Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

מערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד להערכת תרופות פרמקוקנטיות וטוקסיקולוגיות

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

חשפנו מערכת מיקרופיזיולוגית (MPS) עם אורגנואידים במעי וכבד פרצטמול (APAP). מאמר זה מתאר את השיטות לייצור אורגנואידים והערכות רכוש פרמקוקינטי וטוקסיקולוגי APAP ב MPS. הוא גם מתאר את ניתוחי פונקציונליות הרקמה הדרושים כדי לאמת את התוצאות.

Abstract

מערכות מיקרופיזיולוגיות שהוצגו לאחרונה (MPS) טיפוח אורגנואידים אנושיים צפויים לבצע טוב יותר מאשר בעלי חיים בשלב בדיקות פרה-לקלינליות של תהליך פיתוח תרופות כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. במחקר זה, מחסום המעי האנושי (חיקוי על ידי תרבות שיתופית של תאי Caco-2 ו HT-29) ואת המקבילה בכבד (חיקוי על ידי spheroids עשוי תאי HepaRG מובחן ו תאי סטלה כבד אנושיים) שולבו בשבב שני איברים (2-OC) מכשיר מיקרו-נוזלים כדי להעריך כמה פרצטמול (APAP) פרמקוקינטיקה (PK) ומאפיינים טוקסיקולוגיים. MPS היו שלוש הרכבות: המעי רק 2-OC, כבד רק 2-OC, ו מעיים / כבד 2-OC עם אותה מדיה תפרוק שני אורגנואידים. להערכות PK, אנחנו מינון APAP בתקשורת בנקודות זמן מוגדרות מראש לאחר ניהולו או מעל מחסום המעיים (לחקות את המסלול אוראלי) או במדיה (לחקות את המסלול תוך וריד), ב 12 μM ו 2 μM בהתאמה. דגימות המדיה נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה הפוכה (HPLC). אורגנואידים נותחו לביטוי גנים, לערכי TEER, לביטוי ולפעילות של חלבונים, ולאחר מכן נאספו, תוקנו ונשלחו לערכה של הערכות מורפולוגיות. טכניקת MTT ביצעה היטב בהערכת הכדאיות אורגנואיד, אבל ניתוחי תוכן גבוה (HCA) הצליחו לזהות אירועים רעילים מוקדמים מאוד בתגובה לטיפול APAP. אימתנו כי זרימת המדיה אינה משפיעה באופן משמעותי על ספיגת APAP ואילו זה משפר באופן משמעותי את הפונקציונליות המקבילה לכבד. ספיגת המעיים האנושית APAP וחילוף החומרים של hepatic יכול להיות חיקוי MPS. הקשר בין נתוני MPS ומידול silico יש פוטנציאל גדול כדי לשפר את יכולת החיזוי של שיטות מבחנה ולספק דיוק טוב יותר מאשר מודלים של בעלי חיים במחקרים פרמקוקינטיים וטוקסיקולוגיים.

Introduction

בשל הבדלים גנומיים ופרוטונומיים, למודלים של בעלי חיים יש ערך חזוי מוגבל למספר תוצאות אנושיות. יתר על כן, הם גוזלים זמן, יקרים ומנוייםמבחינה אתית 1. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית שמטרתה לשפר את העוצמה החזויה ולהפחית את העלויות והזמן שהושקעו בבדיקות פרה-קליניות. הם מכשירים מיקרו-נוזלים המטפחים אורגנואידים (יחידות פונקציונליות של פנטומימטיקה מלאכותית של איברים) תחת זרימת מדיה המקדמת תקשורת אורגנואיד-אורגנואיד. אורגנואידים עשויים תאים אנושיים להגדיל את הרלוונטיותתרגום 2,3,4. MPS צפוי לבצע טוב יותר מאשר ניסויים בבעלי חיים כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. כאשר פונקציונלי באופן מלא, MPS יספק תוצאות משמעותיות יותר, במהירות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר וסיכונים4. קבוצות רבות מפתחות MPS למספר מטרות, במיוחד מודלים מחלה כדי בדיקות היעילות של התרופה.

רמת החשיפה היא אחד הפרמטרים הקריטיים ביותר להערכת יעילות התרופהורעילות 5, 6,7,8,9,10,11,12. MPS מאפשר שילוב אורגנואידים המחקם חשיפה מערכתית וצפוי לבצע טוב יותר מאשר תרבות הרקמה האנושית הדו-מיומסורתית. טכנולוגיה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את החיזוי של ספיגת מעיים מורכבת וחילוף חומרים בכבד4.

MPS שילוב מודל המקבילה האנושית של המעי והכבד היא נקודת התחלה טובה, בהתחשב בתפקיד המרכזי של שני איברים אלה זמינות ביולוגית סמיםוחשיפה מערכתית 13,14,15. APAP היא תרופה אטרקטיבית לחקר MPS ללא שווה ערך לכליות כי חילוף החומרים שלה נעשה בעיקר עלידי הכבד 16,17.

2-OC הוא מכשיר מיקרו-נוזל דו-קאמרי המתאים לתרבות של שתי רקמות/אורגנואידים מקבילים אנושיים שונים המחוברים על ידימיקרו-צינורות 16. על מנת לחקות בינה אנושית אוראלית / תוך ורדי ניהול של תרופה ולהעריך את ההשפעות של שיחה צולבת בין המעי וכבד שווה ערך על פרמקוקינטיקה APAP, מלבד פונקציונליות organoids וכדאיות, שלושה הרכבות MPS שונות בוצעו: (1) "מעיים 2-OC MPS" מורכב שווה ערך מעיים המבוסס על הוספת תרבות המכילה Caco-2 + HT-29 תאים coculture, משולב בהתקן 2-OC; (2) "כבד 2-OC MPS" המורכב מספרואידים כבד עשוי HepaRG + HHSteC (תאי סטלה הכבד האנושי) משולב בהתקן 2-OC; ו(3) "מעיים / כבד 2-OC MPS" מורכב המקבילה המעי בתא התקן אחד תקשורת עם המקבילה הכבד בשנייה על ידי זרימת התקשורת דרך ערוצים microfluidic.

כל ההתמרמרות בוצעו בתנאים סטטיים (ללא זרימה) ודינמיים (עם זרימה) בשל ההשפעה של הגירויים המכניים (דחיסה, מתיחה וגייה) על הכדאיותוהפונקציונליות של התא 18,19,20. המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול עבור הדמיית ניהול אוראלי /תוך ורדי APAP ואת הספיגה / חילוף החומרים בהתאמה וניתוחים טוקסיקולוגיים ב 2-OC MPS המכילים מודלים מקבילים המעי האנושי והכבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור רקמות שוות ערך לטיפוח ב 2-OC

  1. ייצור שווה ערך למחסום מעיים קטן
    1. לשמור על תאי Caco-2 ו- HT-29 באמצעות המדיום המקביל למעי: DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין, ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות, אשר נקרא "DMEM S" בכתב יד זה.
    2. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם DPBS 1x ולהוסיף 8 מ"ל של 0.25% Trypsin / EDTA כדי לנתק Caco-2 תאים גדל במבחנות תרבות התא (175 ס"מ2). דגירה במשך 5 דקות ב 37 ° C ולעצור את התגובה על ידי הוספת לפחות את הנפח הכפול של מעכב שלושה. בצע את אותו הליך עבור תאי HT-29, התאמת אמצעי האחסון של היריגנט מאז כמות קטנה יותר של תאים אלה נדרשת והם נשמרים במבחנות קטנות יותר (75ס"מ 2).
    3. צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant משני הצינורות, ולענג מחדש את כדורי התא ב 10 מ"ל של DMEM S. לספור תאים, להבטיח כדאיות תא גבוה יותר מ 80%. באופן מבחינה אפטית לשלב את תרבית התא מוסיף בצלחת 24-באר מלא בעבר עם 400 μL של DMEM S לכל באר בצד basolateral (אשר מייצג את מחזור הדם האנושי).
    4. שיתוף לטפח תאים Caco-2 ו HT-29 ביחס של 9:121. השתמש 2.25 x 105 Caco-2 ו 2.5 x 104 HT-29 תאים לכל מקבילה במעי בנפח סופי של 200 μL של DMEM S. להתאים מספרי תאים ונפח בהתאם למספר הרצוי של אורגנואידים. מערבבים היטב.
    5. פיפטה 200 μL של תמיסת תא לתוך הצד apical של כל תוסף (המייצג את הצד האנושי לומן מעיים), זריעת 250,000 תאים לכל הוספה. לטפח את התאים במוסיף במשך שלושה שבועות22. לשנות את המדיום לפחות שלוש פעמים בשבוע, שואפים אותו משני הצדדים apical ו basolateral עם פיפטה פסטר סטרילי, דואג לא לפגוע במחסום התא שלם.
      הערה: המשך עם השאיפה בצד האפאלי, כדי לא לגעת במחסום התא (שאף על-ידי תמיכה בפיפטה פסטר על שפת הפלסטיק של תא הכנס).
    6. בדוק את היווצרות חד שכבתית הדוקה על ידי מדידת TEER (התנגדות חשמלית transepithelial) כל שלושה ימים באמצעות מד מתח23, על פי הוראות היצרן.
      1. בצע ריק, מדידת ההתנגדות על פני תרבות תא להוסיף ללא תאים, אבל עם אותו תא בינוני באותו לוח תא.
      2. לחשב את עמידות הרקמות על ידי חיסור ההתנגדות הריקה מן ההתנגדות שווה רקמות, ולהכפיל על ידי שטח הפנים יעיל של קרום המסנן (0.6ס"מ 2). עמידות טובה במחסום המעיים היא בטווח של 150 עד 400 מטרים Ω∙"מ2.
        הערה: לאחר 21 ימים יש להבדיל את התאים באופן מלא ואת מחסום המעיים נוצר, כך המקבילות המעי מוכנים להיות משולבים MPS.
  2. ייצור שווה ערך לכבד
    1. לשמור על תאי HepaRG באמצעות המדיום המקביל לכבד, שהוא E בינוני של ויליאם בתוספת עם 10% סרום פר עוברי, 2 mM L-גלוטמין, 100 יחידות / mL פניצילין, 100 μg / מ"ל סטרפטומיצין, 5 μg / מ"ל אינסולין אנושי ו 5 x 10-5 M הידרוקורטיזון, והוא נקרא "וויליאמס E S" בכתב יד זה. לחדש את מדיה HepaRG כל 2-3 ימים ולשמור על תרבות התא במשך שבועיים כדי ליזום את ההבידול hepatocytes ו cholangiocytes.
    2. לאחר השבועיים הראשונים, להוסיף 2% DMSO למדיום של HepaRG לשבועיים נוספים כדי להשלים את בידול התא24,25. לגדול HHSTeC במדיה תא Stellate (SteC CM), באמצעות מבחנות תרבות תא מצופה פולי-L-לינזין, שינוי מדיה כל יומיים או שלושה.
    3. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם DPBS 1x ולהוסיף 8 מ"ל של 0.05% Trypsin/EDTA, כדי לנתק תאי HepaRG גדל במבחנות תרבות התא (175 ס"מ2). דגירה במשך 5 עד 10 דקות ב 37 ° C ולעצור את התגובה על ידי הוספת לפחות כפול נפח של מעכב שלושה. בצע את אותו הדבר עבור HHSTeC, התאמת נפח היריגנט מאז כמות קטנה יותר של תאים אלה נדרשים והם יכולים להישמר במבחנות קטנות יותר (75ס"מ 2).
    4. צנטריפוגה הן ב 250 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant ולתחות מחדש את כדורי התא במדיום וויליאמס E S. לספור תאים, להבטיח את הכדאיות של התא גבוה יותר מ- 80%.
    5. צור את כדורי הכבד המשלבים תאי HepaRG ו- HHSTeC ביחס של 24:1, בהתאמה, ב וויליאמס E S בינוני16. הוסף 4.8 x10 4 HepaRG מובדיל ו 0.2 x10 4 HHSTeC כדי לחבר כל ספרואיד כבד של 50,000 תאים, בנפח של 80 μL. להתאים מספרי תאים ונפח בהתאם למספר הרצוי של spheroids. מערבבים היטב.
    6. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לחלק 80 μL של מאגר התא המשולב בכל באר של 384 מיקרו-לוחיות דם spheroid, אשר יש גיאומטריה עגולה היטב התחתון.
      הערה: לאחר ארבעה ימים, spheroids של כ 300 μm נוצרים.
    7. באמצעות טיפים רחבים, להעביר את כדורי הכבד לחיבור אולטרה נמוך 6 צלחות גם, המאפשר את הספירה הנדרשת "אחד אחרי השני".

