Summary
פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של מודל העכבר עבור לימוד האינטראקציות של מלאסזיה-מארחים בעור. היא מתארת את הטיפוח של מלאשזיה במבחנה, את הזיהום של העור המורין עם מלאשזיה, ואת הניתוח העוקב אחר הדלקת והנטל הפטרייתי ברקמת העור.
Abstract
מודלים בעלי חיים חיוניים למחקר מחלות זיהומיות. הם מספקים בסיס חשוב לניתוח הספקטרום המלא של האינטראקציות המתרחשות בין החיידקים והמארחים שלהם בvivo באופן ספציפי לרקמה. פטריות פתוגניים מזוהים יותר ויותר כאיום רציני עבור בני אדם וניצול מודלים אלה זיהום שיפרו מאוד את ההבנה שלנו של פתוגניות פטרייתי. מינים של הסוג מלאכזיה הם הפטריות השופעת ביותר של מיקרוביוטה העור האנושי והם משויכים גם עם התפתחות של הפרעות עור דלקתיות חמורות כגון דרמטיטיס seborrheic ודרמטיטיס אטופית. עם זאת, קשר סיבתי בין מלאציה ופתוגנזה המחלה נשאר לא ידוע, עובדה כי ניתן לייחס את הידע המסכן של הוצלב המורכב של מלאסזיה עם מערכת החיסון לעור. פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של מודל העכבר הניסיוני המאפשר ללמוד את האינטראקציה של מלאסזיה עם העור היונקים בvivo. זה מתאר את השיטה לטיפוח מלאכזיה spp. בתנאי מעבדה, איך להדביק את העור מורלין עם מלאכזיה spp. וכיצד להעריך את תוצאת הזיהום באמצעות דלקת העור וניתוחים פטרייתיים. המודל המתואר כאן עובד בחיות חיסונית מלאה, אינו מסתמך על מדכא החיסונית או אנטיביוטיקה טיפול מקדים של בעלי חיים. הוא גם ניתן להתאמה כמעט כל זנים העכבר מהונדסים גנטית והוא יכול להיות משולב עם דגמים אחרים מחלת העור. תכונות אלה להפוך את המודל הזה זיהום כלי רב עוצמה ללמוד בפירוט את התגובה החיסונית מולדים האדפטיבית של הפונדקאי נגד מלאסזיה בעור vivo.
Introduction
העור מאוכלס על ידי מיקרובים רבים ושונים. החשיפה המתמדת של העור למיקרוביוטה תורמת לעיצוב ולחינוך של המערכת החיסונית של הפונדקאי. פטריות מוכרות יותר ויותר כחלק חיוני של microbiota והם ממלאים תפקיד חשוב הפיזיולוגיה המארחת וחסינות, דומה חיידקים ווירוסים1. מינים של הסוג מלאכזיה הם בהרבה את הפטריות השופעת ביותר הקולוניהעור של החוליות בדם חם והם מפצות על יותר מ 90% של העור האנושי פטרת2,3. שמונה מינים שונים של מלאזיה זוהו עד כה מעור האדם והחיה4.
פתווגיות שונות של העור נחשבים להיווצר, לפחות חלקית, כתוצאה של קומפוזיציה microbiota מאוזנת. דיסביוזיס עלול להוביל לצמיחת יתר של מינים עם פוטנציאל פתוגניים וכתוצאה מכך זיהומים אופורטוניסטים ומחלות5. באופן עקבי, יש הוכחה גוברת כי מלאסזיה, מלבד אורח החיים שלה הקומנדאני, תורמת להתפתחות של הפתווגיות העור השונים, החל קשקשים ו pityriarsis הפרעות דלקתיות יותר כגון כמו seborrheic דרמטיטיס ו אטופיק דרמטיטיס4,6. בעוד שנוצר קשר סיבתי בין מלאסזיה לבין וורסיסיס של פייוזזיס, התפקיד הפתופסולוגי של הפטריה בפתווגיות עור חמורים יותר נותר ברובו לא ידוע.
קביעת התפקיד של מלאסזיה בתוך הומאוסטזיס העור ושיחות מחלות לידע מעמיק יותר על האינטראקציה של הפטריה עם העור ואת מערכת החיסונית עורית. של הערה, מחקר על מלאסזיה הוא, לעומת פתוגנים פטרייתיים אנושיים אחרים (למשל, קנדידה אלביקנס או אספרגייוס דיגאטנוס), עדיין בשלב הטירון. ניתן לייחס זאת לקושי בטיפוח של מאלאזיה בתנאי מעבדה ובהיעדר מודלים ניסיוניים מתאימים לחקר הפטריה במגע עם הפונדקאי בvivo. ניסויים קודמים בתאים בודדים בתרבות הצביעו על מגוון רחב של אינטראקציות ישירות ועקיפות בין מלאציה לבין תאים שונים שאינם חסינים מפני המערכת החיסונית7. עם זאת, אלה בניסויים מחוץ לגופית רק חלקית את המצב של סביבת העור המורכבת בvivo שבו אירועים סלולריים ומולקולריים רבים מתרחשים במקביל בין הפטריה לבין סוגי תאים שונים.
