Summary
Detta protokoll beskriver inrättandet av en musmodell för att studera Malassezia-värd interaktioner i huden. Det beskriver odling av Malassezia in vitro, infektionen av den murina huden med Malassezia, och den efterföljande analysen av inflammationen och svamp bördan i huden vävnad.
Abstract
Djurmodeller är avgörande för forskning om infektionssjukdomar. De utgör en viktig grund för att analysera hela spektrumet av interaktioner som uppstår mellan mikrober och deras värd in vivo på ett vävnads-specifikt sätt. Patogena svampar erkänns alltmer som ett allvarligt hot för människor och utnyttja sådana infektions modeller har avsevärt förbättrat vår förståelse av svamp patogenicitet. Arter av släktet Malassezia är de vanligast förekommande svampar av den mänskliga huden bakterieflora och de är också förknippade med utvecklingen av svåra inflammatoriska hudsjukdomar såsom seborroiskt eksem och atopisk dermatit. Emellertid, en orsakande länk mellan Malassezia och sjukdomens patogenes förblir okänd, ett faktum som kan hänföras till den dåliga kunskapen om den komplexa överhörning av Malassezia med hudens immunförsvar. Detta protokoll beskriver inrättandet av en experimentell musmodell som gör det möjligt att studera samspelet mellan Malassezia och däggdjurs huden in vivo. Den beskriver metoden för odling av Malassezia spp. under laboratorieförhållanden, hur man infekterar murina huden med Malassezia spp. och hur man bedömer resultatet av infektion med hjälp av hudinflammation och svamp bördan analyser. Den modell som beskrivs här fungerar i fullt immunkompetenta djur och inte förlita sig på immunsuppressiv eller antibiotika förbehandling av djuren. Det är dessutom anpassningsbar till praktiskt taget alla genetiskt modifierade mus stammar och kan kombineras med andra hud sjukdomsmodeller. Dessa funktioner gör denna infektion modell ett mycket kraftfullt verktyg för att studera i detalj den medfödda och adaptiva immunsvar av värden mot Malassezia i huden in vivo.
Introduction
Huden fylls av många olika mikrober. Den ständiga exponeringen av huden till bakterieflora bidrar till att forma och utbilda värdens immunförsvar. Svampar erkänns alltmer som en viktig del av bakterieflora och de uppfyller en viktig roll för värdfysiologi och immunitet, liknande bakterier och virus1. Arter av släktet Malassezia är den överlägset vanligast förekommande svampar kolonisera huden på varmblodiga ryggradsdjur och de utgör mer än 90% av den mänskliga huden mycobiome2,3. Arton olika arter av Malassezia har hittills identifierats från människa och djur hud4.
Olika patologier av huden tros uppstå, åtminstone delvis, som ett resultat av en dysbalanced bakterieflora sammansättning. Dysbiosis kan leda till överväxt av arter med patogena potential som resulterar i opportunistiska infektioner och sjukdom5. Konsekvent, det finns ett ökande bevis för att Malassezia, förutom dess kommensaler livsstil, bidrar till utvecklingen av olika hud patologier, allt från mjäll och pityriarsis versicolor till mer allvarliga inflammatoriska sjukdomar såsom som seborroiskt eksem och atopisk dermatit4,6. Medan en orsakande länk mellan Malassezia och pityriarsis versicolor har fastställts, den patofysiologiska roll svampen i mer allvarliga hud patologier fortfarande i stort sett okänd.
Bestämma rollen av Malassezia i huden homeostas och sjukdom kräver mer djupgående kunskap om samspelet mellan svampen med huden och det kutana immunförsvaret. Notera, forskning om Malassezia är, jämfört med andra mänskliga svamp patogener (t. ex., Candida albicans eller Aspergillus fumigatus), fortfarande i spirande skede. Detta kan hänföras till svårigheten i odling av Malassezia under laboratorieförhållanden och avsaknaden av lämpliga experimentella modeller för att studera svampen i kontakt med värden in vivo. Tidigare experiment med isolerade celler i kulturen indikerade ett brett spektrum av direkta och indirekta interaktioner mellan Malassezia och olika immun-och icke-immunceller7. Emellertid, dessa in vitro-experiment endast delvis recapitulate situationen för den komplexa hud miljön in vivo där många cellulära och molekylära händelser uppträder samtidigt mellan svampen och olika celltyper.
