완전한 신체 이완뿐만 아니라 느리고 무거운 (측면) 호흡을 포함한다. 이소플루란에 대한 장기간 노출이 치명적일 수 있기 때문에 마취를 주의 깊게 모니터링하십시오. - 챔버에서 동물을 제거하고 조직에 놓습니다.
- 캘리퍼스(범위 0 - 5mm)를 사용하여 귀의 두께를 측정합니다. 각 귀의 두 개의 서로 다른 영역을 측정하고 귀당 평균 두께를 계산합니다(단계 3.5 참조).
- 동물을 케이지로 다시 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮
참고 : 이소플루란 마취는 매우 수명이 짧으며 동물은 이소플루란 챔버에서 제거 한 후 ~ 30 s 이내에 회복됩니다. - 테이프 스트리핑 및/또는 감염 이전에 측정된 평균 기준선 귀 두께를 감염 후 각 시점에서 측정된 평균 귀 두께에서 빼서 귀 두께의 증가를 계산합니다.
- 계산된 값을 귀 두께의 증가로 또는, 또는, 각 동물 또는 동물군에 대한 시간에 따라 총 귀 두께로서 플롯한다(도2B).
5. 감염된 피부의 곰팡이 부담 분석
- dH 2 O에 0.5 mL의 멸균 0.05% NP40을 함유하고 오토클레이브 강철 볼(직경5mm)을 포함하는 각 귀에 멸균 2 mL 미세원심분리튜브를 준비합니다.
- 정밀 저울을 사용하여 튜브의 무게를 측정하고 정확한 무게를 적어 둡니다.
- CO2 질식에 의해 마우스를 안락사시한다.
- 5.1-5.2단계에서 설명한 바와 같이, 기지에서 귀를 제거하고 0.5 mL의 멸균 0.05% NP40을 dH2O로함유하는 튜브내로 이송한다.
- 귀 조직을 포함하는 튜브를 계량하고 기관과 튜브의 무게에서 기관없이 튜브의 무게를 빼서 각 샘플의 실제 무게를 계산합니다.
- 조직 균질화를 사용하여 25 Hz에서 6 분 동안 귀 조직을 균질화하십시오. 조직이 잘 균질화되었는지 확인하십시오.
- 각 샘플의 플레이트 100 μL (각 균질, 희석 인자 = 5의 1/5에 해당)을 mDixon 한천 플레이트에 놓고 30°C 인큐베이터에서 거꾸로 플레이트를 배양합니다.
참고 : 균질 도금의 양은 예상되는 곰팡이 하중에 따라 조정되어야합니다. 쉽게 열거할 수 있도록 플레이트당 최소 10개 이하의 콜로니를 얻기 에 충분한 균질화를 플레이트해야 합니다. 선택적으로, 균질의 다른 희석과 샘플 당 여러 플레이트. - 정기적으로 말라세지아 식민지의 성장을 검사합니다.
참고 : 식민지는 일반적으로 2 - 3 일 후에 볼 수 있습니다. 말라세지아 식민지가 성장하는 데 필요한 시간은 말라세지아의종과 균주에 따라 달라집니다. - 접시 당 식민지를 계산합니다.
- 다음 수식을 사용하여 CFU/g 조직의 수를 계산합니다.
CFU/g 조직 = (콜로니/플레이트 수) x (희석 인자) / (g의 피부 샘플의 무게).
참고: 최소 검출 한계는 최소 검출 한계 = (1 콜로니/플레이트) x (희석 인자) / (g의 모든 피부 샘플의 평균 중량)을 사용하여 평가할 수 있다. - 곰팡이 하중은 일반적으로 로그 계척도(그림2C)로플롯됩니다.
Representative Results
말라세치아의 체외 재배
C. 알비칸스 또는 A. 훈증과같은 다른 보다 일반적으로 사용되는 곰팡이 모델 병원체에 비해, 말라세지아는 시험관 내에서 배양하기가 더 어렵다. 이것은 Malassezia가 지방산을 합성하는 무능력 때문에 그것의 영양 요구 사항에 대한 외인성 지질 소스에 의존한다는 사실에 기인 할 수있다11. mDixon 배지는 M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa 및 M. 야마토엔시스 시험관에서 여러 말라세지아 종을 배양하는 데 적합합니다7 ,12. 도 1은 1단계 및 2단계에서 설명한 바와 같이 액상 mDixon 배지 및 mDixon 한천에서 M. 심포다이얼리스의 성장에 대한 대표적인 이미지를 나타낸다.