2. שילוב של מעי וכבד שווה ערך ב MPS 2-OC

  1. מכלול 2-OC MPS מעיים לקליטת
    1. פיפט 500 μL של DMEM S לתוך התא הגדול יותר של 2-OC ו 300 μL בקטן יותר. לשאוף את התקשורת basolateral ו apical של כל מחסום מעיים שווה ערך ב 24 צלחות באר. באמצעות מגרסה סטרילית, לשלב הוספה אחת לכל מעגל 2-OC, במיוחד לתוך התא הגדול יותר. למרוח 200 μL של מדיום המעי בצד apical.
      הערה: הימנע היווצרות בועות בעת שילוב organoids לתוך MPS.
    2. חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה, שחייבת להיות מחוברת לאספקת אוויר בלחץ. הגדר את הפרמטרים: לחץ של, כ±300 פס ותדירות שאיבה של 0.3 הרץ. התחל את הזרימה 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה. למחרת, לבצע את הטיפול APAP.
  2. כבד 2-OC MPS הרכבה עבור חילוף חומרים
    1. פיפטה 650 μL של וויליאמס E S לתוך התא הגדול ו 350 μL לתוך התא הקטן יותר, אשר יקבל את spheroids. ב-6 לוחות הבאר עם ההחזקה הנמוכה במיוחד, ספרו את הספרואידים בעזרת טיפים רחבים. כל כבד שווה ערך מורכב מעשרים כדוריות26. שלב עשרים שווה ערך לכבד לכל מעגל, באמצעות טיפים רחבים, המאפשרים העברת אורגנואידים בלבד, לתא הקטן יותר של 2-OC.
    2. חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה, שחייבת להיות מחוברת לאספקת אוויר בלחץ. הגדר את הפרמטרים: לחץ של, כ±300 פס ותדירות שאיבה של 0.3 הרץ. התחל את הזרימה 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה. למחרת, לבצע את הטיפול APAP.
  3. מכלול מעי/כבד 2-OC MPS לספיגה וחילוף חומרים
    1. שלב את שני המדיה (המעי והכבד) בפרופורציה 1:4, מה שאומר 200 μL של DMEM S בצד apical מעיים ו 800 μL של וויליאמס E S בצד basolateral. שלב את המקבילות של המעי והכבד, בו זמנית, ב-2-OC.
    2. חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה, שחייבת להיות מחוברת לאספקת אוויר בלחץ. הגדר את הפרמטרים: לחץ של, כ±300 פס ותדירות שאיבה של 0.3 הרץ. התחל את הזרימה 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה. למחרת, לבצע את הטיפול APAP.
      הערה: עבור כל הניסויים, בצע כל נקודת זמן בשלושה רישיות, כלומר שלושה מעגלים נפרדים של 2-OC (כלומר, 1 ו-1/2 התקני 2-OC). הנפח הכולל של כל מעגלי 2-OC הוא 1 מ"ל.

3. הכנת פרצטמול (APAP)

  1. הכן את פתרון המניות APAP, המסת APAP באתנול מוחלט. ביום הניסוי, לדלל APAP במדיום בהתאמה (פתרון APAP), לריכוז של 12 μM עבור "ניהול אוראלי" ו 2 μM עבור "ניהול תוך ורדי".
  2. ודא כי הריכוז הסופי של אתנול בפיקוח על הרכב ופתרון טיפול הוא 0.5% עבור שני הממשלים. עבור השליטה החיובית (100 mM APAP), ריכוז האתנול הוא 2%.

4. בדיקת ניהול חומרים ותו לא

  1. APAP "אוראלי" ניהול ומדיה דגימה
    1. לשאוף את התקשורת basolateral ו apical של כל מחסום מעיים שווה ערך 2-OC. פיפטה 500 μL של אמצעי התרבות המתאימה לתוך התא הגדול בצד basolateral אורגנואיד ו 300 μL לתוך התא הקטן.
    2. בדוק בועות ולהמשיך עם מחסום המעיים שווה טיפול שווה ערך עם חומר הבדיקה בצד apical, לחקות ניהול אוראלי. לחקות APAP "אוראלי" ממשל על ידי הוספת 200 μL של פתרון APAP 12 μM בצד apical של תוספות תרבות המעיים, אשר מייצג את המעי "צד לומן"(איור 1B). חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה.
    3. אסוף את הנפח הכולל מצדדים apical ומהצדדים basolateral בנקודות הזמן הבאות: 0 שעות, 5 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 1 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות15,27. בצע את כל הניסויים בשלושה ניסויים, בתנאים סטטיים ודינמיים, ולאסוף כל מדגם, של כל שלושה, במיקרו-tube נפרד. נתח את הדגימות באמצעות HPLC/UV.
      הערה: דוגמאות אפיות ובסולטרליות נפרדות.
  2. APAP "תוך ורדי" ניהול ומדיה דגימה
    1. לחקות את המסלול "תוך ורדי" על ידי מתן 2 μM APAP פתרון ישירות לתוך תא הכבד. שאף את כל התוכן הבינוני 2-OC. פיפטה 650 μL של וויליאמס E S המכיל את חומר הבדיקה לתוך התא הגדול ו 350 μL של אותה מדיה לתוך התא הקטן המכיל את 20 spheroids. אסוף את כל אמצעי האחסון בנקודות הזמן הבאות: 0 שעות, 30 דקות, שעה אחת, 2 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות27,28.
    2. בצע את כל הניסויים בטריפוליאט, בתנאים סטטיים ודינמיים. לאסוף כל דגימה, של כל שלושה שלושה, במיקרו-tube נפרד. נתח את הדגימות באמצעות HPLC/UV.