Häri, vi skissera protokollet för en experimentell modell av Malassezia hudinfektion hos möss, som vi nyligen etablerat, att studera svamp-värd interaktion in vivo7. Detta inbegriper förfaranden för (1) en lyckad odling av Malassezia in vitro, (2) epikutan applicering av Malassezia på den murina örat huden, och (3) de tekniska detaljerna för hur man analyserar Malassezia-inducerad hud inflammation och svamp bördan av infekterad hud. Viktigt är att denna modell inte förlitar sig på immunsuppression (t. ex. genom kortikosteroider) eller antibiotikabehandling av möss före infektion, eftersom det praktiseras i andra musmodeller av svampinfektion8,9. I sin tur, det gör det möjligt att studera hela spektrumet av den medfödda och adaptiva immunsvar mot Malassezia i normal hud. Notera, inavlade vild typ möss hålls under specifika patogen-fria (SPF) villkor är inte naturligt koloniseras med Malassezia och därför är deras exponering för svampen inte resultera i ihållande kolonisering men rensas från värden inom cirka 1,5 veckor. Emellertid, modellen gör det möjligt för att studera mekanismerna för svampdödande värd svar initiering och reglering som, i sin tur, är grunden för hur immun minne genereras. Modellen är mångsidig på så sätt att den lätt kan appliceras på en mängd genetiskt modifierade mus stammar och den kan kombineras med andra befintliga modeller av hudsjukdomar, såsom modeller av barriär brist, för att studera effekten av Malassezia under patologiska och inflammatoriska hudåkommor7. Därför, den beskrivna modellen av experimentell Malassezia hudinfektion hos möss ger en hög grad av flexibilitet för att undersöka samspelet mellan svampen med hudens immunförsvar i samband med homeostas och sjukdom.
Detta protokoll beskriver den experimentella hud infektionen hos möss med Malassezia spp. på grund av dess patogena potential klassificeras Malassezia spp. som BSL2 patogener i vissa länder, däribland Schweiz. Vänligen kontrollera de lokala riktlinjerna och följ de lokala myndigheternas föreskrifter. BSL2-klassificerade organismer bör hanteras av utbildad personal under ett BSL2-certifierat biosäkerhetsskåp (BSC). Biologiskt avfall som kontaminerats med BSL2-klassificerade organismer, samt slaktkroppar från möss som infekterats med sådana organismer, bör autoklaveras före bortskaffandet. För experiment med möss, alla ansträngningar bör göras för att minimera lidande och säkerställa högsta etiska och humana normer enligt 3R principer (Ersätt, förfina, minska)10. De experiment som beskrivs i detta protokoll utfördes med m. pachydermatis (atcc 14522), m. furfur (ATCC 14521) och m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll genomfördes i enlighet med förordningen om hantering av organismer i inneslutna system av det federala kontoret för miljön, Schweiz (www.bafu.admin.ch). Musen experiment genomfördes i strikt enlighet med riktlinjerna i den schweiziska djurskydd lag och utfördes under de protokoll som godkänts av veterinärkontoret i kantonen Zürich, Schweiz (licensnummer 168/2018).
1. odling av Malassezia under laboratorieförhållanden
Obs: Förvara alla reagenser och medier som används för detta protokoll i rumstemperatur (RT, 20 – 25 ° c) om inte annat anges, eftersom den lägre temperaturen kan hämma svamp tillväxten.