להלן, אנו מתווה את הפרוטוקול עבור מודל ניסיוני של זיהום עור של מלאסזיה בעכברים, אשר הקמנו לאחרונה, כדי ללמוד את האינטראקציה פטריה-מארח ב vivo7. הדבר כולל הליכים עבור (1) הטיפוח המוצלח של מלאשזיה במבחנה, (2) היישום האפיטנאני של מאלעזיה על עור האוזן המורמי, ו (3) הפרטים הטכניים של אופן הניתוח של העור המושרה מלאשזיה דלקת והנטל הפטרייתי של העור הנגוע. חשוב מכך, מודל זה אינו מסתמך על דיכוי חיסוני (למשל, על ידי קורטיקוסטרואידים) או טיפול אנטיביוטי של עכברים לפני זיהום, כפי שהוא התאמן בדגמי עכבר אחרים של זיהום פטרייתי8,9. בתורו, זה מאפשר ללמוד את הספקטרום המלא של התגובה החיסונית מולדים ואדפטיבית נגד מלאסזיה בעור נורמלי. של הערה, עכברים מסוג פראי שמרו תחת מצבים מסוימים ללא הפתוגן (SPF) לא התיישבות באופן טבעי עם מאלאזיה , ולכן, החשיפה שלהם אל הפטריה אינה מהווה מושבת מתמדת, אלא מנוקה מהמארח בתוך כ 1.5 שבועות. עם זאת, המודל מאפשר ללמוד את המנגנונים של מארח נגד פטריות חניכה התגובה ורגולציה אשר, בתורו, הוא בסיס איך הזיכרון החיסוני נוצר. המודל הוא צדדי בכך שהוא יכול בקלות להיות מוחל על מגוון רחב של זנים העכבר מהונדסים גנטית והוא יכול להיות משולב עם מודלים אחרים מחלת העור הקיימים, כגון מודלים של מחסור במכשול, כדי ללמוד את ההשפעה של מלאציה תחת מצבי עור פתולוגיים ודלקתיים7. לכן, המודל המתואר של זיהום העור הניסיוני mal, בעכברים מספק מידה גבוהה של גמישות לחקור את האינטראקציה של הפטריה עם מערכת החיסון לעור בהקשר של הומאוסטזיס ומחלות.
פרוטוקול זה מתאר את זיהום העור הניסיוני של עכברים עם מלאסזיה Spp. בשל הפוטנציאל הפתוגני שלו, מלאסזיה spp מסווגים כפתוגנים BSL2 במדינות מסוימות, כולל שוויץ. אנא בידקו את ההנחיות המקומיות ועקבו אחר התקנות של הרשויות המקומיות. BSL2-אורגניזמים מסווגים צריך להיות מטופלים על ידי צוות מיומן תחת ארון בטיחות BSL2 מוסמך (תואר ראשון). פסולת ביולוגית מזוהמים עם אורגניזמים BSL2-מסווגים, כמו גם, גוויות של עכברים נגועים באורגניזמים כאלה צריך להיות אוטוקלבד לפני סילוק. לניסויים עם עכברים, יש לעשות את כל המאמצים כדי למזער את הסבל ולהבטיח את הסטנדרטים האתיים והאנושיים הגבוהים ביותר על פי עקרונות 3R (להחליף, לחדד, להקטין)10. הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו עם M. pachydermatis (atcc 14522), m. furfur (atcc 14521) ו -m. סימטרי (atcc 42132)7.
Protocol
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה נעשו בהתאם לפקודה על הטיפול באורגניזמים במערכות הכלולות של המשרד הפדרלי לסביבה, שוויץ (www.bafu.admin.ch). ניסויים בעכבר נערכו בהתאמה קפדנית עם ההנחיות של חוק הגנת בעלי חיים שוויצרי ובוצעו תחת הפרוטוקולים שאושרו על ידי הלשכה הוטרינרית של הקנטון ציריך, שוויץ (רישיון מספר 168/2018).
1. טיפוח מאלאזיה בתנאי מעבדה
הערה: יש לאחסן את כל החומרים הריאגנטים והמדיה המשמשים לפרוטוקול זה בטמפרטורת החדר (RT, 20 – 25 ° c) אלא אם כן צוין אחרת, כאשר הטמפרטורה התחתונה יכולה לעכב את הצמיחה פטרייתי.