5. מכשור ותנאים כרומטוגרפיים

  1. ניתוח HPLC
    1. הגדר את כל הפרמטרים הרלוונטיים לניתוח HPLC בהתאם לטבלה 1.
    2. לסנן את שלב הנייד דרך מסנן קרום 0.45 μm תחת ואקום. לסנן את הדגימות דרך מסנן מזרק PVDF גודל נקבוביות 0.22 μm (קוטר 13 מ"מ) ולאחסן אותם במבערית. התחל את המדידה.
  2. פתרונות מלאי, תקני כיול ודוגמאות בקרת איכות (QC)
    1. הכן 10 mM של פתרונות מלאי APAP במאגר אמוניום אצטט (100 mM, pH 6.8) ודילול נוסף עם DMEM S ו וויליאמס E S תא תרבות מדיה מדולל עם מאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v) כדי להשיג את פתרונות העבודה החל 0.25 כדי 100.00 μM.
    2. כלול קבוצה של דגימות כיול בשלושה רישיות, כמו גם דגימות בקרת איכות בארבע רמות בשלושה. הכן סטנדרטים אלה על-ידי דילול סדרתי.
    3. צור עקומות כיול של אזורי שיא APAP לעומת ריכוזים סטנדרטיים נומינליים APAP. קבע את הרגרסיה ליניארית המתאימה לכל עקומת כיול. העריך את טוב-ההתאים של מודלים שונים של כיול על-ידי בדיקה חזותית, מקדם מתאם, דיוק פנים-ו-הפעלה וערכי דיוק.
    4. להזריק דגימות ריקות של DMEM S ו וויליאמס E S מדיה מדוללת במאגר אמוניום אצטט (1:1, v /v) בsstuplicate. הכן triplicates של דגימות בקרת איכות במדיה DMEM S ו- Williams E S מדולל עם מאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v) עבור ריכוזי APAP של 0.50 (LOQ), 4.50, 45.00 ו- 90.00 μM.
    5. ודא שדגימות בקרת האיכות מוכנות מפתרון מניות חדש, שונה מזה המשמש ליצירת עקומה סטנדרטית. השתמש בדגימות בקרת איכות כדי לחקור וריאציות פנים-והפעלה בין-הפעל.
  3. הליכי אימות
    1. בצע את אימות השיטה הביואנליטית לאחר ההליכים שדווחוקודם לכן 29,30. לבצע את הריצות הכרומטוגרפיות בחמש או שש הזדמנויות שונות, בהתחשב וויליאמס E S ו DMEM S תא תרבות מדיה, בהתאמה.
    2. ודא כי נקודות כיול החל 0.25 כדי 100.00 μM של APAP, ב DMEM S או וויליאמס E S תא תרבות מדיה מדוללת במאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v), התוויה בהתבסס על אזורי השיא של APAP (ציר y) נגד ריכוזים נומינליים בהתאמה (ציר x). השווה את המדרונות של עקומות כיול סטנדרטיות אלה עם מדרונות של עקומת כיול שהוכנו במאגר אמוניום אצטט. ודא שלכל עקומות הכיול יש ערך מתאם של 0.998 לפחות.
    3. קבע את הדיוק והדיוק (פנים והפעלה בין-הפעלה) עבור האנליטיט במטריצה הפונדקאית באמצעות שכפולים בארבע רמות שונות LLOQ, בקרת Low, Middle ו- high-quality בחמישה או שישה ימים שונים. בצע מדידות דיוק ודיוק פנים-ריצה באותו יום במדיה של תרבות התאים DMEM S או Williams E S המדוללת במאגר אצטט אמוניום (1:1, v/v) המכיל 0.50, 4.50, 45.00 ו- 90.00 μM APAP ריכוזים (n = 3).
    4. הערך כל קבוצה של דגימות בקרת איכות המכילות את ריכוזי APAP מתקיות כיול שהושגו לאחרונה. בדוק את הבחירה של האסות על ידי מידת ההפרדה של המתחם של עניין ופסגות כרומטוגרפיות אחרות אפשריות הנגרמות על ידי רכיבים מפריעים.
  4. גבול תחתון של כימות (LLOQ) ומגבלת זיהוי (LOD)
    1. קבע את הגבול התחתון של כימות (LLOQ) בהתבסס על סטיית התקן של התגובה ועל גישת המדרון. חשב באמצעות הנוסחה 10α /S, כאשר α היא סטיית התקן של y-intercept ו- S הוא השיפוע של קו ישר שהושג על-ידי התוויית עקומות כיול29,30. הערכת מגבלת הזיהוי (LOD) תוך התחשבות פי 3.3 סטיית התקן של הריק, המחולקת לפי המדרון שלעקומת הכיול 29,30.