- Förbered den flytande modifierade Dixon (mDixon) medium för Malassezia tillväxt. För att förbereda 500 mL av flytande mDixon medium, lös 18 g malt extrakt, 10 g Desiccated OX-galla, 5 mL Tween-40, 3 g Peptone, 1 mL glycerol och 1 mL oljesyra i 500 mL destillerat H2o (DH2o). Justera mediet till pH 6 med HCl och autoklav. Förvara mediet på RT.
- Förbered mDixon agar plattor genom att tillsätta 7,5 g agar till 500 mL mDixon medium före autoklavering. Sakta svalna mDixon agar efter autoklavering med hjälp av en styr stång och en magnetisk värmeplatta för att undvika partiell stelning av mediet medan kylning ner.
- När agar har svalnat ner till 50-60 ° c, fördela vätskan i petriskålar i en laminär Flow Hood och låt dem torka på RT över natten.
Obs: agarplattorna kan förvaras vid 4 ° c i flera veckor när de förpackas och hålls upp och ner för att undvika avdunstning. - Få Malassezia isolat och återuppliva frystorkade lager av Malassezia enligt de instruktioner som erhållits av leverantören.
- Inokulera 10 mL flytande mDixon-medium i en steril 100 mL-Erlenmeyerkolv med den återupplivade Malassezia -suspensionen enligt de instruktioner som erhålls av leverantören. Inkubera kulturen i en skakande inkubator vid 30 ° c och 180 RPM.
- Inspektera tillväxten av Malassezia kulturen regelbundet genom att kontrollera utseendet på grädde färg och grumlighet. Tillväxtkinetik beror på arten och stammen av Malassezia och kan vara särskilt långsam när Malassezia är nyligen återupplivas från en frystorkat lager. (Figur 1a).
- Förbered glycerol lager genom att blanda 3 delar av den tätt odlade Malassezia kulturen i mDixon medium med 1 del av steril 99% glycerol. Alikvot av Malassezia/glycerolblandningen i sterila skruvkork rör och förvara vid-80 ° c.
- För in vitro-förökning, tallrik Malassezia från den flytande kulturen i mdixon eller från den frusna glycerolbeståndet på en mdixon-agarplatta (som kommer till RT från 4 ° c) med en inympningslinga.
Obs: överför mDixon-agar-plattor till RT från 4 ° c innan användning, eftersom kalla mDixon-agar hämmar svamp tillväxt. - Inkubera agarplattan (-erna) med Malassezia upp och ner i en (icke skakande) inkubator vid 30 ° c. Inspektera tillväxten av Malassezia kolonier regelbundet.
Obs: Malassezia kolonier på mDixon agar plattor visas inom 3-5 dagar och är krämfärgade tråkig, slät med konvex höjd (figur 1B). - Lagra Malassezia -kolonier på mDixon-agar-plattor vid RT för ~ 2 veckor. Bered därefter en ny mdixon-agar-platta genom att strimmor Malassezia från det frysta glycerolbeståndet enligt beskrivningen i 1,7.
2. beredning av inokulum för experimentell Malassezia infektion av möss
- Inokulera 10 mL flytande mDixon-medium i en steril 100 mL-Erlenmeyerkolv med 3-5 individuella Malassezia -kolonier från en mdixon-agar-platta (se steg 1, figur 1B).
- Inkubera Malassezia kulturen för ~ 48 till 96 h vid 30 ° c och 180 rpm tills kulturen är krämfärgad och grumlig (figur 1A).
Obs: den tid som krävs för Malassezia tillväxt beror på Malassezia arter och stam och mängden svamp som används för ympning. - Överför 2 mL av Malassezia -kulturen till ett sterilt 2 ml microcentrifugerör och Centrifugera i 1 min vid 10 000 x g.
- Kassera supernatanten och tvätta pelleten genom att suspendera den i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera igen i 1 min vid 10 000 x g.