- מכינים את המדיום הנוזלי של דיקסון (mDixon) לצמיחת מאלאזיה . כדי להכין 500 mL של מדיום נוזלי mDixon, לפזר 18 g לחלץ מאלט, 10 גרם מיובש שור-מרה, 5 מ ל רצף-40, 3 גרם Peptone, 1 מ ל גליצרול ו 1 mL חומצה אולאית ב 500 mL מזוקקים H2o (dH2o). להתאים את המדיום ל-pH 6 עם HCl ו החיטוי. אחסן את המדיום ב-RT.
- הכן mDixon אגר צלחות על ידי הוספת 7.5 g אגר כדי 500 mL mDixon בינונית לפני אוטוקלינג. לאט לצנן את mDixon אגר לאחר אוטוקלינג באמצעות בר היגוי צלחת חימום מגנטי כדי למנוע מיצוק חלקי של המדיום בזמן הקירור.
- לאחר שאגר התקרר עד 50-60 ° c, מוותר על הנוזל לתוך מנות פטרי במכסה של זרם למינארי ומאפשר להם להתייבש ב-RT בלילה.
הערה: לוחות אגר ניתן לאחסן ב 4 ° צ' במשך מספר שבועות כאשר עטוף ושמור הפוך כדי למנוע אידוי. - השיגו את הליאציה והחייה את המניות של מאלאזיה על פי ההוראות שהושגו על ידי המתווכת.
- האיחסן 10 מ ל של מדיום נוזלי mDixon ב סטרילי 100 mL Erlenmeyer בקבוקון עם השעיית מלאסזיה לתחייה על פי ההוראות שהושגו על ידי הספק. מודאת התרבות באינקובטור רועד ב 30 ° צ' ו 180 סל ד.
- לבחון את צמיחת התרבות המלאזיה באופן סדיר על ידי בדיקת המראה של צבע קרם ועכירות. הקינטיקה של הצמיחה תלויה במין ובזן של מלאסזיה , והיא עשויה להיות איטית במיוחד כאשר מלאסזיה טרייה לאחר שקמה מהמלאי. (איור 1א).
- להכין מניות גליצרול על ידי ערבוב 3 חלקים של התרבות מאלאזיה בצפיפות בינונית mdixon עם 1 חלק של סטרילי 99% גליצרול. לתוך צינורות ברגים מעוקריםולחנות ב-80 ° c.
- עבור הפצת החוץ הגופית, צלחת מלאסזיה מן התרבות הנוזלית של mdixon או מתוך מלאי גליצרול קפוא על צלחת mdixon אגר (הביא RT מ 4 ° c) באמצעות לולאת החיסון.
הערה: העברה לוחות mDixon אגר כדי RT מ 4 ° צ' לפני השימוש, מאז קר mDixon אגר מעכב צמיחה פטרייתי. - הפוך את הצלחת אגר (s) עם מלאזיה הפוכה בחממה (לא רועדת) ב 30 ° c. בדקו את התפתחותם של מושבות מאלאזיה באופן סדיר.
הערה: מושבות מלאסזיה על לוחות mdixon אגר מופיעות בתוך 3-5 ימים והם בצבע קרם משעמם, חלק עם העלאה קמורה (איור 1B). - חנות המושבות של מלאסזיה על הצלחות של mdixon אגר בשעה RT במשך ~ 2 שבועות. לאחר מכן, הכינו צלחת חדשה של mDixon אגר על ידי מלטציה מתוך מלאי הגליצרול הקפוא כפי שמתואר ב1.7.
2. הכנת האינוניות להידבקות בעכברים
- האיחסן 10 מ ל של מדיום נוזלי mDixon בקבוקון 100 mL סטרילי Erlenmeyer אייר עם 3-5 בודדים מושבות מלאסזיה מצלחת של mdixon אגר (ראה שלב 1, איור 1B).
- התרבות המלאבית עבור ~ 48 עד 96 h ב 30 ° צ' ו 180 rpm עד התרבות היא בצבע קרם ו נחל דלוח (איור 1א).
הערה: הזמן הדרוש לצמיחת מלאזיה תלוי במינים ובזנים של המלאזיה ובכמות הפטריה המשמשת לחיסון. - העברה 2 מ ל של התרבות mal, לתוך שפופרת סטרילי 2 מ"ל מיקרוצנטריפוגה ו צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 10, 000 x g.
- להיפטר supernatant ולשטוף את הגלולה על ידי השעיית אותו ב 1 מ ל של תמיסת מלח באגירה של פוספט (PBS). צנטריפוגה שוב עבור 1 דקות ב 10, 000 x g.
- לאחר הכביסה, להשעות את הגלולה ב 1 mL של PBS ידי ליטוף נמרץ למדוד את הצפיפות האופטית של הפתרון ב 600 ננומטר (ODA600) באמצעות ספקטרומטר. לדלל את ההשעיה מלזיה 20 – 50 x עם PBS עבור מדידה OD כדי להבטיח כי הקריאה היא בין 0.1 ו 1.
הערה: הצפיפות של תרבות בת 3 ימים של מאלאזיה משתנה בדרך כלל בין 15 ל-30 ODA600, בהתאם למינים המאלכזיה ולמתח ולמספר תאי שמרים המשמשים לחיסון התרבות (שלב 2.1). מלאסזיה נוטה ליצור אגרגטים, לכן, ליטוף נמרץ הכרחי כדי להבטיח הומוגניות של ההשעיה. - מחלק את הנפח של ההשעיה מלאסזיה ב-PBS שמתאים צפיפות של 4 ODA600 לתוך צינור סטרילי 2 מ ל. הכינו צינור 1 לכל בעל חיים להידבק.
- צנטריפוגה את הצינורות המכילים מאלאזיה עבור 1 דקות ב 10, 000 x g.
- להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה mal, ב 200 μl של שמן זית יליד (מתאים 2 ODA600 שמרים תאים/100 μl שמן זית).
הערה: שמן זית נמצא כרכב טוב לזיהום אפיטנאני עם מאלאזיה, כאשר מלאשזיה הוא שמרים תלויי-ליפופילית ושומנים בשומנים. שמן זית נספג טוב יותר על ידי העור מאשר PBS. עם זאת, יש לזכור כי לא קל להשעות את מלאשזיה בשמן זית. שפר את ההאשזיה/שמן זית מושעה על ידי vortexing. לשמור על ההשעיה ב-RT עד שהוא משמש לזיהום. - הכינו צינורות עם שמן זית בלבד לזיהום מבוים של בעלי חיים בשליטה.
3. הדבקת עכברים עם מלאזיה
- הזמנת נקבה C57BL/6 עכברים בגיל של 6-8 שבועות ולאפשר להם לתקן במתקן החיות הניסיוני לפחות שבוע אחד. חשב עבור 3-5 עכברים לכל קבוצה, כולל קבוצת בקרה לא נגוע.
- הכנת קוקטייל סטרילי הרדמה המכיל 1.3 mg/mL Xylazine ו 6.5 mg/mL קטמין ב-PBS. 5 מ ל של קוקטייל ההרדמה מספיק כדי לעבור 20 חיות. התאימו את עוצמת הקוקטייל בהתאם למספר החיות המורדם.
- בעלי חיים על ידי הזרקת 10 μL/g משקל גוף של קוקטייל הרדמה intraperitoneally (מתאים 65 mg קטמין ו -13 מ"ג Xylazine למשקל הגוף) ומניחים את החיות מורדם על משטח חימום ב 37 ° c.
הערה: במינון שצוין, בעלי חיים בדרך כלל נשארים מורדם עבור ~ 30-60 min.
- בעלי חיים על ידי הזרקת 10 μL/g משקל גוף של קוקטייל הרדמה intraperitoneally (מתאים 65 mg קטמין ו -13 מ"ג Xylazine למשקל הגוף) ומניחים את החיות מורדם על משטח חימום ב 37 ° c.
- בדוק את הרפלקסים על ידי צובט את הרגל האחורית עם מלקחיים כדי להבטיח כי בעלי חיים מורדם לחלוטין.
- החלת קרם עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ההרדמה.
- באופן אופציונלי, למדוד את עובי האוזן של שתי האוזניים באמצעות קליבר (0-5 מ"מ טווח). למדוד שני אזורים שונים של כל אוזן ולחשב את עובי האוזן הממוצעת לכל אוזן.
הערה: מדידת עובי האוזן היא אופציונלית ותלויה בשאלת המחקר. עם זאת, אם עובי האוזן משמש כבדיקה עבור דלקת העור, יש צורך למדוד את עובי האוזן הבסיסית לפני זיהום. (ראה שלב 4). - באופן אופציונלי, לשבש את המכשול באפידרמיס של עור האוזן החוזרת על ידי סרט מתון להתפשט: להחיל ידנית פיסת נייר קטנה על העור ולהסיר אותו שוב. חזור על 5 סיבובים רצופים תוך שימוש בנייר דבק טרי לכל סיבוב.
הערה: מלאזיה גורמת לדלקת עור בולטת יותר בעור המכשול בהשוואה לעור בלתי מודאג (איור 2א)7. - למריחה על התינוק להחיל 100 μL (2 ODA600) של האאשזיה/שמן זית הבולם על הצד השני של כל אוזן באמצעות פיפטה סטרילי. כלול קבוצת בקרה של בעלי חיים המטופלת בשמן זית בלבד (קבוצת בקרה המטופלת ברכב).