6. רקמה שווה ערך לכדאיות/פונקציונליות

  1. MTT (1000
    1. לבצע תסריט MTT כדי להעריך את הכדאיות אורגנואיד בכל נקודות הזמן של תסכולת MPS. כשליטה שלילית, השתמש במדיה סלולרית בתוספת רכב. כשליטה חיובית, לטפל באורבנואידים עם APAP 100 mM ו 1% NaOH מדולל במדיום התא.
    2. להעביר את 20 spheroids של כל שכפול עבור בארות בודדות בצלחת 96 באר, ואת תרבות התא מוסיף, המכיל את המקבילות מעיים, כדי 24 לוחות תא גם, הצבת אחד שווה ערך מעיים לכל באר. לשטוף את הרקמה שווה שלוש פעמים עם DPBS 1x.
    3. להוסיף 300 μL של 1 פתרון MTT מ"ג/מ"ל, מדולל במדיום התא המתאים, לכל באר. דגירה את הצלחות במשך 3 שעות בתנאי תרבות תא סטנדרטיים.
    4. הסר את פתרון MTT מכל באר בזהירות על-ידי pipetting. לחלץ formazan MTT מן המעי והכבד שווה ערך באמצעות 200 μL של isopropanol לכל לילה ב 4 ° C.
      הערה: אטמו את המכסה כדי למנוע אידוי.
    5. להעביר 200 μL של כל supernatant לבאר המזוהה מראש בהתאמה בצלחת בדיקה מיקרו 96 גם. השתמש isopropanol כריק.
    6. קרא את ספיגת formazan לקורא צלחת ב 570 נמיר. חישוב היכולת היחסית של התאים להפחית MTT (%) שימוש בצפיפות האופטית הממוצעת של כל נקודת זמן, בהשוואה לבקרה השלילית, הנחשבת לכדאיות של 100% תאים.
  2. ציטוכימיה/היסטולוגיה
    1. לתקן את המקבילות המעי והכבד, במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות 4% (w / v) paraformaldehyde ב 0.1 M פוספט תמיסת מלח, pH 7.4. לשטוף את האורבנואידים 5 פעמים במאגר PBS במשך 10 דקות בכל פעם. כתם את המעי ואת המקבילות בכבד עם tetramethylrhodamine isothiocyanate-phalloidin או אלקסה פלור 647 פאלודין, 1:50 ב PBS31.
    2. מעבירים אותם למדיום הקפאה OCT במשך כמה דקות כדי להסתגל ב RT לפני העברתם חנקן נוזלי עד להקפאה מלאה. לבצע קריוסקטים כדורי כבד על 10-12 μm עבה, באמצעות cryostat.
    3. הר את מקטעי הרקמות במדיום הרכבה עם DAPI. בדוק אותם על ידי מיקרוסקופ פלואורסץ confocal.
    4. להקפיא את organoids לאחר קיבעון לבצע המטוקסילין & כתמים אאוסין על פי הפרוטוקולים שנקבעו. הר השקופיות עם הרכבה בינונית לאחר חיתוך הרקמה כמתואר לעיל ולקחת תמונות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
  3. ניתוח תוכן גבוה
    1. המיטוכונדריה והכתמים הגרעיניים של התאים
      1. לשחזר את האבקה lyophilized ב DMSO כדי להפוך 1 mm מיטוכונדריאלי תמיסת מניות (למשל, MitoTracker עמוק אדום FM). אחסן פתרון מניות aliquoted ב -20 °C מוגן מפני אור. לדלל את 1 mM מיטוכונדריאלי תמיסת מניות כתמים לריכוז הסופי (200 מילימ') בטרום חחום (37 ° C) תרבות רקמות בינוני ללא סרום.
      2. הסר את מדיה תרבות התא. הוסף את פתרון הכתמים המיטוכונדריאלי כדי לכסות לחלוטין את הדגימה ודגירה תאים במשך 15-45 דקות ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.
      3. מסירים בזהירות את פתרון העבודה של הכתמת המיטוכונדריה ומחליף אותו ב-2-4% קיבעון paraformaldehyde ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. יש לשטוף את התאים הקבועים בעדינות באמצעות PBS למשך 5 דקות. חזור על תהליך הכביסה פעמיים.
      5. להכין 10 מ"ג /מ"ל (16.23 M) חומצה גרעין מכתים תמיסת מלאי על ידי המסת 100 מ"ג של Hoechst 33342 צבע ב 10 מ"ל של מים אולטרה פורים.
        הערה: יש לצטט את פתרון המלאי ולאחסן אותו מוגן מפני אור ב-20°C.
      6. להכין 0.2-2.0 μg / מ"ל חומצה גרעין מכתים פתרון עבודה PBS דגירה את התאים מקובעים עם חומצה גרעין מכתים פתרון עבודה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. הסר את תמיסת ההכתמה של חומצת הגרעין ושטוף את התאים בעדינות עם PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים. יש לשמור על תאים ב-PBS ב-4°C, מוגנים מפני אור.
    2. ניתוח כתמים מיטוכונדריאליים וגרעיניים
      1. לנתח תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס עם ערכות מסנן המתאים כתם חומצה גרעין (ρEx / ρEm: 361/497 ננ"מ) ואת הכתם המיטוכונדריאלי (ωEx / ρEm: 644/665 ננ"מ). מצא תאים על ידי חומצה גרעין כתמים חיוביים לכמת את מספר התא. לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות של כתם מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה.
  4. מדידות מורפומטריות (חישובי ספרואידים) ב- ImageJ
    1. יצא תמונות ניתוח תוכן גבוה (HCA) כקבצי *.flex מהתוכנה Columbus. יבא קבצי .flex כגווני אפור ב- ImageJ באמצעותתוסף ביו-פורמטים 32: קובץ > ייבוא > פורמטים ביולוגיים.
    2. בחלון אפשרויות ייבוא, בחר הצגה Hyperstack והפוך ערוצי פיצול לזמינים תחת פיצול לחלונות נפרדים. אפשרות זו תאפשר גישה של כל הקבצים בערוץ מסוים (למשל, DAPI, מיטוטרטר וכו'). אל תבחר באפשרות השתמש מחסנית וירטואלית תחת ניהול זיכרון.
      הערה: עדיף להשתמש בערוץ DAPI כ"אבק" בתמונות כמדיום תרבות מופחת באורך גל UV (למשל, 405 נה"מ).
    3. כוונן את גודלהפיקסל ( ניתוח > קבע קנהמידה) אם הוא לא נטען בהתאם לערכים מוטבעים בקובץ ה- .flex. החל מסנן טשטוש גאוסיאני כדי להסיר את עודף הרעש ולהימנע מחריגות בקווי המתאר של הצורה. תהליך > מסננים > טשטוש גאוס . ערך גבוה של סיגמא (רדיוס) בין 2.0 ל- 3.0 הוא אידיאלי עבור רוב המקרים. אם המחסנית כוללת מספר תמונות, החל על כולן (בחר כן בחלון מחסנית תהליך).
    4. צור תמונה בינארית כדי להפריד בין רקע לבין אורגנואידים (אובייקטים) באמצעות סף. לחץ על תמונה > כוונן > סף. השתמש במסכה האדומה כדי להתאים את הערכים בהתאם לעוצמת התמונה, כדי להתאים את צורת האורגן, תוך שמירה על המורפולוגיה ללא שינוי. הפוך רקע כהה ללא זמין אם לתמונה יש רקע לבן. לחץ על החל.
    5. בחלון המרת מחסנית לחלון בינארי, בחר בשיטת הסף. בדרך כלל, ברירת מחדל או משולש מועדפים בעיבוד תמונה מסוג זה. שמור על הרקע כהה . בחר חשב סף עבור כל תמונה אם קיימות מספר תמונות בערימה.
    6. בחר תהליך > בינארי > מילוי חורים. לחלופין, הסר חורים מהרקע. בתהליך > בינארי > אפשרותs, בחר רקע שחור ובצע חורי מילוי שוב. הפוך את האפשרות 'רקע שחור ללא זמין' לפני שתמשיך לשלב הבא.
    7. הפרד אובייקטים. עבור אורגנואידים, שיטת קו פרשת המים היא בחירה טובה. לחץ על תהליך > בינארי > קו פרשת המים. בצע את ניתוח הצורה.
      1. בחר 'נתח' > 'קבע מידות'. מספר אפשרויות זמינות (פרטים https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). עבור אורגנואידים, בחר אזור, ערך אפור ממוצע, ערך אפור מרבי ומתארי צורה. לחלופין, בחר הצג תווית כדי לזהות אובייקטים בתמונה ובסימון מדעי. לחץ על אישור.
      2. בחר ניתוח > נתח חלקיקים. בחר את מגבלות הגודל והמעגליות. שמור 0 אינסוף ו- 0.00-1.00, בהתאמה כדי למדוד את כל האובייקטים בתמונה. ב'הצג', בחרו 'קווי מתאר' כך שהאובייקטים יזוהו. אפשר תוצאות תצוגה לתוצאות פלט; אל תכלול בקצוות כדי לא לכלול אובייקטים נוגעים בגבולות; כלול חורים כך חורים פנימיים בסופו של דבר באובייקטים נחשבים כחלק מהצורה הראשית.
    8. חזור על ניתוח צורה עבור כל מחסנית תמונות והתוצאות יצורפו בטבלה אחת. יצא טבלת תוצאות בקובץ > שמירה .csv בשם...
  5. PCR בזמן אמת
    1. לחלץ RNA מן המקבילות רקמות באמצעות פתרון monophasic של פנול ו guanidine isothiocyanate, בעקבות הוראות היצרן.
    2. לבצע את סינתזה cDNA על ידי שעתוק הפוך של 1 – 2 μg של RNA הכולל.
    3. הגביר את כל המטרות באמצעות פריימרים ספציפיים לגן (טבלה 5) כדי לבצע PCR כמותי בזמן אמת. כל qRT-PCR מכיל 30 ng של RNA מתעתק לאחור ו- 100 nM של כל פריימר.
    4. בצע את תנאי PCR: 50 °C במשך 3 דקות (מחזור אחד); 95 °C למשך 5 דקות (מחזור אחד); 95°C למשך 30 שניות, 59°C למשך 45 שניות ו-72°C למשך 45 שניות (35 - 40 מחזורים).
  6. סיסאי CYP
    1. בצע את סעיף 2.2 להרכבת כבד 2-OC. הקבוצות הניסיוניות הן ללא תא שליטה, APAP 2 μM טיפולים עבור 12 שעות, 24 שעות, ובקרה ברכב. בצע את הסעיפים 3.3 ו 4.2 עבור APAP 2 μM הכנה וטיפול.
      הערה: כדי להבטיח שכל הדגימות יהיו מוכנות בו-זמנית עבור CYP assay, התחל את הטיפול 12 שעות 12 שעות לאחר תחילת הטיפול 24 שעות. טפל בשליטה ללא תאים של פעילות CYP עם פתרון אתנול 0.5%, כמו גם בקרת הרכב.
    2. להפשיר 3 mM פתרון מלאי שלמצע luminogenic בטמפרטורת החדר ו לעשות דילול 1:1000 ב E S של ויליאם להגן מפני אור.
    3. לאסוף spheroids ולהעביר כל קבוצה ניסיונית לבאר של צלחת 96-באר. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם 100 μL של 1x DPBS ולהוסיף 80 μL של 3 μM פתרון המצע לכל טוב. שמור את השליטה ללא תאים במדיום E S של ויליאם. שמור באר ללא spheroids או פתרון ההחתמה עבור בקרת רקע. דגור במשך 30-60 דקות ב- 37 °C עם 5% CO2, מוגן מפני אור.
    4. שיווי משקל ליופיליה לוציפרין זיהוי רייגנט (LDR) באמצעות מאגר Reconstitution עם esterase. מערבבים על-ידי מערבול או היפוך. אחסן את אמצעי האחסון המתאים בטמפרטורת החדר עד לשלב הבא.
      הערה: ניתן לאחסן את LDR מחדש בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות או ב- 4 °C למשך שבוע אחד ללא אובדן פעילות. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן ב- -20°C.
    5. להעביר 25 μL של סופרנטנט של ספרואידים שלמים בשלוש בארות שונות של לבן אטום 96-באר microplate, לאחר הדגירה. להוסיף 25 μL של LDR לכל באר הומוגניזציה.
    6. מנטרים את הצלחת הלבנה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. קרא את הזוהר על מד לומינומטר. אל תשתמש בפלואורומטר.
    7. חשב אותות נטו על-ידי חיסור ערכי זוהר רקע (פקד ללא תאים) מהערכים שטופלו בבדיקה ולא טופלו (בקרת רכב). חשב אחוז שינוי של פעילות CYP3A4 על-ידי חלוקת הערכים נטו שטופלו על-ידי הערכים נטו לא מטופלים והכפלה ב- 100.
  7. כתמים מערביים
    1. להעביר את כדורי הכבד למיקרו-טיוב שזוהה ב-1.5 מ"ל. הסר את המדיום ושטוף פעמיים עם 100 μL של DPBS אחד.
    2. לזלות את כדורי הכבד ב 100 μL של תא lysis RIPA מאגר ב 4 ° C במשך 20 דקות. צנטריפוגה למשך 15 דקות, 4°C ו-11,000 סל"ד. להעביר את supernatant למיקרוTube 1.5 מ"ל מזוהה אחר.
    3. לכמת את כמות החלבון המתקבל באמצעות שיטת ברדפורד. לטעון בין 10 ל 50 μg של חלבון מהתא מכמת lysate לכל באר של ג'ל פוליקרילאמיד הדרגתי 3-15% ולבצע SDS-PAGE.
    4. מעבירים את החלבון הטעון מהז'ל לממברנה PVDF של 0.22 μm באמצעות ציוד המערכת היבש למחצה. השתמש בפתרון העברה של 50 מ"מ Tris-HCl ו 192 mM גלצין. הגדר פרמטרים של ציוד בהתאם למספר הג'לים להעברה (1 עד 2 בכל פעם).
    5. לחסום אינטראקציות לא ספציפיות על קרום PVDF עם תמיסת חלב 3-5% חלב דל שומן במאגר TBS-T: Tris-Buffered תמיסת מלח (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM נתרן כלוריד) בתוספת 0.1% של Tween 20. שמרו על הממברנה תחת רעד מתמשך בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    6. יש לשטוף עם TBS-T תחת רעידות קבועות בעדינות במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים.
    7. דילו אלבומין ונוגדנים ראשיים vinculin ל 1:1000 ו 1:2000 בהתאמה על TBS-T. דגירה קרום עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס, תחת רעידות קבועות בעדינות.
      הערה: פעל תמיד לפי הוראות היצרן כדי לדלל נוגדנים.
    8. הסר את הנוגדן הראשי ושטוף את הממברנה 3 פעמים (שלב 6.7.6). דיללו את הנוגדן המשני IgG נגד עכברים ECL ל- 1:5000 ב-TBS-T. דגירה את הממברנה עם נוגדן משני תחת טלטול קבוע בעדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את הנוגדן המשני ושטוף את הממברנה (שלב 6.7.6). בצע זיהוי חלבונים באמצעות ECL המערבי Blotting סאבסט. לחשוף את הסרטים האוטודיוגרפיים במשך 30-30 דקות. בצע את זיהוי immunoblotting בטרישת 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבצע את בדיקות APAP PK ב 2-OC MPS, הצעד הראשון הוא לייצר את המעי האנושי וכבד שווה ערך (אורגנואידים). הם משולבים בהתקן מיקרו-נוזל 2-OC (איור 1A) 24 שעות לפני תחילת תוואי APAP PK. למחרת, המדיום משתנה, והמודל נחשף APAP. איור 1 ממחיש את המקבילות של המעי והכבד הממוקמות בתוך התקן 2-OC(איור 1B) וקורסהזמן לניסוי APAP PK(איור 1C). ביצענו תסיסה MTT, מדידות TEER, HCA, PCR בזמן אמת, כתמים מערביים, היסטולוגיה, ומיקרוסקופ פלואורסצנט confocal בתרבות 2D ו organoids 3D כדי לבדוק את הכדאיות של הרקמה ולזהות השפעות רעילות APAP אפשריות. בתמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות confocal, דגימות המקבילות מעיים מוכתמות DAPI ו Phalloidin (עבור גרעין וactin בהתאמה) הוצגו כמחסום רציף עבור לא מטופלים(איור 2A)ואת 12 μM APAP טיפל דגימות(איור 2B). כפי שניתן לראות בדמות 2C, כך עולה מ-MTT רמות קיימות יחסית של תאים מעל 70%, מה שמצביע על היעדר השפעות ציטוקוקסיות רלוונטיותבתגובהלחשיפה ל-APAP בריכוז 12 μM 33,34,35,36,37. השליטה החיובית (100 מ"ר) גרמה למוות משמעותי של תאים (הישרדות מתחת ל-5%). הכדאיות של Caco-2/HT-29 והבידול הנכון, כמו גם שלמות המחסום המקבילה למעי, אומתו על-ידי התפתחות TEERבמהלך תקופת הבידול (איור 2D). APAP לא גורם לשינוי בערכי TEER כפיצג באות 2E. הביטוי של טרנספורטרים גלוקוז המוזהרים נתרן פעיל SLC5A1, טרנספורטר התנגדות multidrug MDR1 ו נתרן-אשלגן ATPase נותחו, כדי לאמת את ההשפעה טיפול APAP על היווצרות מחסומי תאים ופונקציונליות בסיס. כפי שהוכח בדמות 2F-H, הן לא מטופלים והן APAP טופלו במעי שווה ערך הראו ביטוי דומה של SLC5A1 ו NaKATPase. ניהול אוראלי של 12 μM APAP המושרה סימן עלייה ברמות MDR1 mRNA במעיים מקבילים לאחר 24 שעות(איור 2H). ביצענו גם HCA של שינויים פנוטיפיקים תא על ידי תערובת צבע פלואורופור עבור גרעין ותוכן המוני מיטוכונדריאלי. פקדים חיוביים היו 100 mM APAP ו 1% NaOH.