- Efter tvättning, suspendera pelleten i 1 mL PBS genom kraftig pipettering och mät den optiska densiteten hos lösningen vid 600 Nm (ODA600) med hjälp av en spektrometer. Späd Malassezia suspensionen 20 – 50 x med PBS för OD-mätningen för att säkerställa att avläsningen är mellan 0,1 och 1.
Notera: tätheten av en 3-dagars kultur av Malassezia varierar vanligtvis mellan 15 och 30 ODA600, beroende på Malassezia arter och stam och på antalet jästceller som används för inympning av kulturen (steg 2,1). Malassezia tenderar att bilda aggregat, därför är kraftig pipettering nödvändigt för att säkerställa homogenitet av suspensionen. - Alikvot en volym av Malassezia suspensionen i PBS som motsvarar en densitet av 4 ODA600 i en steril 2 ml rör. Förbered 1 tub per djur som ska smittas.
- Centrifugera rören som innehåller Malassezia i 1 min vid 10 000 x g.
- Kassera supernatanten och suspendera Malassezia -pelleten i 200 μl av ursprunglig olivolja (motsvarande 2 ODA600 jästceller/100 μl olivolja).
Obs: olivolja befanns vara ett bra fordon för epikutana infektion med Malassezia, som Malassezia är en lipofila och lipid-beroende jäst. Olivolja absorberas bättre av huden än PBS. Men var medveten om att det inte är lätt att upphäva Malassezia i olivolja. Förbättra Malassezia/olivolja suspension genom vortexing. Håll suspensionen vid RT tills den används för infektion. - Förbered rör med olivolja ensamt för mock infektion av kontrolldjur.
3. infektera möss med Malassezia
- Beställ kvinnliga C57BL/6 möss vid en ålder av 6-8 veckor och låt dem acklimatisera sig i försöksdjurs anläggningen i minst en vecka. Beräkna för 3-5 möss per grupp, inklusive en icke-infekterad kontrollgrupp.
- Förbered steril bedövningsmedel cocktail innehållande 1,3 mg/mL xylazin och 6,5 mg/mL ketamin i PBS. 5 mL av bedövningsmedlet cocktail är tillräckligt för att bedra 20 djur. Justera volymen av cocktail enligt antalet djur som skall sövda.
- Anesthetize djur genom att injicera 10 μL/g kroppsvikt av narkos cocktail intraperitonealt (motsvarande 65 mg ketamin och 13 mg xylazin per kg kroppsvikt) och placera de sövda djuren på en värmedyna vid 37 ° c.
Anmärkning: vid den angivna dosen förblir djuren vanligtvis sövda för ~ 30-60 min.
- Anesthetize djur genom att injicera 10 μL/g kroppsvikt av narkos cocktail intraperitonealt (motsvarande 65 mg ketamin och 13 mg xylazin per kg kroppsvikt) och placera de sövda djuren på en värmedyna vid 37 ° c.
- Kontrollera reflexer genom att nypa den bakre foten med pincett för att säkerställa att djuren är helt sövda.
- Applicera en ögonkräm på ögonen för att förhindra uttorkning under anestesi.
- Alternativt kan du mäta öron tjockleken på båda öronen med hjälp av en bromper (0-5 mm intervall). Mät två olika områden av varje öra och beräkna den genomsnittliga örat tjocklek per öra.
Anmärkning: att mäta öron tjockleken är frivillig och beror på forskningsfrågan. Men om örat tjocklek används som en avläsning för hudinflammation, är det nödvändigt att mäta baslinjen örat tjocklek före infektion. (se steg 4). - Alternativt, störa den epidermala barriären av dorsala örat huden genom mild tejp strippning: manuellt Applicera en liten bit tejp på huden och ta bort den igen. Upprepa för 5 på varandra följande rundor med en ny bit tejp för varje omgång.
Anmärkning: Malassezia inducerar en mer uttalad hudinflammation i barriär-störd hud jämfört med oberörd hud (figur 2a)7. - Applicera med hjälp av en steril pipett lokalt 100 μL (2 ODA600) av Malassezia/olivoljesus pensionen på ryggsidan av varje öra. Omfatta en kontrollgrupp av djur som endast behandlas med olivolja (vehikel-behandlad kontrollgrupp).