말라세치아 피부 염증의 피부 염증 및 곰팡이 부담 분석
감염 전에 테이프 스트립에 의해 차단된 마우스 귀 피부에 Malassezia의 노출은 피부의 염증을 악화시키고, 표피 및 진피 증식 및 부종의 발달을 특징으로한다 7. 4 단계 및 5 단계는 Malassezia-유도 된 귀 붓기 및 피부의 곰팡이 부담을 분석하는 방법을 설명합니다. 두 매개 변수는 감염 과정을 모니터링하기 위한 주요 판독을 나타냅니다. 그림 2A는 WT C57BL/6 마우스의 흔들리지 않는 피부에 비해 장벽이 붕괴된 피부에 M. furfur 노출 후 관찰될 수 있는 귀 두께의 증가를 나타낸다. 도 2B는 시간이 지남에 따라 귀 두께의 증가에 대한 대표적인 요약 그래프를 나타낸다. 그림 2C는 M. pachydermatis에감염 된 후 2 일째에 귀 피부에 곰팡이 부담을 표시합니다.
그림 1: 말라세치아의 체외 재배.
(a) M. 심포다이얼리스 스트레인 ATCC 42132는 30°C및 180 rpm에서 3일 동안 성장하여 액체 mDixon 배지(왼쪽)에서 접종되지 않은 mDixon 배지를 함유하는 제어 에를렌마이어 플라스크(왼쪽)에 있었다. (B) M. 심포다이얼리스 균주 ATCC 42132의 콜로니를 30°C에서 5일간 배양한 후 mDixon 한천에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 귀 두께 및 곰팡이 부담을 기준으로 말라세지아 피부 감염 분석.
(A)C57BL/6 마우스로부터 얻어진 귀 절제술의 이골은 올리브오일(비히클, 왼쪽)으로 처리되거나 M. furfur 균주 JPLK23에 5일 동안 감염되었다(중간 및 우측). 오른쪽에, 귀 피부는 감염 하기 전에 테이프 제거 했다. 섹션은 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)로 염색하였다. (B) 말라세치아에 노출되거나 대조군으로 감염되지 않은 채 방치된 C57BL/6 마우스에 대해 시간이 지남에 따라 귀 두께의 증가를 보여주는 요약 그래프. M. pachydermatis 균주 ATCC 14522-노출 또는 각 시점에서 차량 처리 귀 피부의 절대 두께는 왼쪽에 표시됩니다; 0일째 기준선에 대한 표시된 시간 포인트에서귀 두께의 증가는 오른쪽에 표시됩니다. (C) M. 파키드르미티스 균주 ATCC 14522에 감염되거나 올리브 오일을 대조군으로 처리한 C57BL/6 마우스의 피부에 곰팡이 부담(vehicle). 두 경우 모두, 피부는 테이프 제거되었다. 요약 그래프 B 및 C의 각 기호는 하나의 동물을 나타냅니다. 그룹 간의 차이의 통계적 유의는 단방향 ANOVA(B) 또는 학생의 t-test(C)를 사용하여 계산되었습니다. p <0.001, ****p&0.0001, D.L.: 탐지 제한이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 Malassezia spp에 의해 일반적으로 사용되는 근친 마우스 균주 C57BL/6의 피부 감염을 기술합니다. 균주는 감염 복용량, 분석의 시간 점,등등의 조정이 필요할 수 있습니다. 재현성을 보장하기 위해 마우스 그룹은 항상 같은 연령과 성별이어야합니다. 마우스의 근원은 공급 업체 사이에 존재하고 단일 번식 시설의 다른 단위 사이에 존재할 수 있는 유전적 배경과 microbiota의 차이에 있는 사소한 변경조차, 에 예측할 수 없는 충격을 미칠 수 있기 때문에, 안정적으로 유지되어야 합니다 감염의 과정. 이 프로토콜에 설명된 Malassezia 감염 모델을 설정할 때, 식민지의 정도, 곰팡이 클리어런스의 운동학 및 그 정도를 포함하여 감염 과정을 주의 깊게 모니터링하기 위해 파일럿 연구를 수행하는 것이 좋습니다. 염증 및 유도 될 수 있는 병 리 (예를 들어, 귀 피부는 감염 전에 장벽-중단 하는 경우) 최적의 분석 조건을 결정 하기 위해.
재현성을 보장하고 실험 군 간의 차이를 안정적으로 감지하려면 통계 분석을 기반으로 그룹당 사용되는 동물 수를 계산해야 합니다. 표본 크기는 생물학적 및 실험적 변이(예: 면역 계통의 변화로 인한)를 고려하는 효과 크기, 오차율 및 전력에 따라 계산됩니다. 윤리적 이유로 불필요하게 많은 수의 동물을 사용하지 마십시오. Malassezia 피부 감염에 관해서는, 곰팡이로 한 쪽 귀만 취급하고 동일한 마우스 내의 통제로 다른 귀를 사용하는 것은, 마우스가 손질할 때 양쪽 귀에 곰팡이를 퍼질 수 있기 때문에 조언되지 않습니다. 그러나, 곰팡이 부담의 결정, 면역 세포의 격리 또는 조직학 분석과 같은 다른 방법론적 판독을 위해 1/2 귀를 사용하는 것은 종종 충분하며 실험에 사용되는 동물 수의 현저한 감소를 초래합니다.
말라세지아의 18 가지 종은 최신으로 설명되었습니다. Malassezia 속 내의 간 및 종 내 변이는 우리가 또한 그밖 인간적인 병원성 균류에 대한 연구 결과에서 배운 것과 같이 호스트와의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다13. 다른 Malassezia 종및 균주는 기원에서 다릅니다 (예를 들어, M. pachydermatis는 동물로부터 고립 된 가장 빈번한 종인 반면, M. 제한, M. 글로보사 및 M. 심포지얼리스가 가장 많다. 다른 피부 영역 사이 이 종의 가변 분포를 가진 인간에 있는 곰팡이 피부 microbiome의 저명한 일원). 몇몇 종은 공생과 연관되었습니다, 그 외는 더 병원성이라고 생각되는 동안, 상세한 기록은 상대적으로 약한 남아 있더라도. 중요한 것은, 일부 종과 균주는 본질적으로 다른 사람보다 성장하기가 더 어렵다. 따라서, 감염에 사용할 종/균주의 결정은 연구 질문에 근거해야 합니다.
칸디다 알비칸스 또는 황색포도상구균과 같은 일부 미생물을 가진 뮤린 피부의 실험적 감염은 감염 전에 표피 장벽의 중단을 요구합니다(예: 모래 종이14). 15,16. 대조적으로, 여기에 설명된 Malassezia 감염의 모형은 장벽 중단7의그리고 없이 동등하게 효율적입니다. 곰팡이에 의해 유도된 염증의 정도는 감염 전에 피부가 테이프를 벗겨지면 엄청나게 향상된다7. 따라서 Malassezia의 적용 전에 피부를 조작해야하는지 여부는 연구 질문에 달려 있습니다. 만성 및 급성 피부 염증의 다양한 모델 (예를 들어, 지연 된 유형 과민증에 대한 모델 (DTH) 및 접촉 과민증 (CHS)) 및 장벽 결핍의 모델은 코멘탈 효모의 기여를 조사하기위한 관심이있을 수 있습니다 존재 피부 병리로.
특정 병원균 자유(SPF) 조건 하에서 유지되는 근친 마우스는 (우리의 지식에) 말라세치아로자연적으로 식민지화되지 않는다. 따라서, Mouse 귀 피부에 Malassezia의 실험적 적용은 숙주에서 급성 반응을 유도하는 곰팡이에 대한 1 차적인 노출을 나타내며,이는 차례로 1 - 2 주 내의 곰팡이 클리어런스로 이어집니다 7. 이 프로토콜에 기술된 모형은 그러므로 단지 Malassezia로영구적으로 식민지화되는 면역 적격 인간 또는 그밖 호스트 유기체에 있는 상황을 부분적으로 반영하는 동안, 실험적인 감염은 의 충분한 창을 허용합니다 항진균성 면역과 이 반응의 기초가 되는 세포 및 분자 메커니즘을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 그것은 또한 다른 실험 조건 하에서 다른 Malassezia 종 및 긴장에 대 한 응답에 변화를 조사 할 수 있습니다 (예를 들어, 피부의 장벽 중단 없이).
Malassezia의 연구-숙주 상호작용은 배양에서 단부된 세포 유형을 가진 시험관 내 실험(예를 들어, 각질세포 세포주, PBMC)에 과거에 제한되었다. 이러한 연구는 Malassezia와 호스트(17)사이의 상호 작용을 형성하는 곰팡이 및 호스트 결정요인에 약간의 빛을 발산했지만, 그들은 곰팡이의 포괄적 인 이해를 얻을 수 없습니다 - 복잡한 호스트 상호 작용 각질 세포, 섬유아세포 및 조직 상주 면역 세포와 같은 일정한 통신에 있는 다중 세포 모형을 관련시키는 피부의 환경, 그러나 또한 백혈구 인구는 또한 미생물 만남시에만 조직에 침투합니다 피부. 이 다세포 네트워크는 대부분의 고급 오르가노이드 시스템에서도 시험관 내 모델에서 완전히 재현될 수 없습니다. 따라서, 마우스의 실험적 감염은 여전히 면역학 및 전염병 연구에서 금본위제이며, 여기에 기술된 모델의 가용성은 Malassezia 연구 분야의 돌파구를 나타낸다. 중요한 것은, 이 모형은 달리 교란되지 않은 마우스 귀 피부에 Malassezia의 표상 적용에 의존하고, 조직에 주입해서 균류의 접종을 연루하지 않습니다, 예를 들면, 피하 또는 복강 내, 이전 연구 보고18,둘 다 자연스럽 게 식민지 호스트에 있는 상황에서 더 먼.
이 프로토콜에 설명된 Malassezia 감염의 모델을 다른 사용 가능한 마우스 모델과 결합할 수 있는 가능성은 응용 프로그램의 범위 및 유연성을 크게 증가시킨다. 후자는 아토피 성 피부염의 중요한 특징을 모방하는 장벽 결핍의 모형과 같은 특정 피부 무질서의 각종 모형을, 인간과 개 둘 다에 있는 Malassezia와 관련되었던 질병을 포함합니다. 더욱이, Malassezia를 가진 피부의 종피감염은 관심 있는 호스트 유전자에 있는 유전적 결함을 가진 마우스, 또는 관심의 세포 모형이 유전으로 삭제되거나 약리학적으로 고갈될 수 있는 마우스에 쉽게 적용될 수 있습니다 (예를 들면, 수단에 의하여 디프테리아 독소 수용체 발현 마우스에서 디프테리아 독소 투여). 이러한 모델은 Malassezia를포함하여 연구용 및 병원성 미생물에 대한 숙주 반응을 해부하고, 곰팡이 숙주 상호 작용에서 이러한 유전자 및 세포 유형의 역할을 평가하기 위한 불가피한 도구를 나타낸다. Malassezia-host피부 상호 작용의 분석은 이 프로토콜에 설명된 것 이상으로 확장될 수 있습니다. 이들은 조직학에 의하여 분석 (예를 들면, 균류에 의해 유도된 피부 병리 또는 표피 두껍게 하는 정도를 결정하기 위하여), 세포 모형에 대하여 지시된 항체를 사용하여 조직 단면도의 면역 조직 화학 또는 면역 형광 염색에 의해 포함합니다 특정 마커 또는 관심있는 다른 분자. 또한 감염된 피부 조직으로부터 세포(예를 들어, 조직 상주 또는 조직 침윤 백혈구 서브세트)의 분리를 수반하여 Malassezia에 대한 면역 반응의 편광, 조절 및 역학을 매우 깊이 연구할 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 취리히 대학에 의해 지원되었다, 스위스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
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