בנוסף, ניתחנו אם 12 μM APAP יכול לגרום cytotoxicity 2D Caco-2/HT-29 שיתוף תרבות. תמונות תאי מעיים שנרכשו עם מיקרוסקופ פלואורסצנס המוצגים איור 2I מאשר את נתוני MTT, אשר הוכיחו כי 12 μM APAP לא לגרום cytotoxicity משמעותית ב Caco-2/HT-29 המקבילות מעיים.

ההערכה של הכדאיות ההפטית spheroids בסיס ואת cytotoxicity בתגובה 2 μM APAP נעשו על ידי MTT אסר וניתוחים מורפולוגיים על ידי מיקרוסקופית פלואורסצנטית confocal, היסטולוגיה H & E, ו HCA אסמאים. כפי המוצג ב איור 3A, Assay MTT לא הצליח לזהות כל cytotoxicity רלוונטי בתגובה לטיפול 2 μm APA בדגימות שנלקחו מהרכבת כבד 2-OC בתנאים סטטיים ודינמיים. הכדאיות בתא ירדה אך נותרה מעל 80% הן במשך 12 שעות והן 24 שעותזמן 33,34,35,36,37. טיפולי הבקרה החיוביים (100 mM APAP ו 1% NaOH) גרמו נזקי רקמות משמעותיים (קיימא מתחת 10%). תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מצביעות על היעדרו של מרכז נמק בספירואידים בכבד הן בתנאי טיפול בסיס או APAP, ואין עדות שיעורי מוות משמעותיים(איור 3B-C). עם זאת, כאשר ניתחנו שינויים פנוטיפיים תאיים מרובים בעקבות הרכב או 2 μM APAP הממשל ב 2D HepaRG / HHSteC coculture באמצעות חיבור HCA, באמצעות 100 mM APAP (C+) כשליטה חיובית, בניגוד לתוצאות של אסאי MTT, התאים hepatic הפגינו תגובות cytotoxic מוקדם לטיפול 2 μM APAP(איור 3D). לאחר 24 שעות, הייתה ירידה במספר התאים, באזור הגרעיני ועלייה במסה המיטוכונדריאלית. בנוסף, קוקטייל צבע פלואורופור המכיל Hoechst 33342 ו MitoTracker אדום עמוק שימש כדי להכתים את spheroids hepatic3D (איור 3J). תוכנת פיג'י שימשה להערכת הומוגניות ארכיטקטורה כדורית תלת-מיומת בין מספר כדוריות (איור 3E–I). הגרפיקה המוצגת באיון 3E מראה את הדמיון בין שטח סה"כ כדורי כבד. יחסהגובה-רוחב (איור 3F)בסביבות 1 פירושו היעדר הטיה במהלך תהליך הקונדיטוריה של הספירואידים. ההערכה גם הצביעה על כך שרוב הספירואידים היו מגולגלים בערך(איור 3G). ההערכה של היקף המורפולוגיה והתפלגות התא נעשתה על ידי מעגליות (איור 3I) ועל ידי חישוב מוצקות (איור 3H), בהתאמה. הגענו למסקנה כי המתודולוגיה כדי לתקנת כדורי הכבד יצר אורגנואידים עם היקף חלק, תואם עם צמיחה כדורית, אין הטיות, או נמק במהלך התהליך.

כפי שהוכח בדמות 4A-B, כדורי הכבד הראו רמה בסיסית גבוהה יחסית של אלבומין וביטוי mRNA GST בהתאמה, המציין פונקציונליות בסיסית נכונה. אף על פי כן, טיפול APAP 2 μM עבור 24 שעות גרם לירידה ברמות הביטוי mRNA GST, מציע פגיעה של כדורי כבד באופן פונקציונלי ב 24 שעות נקודת זמן של טיפול APAP.

הגילוי של CYP3A4 ו UGT1A1 mRNA רמות ביטוי מדגים את הקיבולת המטבולית שווה ערך לכבד. רמת בסיס mRNA CYP3A4 (איור 4C) היה עקבי עם דוחות קודמים6. הטיפול APAP גרם מגמה לירידה הן CYP3A4 mRNA ו UGT1A1 ביטוי בתגובה לטיפול APAP (איור 4C-D) שוב לאשש את ההשערה של פגיעה של כדורי כבד באופן פונקציונלי בנקודת זמן 24 שעות של טיפול APAP.

בנוסף, בוצעו ניסויים של כתמים מערביים ופעילות אנזימטית מבחנה על מנת לנתח את ביטוי חלבון אלבומין, כמו גם את פעילות CYP 3A4 במקביל לכבד בבזלי וב תנאי טיפול APAP. מצאנו כי טיפול APAP μM μM שבוצע בכבד 2-OC MPS, גרם לירידה בכבד שווה ערך ביטוי אלבומין ב 12 שעות ו 24 שעות בנקודות זמן הן סטטי(איור 4E) ודינמי(איור 4F)תנאים. מצד שני, דגימות מקבילות לכבד מתנאים דינמיים הפגינו מגמה להציג רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון של אלבומין בהשוואה לתנאים הסטטיים(איור 4G). CYP 3A4 במבחנה אסייג שבוצע המקבילות בכבד מ כבד 2-OC MPS הראה כי 2 μM טיפול APAP עבור 12 שעות או 24 שעות היה מסוגל לגרום לפגיעה חזקה ומשמעותית של פעילות CYP 3A4 בתנאים סטטייםודינמיים (איור 4H-I). מעניין יותר, הנוכחות של זרימת מדיה (דינמי) גרמה לשיפור משמעותי של רמות פעילות CYP 3A4 בהשוואה לתנאים שבהם המקבילות לכבד נשמרו בהיעדר מדיום במחזור (תנאים סטטיים) (איור 4J).

כדי למצוא את המצב האנליטי הרגיש ביותר בנוגע לניתוח HPLC, נחקרו מספר פרמטרים, כולל הרכב שלב הנייד, הסוג והריכוז של תוספים. נמצא כי אצטוניטריל נתן רזולוציית כרומטוגרמה טובה יותר וזמן שמירה מתאים מאשר מתנול. הפרדה מהירה וניתנית לשחזור של APAP הושגה באמצעות עמודה הפוכה C18. ערך זמן השמירה של APAP (Rt) היה 9.27 ± 0.19 דקות. הבחירה עבור APAP מסומן על ידי הצורה ואת הרזולוציה הסימטרית של השיא, כמו גם על ידי חוסר פסגות מפריעות מהתקשורת תרבות התא DMEM וויליאמס.

ריכוזים סטנדרטיים APAP בתקשורת תרבות התא DMEM S ו וויליאמס E S מדולל עם מאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v) החל 0.25 כדי 100.00 μM שימשו לבניית עקומות כיול. הליניאריות של השיטה נקבעה בתשע רמות ריכוז. הנתונים מוצגים בטבלה 2 ובטבלה 3. הקשר בין ריכוז APAP לבין אזורי השיא תואר על-ידי משוואות הרגרסיה ליניארית: y = 16106*x + 3579.8 (R2=1, ב DMEM בינוני) ו y = 16397 *x + 2475.1 (R2=1, במדיום וויליאמס), שבו "x" הוא ריכוז נומינלי APAP ב μM ו -"y" הוא אזור שיא כרומטוגרמה של APAP ב AU. בנקודה העליונה של הכימות (כלומר, 100.00 μM), סטיית האחוזים וערכי השונות בין-רצים היו נמוכים מ- 2.50%. הדיוק והדיוק עבור תשע רמות ריכוז, לא כולל 0.50 μM (LLOQ), היו בטווח מקובל עם ערכי DEV ו- C.V. פחות מ- 7.00%(טבלה 2 וטבלה 3).

השיטה האנליטית בין-ו-תוך-ריצה דיוק ודיוק, בארבעה ריכוזים שנבדקו, נפלה במסגרת הקריטריונים המקובלים עבור מחקרים ביואנליטיים. השכפול של השיטה הוערך על ידי ניתוח שכפולים של דגימות בקרת איכות APAP של 0.50 (LLOQ), 4.50, 45.00 ו- 90.00 μM. התוצאות הממוצעות של הפעלה פנים-הפעלה והווריצה מדווחות בטבלה 4. הדיוק והדיוק של ההסג מדגימים על-ידי ערכי DEV ≤ 15.00% ועל-ידי ערכי C.V. ≤ 7.00%, בהתאמה.