Anmärkning: Vortex Malassezia/olivoljesus pensionen kraftigt för att säkerställa en homogen Malassezia -suspension omedelbart före appliceringen. - Lämna de sövda djuren på värmeplattan för att undvika hypotermi tills de visar tecken på återhämtning (morrhår rörelse, ökad andningsfrekvens, etc.).
- Injicera 200 μl steril och förvärmda 2% glukoslösning subkutant i den nack luckan för att stödja deras metabolism och rehydrering.
Anmärkning: för att bereda en steril 2% glukoslösning, lös 1 mg glukos i 50 mL PBS och filtrera den med ett 0,2 μm filter. Lösningen kan förvaras vid 4 ° c. - Överför djuren tillbaka till sin bur.
4. analys av Malassezia-inducerad hudinflammation
Anmärkning: denna procedur beskriver analysen av Malassezia-inducerad öron svullnad under infektion som fungerar som en parameter av hudinflammation. En förutsättning för att analysera svampinducerad öron svullnad är att mäta utgångsläget örat tjocklek före band-strippning och/eller infektion (steg 3,5).
- Förbered isofluran kammare för kortsiktig anestesi av Malassezia-infekterade och kontrolldjur.
- Överför ett djur i taget till kammaren och vänta tills djuret är helt sövda.
Obs: tecken på ordentlig anestesi inkluderar fullständig kropps avslappning samt långsam och tung (flank) andning. Noggrant övervaka anestesi som utökad exponering för isofluran kan vara dödlig. - Ta bort djuret från kammaren och placera det på en vävnad.
- Mät tjockleken på örat (s) med en bromper (intervall 0-5 mm). Mät två olika områden av varje öra och beräkna den genomsnittliga tjockleken per öra (se steg 3,5).
- Överför djuret tillbaka till buren.
Obs: isofluran anestesi är mycket kortlivade, och djuren återhämta sig inom ~ 30 s efter avlägsnande från isofluran kammaren. - Beräkna ökningen av örat tjocklek genom att subtrahera den genomsnittliga baslinjen örat tjocklek, mätt före tejpen strippning och/eller infektion, från den genomsnittliga örat tjocklek mätt vid varje tidpunkt efter infektion.
- Rita de beräknade värdena som ökningen av öron tjockleken eller, alternativt, som den totala öron tjockleken över tiden för varje djur eller grupp av djur (figur 2B).
5. analys av svamp börda i den infekterade huden
- Bered ett sterilt 2 mL microcentrifugerör för varje öra som ska skördas, innehållande 0,5 mL sterilt 0,05% NP40 i dH2O och en autoklaverad stålkula (5 mm diameter).
- Väg rören med en precisions balans och anteckna den exakta vikten.
- Euthanize möss genom CO2 kvävning.
- Ta bort örat (s) vid basen och överför till röret som innehåller 0,5 mL steril 0,05% NP40 i dH2O, enligt beskrivningen i steg 5,1-5,2.
- Väg röret som innehåller öron vävnaden och beräkna den faktiska vikten av varje prov genom att subtrahera vikten av röret utan att organet från vikten av röret med orgeln.
- Homogenisera öron vävnaden i 6 min vid 25 Hz med hjälp av en vävnad Homogenisatorer. Se till att vävnaden är väl homogeniserad.
- Platta 100 μL av varje prov (motsvarande 1/5 av varje homogeniat, utspädningsfaktor = 5) på mDixon-agar-plattor och inkubera plattorna upp och ner i en inkubator på 30 ° c.
Obs: mängden homogena pläterade bör justeras enligt den svamp belastning som förväntas. Se till att plattan tillräckligt homogena att få minst 10 och inte mer än 250 kolonier per tallrik för att möjliggöra enkel uppräkning. Alternativt, platta flera plattor per prov med olika utspädningar av homogena. - Inspektera tillväxten av Malassezia kolonier regelbundet.