הערה: מערבולת המאשזיה/שמן זית מושעה במרץ על מנת להבטיח השעיית מלציה הומוגנית מיד לפני הבקשה. - הניחו לבעלי החיים המורדם על משטח החימום להימנע מהיפותרמיה עד שהם מראים סימנים של התאוששות (תנועת הקצפת, קצב נשימה מוגבר וכו ').
- הכנס 200 μL של התמיסה סטרילי ומחומם מראש 2% תת-עורי לתוך קיפול הסוף כדי לתמוך בחילוף החומרים שלהם ולחות מחדש.
הערה: כדי להכין תמיסה סטרילית 2% גלוקוז, לפזר 1 מ"ג גלוקוז ב 50 mL PBS ולסנן אותו באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר. ניתן לאחסן את הפתרון ב -4 ° c. - להעביר את החיות. בחזרה לכלוב שלהם
4. ניתוח מלאזיה-דלקות עור מושרה
הערה: הליך זה מתאראת הניתוח של נפיחות באוזן הנגרמת במהלך זיהום המשמש כפרמטר של דלקת בעור. תנאי מוקדם לניתוח נפיחות האוזן הנגרמת על ידי פטריה היא למדוד את עובי האוזן הבסיסית לפני הקלטת-להתפשט ו/או זיהום (שלב 3.5).
- הכינו את החדר הארוך להרדמה לטווח קצר של מאלאזיה-בעלי חיים נגועים ושליטה.
- העבר חיה אחת בזמן לחדר והמתן עד שהחיה תהיה מורדם לגמרי.
הערה: סימנים של הרדמה נכונה כוללים הרפיה גופנית מלאה, כמו גם איטית וכבדה (האגף) נשימה. לעקוב בזהירות הרדמה כחשיפה מורחבת של isofלאנה יכול להיות קטלני. - מוציאים את החיה מהתא ומניחים אותו על הרקמה.
- למדוד את עובי האוזן (של) באמצעות קליבר (טווח 0-5 מ"מ). למדוד שני אזורים שונים של כל אוזן ולחשב את עובי ממוצע לכל אוזן (ראה שלב 3.5).
- . להעביר את החיה חזרה לכלוב
הערה: הרדמה Isofלוריאן היא קצרת מאוד, ובעלי החיים להתאושש בתוך ~ 30 לאחר ההסרה מהתא isofלאנה. - לחשב את הגידול בעובי האוזן על ידי הפחתת עובי האוזן הממוצעת הבסיסית, נמדד לפני הקלטת להתפשט ו/או זיהום, מן עובי האוזן הממוצעת נמדד בכל נקודה לאחר ההדבקה.
- התווה את הערכים המחושבים כגידול בעובי האוזן או, לחילופין, כמו עובי האוזן הכולל לאורך זמן עבור כל בעל חיים או קבוצת בעלי חיים (איור 2ב').
5. ניתוח העמסה של פטריות בעור הנגוע
- הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 2 מ ל עבור כל אוזן להיות נקצרו, המכיל 0.5 mL של וסטרילי 0.05% NP40 ב dH2O ו כדור פלדה אוטוקלבד (5 מ"מ קוטר).
- שוקלים את הצינורות באמצעות איזון מדויק וכותבים את המשקל המדויק.
- המתת חסד העכברים על ידי שיתוף2 חנק.
- הסר את האוזן (ים) בבסיס והעבר לתוך הצינור המכיל 0.5 mL של מ0.05% NP40 ב dH2O, כפי שמתואר בשלבים 5.1-5.2.
- שוקלים את הצינורית המכילה את רקמת האוזן ומחשבים את המשקל הממשי של כל מדגם על ידי הפחתת משקל הצינורית ללא איבר ממשקל הצינורית עם העוגב.
- הומוגון רקמת האוזן במשך 6 דקות ב -25 הרץ באמצעות מכשיר הומוגניזציה ברקמה. ודא כי הרקמה היא הומוגניים היטב.
- צלחת 100 μL של כל מדגם (המתאים ל 1/5 של כל הומוגון, דילול פקטור = 5) אל mDixon אגר צלחות ומודקת את הצלחות הפוכה בחממה 30 ° c.
הערה: יש לכוונן את כמות הציפוי המגון בהתאם לעומס הפטרייתי הצפוי. הקפד על הלוח מספיק הומואט להשיג לפחות 10 ולא יותר מ 250 מושבות לכל צלחת כדי לאפשר ספירה קלה. באופן אופציונלי, צלחת לוחות מרובים לכל מדגם עם דילול שונה של הומואט. - בדקו את התפתחותם של מושבות מאלאזיה באופן סדיר.
הערה: המושבות בדרך כלל הופכות לגלויות לאחר 2-3 ימים. הזמן הדרוש למושבות מלאציה לצמוח תלוי במין ובזן של מאלאזיה. - . תספור את המושבות לצלחת
- חשב את מספר רקמת ה-CFU/g באמצעות הנוסחה הבאה:
CFU/g רקמה = (מספר של מושבות/צלחת) x (גורם דילול)/(משקל של דגימת העור ב g).
הערה: ניתן להעריך את מגבלת הזיהוי המינימלית המשוערת באמצעות הנוסחה הבאה: מגבלת זיהוי מינימלית = (מושבה אחת/צלחת) x (משקל ממוצע של כל דגימות העור ב-g). - עומסים פטרייתיים מותווים בדרך כלל בקנה מידה לוגריתמי (איור 2ג).
Representative Results
טיפוח- גופית של מלאזיה
לעומת פתוגנים אחרים בשימוש נפוץ מודל פטרייתי כגון C. אלביקנס או. חיטוי, מאלאזיה קשה יותר לתרבות בתוך מבחנה. ניתן לייחס זאת לעובדה כי מלאסזיה נשענת על מקורות שומנים אקגניים לדרישות התזונתית שלה, בשל חוסר יכולתה לסנתז חומצות שומן11. מדיום mDixon מתאים באופן מיני מינים מלאסזיה , כולל m. paכידרמאטיס, מ. furfur, m. סימפאלאז, מ. סלואואה, מ. globosa ומסיה יאמאטואנסיס במבחנה7 ,12. איור 1 מראה תמונות מייצגות לגידול של M. בינונית הנוזלית של mdixon ועל mdixon אגר כמתואר בשלב 1 וצעד 2.
ניתוח דלקות עור ופטריות בעור מלאכזיה
חשיפה של מאלאזיה לעור האוזן של העכבר כי היה המכשול שיבשו על ידי קלטת, להתפשט לפני תוצאות הזיהום בדלקות המוני של העור, המאופיינת היפרפלזיה באפידרמיס ובעורי התפתחות של בצקת7. שלב 4 ו-5 מתווה את השיטות לניתוח נפיחותבאוזן הנגרמת והנטל הפטרייתי של העור. שני הפרמטרים מייצגים את הקריאות המרכזיות לניטור מהלך ההדבקה. איור 2A ממחישה את העלייה בעובי האוזן שניתן לצפות לאחר M. furfur חשיפה לעור כי היה מכשול ההפרדה לעומת העור בלתי מודאג של WT C57BL/6 עכברים. איור 2ב מראה גרף סיכום מייצג של הגידול בעובי האוזן לאורך זמן. איור 2ג מציג את הנטל הפטרייתי בעור האוזן ביום 2 לאחר ההדבקה עם M. paכידרמאטיס.
איור 1: טיפוח-תרגול של מלאזיה.
(א) מאמץ המתח atcc 42132 גדל במשך 3 ימים ב 30 ° צ' ו 180 סל"ד בינונית mdixon נוזלי (משמאל) ליד שליטה erlenmeyer בקבוקון המכיל mdixon מדיום שלא היה מחוסן (מימין). (ב) המושבות של M. הנבג המתח Atcc 42132 על mdixon אגר לאחר 5 ימים של דגירה ב 30 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח זיהום העור על בסיס עובי האוזן ומעמסה פטרייתיים.
(א) היסטולוגיה של קטעי האוזן שהתקבלו מ C57BL/6 עכברים שטופלו עם שמן זית (הרכב, שמאל) או נגוע M. FURFUR זן JPLK23 עבור 5 ימים (באמצע ובזכות). מימין, עור האוזן התפשט לפני ההדבקה. הסעיפים היו מוכתמים במטאוקסילין ובאאוזין (H & E). (ב) תרשימי סיכום המראים את הגידול בעובי האוזן לאורך זמן עבור C57BL/6 עכברים שנחשפו למאלאזיה או שמאל לא נגוע כפקדים. העובי המוחלט של מ. פכידרטיס למתח atcc 14522-חשוף או עור האוזן המטופלת בכל נקודת זמן מוצג בצד שמאל; הגידול בעובי האוזן בנקודות הזמן המסומנות ביחס לתוכנית הבסיסית ביום 0 מוצג בצד ימין. (ג) לנטל פטרייתי בעור של C57BL/6 עכברים שנדבקו M. paכידרמאטיס המתח atcc 14522 או מטופלים עם שמן זית כפקד (כלי רכב). בשני המקרים, העור התפשט. כל סמל בתרשימי הסיכום B ו- C מייצג בעל חיים אחד. המשמעות הסטטיסטית של ההבדלים בין קבוצות חושבה באמצעות ANOVA בכיוון אחד (B) או במבחן t של סטודנט (C). p < 0.001, * * * * p < 0.0001, די. אל: מגבלת זיהוי נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הזיהום של העור של זן בשימוש נפוץ של העכבר C57BL/6 על ידי מלאסזיה spp. התאמת פרוטוקול זה לזנים אחרים של העכבר עם רקע גנטי שונה (למשל, balb/c) או שונה בעכבר גנטית זנים עשויים להזדקק לכוונון של מינון הזיהום, נקודת הזמן (s) של ניתוח, וכו '. כדי להבטיח הזדקנות, קבוצות של עכברים תמיד צריך להיות באותו גיל ומין. מקור העכברים צריך להישמר יציב, כמו שינויים קלים אפילו ברקע גנטי הבדלים microbiota, אשר קיימים בין הספקים יכול להתקיים גם בין יחידות שונות של מתקן רבייה אחת, יכול להיות השפעה בלתי צפויה על מובן של זיהום. כאשר מקימים את מודל ההדבקה של מלאסזיה המתואר בפרוטוקול זה, מומלץ לבצע מחקר פיילוט כדי לפקח בזהירות על מהלך הזיהום, כולל היקף הקולוניזציה, הקינטיקה של הסיווג הפטרייתי ומידת ה דלקת ופתולוגיה שעלולים להיגרם (למשל, אם עור האוזן משתבש לפני ההידבקות) כדי לקבוע את תנאי היכולת האופטימליים.
על מנת להבטיח הבדלים ולזהות באופן אמין את ההבדלים בין קבוצות נסיוניות, מספר בעלי החיים המשמשים לקבוצה חייב להיות מחושב בהתבסס על הניתוח הסטטיסטי. גודל המדגם מחושב על בסיס גודל האפקט, שיעור השגיאה והעוצמה, הרואים וריאציות ביולוגיות ונסיוניות (לדוגמה, עקב השתנות במערכת החיסונית). מסיבות אתיות להימנע משימוש במספר גבוה שלא לצורך של בעלי חיים. ביחס לדלקת העור, בטיפול באוזן אחת בלבד עם הפטריה ושימוש באוזן השנייה כפקד באותו עכבר, לא מומלץ כי עכברים עלולים להפיץ את הפטריה לשתי האוזניים בעת הטיפוח. עם זאת, שימוש 1/2 האוזן עבור מתודולוגיים שונים לקרוא כגון קביעת נטל פטרייתי, בידוד של תאים חיסוניים או ניתוח היסטולוגית הוא לעתים קרובות מספיק ותוצאות הפחתה משמעותית מספרי בעלי חיים המשמשים ניסויים.
18 מינים שונים של מלאזיה תוארו עד כה. וריאציות בין-מינים בתוך הסוג מלאכזיה יכול להשפיע על האינטראקציה עם המארח, כפי שלמדנו גם ממחקרים על פטריות הפתוגניים האדם האחר13. מינים שונים של מלאסזיה וזנים שונים במקורם שלהם (למשל, m. paכידרמאטיס הוא המינים התכופים ביותר מבודדים מבעלי חיים, בעוד m. restricta, m. globosa ו -הסימפדקיים הם ה חברים בולטים של מיקרובידום עור פטרייתי בבני אדם עם התפלגות משתנה של מינים אלה בין אזורי העור השונים). מינים מסוימים משויכים להטיות, בעוד שאחרים נחשבים ליותר פתוגניים, למרות שראיות מפורטות נשארות חלשות יחסית. חשוב מכך, מינים וזנים מסוימים קשה יותר לצמוח מאחרים. לפיכך, ההחלטה של איזה מינים/מאמץ להשתמש עבור הזיהום חייב להיות מבוסס על שאלת המחקר.
זיהום ניסיוני של העור murine עם אורגניזמים מסוימים כגון קנדידה אלביקנס או האורהולוקוקוס מחייב את השיבוש של המכשול באפידרמיס לפני זיהום, למשל, עם נייר חול14, 15,16. לעומת זאת, המודל של זיהום מלאסזיה המתואר כאן הוא יעיל באותה מידה עם ובלי שיבוש מכשול7. מידת הדלקת הנגרמת על ידי הפטריה היא מוגברת בנפט אם העור הוא הקלטת לפני זיהום7. לפיכך, האם יש לתמרן את העור לפני שיישום מלאזיה תלוי בשאלת המחקר. מודלים שונים של דלקת בעור כרונית וחריפה (למשל, מודלים לסוג מושהה רגישות יתר (DTH) וליצור קשר עם רגישות יתר (CHS) ומודלים של חוסר מכשול קיים שעשוי להיות עניין לחקור את תרומת השמרים שמרים הפתווגיות עור.
עכברים מטופחים המתוחזקים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן (SPF) הם (לידיעת הידע שלנו) לא באופן טבעי הכובש עם מלאזיה. לכן, היישום הניסיוני של מלאסזיה לעור האוזן של העכבר מייצג חשיפה ראשונית לפטריה הגורמת תגובה חריפה במארח, אשר בתורו מוביל לסיווג פטרייתי בתוך 1-2 שבועות7. בעוד המודל המתואר בפרוטוקול זה, לפיכך, משקף רק באופן חלקי את המצב בבני אדם הקשורים חיסוני או אורגניזמים מארחים אחרים, כי הם לצמיתות הכובש עם מלאזיה, הזיהום הניסיוני מאפשר חלון מספיק של הזדמנות ללמוד חסינות נגד פטריות ומנגנונים סלולאריים ומולקולריים אשר מתחת לתגובה זו. כמו-כן, היא מאפשרת חקירת וריאציות בתגובה למינים שונים של מלגזיה ולזנים בתנאים ניסיוניים שונים (למשל, עם ובלי הפרעה בעור).
המחקר של מלאסזיה -אינטראקציות מארחים הוגבלה בעבר לניסויים מחוץ למבחנה עם סוגי תאים בודדים בתרבויות (g., קווי התאים keratinocyte, PBMCs). למרות שמחקרים אלה הדליקו קצת אור על הגורמים הפטרייתיים והמארחים שמעצבים את הגומלין בין מלאזיה לבין הפונדקאי17, הם אינם מאפשרים להשיג הבנה מקיפה של האינטראקציה בין הפטרייה במתחם. סביבה של העור, אשר מערבת סוגי תאים מרובים הנמצאים בתקשורת מתמדת, כגון keratinocytes, פיברותקיעות ותאי החיסון שוכני-רקמות, אלא גם אוכלוסיות לוקיוניות המחלשות את הרקמה רק על מפגש מיקרוביאלית של עור. רשת רב-תאיים זו אינה יכולה להיות משוחזר לחלוטין במודלים של מבחנה, אפילו עם מערכות מתקדמות של אורגנואיד. לפיכך, הזיהום הניסיוני של עכברים עדיין מייצג את תקן הזהב באימונולוגיה ומחקר מחלות זיהומיות, והזמינות של המודל המתואר כאן מייצגת פריצת דרך בתחום מחקר מאלאזיה . והכי חשוב, מודל זה מסתמך על היישום האפיטאלי של מלאסזיה על עור האוזן הבלתי מודאג, והוא אינו מסבך את הפטריה על ידי הזרקה לתוך הרקמה, למשל, תת-עורי או intraperitoneally, כמו מחקרים קודמים דיווחו על18, שניהם רחוקים יותר מן המצב באופן טבעי מארחים הכובש.
האפשרות לשלב את הדגם של זיהום מאלאזיה המתואר בפרוטוקול זה עם דגמי עכבר זמינים אחרים מגדיל מאוד את היקף וגמישות של היישום. האחרון כוללים מודלים שונים של הפרעות עור ספציפיות, כגון המודל של חוסר מכשול המחקה תכונות חשובות של דרמטיטיס אטופיק, מחלה הקשורה מלאסזיה בשני בני אדם וכלבים. כמו-כן, ניתן למרוח בקלות את הזיהום האפיאואלי של העור עם מלאסזיה על עכברים בעלי פגמים גנטיים בגנים מארחים של עניין, או עכברים שבהם סוג תא של עניין נמחק גנטית או שניתן לרוקן באופן מבחינה תרופתי (למשל, באמצעות של מינהל הרעלים של דיפתריה ב קולטן של דיפתריה-עכברים מבטאים). דגמים כאלה מייצגים כלי בלתי נמנע לבתר את התגובה המארחת לתוך המיטובים וחיידקים פתוגניים, כולל מלאזיה, ולהעריך את התפקיד של גנים אלה סוג תא באינטראקציה מארח פטריה. ניתן להרחיב את הניתוחים של האינטראקציה עם מלאציה-העור המארחת הרבה מעבר למה שמתואר בפרוטוקול זה. אלה כוללים ניתוחים של היסטולוגיה (למשל, כדי לקבוע את מידת הפתולוגיה של העור או את העיבוי באפידרמיס הנגרמת על ידי הפטריה), על ידי אימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים מפרקים רקמות באמצעות נוגדנים מכוונים נגד סוג תא סמנים ספציפיים או מולקולות אחרות של עניין. זה יכול להיות גם כרוך בידוד של תאים (למשל, תושב רקמות או החדירה רקמה לבין תת-ערכות) מרקמת העור הנגועים לחקור את הקיטוב, רגולציה, ודינמיקה של התגובה החיסונית למאלאציה בעומק רב.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת ציריך, שווייץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