LOD נקבעה כדגימה שיחס האות לרעש (S/N) שלה היה גדול מ- 3 והתאים ל-APAP של 0.25 μM. מצד שני, LLOQ, מוערך עם 0.50 μM דגימות APAP, מוצג יחס S/N שווה 10. יתר על כן, מצאנו ערכי דיוק (DEV%) בטווח ≤ 19.00% מערך הריכוז הנומינלי. השונות בין-ובין-הפעלות הוצגה על-ידי C.V. ≤ 18.77%, כפי שמוצג בטבלה 2, בטבלה 3 ובטבלה 4)29,30.

ניתוחי APAP PK בוצעו בשלוש הרכבות MPS שונות של 2-OC: 1) מעיים 2-OC, המכילים את המקבילה למעי בלבד; 2) כבד 2-OC, המכיל את כדורי הכבד בלבד ו 3) מעיים / כבד 2-OC עם שני מחסום מעיים וspheroids הכבד.

עבור מחקרי ספיגה, המסלול אוראלי היה חיקה על ידי הממשל של 12 μM APAP בצד המקביל של המעי. ריכוזי APAP נמדדו על ידי HPLC/UV, בדגימות הבינוניות, שנאספו מצדדים מקבילים למעיים, הן בתנאים סטטיים והן בתנאים דינמיים. קינטיות APAP במדיום שנאסף מן הצדדים apical ו basolateral הוכיח כי מודל המעי היה מסוגל לספוג את APAP. הייתה ירידה הדרגתית בריכוז APAP בצד apical(איור 5A) במקביללעלייה בריכוז APAP בצד basolateralמעיים (איור 5B). הריכוזים המרביים (Cmax) במדיום היו סביב 2 μM עבור תנאים סטטיים ודינמיים, לאחר 12 שעות של הממשל (Tmax).

עבור מחקרי חילוף החומרים, הממשל תוך ורדי היה חיקה על ידי היישום של 2 μM APAP במדיום של תא הכבד. קינטיקה ריכוז APAP בתקשורת הן בתנאים סטטיים ודינמיים הצביע כי רק בתנאים הדינמיים ניתן לזהות את הירידה בריכוז APAP, להגיע 0.87 μM APAP 12 שעות לאחר 2 μM APAP ניהול (T1/2 = 12 שעות). המקבילות לכבד הראו יעילות חילוף חומרים מינימלית בתנאים סטטיים(איור 5C). ריכוז APAP הגיע 1.7 μM 12 שעות לאחר ניהול APAP. משולב, מערכתי כמו ספיגת APAP והערכת חילוף החומרים בוצעה במודל המעי / כבד 2-OC. APAP היה מנוהל על הצד apical של המקבילה המעי, לחקות את המסלול אוראלי. דגימות בינוניות נאספו משני צידי המעי וגם מתא הכבד. איור 5D מראה את הריקבון המתקדם של ריכוז APAP בצד האפאלי הן בתנאים סטטיים והן בתנאים דינמיים.

איור 5E מציג שלבי ספיגה וחילוף חומרים ייחודיים. הזרימה השפיעה גם בספיגת המעיים. APAP Cmax במדיום השתנה מ 2 μM על "המעי 2-OC"(איור 5B)הרכבה 1.7 μM עבור דינמי "מעיים / כבד 2-OC" (איור 5E). איור 5F מציג השוואה ישירה בין פרופיל הריכוז-זמן של APAP במערכת המיקרופיזיולוגית הדינמית שלנו "מעיים/כבד 2-OC" (עקומה אדומה וציר y) לבין פרופיל מייצג שהושג בבני אדם לאחר מנה אוראלית אחת של 1000 מ"ג (עקומה שחורה וציר y).

Figure 1
איור 1: אוסף צעד סכמטי עבור מחקרי PK ב MPS 2-OC. A) ציור סכמטי של MPS 2-OC, מראה את המעיים ואת הרקמות האנושיות המקבילות בתצוגה מלמטה למעלה. ב)תצלום MPS 2-OC עם מקבילות מעיים וכבד משולבים במכשיר בתצוגה מלמטה למעלה, עם תמונות מיקרוסקופיה אופטיות מייצגות. C) ציר הזמן של הכנת רקמות שוות ערך, טיפול APAP, ותרבות אוספים בינוניים שלבים לייצור אורגנואידים, והערכות פרמקוקינטיות וטוקסיקולוגיות. נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: יכולת קיום והערכה טוקסיקולוגית של המקבילות במעי. A) תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות מייצגות של תאי Caco-2/HT-29 לא מטופלים המוכתמים בגרעין התאים וצבע פלואורסצנטי של חוטי אקטין (DAPI ופאלודין בהתאמה); הגדלה של 63x, זום 2.6. ב)נציג confocal מיקרוסקופיה תמונות של Caco-2/HT-29 תאים שטופלו עם 12 μM APAP עבור 24 שעות, מוכתם בגרעין וצבע פלואורסצנטי actin (DAPI ופאלודין בהתאמה); הגדלה של 63x, זום 2.6. C) המעי שווה ערך להערכת הכדאיות על-ידי אסייג MTT הן בתנאים סטטיים והן בתנאים דינמיים. הערכים המיוצגים על-ידי מייצגי הזמן בגרף מחושבים באחוזים ביחס לבקרת כלי רכב (נקודת זמן בשם כ- 0)*P<0.05 0 לעומת טיפול. D) אבולוציית TEER במהלך 21 הימים של בידול. *P<0.05 יום 1 לעומת ימים אחרים. E) ערכי TEER לאחר ניהול APAP לתוך המעי 2-OC MPS בתנאים דינמיים. ביטוי גנים במעיים מקבילים. פוטנציאל הספיגה של מחסום המעי והשפעות אפשריות של 12 μM APAP עבור 24 שעות במצב דינמי אומת על ידי SLC5A1 (F), Na-K-ATPase (G) ו- MDR1 (H) ביטוי. ערכים מייצגים את ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. התוצאה באה לידי ביטוי כיחס למשק בית GAPDH. *P<0.05 רכב לעומת APAP. I) Operetta תמונה מבוססת HCA שבוצע על ידי קולומבוס® 2.4.0. תוכנה. תמונות מייצגות של תרבות מעי דו-מיו בנקודות זמן שונות לאחר טיפול APAP μM 12. פקדים שליליים היו בינוניים (0 ש') או רכב (0.5% אתנול). פקדים חיוביים המוצגים כאן הוא APAP 100 mM. נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: יכולת וכדאיות והערכה טוקסיקולוגית של המקבילות לכבד. A) כבד שווה ערך הערכת הכדאיות על ידי MTT assay הן בתנאים סטטיים ודינמיים. הערכים המיוצגים על-ידי מייצגי הזמן בגרף מחושבים באחוזים ביחס לבקרת כלי רכב (נקודת זמן בשם כ- 0) *P<0.05 0 לעומת טיפול. ב)נציגים תמונות קונפוקליות שצולמו מהרכב ו 2 μM APAP 24 h טיפלו כדורי כבד מסעיף פנימי. C) נציגי H & E (המטוקסילין וכתמים אאוסין) תמונות שצולמו מהרכב ו 2 μM APAP 24 h טיפלו כדורי כבד מסעיף פנימי. סרגל קנה מידה = 50 μm. D) תמונות מייצגות של 2D כבד שיתוף תרבות בנקודות זמן שונות לאחר 2 μM טיפול APAP. דגימות שטופלו ברכב עם 2 μM APAP נחשבו בניתוחים אלה. תערובת צבע פלואורופור כוללת Hoechst עבור כתמים גרעיניים מיטוטראק אדום עמוק עבור כתמים מסה מיטוכונדריה. פקדים שליליים היו בינוניים (0 ש') או רכב (0.5% אתנול). פקדים חיוביים היו 100 mM APAP. מדידות של תמונות שלם שנתפסו בוצעו באמצעות תוכנת פיג'י. E) הפצות תדירות של אזור F) יחס גובה-רוחב, G) מעוגלות, H) מוצקות, I) מעגליות. N = 85. *p < 0,05. J) תמונות מייצגות של כדורי כבד תלת-מיוד שנרכשו על ידי האופרטה באמצעות המטרה LWD 10x. נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: יכולת קתיות/פונקציונליות בכבד והשפעות אפשריות של 2 μM APAP בתנאים סטטיים ודינמיים מעליו אומתו על ידי ביטוי גנים וחלבון ועל ידי פעילות אנזימטית. A) ביטוי גנים אלבומין. ב)ביטוי גנים GSTA2. יכולת הכבד לבצע את חילוף החומרים שלב I ושלב II והשפעות אפשריות של 2 μM APAP עבור 24 שעות במצב דינמי על זה אומתו על ידי ביטוי גנים של CYP3A4 (C) ועל ידי UGT1A1 (D) בהתאמה. E) סה"כ ביטוי חלבון אלבומין במצב סטטי. F) ביטוי חלבון אלבומין כולל בתנאים דינמיים. תנאי. G) גרף השוואתי הממחיש את ההבדל בביטוי הכולל של אלבומין בשווה ערך לכבד מעובד ומטופל בתנאים סטטיים או דינמיים. H) CYP 3A4 בפעילות אנזימית במבחנה בתנאים סטטיים. I) CYP 3A4 בפעילות אנזימית במבחנה בתנאים דינמיים. J) גרף השוואתי הממחיש את ההבדל בפעילות CYP 3A4 בשווה ערך לכבד מעובד ומטופל בתנאים סטטיים או דינמיים. ערכים מייצגים את ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. הנתונים של ביטוי גנים באים לידי ביטוי כיחס למשק בית GAPDH. הנתונים של ביטוי חלבון מתבטאים כייחס לחלבון vinculin. *P<0.05 רכב לעומת טיפול APAP. נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ניתוחים של פרמקוקינטיקה APAP ב 2-OC MPS. פרופיל ספיגת APAP לאחר ניהול APAP 12 μM בצד apical של המעי 2-OC MPS הכנה. מחסום המעיים היה עשוי coculture של קווי תאים Caco-2/HT-29(A)ריכוזי APAP סטטי ודינמי במדיום מהצד apical (המייצג את הצד האנושי לומן מעיים). (ב)ריכוזי APAP סטטיים ודינמיים במדיום מהצד הבאסולטרי (המייצג את צד מחזור הדם של המעי האנושי). *P<0.05 תנאים סטטיים לעומת תנאים דינמיים. C) פרופיל חילוף החומרים APAP בכבד 2-OC MPS על ידי ספרואידים כבד HepaRG / HHSTeC. השוואה של תנאים סטטיים ודינמיים לאחר ניהול APAP 2 μM לתוך המדיום. *P<0.05 0h לעומת 6 שעות, 12 שעות, ו 24 שעות טיפול APAP. APAP ספיגה ופרופיל חילוף החומרים לאחר ניהול 12 μM בצד apical מחסום מעיים של המעי / כבד 2-OC MPS הכנה. זה מחקות את המסלול בעל פה. מחסום המעיים היה עשוי קווי תאים Caco-2/HT-29 ואת המקבילה הכבד עשוי spheroids של קווי תא HepaRG / HHSTeC. (D)מעיים / כבד 2-OC APAP ריכוזים בצד apical של מחסום המעיים בתנאים סטטיים ודינמיים. (ה)מעיים / כבד 2-OC APAP ריכוזים במדיום בתנאים סטטיים ודינמיים. *P<0.05 תנאים סטטיים לעומת תנאים דינמיים. (F)השוואה בין פרופיל הריכוז-זמן של APAP במערכת המיקרופיזיולוגית שלנו (עקומה אדומה וציר y) לבין פרופיל מייצג שהושג בבני אדם לאחר מנה אוראלית אחת של 1000 מ"ג (עקומה שחורה וציר y). הנתונים חולצו מתווה באמצעות WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