Notera: kolonier blir vanligtvis synliga efter 2-3 dagar. Den tid som krävs för Malassezia kolonier att växa beror på arten och stammen av Malassezia. - Räkna kolonier per tallrik.
- Beräkna antalet CFU/g vävnad med hjälp av följande formel:
CFU/g vävnad = (antal kolonier/plattor) x (utspädningsfaktor)/(vikt på hud provet i g).
Den ungefärliga gränsen för minimal identifiering kan bedömas med hjälp av följande formel: minimal detektionsgräns = (1 koloni/platta) x (utspädningsfaktor)/(Genomsnittlig vikt för alla hudprover i g). - Svamp laster är vanligtvis plottas på en logaritmisk skala (figur 2C).
Representative Results
In vitro odling av Malassezia
Jämfört med andra oftare använda svamp modell patogener såsom C. albicans eller A. fumigatus, Malassezia är svårare att kulturen in vitro-. Detta kan tillskrivas det faktum att Malassezia förlitar sig på exogena lipidkällor för dess Nutritive krav, på grund av dess oförmåga att syntetisera fettsyror11. Den mdixon medium är lämplig för odling av flera Malassezia arter inklusive m. pachydermatis, m. furfur, m. sympodialis, m. slooffiae, m. Auktor och m. yamatoensis in vitro7 ,12. Figur 1 visar representativa bilder för tillväxten av M. sympodialis i flytande mdixon medium och på mdixon agar som beskrivs i steg 1 och steg 2.
Analys av hudinflammation och svamp börda av Malassezia hudinflammation
Exponering av Malassezia till musen örat huden som var barriär störs av band-strippning före infektion resulterar i förvärrade inflammation i huden, som kännetecknas av epidermal och dermal hyperplasi och utveckling av ödem7. Steg 4 och 5 beskriva metoderna för att analysera Malassezia-inducerad öronsvullnad och svamp bördan i huden. Båda parametrarna representerar nyckel avläsning för övervakning av infektionsförloppet. Figur 2A illustrerar ökningen av öron tjockleken som kan observeras efter M. furfur exponering för hud som var barriär-störd jämfört med ostörda hud av WT C57BL/6 möss. Figur 2B visar en representativ sammanfattande Graf över ökningen av öron tjockleken över tid. Figur 2C visar svampen börda i örat huden på dag 2 efter infektion med M. pachydermatis.
Figur 1: in vitro-odling av Malassezia.
(A) M. sympodialis stam ATCC 42132 odlas i 3 dagar vid 30 ° c och 180 rpm i flytande mdixon medium (vänster) bredvid en kontroll Erlenmeyer kolv som innehåller mdixon medium som inte inokulerades (höger). Bkolonier av M. sympodialis stam ATCC 42132 på mdixon agar efter 5 dagars inkubering vid 30 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av Malassezia hudinfektion på grundval av örat tjocklek och svamp börda.
(A) histologi av öron sektioner som erhållits från C57BL/6 möss som behandlades med olivolja (fordon, vänster) eller infekterade med M. FURFUR stam JPLK23 i 5 dagar (mitten och höger). Till höger, var örat huden tejp-strippad före infektion. Avsnitten färgas med hematoxylin och eosin (H & E). (B) sammanfattande diagram som visar ökningen av öron tjockleken över tiden för C57BL/6 möss som exponerades för Malassezia eller lämnades oinfekterade som kontroller. Den absoluta tjockleken på M. pachydermatis stam atcc 14522-exponerad eller vehikel-behandlad öron skinn vid varje tidpunkt visas till vänster; ökningen av öron tjockleken vid de angivna tids punkterna i förhållande till baslinjen på dag 0 visas till höger. C) svamp börda i huden hos C57BL/6-möss som var infekterade med M. pachydermatis stam ATCC 14522 eller behandlade med olivolja som kontroll (fordon). I båda fallen var huden tejp-strippad. Varje symbol i de sammanfattande diagrammen B och C representerar ett djur. Den statistiska betydelsen av skillnaderna mellan grupperna beräknades med enkelriktad ANOVA (B) eller Students t-test (C). p < 0,001, * * * * p < 0,0001, D.L.: detektionsgräns vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver infektion i huden hos den vanligen använda inavlade mus stammen C57BL/6 av Malassezia spp. anpassning av detta protokoll till andra mus stammar med en annan genetisk bakgrund (t. ex. Balb/c) eller till genetiskt modifierad mus stammar kan behöva justering av infektions dosen, tidspunkten (s) analys, etc. För att säkerställa reproducerbarhet bör grupper av möss alltid ha samma ålder och kön. Källan till möss bör hållas stabil, eftersom även smärre förändringar i den genetiska bakgrunden och skillnader i bakterieflora, som finns mellan leverantörer och kan existera även mellan olika enheter av en enda avelsanläggning, kan ha en oförutsägbar inverkan på infektionsförloppet. När du ställer in Malassezia infektion modell som beskrivs i detta protokoll, det rekommenderas att utföra en pilotstudie för att noggrant övervaka förloppet av infektionen, inklusive omfattningen av kolonisering, kinetik av svamp clearance och graden av inflammation och patologi som kan induceras (t. ex. om öron huden är barriär-störd före infektion) för att bestämma de optimala testförhållandena.
För att säkerställa reproducerbarheten och på ett tillförlitligt sätt upptäcka skillnader mellan försöks grupperna måste antalet djur som används per grupp beräknas utifrån den statistiska analysen. Urvalsstorleken beräknas utifrån effekt storlek, felfrekvens och effekt, som beaktar biologiska och experimentella variationer (t. ex. på grund av variation i immunsystemet). Av etiska skäl undvika att använda onödigt höga antal djur. När det gäller Malassezia hudinfektion, behandla endast ett öra med svampen och använda det andra örat som en kontroll inom samma mus, rekommenderas inte eftersom möss kan sprida svampen till båda öronen när grooming. Men med 1/2 öra för olika metodologiska Läs outs såsom bestämning av svamp börda, isolering av immunceller eller histologisk analys är ofta tillräckligt och resulterar i en signifikant minskning av djur nummer som används för experiment.
18 olika arter av Malassezia har beskrivits aktuella. Inter-och kommunikation variationer inom släktet Malassezia kan påverka interaktionen med värden, som vi också har lärt oss från studier på andra mänskliga patogena svampar13. Olika Malassezia arter och stammar skiljer sig i deras ursprung (t. ex., m. pachydermatis är den mest frekventa arter isolerade från djur, medan m. Auktor, m. Auktor och m. sympodialis är de mest framstående medlemmar av den fungal flå microbiomen i människor med variabel fördelning av dessa art mellan olika flå områden). Vissa arter har förknippats med commensalism, medan andra tros vara mer patogena, även om detaljerade bevis är fortfarande relativt svag. Viktigare, vissa arter och stammar är till sin natur svårare att växa än andra. Beslutet om vilken art/stam som ska användas för infektionen måste således grundas på forskningsfrågan.
Experimentell infektion i murina huden med vissa mikrobiella organismer såsom Candida albicans eller Staphylococcus aureus kräver störning av den epidermala barriären före infektion, e.g., med sandpapper14, 15,16. Däremot är den modell av Malassezia infektion som beskrivs här lika effektiv med och utan barriär störning7. Graden av inflammation som induceras av svampen förstärks kraftigt om huden är tejp strippad före infektion7. Därför, om huden ska manipuleras innan tillämpningen av Malassezia beror på forskningsfrågan. Olika modeller av kronisk och akut hudinflammation (t. ex. modeller för fördröjd typ överkänslighet (DTH) och kontakt överkänslighet (CHS)) och modeller av barriär brist finns som kan vara av intresse för att utreda bidraget av kommensaler jäst till hud patologier.
Inavlade möss som underhålls under specifika patogenfria (SPF) villkor är (enligt vår kännedom) inte naturligt koloniserade med Malassezia. Därför är den experimentella tillämpningen av Malassezia till mus örat huden en primär exponering för svampen som inducerar ett akut svar i värden, vilket i sin tur leder till svamp clearance inom 1-2 veckor7. Medan den modell som beskrivs i detta protokoll därför endast delvis återspeglar situationen hos immunkompetenta människor eller andra värdorganismer som permanent koloniseras med Malassezia, möjliggör den experimentella infektionen ett stort fönster av möjlighet att studera svampdödande immunitet och cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom detta svar. Det gör det också möjligt att undersöka variationer i svaret på olika Malassezia arter och stammar under olika experimentella förhållanden (t. ex., med och utan barriär störning i huden).
Studiet av Malassezia -värd interaktioner har varit begränsade i det förflutna till in vitro-experiment med isolerade celltyper i kulturer (t. ex., keratinocyter cellinjer, pbmcs). Även om dessa studier har sprida lite ljus över svamp och värden determinanter som formar samspelet mellan Malassezia och värd17, de tillåter inte att få en omfattande förståelse av svamp-värd interaktion i komplexet miljö i huden, som involverar flera celltyper som är i ständig kommunikation, såsom keratinocyter, fibroblaster och vävnad bosatta immunceller, men också leukocyter populationer som infiltrera vävnaden endast på mikrobiell möte i Hud. Detta flercelliga nätverk kan inte återges helt i in vitro-modellerna, även med de flesta avancerade Organoid system. Således är den experimentella infektionen av möss fortfarande den gyllene standarden inom immunologi och infektionssjukdomar forskning, och tillgängligheten av den modell som beskrivs här utgör ett genombrott inom området Malassezia forskning. Viktigare, denna modell förlitar sig på epikutan applicering av Malassezia på den annars ogenomträngbara mus öra huden, och det inte implerar inympning av svampen genom injektion i vävnaden, e.g., subkutant eller intraperitonealt, som tidigare studier rapporterade18, som båda är mer avlägsen från situationen i naturligt koloniserade värdar.
Möjligheten att kombinera den modell av Malassezia infektion som beskrivs i detta protokoll med andra tillgängliga musmodeller ökar kraftigt omfattningen och flexibiliteten i programmet. Den senare omfattar olika modeller av specifika hudsjukdomar, såsom modellen av barriär brist som härmar viktiga egenskaper hos atopisk dermatit, en sjukdom som förknippas med Malassezia hos både människor och hundar. Dessutom kan epikutana infektioner i huden med Malassezia lätt appliceras på möss med genetiska defekter i värd gener av intresse, eller möss där en celltyp av intresse är genetiskt utplånas eller kan vara farmakologiskt utarmat (t. ex., med hjälp av difteri toxin administration i difteri toxin receptor-uttrycker möss). Sådana modeller utgör ett oundvikligt verktyg för dissekera värd svar på kommensaler och patogena mikrober, inklusive Malassezia, och att bedöma vilken roll dessa gener och celltyp i svampen-värd interaktion. Analyserna av Malassezia-Host hud interaktion kan utökas långt bortom vad som beskrivs i detta protokoll. Dessa inkluderar analyser av histologi (t. ex. för att bestämma graden av hudpatologi eller epidermal förtjockning inducerad av svampen), genom immunohistokemi eller Immunofluorescerande färgning av vävnad sektioner med antikroppar riktade mot celltyp specifika markörer eller andra molekyler av intresse. Det kan också innebära isolering av celler (t. ex., vävnad bosatt eller vävnad-infiltrerande leukocyter undergrupper) från den infekterade huden vävnad att studera polarisering, reglering, och dynamik i immunförsvaret mot Malassezia i stort djup.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av universitetet i Zürich, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