מערכת HPLC Waters Alliance 2695 (מילפורד, MA, ארה"ב), מצוידת במשאבה קוויטרנרית, מנהלת מדגם ודגה
גלאי ווטרס 2996 Uv-Vis להגדיר בטווח 210-400 נה"מ
בקרת מערכת, רכישת נתונים ועיבוד ווטרס מעצימה את תוכנת הכרומטוגרפיה 2002
עמודה לונה C18 הפוכה
(150 x 4.6 מ"מ מזהה; גודל חלקיקים של 5 מ"מ)
תופעה (תופעה)
עמודת שמירה לונה C18 הפוכה (4 x 3 מ"מ)
תופעה (תופעה)
שלב נייד ממס A- אצטוניטריל
ממס B- 0.10 M אמוניום אצטט, pH 6.8
תנאים Isocratic זמן A (%) B (%)
(דקות) מה אתה עושה?
15 5 95
זרימת 1.0 מ"ל/דקה
נפח הזרקה 25 μL
טמפרטורה 25°C
זיהוי APAP UV @ 243 ו- 254 נה"מ
זמן ריצה 15 דקות

טבלה 1: תנאים ופרמטרים לשימוש עבור ניתוחי HPLC-UV של APAP בתרבות מטריצות בינוניות.

ריכוז נומינלי ריכוז APAP מחושב (μM) ממוצע (μM) S.D.B. סי-וי . Dev
אני לא יודע מה לעשות. (שלושה אנשים של כל ריכוז) אני לא יודע מה לעשות. (%) (%)
מספר תס"א 1 2 3 4 5 6
0.25 (לוד) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46.05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6.65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 0.09.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 0.03.03
ארטו 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

טבלה 2: וריאציה בין-ריצה - דיוק, דיוק וליניאריות של דגימות עקומה סטנדרטיות שהוכנו בתערובת של DMEM בינוני עם מאגר אצטט אמוניום 0.10 M (1:1, v/v) משש תמורות נפרדות. a
a עקומה ליניארית הותאם לנתונים לתגובה(APAP)לעומת ריכוז תיאורטי כמתואר בניסיוני. הריכוז המחושב נגזר מקריאת התגובה עבור כל דגימה סטנדרטית כנגד עקומת הכיול. כל ערך (1-6) תואם לערך הממוצע של ניתוח שלושה רישיות.
ב. SD = סטיית תקן.
ג C.V. (מקדם של וריאציה.
אני לא יודע אם אני דיוק (DEV %) = סטיית הריכוז המחושב מהערך הנומינלי.
נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019).

ריכוז נומינלי ריכוז APAP מחושב (μM) ממוצע S.D.B. סי-וי . Dev
אני לא יודע מה לעשות. (שלושה אנשים של כל ריכוז) אני לא יודע מה לעשות. אני לא יודע מה לעשות. (%) (%)
מספר תס"א 1 2 3 4 5
0.25 (לוד) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 26.03 .19:03-
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 14.97 איי םווה םיונו
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 100.000 ₪
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1.56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 0.01 .000 ₪
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 0.05 05 00:
ארטו 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

טבלה 3: וריאציה בין-ריצה - דיוק, דיוק וליניאריות של דגימות עקומה סטנדרטיות שהוכנו בתערובת של וויליאמס בינוני עם מאגר אצטט אמוניום 0.10 M (1:1, v/v) משש פעמים נפרדות. a
a עקומה ליניארית הותאם לנתונים לתגובה(APAP)לעומת ריכוז תיאורטי כמתואר בניסיוני. הריכוז המחושב נגזר מקריאת התגובה עבור כל מדגם סטנדרטי כנגד עקומת כיול. כל ערך (1-5) תואם לערך הממוצע של ניתוח שלושה רישיות.
ב. SD = סטיית תקן.
ג C.V. (מקדם של וריאציה.
אני לא יודע אם אני דיוק (DEV %) = סטיית הריכוז המחושב מהערך הנומינלי.
נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019).

ויליאמס מדיום ריכוז נומינלי ריכוז נמדד S.D. סי-וי . Dev
אני לא יודע מה לעשות. אני לא יודע מה לעשות. אני לא יודע מה לעשות. (%) (%)
הפעלה אינטרה-הפעלה (n = 3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 1.77 00:00:00,000 -
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 08.37 00:00:00,000
90.00 82.29 1.75 2.13 08.57 00:00:00,000
הפעלה בין-הפעלה (n= 15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 14.97 איי םווה םיונו
4.50 4.37 0.19 4.42 100:00:00 --& 12:0
45.00 42.35 0.82 1.93 100.000 ₪
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
DMEM בינוני ריכוז נומינלי ריכוז נמדד S.D. סי-וי . Dev
אני לא יודע מה לעשות. אני לא יודע מה לעשות. אני לא יודע מה לעשות. (%) (%)
הפעלה אינטרה-הפעלה (n = 3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 100.000 ₪
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1.69
90.00 86.40 4.09 4.73 04.00 00 00:00 :00:
הפעלה בין-הפעלה (n= 12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 100.000 ₪
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

טבלה 4: דיוק ודיוק פנים-הפעלה בין-הפעל עבור APAP בדגימות בקרת איכות. a
a הנתונים מוצגים כמוצעים. SD (סטיית תקן). C.V. (מקדם של וריאציה. דיוק) ודיוק (סטיית אחוזים. DEV)..
נתון זה שונה מ-Marin ואח '. ספיגת פרצטמול וחילוף חומרים במערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד. כימיה ביול אינטראקציה. 299, 59-76 (2019).

פריימר (1.→ 3')
רקמות ג'ין קדימה הפוך
המעי SGLT1/SLC5A1 ג'י.פי.סי.אי.ג'י אני לא יודע אם אני יכול לעשות את זה, אבל אני יכול לעשות את זה.
נא-קיי-א-א ליאור הירש אני לא יודע מה לעשות.
MDR1 (1) ג'אגהTTTTTCCGGTTGG מיקום מעולה, 1000 דולר, 100 דולר, 000 דולר, 000 דולר, 000 00:00:00,000
הכבד אלבומין (אלבומין) מלונות ב- ב-2018, ה ת.ג.ב. אגגטקטאק
ג'יתא 2 אני לא יודע מה זה אומר. אגגאגאגאטאג
ת/2018 לא, ת.א.ק.ט.ק.ט.ק.
UGT1A1 אני לא יודע אם אני יכול לעשות את זה, אבל אני יכול לעשות את זה ג'י.טי.ג'י.טי.ג'י.

טבלה 5: פריימרים qPCR בזמן אמת כדי להעריך שעתוק גנים ברמת mRNA בתרביות 2-OC עבור המעי ורקמות הכבד

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההערכה המדויקת והאמינה של המאפיינים הפרמקולוגיים של תרופות חדשות חוקרות היא קריטית להפחתת הסיכון בשלבי הפיתוח הבאים. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית, שמטרתה לשפר את הכוח החזוי ולהפחית את העלויות והזמן בילה עם בדיקות פרה-קלינליות. הקבוצה שלנו מתקדמת בהערכת תכונות פרמקוקינטיות וטוקסיקולוגיות הדרושות בעיקר לאופטימיזציה עופרת. עבדנו עם המכשיר המיקרו-נוזל 2-OC, שיש לו שני תאים, המאפשר שילוב של שני אורגנואידים. APAP נבחר כי יש לו שפע של נתונים אנושיים באיכות גבוהה, הוא בעיקר מטבוליזם על ידי הכבד, וגם מציג תכונות hepatotoxic. פרוטוקול המחקר נועד לחקות כמה צעדים של הניסוי הקליני שלב אדם שלב I, שבו תרופה ניתנת דרך הפה למתנדבים, דגימות דם תקופתיות נמשכים כדי להעריך את הריכוז של התרופות לדעת את המאפיינים פרמקוקינים ופרמטרים ביוכימיים וקליניים נאספים כדי להעריך את הבטיחות וסבליות. לכן, כאשר MPS מתפתח מספיק כדי לספק תחזיות אמינות, זה יפחית באופן משמעותי את הסיכון של כישלון בשלב אני משפט. על ידי הוספת מודלים המחלה בעתיד, אותה הנחה עשויה לחול על השלבים II ו- III ניסויים קליניים.

כל המחקרים בוצעו בשלושה מודלים: מעיים 2-OC (ניהול אוראלי APAP), כבד 2-OC (ניהול תוך ורדי), מעיים / כבד 2-OC (ניהול אוראלי). המודל הראשון בודד את הספיגה, השני חילוף החומרים, והשלישי שילב את שניהם. ייצרנו לראשונה את האורגניואידים ושילבנו במכשיר המיקרו-נוזלים, השני ניהל את ה-APAP ואספנו את דגימות המדיה, וביצענו לאחרונה סט של בדיקות כדי להעריך את הכדאיות והפונקציונליות של התא ואת ההשפעה הרעילה של חשיפה ל-APAP. עבור מחקרים פרמקוקנטיים, פיתחנו ואימתנו שיטה כרומטוגרפית לכמת APAP במדיום. האימות תואם לקו המנחה על אימות שיטה ביואנליטית לגבי ספציפיות, ליניאריות, מגבלת הכימות (LOQ), מגבלת הזיהוי (LOD), אפקט מטריצה, דיוק ודיוק, כפי שתואר על-ידי ה-FDA29,30. ה הספציפיות הוקמה עם דגימות ביולוגיות ריקות, מנופחות ופרטיות משני מקורות שונים. השיטה בוצעה באופן מקובל במהלך הניתוח, והנתונים אישרו את היכולת של שלב נייד איזוקרטי פשוט להפריד ול לכמת APAP.

הכדאיות / פונקציונלי של המעי והכבד organoids הוערך על ידי טכניקות שונות. עבור המקבילה במעי, מיקרוסקופית הפלואורסצנה הנוקודלית(איור 2A-B),תסרוקת MTT (איור 2C), הערכת ביטויגנים (איור 2D-F)או ניסוי HCA, לא זיהתה רעילות 24 שעות לאחר חשיפה לAPAP. כמו כן, MTT assay לא זיהה עלבונות רעילים המושרה על ידי APAP בשווה ערך לכבד(איור 3A). עם זאת, טכניקת HCA הוסיפה את האפשרות של זיהוי של אירועים רעילים מוקדמים מאוד (24 שעות לאחר חשיפה APAP) עבור תאי כבד, על ידי תצפית של שינויים פנוטיפים תא, עם כמה רמזים מכניים(איור 3D). מצד שני, מיקרוסקופית הפלואורסצנט הנוקודלית (איור 3B) וההסטולוגיה(איור 3C)הראו כלי משלים שימושי בחקירת מצב הכדאיות של המקבילות של הרקמה האנושית. עבור תאי הכבד, השימוש בו זמנית בטכניקות שונות היה יתרון מאוד. תסיסת MTT, כפי שהוזכר קודם לכן, לא הצליחה לזהות את ה-APAP cytotoxicity שזוהה על ידי HCA 24 שעות לאחר חשיפה APAP. ניתוחי ביטוי הגן העריכו את הפונקציונליות של המעי (איור 2D-F) ו אורגנואידים בכבד (איור 4A-D) הן בסיס ו 24 שעות לאחר טיפול APAP. בתנאים בסיסיים, היו רמות נורמליות של סמנים ספציפיים למעיים ולכבד, מה שמצביע על פונקציונליות נכונה. לאחר 24 שעות של חשיפה APAP, הייתה רגולציה של אלבומין, רמות mRNA GST, ונטייה להפחית את ביטוי הגן CYP3A4 ברקמות שוות ערך לכבד, המציין cytotoxicity מוקדם APAP. אימות ממצאים אלה, ניסויי ההתנפחות המערביים הראו כי הירידה בביטוי הגנים לוותה גם בירידה חזקה בביטוי חלבון אלבומין כולל בכבד בתגובה לטיפול APAP(איור 4E-F),המאשר את העלבונות הרעלים שהוטלו על רקמת הכבד על ידי חשיפה ל-APAP. בהתאם לכך, ניסויים של פעילות אנזימית במבחנה הראו הפחתה חזקה ומתקדמת ברמות פעילות CYP 3A4 המושרה על ידי טיפול APAP, בשווה ערך לכבד(איור 4H-I).

סטטיסטיקה מורפומטרית של אורגנואידים בוצעו על תמונה J(איור 3E-I). האזור חושף עד כמה הגודל הדו-מיו-די קרוב לכל האורבנואידים שנותחו, אשר יכולים לשמש כסטנדרטיליזציה בפרוטוקול זה, כך שניתן יהיה לייצר תוצאה לא משוחדת. 'מתארי הצורה' חושפים סטטיסטיקות התואמות בדיוק למורפולוגיה של הצורה. יחס הגובה-רוחב הוא מדד המשתמש בציר הראשי והמינורי, כך שהתוצאות סביב 1 מצביעות על הטיה (כלומר, צמיחה מועדף) במהלך היווצרות אורגנואיד. ערכי העגולות (4 ×[אזור]/ (π × [ציר ראשי]2))רגישים מאוד לצמיחה מועדף, אשר יתגלה כצור מרכזי. מוצקות ([אזור]/ ([אזור קמור])) חיונית בהצגת מורפולוגיה גולמית מכיוון שהיא אינה מושפעת מחריגות בגבולות מאחר שהיא משתמשת באזור קמור (=מעטפה). התפלגויות המיורכזות סביב 1.0 מצביעות על צמיחה כדורית putative. לעומת זאת, מעגליות (4× π [שטח]/[היקף]2)רגישה מאוד להיקף מורכב, כך ש"חללים" או "כיסים" ישפיעו על מדד זה. לכן, מעגליות סביב 1 גם מאשרת צמיחה כדורית putative, תואם עם פונקציונליות אורגנואיד נכונה.

התוצאות האנליטיות הראו כי MPS יכול לחקות את תכונות ספיגת APAP וחילוף חומרים, הן מבודד או משולב בעקומה דומה לזה המיוצר vivo (איור 5F) ללא שלב ההפרשה. ספיגת APAP הייתה דומה לאחר ניהול בעל פה הן MPS מעיים או מעיים / כבד MPS מודלים, בתנאים סטטייםודינמיים (איור 5A-B, איור 5D-E). בשניהם, היה ריכוז APAP יורד בצד apical במקביל לעלייה שלה בצד basolateral, ללא הבדל משמעותי עבור תנאים סטטיים ודינמיים. לעומת זאת, חילוף החומרים של הפטי APAP שונה בתנאים אלה. התקשורת במחזור MPS נראה לשפר את יכולת חילוף החומרים organoid (איור 5C ו איור 5E). הייתה תנוון משמעותי של תפוררות APAP שלא נראתה ללא זרימה. מעניין, במבחנה, CYP3A4 ניסויי פעילות לאשש את ההשערה כי הנוכחות של זרימה במערכת מגבירה את הפונקציונליות של שווה ערך לכבד אנושי. כפי שהראה בגרף בדמות 4J, הפעילות של CYP 3A4 היה גבוה באופן משמעותי בשווה ערך לכבד נשמר תחת זרימה הן בתנאי טיפול בסיס וAPAP. כמו כן, המקבילות בכבד נשמרו תחת זרימה (דינמי) הראו נטייה להגדיל את ביטוי החלבון של אלבומין בהשוואה לאלה ששמורים ללא זרימה (סטטי) הן בבסיס או בתנאים שטופלו APAP(איור 4G).

בהשוואה לפרופיל זמן הריכוז לאחר ניהול אוראלי של APAP לבני אדם, המערכת המיקרופיזיולוגית שלנו מראה הרבה יותר גדול t1/2 (זמן מחצית החיים) (איור 5F). זה קורה, כפי שהוזכר קודם לכן, כי בעוד יש לנו מערכת שני איברים עם מעי וכבד שווה ערך שיכול לספוג ולעכל את התרופה, אין שווה ערך לכליות כדי להפרש APAP ואת חילוף החומרים שלהמתא הפלזמה 38. בנוסף לכך, המערכת המיקרופיזיולוגית מראה Cmax קטן יותר (ריכוז פלזמה שיא) ו tmax גדול יותר (זמן להגיע Cmax) ממה שנצפה בדרך כלל עבור בניאדם (איור 5F). זוהי תוצאה של ההבדלים בקנה המידה של המבחנה ובניסויים vivo. בסך הכל, ישנם שלושה הבדלים עיקריים בין פרופיל זמן הריכוז שהושג באמצעות המערכת המיקרופיזיולוגית ופרופילים שהושגו לאחר ניהול אוראלי של APAP לבני אדם: tגדול יותר 1/2, קטן יותר Cמקסימום ו tmax גדול יותר(איור 5F). בעוד tגדול יותר 1/2 הוא בשל היעדר כליה שווה ערך כדי להפרש APAP ואת חילוף החומרים שלה מן המקבילה פלזמה, קטן יותר Cמקסימום וגדול tמקסימום הם ההשלכות של קנה המידה הקטן של הניסוי בהשוואה לגוף האדם. אסטרטגיות קנה המידה הטובות ביותר לבנייה והפעלה של מערכות מיקרופיזיולוגיות הן עדיין תחום מחקר פעיל ולא סביר שגישה אחת היא אופטימלית עבור כל מערכות39. בנוסף, מידול מתמטי או למידת מכונה יכול לשמש כדי להחיל תיקונים או ללמוד את המיפוי בקנה מידה מיקרו בקנה מידה מלא על מנת לשער בנתונים מבחנה שהושגו עם מערכות מיקרופיזיולוגיות להתנהגות vivo שנצפתה בבניאדם 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר כריסטי Guguen-Guillouzo, ד"ר פיליפ גריפון ביחידה 522 INSERM וד"ר כריסטיאן Trepo ביחידה 271 INSERM לשימוש בחומר הביולוגי (Hepa RG תאים) ועל הפיכתו לאחר מכן זמין עבורנו על מנת לבצע את המחקר האקדמי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

כימיה גיליון 166 מערכת מיקרופיזיולוגית פרצטמול ADMETox אורגנואידים
מערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד להערכת תרופות פרמקוקנטיות וטוקסיקולוגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter