Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Микрофизиологическая система кишечника/печени для фармакокинетической и токсикологической оценки лекарственных препаратов

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Мы подвергли воздействию микрофизиологическую систему (MPS) с органоидами кишечника и печени на ацетаминофен (APAP). В данной статье описаны методы производства органоидов и оценки фармакокинетической и токсикологической собственности АПАП в MPS. В нем также описаны анализы функциональности тканей, необходимые для проверки результатов.

Abstract

Недавно введенные микрофизиологические системы (MPS), культивирующие человеческие органоиды, как ожидается, будут работать лучше, чем животные, на доклинологической фазе испытаний процесса разработки наркотиков, поскольку они генетически являются человеческими и подыгрывать взаимодействию между тканями. В этом исследовании, кишечный барьер человека (эмулируется совместно культуры Caco-2 и HT-29 клеток) и печени эквивалент (эмулируется сфероидов из дифференцированных клеток гепаРГ и человеческих печеночной стеллат клетки) были интегрированы в двухорганический чип (2-OC) микрофлюидное устройство для оценки некоторых ацетаминофен (APAP) фармакокинетических (APAP) MPS было три сборки: кишечник только 2-OC, печень только 2-OC, и кишечник / liver 2-OC с теми же средствами, perfusing обоих органоидов. Для оценок ПК, мы dosed APAP в средствах массовой информации на заданных времени после введения его либо над кишечным барьером (эмуляция устного маршрута) или в средствах массовой информации (эмуляция внутривенного маршрута), на 12 МКМ и 2 МКМ соответственно. Образцы средств массовой информации были проанализированы с помощью жидкой хроматографии высокого давления (HPLC). Органоиды анализировались на экспрессию генов, значения TEER, экспрессию и активность белка, а затем собирали, чинить и подались на набор морфологических оценок. Техника MTT хорошо справились с оценкой жизнеспособности органоидов, но анализы высокого содержания (HCA) смогли обнаружить очень ранние токсичные события в ответ на лечение APAP. Мы проверили, что поток мультимедиа не влияет на поглощение APAP, в то время как он значительно улучшает функциональность эквивалента печени. APAP поглощения кишечника человека и печеночным метаболизмом может быть подражания в MPS. Связь между данными MPS и силико-моделированием имеет большой потенциал для повышения предсказуемости методов in vitro и обеспечения лучшей точности, чем модели животных в фармакокинетических и токсикологических исследованиях.

Introduction

Из-за геномных и протеомных различий модели животных имеют ограниченную прогностический значение для нескольких исходов человека. Кроме того, они относят много времени, дорогие и этическисомнительные 1. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностический мощности и сократить расходы и время, проведенное с доклинических испытаний. Это микрофлюидные устройства, культивирующие органоиды (искусственные миметические функциональные единицы органов) под потоком мультимедиа, который способствует органоидно-органоидной коммуникации. Органоиды из клеток человека увеличивают транстулятнуюактуальность 2,3,4. MPS, как ожидается, будет работать лучше, чем тесты на животных, потому что они генетически человека и повторить взаимодействие между тканями. При полной функциональности, MPS обеспечит более значимые результаты, на более высокой скорости и более низкие затраты ириски 4. Многие группы разрабатывают MPS для нескольких целей, особенно модели заболеваний для проверки эффективности препарата.

Уровень воздействия является одним из наиболее важных параметров для оценки эффективностии токсичности препарата 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS позволяет органоидной интеграции, которая эмулирует системное воздействие и, как ожидается, будет работать лучше, чем традиционные 2D культуры тканей человека. Эта технология может значительно улучшить прогнозирование поглощения соединения кишечника и метаболизма печени4.

MPS интеграции человеческой эквивалентной модели кишечника и печени является хорошей отправной точкой, учитывая центральную роль этих двух органов в биодоступности наркотикови системного воздействия 13,14,15. APAP является привлекательным препаратом для изучения MPS без эквивалента почек, потому что его метаболизация делается восновном печенью 16,17.

2-OC представляет собой двухкамерное микрофлюидное устройство, подходящее для культуры двух различных человеческих эквивалентных тканей/органоидов, взаимосвязанных микроканалами16. Для того, чтобы подражать in vitro человека устные / внутривенное введение препарата и оценить влияние перекрестного разговора между кишечником и печенью эквиваленты на APAP фармакокинетики, помимо функциональности и жизнеспособности органоидов, были выполнены три различных сборки MPS: (1) "Intestine 2-OC MPS", состоящий из эквивалента кишечника, основанного на культурной вставке, содержащей кокультуру клеток Caco-2 и HT-29, интегрированную в устройство 2-OC; (2) "Liver 2-OC MPS", состоящий из сфероидов печени, сделанных из HepaRG и HHSteC (Человеческие печеночные клетки Stellate), интегрированные в устройство 2-OC; и (3) "Intestine/Liver 2-OC MPS", состоящий из эквивалента кишечника в одном отсеке устройства, общаясь с эквивалентом печени в другом потоком средств массовой информации через микрофлюидные каналы.

Все анализы проводились в статических (без потока) и динамических (с потоком) условиях из-за воздействия механических стимулов (сжатие, растяжение и стрижка) на жизнеспособность клеткии функциональные возможности 18,19,20. В настоящей статье описывается протокол для APAP устной / внутривенной эмуляции введения и соответствующих абсорбции / метаболизма и токсикологических анализов в 2-OC MPS, содержащих кишечника человека и печени эквивалентных моделей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Производство тканевых эквивалентов для выращивания в 2-OC

  1. Производство эквивалента тонкого кишечника
    1. Поддерживайте клетки Caco-2 и HT-29 с использованием эквивалентной кишечника среды: DMEM дополнен 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина, и 1% несущественных аминокислот, который называется "DMEM S" в этой рукописи.
    2. Удалите среду, мыть дважды с 1x DPBS и добавить 8 мл 0,25% трипсина / ЭДТА, чтобы отмежеваться Caco-2 клеток, выращенных в колбах клеточной культуры (175 см2). Инкубировать в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию и остановить реакцию, добавив по крайней мере двойной объем ингибитора трипсина. Выполните ту же процедуру для клеток HT-29, регулируя объемы реагентов, так как меньшее количество этих клеток необходимо, и они поддерживаются в небольших колбах (75см 2).
    3. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин, удалить супернатант из обеих трубок, и повторное использование клеточных гранул в 10 мл DMEM S. Граф клеток, обеспечивая жизнеспособность клеток выше 80%. Асептически интегрировать клеточной культуры вставки в 24-хорошо пластины ранее заполнены 400 йл DMEM S на хорошо в базолатеральной стороне (которая представляет собой человеческий кровоток).
    4. Совместно культивировать како-2 и HT-29 клетки в соотношении 9:121. Используйте 2.25 x 105 Caco-2 и 2.5 x 104 HT-29 клеток к каждому эквиваленту кишечника в окончательном объеме 200 МКЛ DMEM S. Отрегулируйте количество клеток и объем в соответствии с желаемым количеством органоидов. Тщательно перемешать.
    5. Pipette 200 МКЛ клеточного раствора в апикалической стороне каждой вставки (которая представляет человека кишечной люмен стороны), посев 250000 клеток на вставку. Совместно культивировать клетки в вставки в течение трех недель22. Изменение среды по крайней мере три раза в неделю, аспирации его как с апической и базолатеральной стороны с стерильной пипетки Пастер, заботясь, чтобы не повредить нетронутыми барьер клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжить с устремлением на апической стороне, чтобы не коснуться клеточного барьера (аспират, поддерживая пастер пипетку на пластиковом ободе клетки вставки).
    6. Проверьте плотное образование монослой, измеряя TEER (трансепителиальное электрическое сопротивление) каждые три дня спомощью вольтметра 23,в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Выполните пустой, измерения сопротивления через клеточной культуры вставить без клеток, но с той же среде клеток и на той же пластине клетки.
      2. Рассчитайте устойчивость тканей, вычитая пустую устойчивость из ткани эквивалентной устойчивости, и умножить на эффективную площадь поверхности фильтровальной мембраны (0,6см 2). Хорошая устойчивость к барьеру кишечника находится в диапазоне от 150 до 400 Ω см2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После 21 дней клетки должны быть полностью дифференцированы и кишечный барьер формируется, так что кишечник эквиваленты готовы быть интегрированы в MPS.
  2. Производство эквивалентов печени
    1. Поддерживайте клетки HepaRG с использованием среды эквивалента печени, которая является средней E Уильяма дополнены 10% плода бычьей сыворотки, 2 мМ Л-глутамин, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицин, 5 мкг / мл человеческого инсулина и 5 х 10-5 М гидрокортизон, и называется "Williams E S" в этой рукописи. Возобновление HepaRG средств массовой информации каждые 2-3 дней и поддерживать культуру клеток в течение двух недель, чтобы инициировать дифференциацию в гепатоцитов и холангиоцитов.
    2. После первых двух недель, добавить 2% DMSO в среде HepaRG в течение еще двух недель, чтобы завершить дифференциациюклеток 24,25. Выращивайте HHSTeC в Stellate Cell Media (SteC CM), используя колбы с покрытием поли-L-лизина, меняя средства массовой информации каждые два-три дня.
    3. Удалите среду, мыть дважды с 1x DPBS и добавить 8 мл 0,05% трипсина / ЭДТА, чтобы разобщить клетки гепаРГ, выращенные в колбах клеточной культуры (175 см2). Инкубировать в течение 5 до 10 минут при 37 градусов по Цельсию и остановить реакцию, добавив по крайней мере в два раза объем ингибитора трипсина. Выполните то же самое для HHSTeC, адаптируя объем реагента, так как меньшее количество этих клеток необходимы, и они могут быть сохранены в небольших колбы (75см 2).
    4. Центрифуга как при 250 х г в течение 5 мин, удалить супернатант и повторно гранулы клеток в Уильямс E S среды. Подсчитайте клетки, обеспечивая жизнеспособность клетки выше 80%.
    5. Создание сфероидов печени, сочетающих клетки HepaRG и HHSTeC в соотношении 24:1, соответственно, в Williams E Smedium 16. Добавьте 4,8 x10 4 дифференцированных HepaRG и 0,2 x 104 HHSTeC, чтобы составить каждый сфероид печени из 50 000 клеток, в объеме 80 МКЛ. Отрегулируйте количество клеток и объем в соответствии с желаемым количеством сфероидов. Тщательно перемешать.
    6. Используя многоканальный пипетку, обойтись 80 йл комбинированного пула клеток в каждой колодец из 384 сфероидных микропластов, которые имеет круглую геометрию хорошо дна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через четыре дня образуются сфероиды около 300 мкм.
    7. Используя широкосовременные наконечники, перенесите сфероиды печени на сверхнизкие пластины 6 скважин, что позволяет считать требуемый "один за другим".

2. Интеграция эквивалентов кишечника и печени в 2-OC MPS

  1. Сборка intestine 2-OC MPS для анализа абсорбции
    1. Pipette 500 йл DMEM S в больший отсек 2-OC и 300 йл в меньшем. Аспирировать базолатеральные и апические средства массовой информации каждого кишечного барьера эквивалента в 24 пластины хорошо. Используя стерильные типсы, интегрируйте одну вставку на 2-OC цепи, в частности, в больший отсек. Нанесите 200 МКЛ среды кишечника на апиальной стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков при интеграции органоидов в MPS.
    2. Подключите MPS к блоку управления, который должен быть подключен к герметичной подачи воздуха. Установите параметры: давление около ±300 бар и частота перекачки 0,3 Гц. Запуск потока 24 ч до введения испытательного вещества. На следующий день выполните лечение APAP.
  2. Печень 2-OC MPS сборки для анализа метаболизма
    1. Pipette 650 йл Williams E S в большой отсек и 350 йл в меньший отсек, который будет получать сфероиды. В ультра-низкой крепления 6 пластин скважины, рассчитывать сфероиды с помощью широкой родила советы. Каждый эквивалент печени состоит из двадцати сфероидов26. Интегрируйте двадцать эквивалентов печени на цепь, используя широко скважинные наконечники, которые позволяют передавать только органоиды, в меньший отсек 2-OC.
    2. Подключите MPS к блоку управления, который должен быть подключен к герметичной подачи воздуха. Установите параметры: давление около ±300 бар и частота перекачки 0,3 Гц. Запуск потока 24 ч до введения испытательного вещества. На следующий день выполните лечение APAP.
  3. Сборка intestine/Liver 2-OC MPS для анализа абсорбции и метаболизма
    1. Объедините два средства массовой информации (кишки и печени) в пропорции 1:4, что означает 200 МКЛ DMEM S в кишечнике апической стороне и 800 йл Уильямс e S в базолатеральной стороне. Интеграция кишечника и печени эквиваленты, одновременно, в 2-OC.
    2. Подключите MPS к блоку управления, который должен быть подключен к герметичной подачи воздуха. Установите параметры: давление около ±300 бар и частота перекачки 0,3 Гц. Запуск потока 24 ч до введения испытательного вещества. На следующий день выполните лечение APAP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех экспериментов выполните каждую точку времени в тройном, что означает три разделенных 2-OC цепи (т.е. 1 и 1/2 2-OC устройств). Общий объем каждой 2-OC цепи составляет 1 мл.

3. Ацетаминофен (APAP) препарат

  1. Подготовь решение ПОАП, растворив APAP в абсолютном этаноле. В день эксперимента разбавляют АПАП в соответствующей среде (решение APAP) концентрацией 12 МКМ для "устного введения" и 2 МКМ для "внутривенного введения".
  2. Убедитесь, что окончательная концентрация этанола в растворе управления и обработки транспортных средств составляет 0,5% для обеих администраций. Для положительного контроля (100 мМ APAP) концентрация этанола составляет 2%.

4. Тестирование администрирования веществ и отбора проб средств массовой информации

  1. APAP "устное" администрирование и выборка средств массовой информации
    1. Аспирировать базолатеральные и апические средства массовой информации каждого эквивалента кишечного барьера в 2-OC. Pipette 500 йл соответствующей среды культуры в большой отсек на органоидной базолатеральной стороне и 300 йл в небольшой отсек.
    2. Проверьте наличие пузырьков и приступайте к равной обработке кишечным барьером с помощью испытательного вещества в апиальной стороне, подражая пероральному администрированию. Подражать APAP "устной" администрации, добавив 200 йл из 12 ЗМ APAP решение на апической стороне кишечной культуры вставки, которая представляет собой кишечную "люмен сторону" (Рисунок 1B). Подключите MPS к блоку управления.
    3. Соберите общий объем с апикалов и с базолатеральных сторон в следующих точках времени: 0 ч, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч и 24ч 15,27. Выполните все эксперименты в тройном, в статических и динамических условиях, и соберите каждый образец, каждого тройного, в отдельной микротрубки. Проанализируйте образцы с помощью HPLC/UV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные апические и базолатеральные образцы.
  2. APAP "внутривенное" администрирование и выборка средств массовой информации
    1. Подражать "внутривенный" маршрут, внося 2 МК APAP раствор непосредственно в печени отсека. Аспирировать все 2-OC среднего содержания. Pipette 650 йл Из Williams E S, содержащий испытательное вещество в большом отсеке и 350 МКЛ из тех же средств массовой информации в меньший отсек, который содержит 20 сфероидов. Соберите все объемы в следующих точках времени: 0 ч, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч и 24ч 27,28.
    2. Выполняем все эксперименты в тройном, статичном и динамическом условиях. Соберите каждый образец, каждого тройного, в отдельной микротрубки. Проанализируйте образцы с помощью HPLC/UV.

5. Инструментальные и хроматографические условия

  1. Анализ HPLC
    1. Установите все соответствующие параметры для анализа HPLC в соответствии с таблицей 1.
    2. Фильтровать мобильную фазу через мембранный фильтр на 0,45 мкм в вакууме. Фильтруйте образцы через фильтр для шприца PVDF размером 0,22 мкм (диаметр 13 мм) и храните их во флаконе. Начало измерения.
  2. Фондовые решения, стандарты калибровки и образцы контроля качества (КК)
    1. Подготовьте 10 мМ. фондовых решений APAP в буфере ацетата аммония (100 мМ, рН 6,8) и еще больше разбавляйте DMEM S и Williams E S клеточными культурами, разбавленными ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) для достижения рабочих решений в диапазоне от 0,25 до 100,00 МКМ.
    2. Включите набор образцов калибровки в тройном, а также образцы контроля качества на четырех уровнях в три раза. Подготовь эти стандарты к серийному разбавлению.
    3. Создание кривых калибровки пиковых областей APAP по сравнению с номинальными стандартными концентрациями APAP. Определите линейную регрессию, пригодную для каждой кривой калибровки. Оцените доброту различных калибровочные модели с помощью визуального осмотра, коэффициента корреляции, внутри- и межунимной точности и точности значений.
    4. Инъекции пустых образцов СРЕДСТВ массовой информации DMEM S и Williams E S, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) в секступликате. Подготовь трипликаты образцов контроля качества в DMEM S и Williams E S-средствах массовой информации, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) для концентраций APAP 0,50 (ЛОЗ), 4,50, 45,00 и 90,00 МКМ.
    5. Убедитесь, что образцы контроля качества готовятся из нового решения запасов, отличается от того, которое используется для создания стандартной кривой. Используйте образцы контроля качества для изучения внутри- и межрегионных вариаций.
  3. Процедуры проверки
    1. Выполните биоаналитическую проверку метода после ранее сообщенных процедур29,30. Проведение хроматографических работает в пяти или шести отдельных случаях, учитывая Уильямс E S и DMEM S ячейки культуры средств массовой информации, соответственно.
    2. Убедитесь, что калибровочные точки в диапазоне от 0,25 до 100,00 МКМ APAP, в DMEM S или Williams E S клеточных культур СМИ разбавленных ацетат буфера аммония (1:1, v/v), построены на основе пиковых областей APAP (оси y) против соответствующих номинальных концентраций (оси x). Сравните склоны этих стандартных кривых калибровки со склонами кривой калибровки, подготовленной в буфере ацетата аммония. Убедитесь, что все кривые калибровки имеют значение корреляции не менее 0,998.
    3. Определите точность и точность (внутри- и межголовые) для анализа в суррогатной матрице с помощью репликаций на четырех различных уровнях LLO, низкого, среднего и высококачественного контроля в течение пяти или шести различных дней. Выполняйте внутриутробные измерения точности и точности в тот же день в средствах культуры клеток DMEM S или Williams E S, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v), содержащим концентрации 0,50, 4,50, 45,00 и 90,00 ЗМ АПАП (n'3).
    4. Оцените каждый набор образцов контроля качества, содержащих концентрации APAP из недавно полученных кривых калибровки. Проверьте избирательность анализов по степени разделения соединения интереса и возможных других хроматографических пиков, вызванных вмешательством компонентов.
  4. Нижний предел количественной оценки (ЛЛОЗ) и предел обнаружения (LOD)
    1. Определите нижний предел количественной оценки (LLO) на основе стандартного отклонения ответа и наклонного подхода. Рассчитайте с помощью формулы 10 "/S, где α является стандартным отклонением у-перехвата и S является наклон прямой линии, полученной путем построения кривыхкалибровки 29,30. Оцените предел обнаружения (LOD) с учетом в 3,3 раза стандартного отклонения заготовки, разделенного наклоном кривойкалибровки 29,30.

6. Ткань эквиваленты жизнеспособности / функциональности

  1. Mtt
    1. Выполните анализ MTT для оценки органоидной жизнеспособности во всех точках анализа MPS. В качестве отрицательного контроля используйте сотовые медиа плюс транспортное средство. В качестве положительного контроля, лечить органоиды с 100 мМ APAP и 1% NaOH разбавленной в клеточной среде.
    2. Передача 20 сфероидов каждой репликации для отдельных скважин в 96 хорошо пластины, и клеточной культуры вставки, содержащие эквиваленты кишечника, на 24 хорошо клеточных пластин, размещение одного кишечника эквивалент на скважину. Вымойте эквиваленты ткани три раза с 1x DPBS.
    3. Добавьте 300 л раствора МТТ 1 мг/мл, разбавленного в соответствующей клеточной среде, на колодец. Инкубировать пластины в течение 3 ч в стандартных условиях культуры клеток.
    4. Удалите решение MTT из каждого хорошо тщательно pipetting. Экстракт МТТ formazan из кишечника и печени эквиваленты с использованием 200 йл изопропанола на ночь при 4 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Печать крышки, чтобы предотвратить испарение.
    5. Передача 200 МКЛ каждого супернатанта в соответствующие предварительно идентифицированные хорошо в 96 хорошо микро-тестовой пластины. Используйте изопропанол в качестве пробела.
    6. Прочитайте абсорбанс formazan в читателе плиты на 570 nm. Рассчитайте относительную способность ячеек уменьшать МТТ (%) использование средней оптической плотности каждой точки времени, по сравнению с отрицательным контролем, считается 100% жизнеспособности клеток.
  2. Цитохимия/гистология
    1. Исправить кишечника и печени эквиваленты, в течение 25 мин при комнатной температуре, используя 4% (ж / в) параформальдегид в 0,1 М фосфат-солевой буфер, рН 7,4. Вымойте органоиды 5 раз в буфере PBS в течение 10 минут каждый раз. Пятно кишечника и печени эквиваленты с тетраметилфодамин изотиоцианат-фаллоидин или Alexa Fluor 647 фаллоидин, 1:50 в PBS31.
    2. Перенесите их в ОКТ замораживания среды в течение нескольких минут, чтобы акклиматизироваться на RT перед передачей их в жидкий азот до полного замораживания. Выполните криозы печени криозеции около 10-12 мкм толщиной, используя криостат.
    3. Намонтировать секции тканей в монтажной среде с DAPI. Изучите их с помощью конфокальные микроскопии флуоресценции.
    4. Заморозить органоиды после фиксации для выполнения гематоксилина и эозин окрашивания в соответствии с установленными протоколами. Намонтировать слайды с монтажной среды после нарезки ткани, как описано выше, и принять гистологические изображения с помощью оптического микроскопа.
  3. Анализ высокого содержания
    1. Митохондриальное и ядерное окрашивание клеток
      1. Восстановить лиофилизированный порошок в DMSO, чтобы сделать 1 мМ митохондриального окрашивания фондового раствора (например, MitoTracker Deep Red FM). Храните раствор для акций с aliquoted при -20 градусов по Цельсию, защищенный от света. Разбавить 1 мМм митохондриального окрашивания стокового раствора до конечной концентрации (200 нМ) в предварительной (37 градусов по Цельсию) среде культуры тканей без сыворотки.
      2. Удалите мультимедиа культуры ячейки. Добавьте митохондриальный раствор окрашивания, чтобы полностью покрыть образец и инкубировать клетки в течение 15-45 мин при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере с 5% CO2.
      3. Тщательно удалите митохондриальное окрашивание рабочего раствора и замените его 2-4% параформальдегидом фиксации в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
      4. Промыть фиксированные клетки осторожно с PBS в течение 5 минут. Повторите процесс стирки дважды.
      5. Приготовьте раствор нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой 10 мг/мл (16,23 м), растворив 100 мг красителя Hoechst 33342 в 10 мл ультрапурной воды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковое решение должно быть aliquoted и храниться защищены от света при -20 градусов по Цельсию.
      6. Подготовьте 0,2-2,0 мкг/мл нуклеиновой кислоты, окрашивая рабочий раствор в PBS и инкубировать зациклененные клетки нуклеиновым кислотным окрашиванием рабочего раствора в течение 10 минут при комнатной температуре.
      7. Удалить нуклеиновой кислоты окрашивания рабочий раствор и промыть клетки осторожно с PBS в течение 5 минут три раза. Клетки должны храниться в PBS при 4 градусах Цельсия, защищенных от света.
    2. Анализ митохондриального и ядерного окрашивания
      1. Анализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью наборов фильтров, подходящих для пятна нуклеиновой кислоты («Екс/Ем: 361/497 нм») и митохондриального пятна («Ex/»Em: 644/665 nm). Найти клетки нуклеиновой кислоты положительное окрашивание и количественное число клеток. Количественная оценка интенсивности митохондриальной флуоресценции пятен в митохондриях.
  4. Морфометрические измерения (расчеты сфероидов) в ImageJ
    1. Экспорт высококонтентного анализа (HCA) изображения, как .flex файлов из программного обеспечения Columbus. Импорт .flex файлов в качестве серого масштаба в ImageJ с помощью плагина Bio-Formats32: Файл
    2. В окне Параметры импорта выберите просмотр Hyperstack и включите каналы Split под Split в отдельные окна. Эта опция позволит получить доступ ко всем файлам в определенном канале (например, DAPI, mitotracker и т.д.). Не выберите использовать виртуальный стек под управлением памяти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительнее использовать канал DAPI в качестве "пыли" в изображениях, так как среда культуры уменьшается в ультрафиолетовой длине волны (например, 405 нм).
    3. Отрегулируйте размерпикселей (Analyze и Set Scale),если он не был загружен в соответствии со встроенными значениями в файле .flex. Нанесите gaussian Blur фильтр, чтобы удалить избыток шума и избежать нарушений в контуре формы. Процесс йgt; Фильтры Высокое значение Sigma (радиус) между 2.0 и 3.0 идеально подходит для большинства случаев. Если стек имеет несколько изображений, примените ко всем из них (выберите окно Да в окне Process Stack).
    4. Создайте двоичное изображение для отдельного фона и органоидов (объектов) с помощью порога. Нажмите на изображение, чтобы настроить Используйте красную маску, чтобы настроить значения в зависимости от интенсивности изображения, чтобы соответствовать органоидной форме, сохраняя морфологию нетронутой. Отключите темный фон, если изображение имеет белый фон. Нажмите Применить.
    5. В стеке преобразования в двоичное окно выберите метод Порога. Как правило, по умолчанию или треугольник предпочтительнее в этом виде обработки изображений. Держите фон, как темный. Выберите порог расчета для каждого изображения, если в стеке есть несколько изображений.
    6. Выберите Процесс юgt; Двоичный По желанию удалите отверстия из фона. В процессе юgt; Двоичный йgt; Вариантs, выберите черный фон и выполнить Заполнить отверстия снова. Отключите опцию Черного фона, прежде чем приступить к следующему шагу.
    7. Отдельные объекты. Для органоидов, метод водораздела является хорошим выбором. Нажмите Процесс юgt; Двоичный Выполните анализ формы.
      1. Выберите Анализ и установить измерения. Доступно несколько вариантов (подробная информация в https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Для органоидов, выберите площадь, Среднее серое значение, Мин и макс серое значение и формы дескрипторов. Дополнительно выберите метку Display для идентификации объектов на изображении и научной нотации. Нажмите OK.
      2. Выберите Анализ и анализ частиц. Выберите пределы размера и круговорота. Держите 0-бесконечность и 0.00-1.00, соответственно, чтобы измерить все объекты на изображении. В Showвыберите контуры, чтобы объекты были идентифицированы. Включить результаты отображения к результатам вывода; Исключить по краям, чтобы исключить объекты, касаясь границ; Включите отверстия так в конечном итоге внутренние отверстия в объектах рассматриваются как часть основной формы.
    8. Повторите анализ форм для каждого стека изображений, и результаты будут приложены в одной таблице. Таблица результатов экспорта в файле «Сохранить как...», как файл «Запятая разделенные .csv» (.csv).
  5. ПЦР в режиме реального времени
    1. Извлекайте РНК из тканевых эквивалентов с использованием монофазного раствора фенола и гуанидина изотиоцианата, следуя инструкциям производителя.
    2. Выполните синтез кДНК путем обратной транскрипции от 1 до 2 мкг общей РНК.
    3. Усильте все цели с помощью генно-специфических праймеров(таблица 5) длявыполнения количественного ПЦР в режиме реального времени. Каждый qRT-PCR содержит 30 нг обратной транскрибируется РНК и 100 нм каждого грунтовка.
    4. Следуйте условиям ПЦР: 50 градусов по Цельсию в течение 3 минут (1 цикл); 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут (1 цикл); 95 градусов по Цельсию в течение 30 секунд, 59 градусов по Цельсию в течение 45 секунд и 72 градусов по Цельсию в течение 45 секунд (35 - 40 циклов).
  6. CYP анализ
    1. Следуйте разделу 2.2 для печени 2-OC сборки. Экспериментальными группами являются нет-клеточный контроль, APAP 2 ЗМ лечения 12 ч, 24 ч, и управление транспортным средством. Следуйте разделам 3.3 и 4.2 для подготовки и лечения APAP 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что все образцы будут готовы в то же время для анализа CYP, начать 12 ч лечения 12 часов после начала 24 ч лечения. Относитесь к нетклеточному контролю активности CYP с раствором этанола 0,5%, а также к управлению транспортным средством.
    2. Оттепель 3 мМм люминогенный субстрат запас раствор при комнатной температуре и сделать 1:1000 разбавления в William's E S. Защитите от света.
    3. Соберите сфероиды и перенесите каждую экспериментальную группу в колодец из 96-хорошо пластины. Удалите среду, мыть дважды с 100 йл 1x DPBS и добавить 80 МКЛ из 3 МКГ субстрат раствор на колодец. Держите не-клеточный контроль в среде E S Уильяма. Сохранить хорошо без сфероидов или субстрат решение для фонового контроля. Инкубировать в течение 30-60 мин при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2, защищены от света.
    4. Эквилибррат лиофилинизированный реагент обнаружения люциферина (LDR) с помощью буфера восстановления с эстеразой. Смешайте путем закрученного или инвертирования. Храните присвоенный объем при комнатной температуре до следующего шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановленный LDR может храниться при комнатной температуре в течение 24 часов или при температуре 4 градусов по Цельсию в течение 1 недели без потери активности. Для длительного хранения храните при -20 градусов по Цельсию.
    5. Передача 25 МКЛ супернатанта нетронутых сфероидов в трех различных скважинах белой непрозрачной микроплоцы 96 скважин после инкубации. Добавьте 25 л LDR на колодец и гомогенизируйте.
    6. Инкубировать белую тарелку при комнатной температуре в течение 20 минут. Прочитайте люминесценцию на люминометре. Не используйте флюорометр.
    7. Рассчитайте чистые сигналы, вычитая значения фоновых люминесценций (без клеточного контроля) из тестовых обработанных соединений и необработанных (контроль транспортных средств) значений. Рассчитайте процентное изменение активности CYP3A4 путем деления чистых обработанных значений на чистые необработанные значения и умножения на 100.
  7. Западный blotting
    1. Перенесите сфероиды печени на идентифицированную микротрубосеку 1,5 мл. Удалите среду и мыть дважды с 100 йл 1x DPBS.
    2. Лизате сфероиды печени в 100 мкл буфера лиза клетки RIPA при 4 градусов по Цельсию в течение 20 мин. Центрифуга в течение 15 мин, 4 градусов по Цельсию и 11000 об/мин. Перенесите супернатант на другой идентифицированный микротрубок 1,5 мл.
    3. Количественная оценка количества белка, полученного методом Брэдфорда. Загрузите от 10 до 50 мкг белка из количественного лисата клетки на колодец градиентного полиакриламинида геля 3-15% и выполните SDS-PAGE.
    4. Перенесите загруженный белок из геля в мембрану PVDF на 0,22 мкм через полусухое системное оборудование. Используйте раствор переноса 50 мМ Трис-ХКл и глицин 192 мМ. Установите параметры оборудования в зависимости от количества гелей, которые будут переданы (от 1 до 2 за один раз).
    5. Блок неспецифических взаимодействий на мембране PVDF с 3-5% обезжиренного молочного раствора в буфере TBS-T: Tris-Buffered Saline (50 мМ Трис рН 7,6, 150 мМ хлорида натрия) дополнен 0,1% Tween 20. Держите мембрану под нежно постоянной тряской в течение 1 часа при комнатной температуре.
    6. Вымойте TBS-T под нежно постоянной тряской в течение 3-5 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг стирки дважды.
    7. Разбавить альбумин и винкулин первичных антител до 1:1000 и 1:2000 соответственно на TBS-T. Инкубировать мембрану с первичными антителами на ночь при 4 градусов по Цельсию, под мягко постоянной тряской.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда следуйте инструкциям производителя, чтобы разбавить антитела.
    8. Удалить первичное антитело и мыть мембрану 3 раза (шаг 6.7.6). Разбавить ECL анти-мышь IgG вторичного антитела до 1:5000 на TBS-T. Инкубировать мембрану вторичным антителом под нежно постоянной тряской в течение 2 часов при комнатной температуре.
    9. Удалить вторичное антитело и промыть мембрану (шаг 6.7.6). Выполните обнаружение белка с помощью ECL Western Blotting Substrate. Разоблачить авторадиографические пленки от 30 с до 30 мин. Выполните иммуноблоттинг обнаружения в тройном.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для выполнения испытаний PK APAP в 2-OC MPS, первым шагом является производство кишечника человека и печени эквиваленты (органоиды). Они интегрированы в 2-OC микрофлюидное устройство(рисунок 1A) 24 ч до начала анализа PK APAP. На следующий день среда изменена, и модель подвергается APAP. Рисунок 1 иллюстрирует эквиваленты кишечника и печени, помещенные внутри устройства 2-OC(рисунок 1B)и курс времени эксперимента APAPPK (рисунок 1C). Мы провели анализ MTT, измерения TEER, HCA, ПЦР в режиме реального времени, западные блаттинги, гистологию и конфокаловую микроскопию флуоресценции в 2D-культуре и 3D органоиды, чтобы проверить жизнеспособность ткани и обнаружить возможные токсические эффекты APAP. В конфокальных флуоресценции микроскопии изображения, кишечник эквивалентные образцы окрашенных ДАПИ и фаллоидин (для ядер и актина соответственно) были представлены в качестве сопредельного барьерадля необработанное ( Рисунок 2A) и 12 ЗМ APAP обработанных образцов (Рисунок 2B). Как видно на рисунке 2C, анализ MTT показал относительные уровни жизнеспособности клеток выше 70%, что свидетельствует об отсутствии соответствующих цитотоксических эффектов в ответ на воздействие APAP при концентрации12 МКМ 33,34,35,36,37. Положительный контроль (100 мМ) индуцированных значительную гибель клеток (выживание ниже 5%). Жизнеспособность и надлежащая дифференциация како-2/HT-29, а также целостность барьерного барьера кишечника были проверены эволюцией TEER в периоддифференциации (рисунок 2D). APAP не вызывает каких-либо изменений в значениях TEER, как показано на рисунке 2E. Было проанализировано выражение активных транспортеров глюкозы, связанных натрия SLC5A1, транспортера множественной лекарственной устойчивости MDR1 и atPase натрия-калия, чтобы проверить влияние лечения APAP на образование клеточных барьеров и базально-функциональность. Как показано на рисунке 2F-H, как необработаваемые и APAP лечение кишечника эквиваленты показали аналогичное выражение SLC5A1 и NaKATPase. Устное администрирование 12 МК APAP индуцированных отмечено увеличение уровня MDR1 мРНК в кишечнике эквиваленты после 24 ч (Рисунок 2H). Мы также выполнили HCA клеточных фенотипических изменений смесью флюорофорного красителя для ядер и митохондриального содержания массы. Положительные элементы управления составили 100 мМ АПАП и 1% NaOH.

Кроме того, мы проанализировали, может ли 12 ЗМ АПАП вызвать цитотоксичность к 2D-ко-культуре Caco-2/HT-29. Изображения кишечных клеток, полученные с помощью микроскопии флуоресценции, показанной на рисунке 2I, подтверждают данные МТТ, которые показали, что 12 МК АПАП не вызывают значительной цитотоксичности в кишечных эквивалентах Caco-2/HT-29.

Оценка базально-базальной жизнеспособности печеновидных сфероидов и цитотоксиальности в ответ на 2 МК АПАП была проведена с помощью анализа анализа МТТ и морфологических анализов с помощью конфокальной микроскопии флуоресценции, ГИСТологии Н И Э и HCA. Как показано на рисунке 3A, анализ МТТ не смог определить какую-либо соответствующую цитотоксичность в ответ на 2 мкм АПА лечения в образцах, взятых из печени 2-OC сборки в статических и динамических условиях. Жизнеспособность ячейкиснизилась,но осталась более чем на 80% как для 12 ч и 24 чвремени точек 33,34,35,36,37. Положительное контрольное лечение (100 мМ APAP и 1% NaOH) вызвало значительные повреждения тканей (жизнеспособность ниже 10%). Микроскопические конфокальные изображения указывают на отсутствие некротического центра в сфероидах печени в базальных или APAP условиях лечения, и никаких доказательств значительной смертности(рисунок 3B-C). Однако, когда мы проанализировали несколько клеточных фенотипических изменений после транспортного средства или 2 МК APAP администрации в 2D HepaRG / HHSteC кокультуры через HCA анализа, используя 100 мММ APAP (C) в качестве положительного контроля, противоречит результатам анализа MTT, печеночные клетки продемонстрировали ранние цитотоксические ответы на 2 ЗМ APAP лечения (Рисунок 3D). После 24 ч произошло уменьшение количества клеток, в ядерной области и увеличение митохондриальной массы. Кроме того, флюорофор красителя коктейль, содержащий Hoechst 33342 и MitoTracker Deep Red был использован для пятна 3D печеночным сфероидов (Рисунок 3J). Программное обеспечение Фиджи было использовано для оценки однородности 3D сферической архитектуры среди нескольких сфероидов(рисунок 3E-I). На рисунке, показанной на рисунке 3E, показано сходство между сфероидами печени общей площади. Соотношение сторон(рисунок 3F) около 1 означает отсутствие предвзятости во время процесса кондитерских изделий сфероидов. Оценка также показала, что большинство сфероидов были примерно округлены(рисунок 3G). Оценка периметра морфологии и распределения клеток проводилась покруговороту (рисунок 3I)и расчетупрочности (рисунок 3H),соответственно. Мы пришли к выводу, что методология кондитерских сфероидов печени породила органоиды с гладким периметром, совместимым с сферическим ростом, без предубеждений или некроза во время процесса.

Как попродемонстрировано на рисунке 4A-B, сфероиды печени показали относительно базальный высокий уровень экспрессии альбумин и GST mRNA соответственно, что указывает на правильную базальную функциональность. Тем не менее, лечение 2 МК APAP для 24 ч индуцированных снижение уровня альбумин и GST мРНК экспрессии, предполагая ухудшение сфероидов печени функционально на 24 ч точки времени лечения APAP.

Обнаружение уровней экспрессии CYP3A4 и UGT1A1 mRNA демонстрирует метаболическую способность печени. Базальный уровень CYP3A4 mRNA(рисунок 4C) соответствовал предыдущим отчетам6. Лечение APAP вызвало тенденцию к снижению как CYP3A4 mRNA и UGT1A1 выражение в ответ на лечение APAP (Рисунок 4C-D) еще раз подтверждающие гипотезу нарушения сфероидов печени функционально на 24 ч времени точки лечения APAP.

Кроме того, были проведены эксперименты западной blotting и in vitro ферментативной активности для анализа экспрессии белка альбумин, а также активности CYP 3A4 в эквивалентах печени в базальных и в условиях лечения APAP. Мы обнаружили, что 2 ЗМ APAP лечение осуществляется в печени 2-OC MPS, индуцированных сокращение печени эквивалент общего выражения альбумин на 12 ч и 24 ч времени точек как статические (Рисунок 4E) и динамические(рисунок 4F) условиях. С другой стороны, образцы эквивалентов печени из динамических условий продемонстрировали тенденцию представлять более высокие уровни экспрессии белка альбумин по сравнению со статичными условиями (Рисунок 4G). CYP 3A4 in vitro анализ, выполненный в эквивалентах печени от печени 2-OC MPS, показал, что 2 МК APAP лечение 12 ч или 24 ч был способен вызвать надежное и значительное ухудшение активности CYP 3A4 как в статических, так и в динамических условиях (Рисунок 4H-I). Что еще более интересно, наличие потока средств массовой информации (динамический) вызвало значительное улучшение печени эквиваленты CYP 3A4 уровни активности по сравнению с условиями, в которых эквиваленты печени были сохранены в отсутствие циркулирующих средних (статические условия) (Рисунок 4J).

Чтобы найти наиболее чувствительное аналитическое состояние в отношении анализа HPLC, было исследовано несколько параметров, включая состав мобильной фазы, тип и концентрацию добавок. Было установлено, что ацетонитрил дал лучшее разрешение хроматограммы и соответствующее время удержания, чем метанол. Быстрое и воспроизводимое разделение APAP было получено с помощью обратной фазы C18. Значение времени удержания APAP (Rt) составило 9,27 ± 0,19 минуты. Избирательность APAP указывается на форму и симметричное разрешение пика, а также отсутствие вмешательства пиков из DMEM и Уильямс ячейки культуры средств массовой информации.

Стандартные концентрации APAP в DMEM S и Williams E S-средствах культуры клеток, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) в диапазоне от 0,25 до 100,00 МКМ, использовались для построения кривых калибровки. Линейность метода была определена на девяти уровнях концентрации. Данные отображаются в таблице 2 и таблице 3. Взаимосвязь между концентрацией APAP и пиковыми областями была описана линейными уравнениями регрессии: y 16106'x и 3579.8 (R2No1, в среде DMEM) и y 16397'x 2475.1 (R2 No1,в среде Williams), в котором "x" является номинальной концентрацией APAP в МКМ и "y" является пиковой областью хроматограммы APAP в АС. При верхнем пределе количественной оценки (т.е. 100,00 МКМ) процентное отклонение и межголические значения изменчивости были менее 2,50%. Точность и точность девяти уровней концентрации, за исключением 0,50 МКМ (ЛЛОЗ), находились в приемлемом диапазоне с значениями DEV и C.V. менее 7,00%(таблица 2 и таблица 3).

Аналитический метод меж- и внутриголовые точность и точность в четырех проверенных концентрациях подпал под общепринятые критерии биоаналитических анализов. Воспроизводимость метода оценивалась путем анализа репликаций образцов контроля качества APAP 0,50 (ЛЛОЗ), 4,50, 45,00 и 90,00 МКМ. Результаты внутриим ведений и межучрежреж показатель представлены в таблице 4. Точность и точность анализа демонстрируются значениями DEV ≤ 15,00% и значениями C.V. ≤ 7,00% соответственно.

LOD был определен в качестве образца, соотношение сигнала к шуму (S/N) было чуть больше 3 и соответствовало 0,25 ЗМ APAP. С другой стороны, в ЛЛОЗ, по оценкам, с образцами 0,50 МК АПАП, отображается соотношение S/N, равное 10. Кроме того, мы обнаружили значения точности (DEV%) в пределах ≤ 19,00% от номинальных значений концентрации. Внутри- и междоходные изменчивости продемонстрировали C.V. ≤ 18,77%, как показано в таблице 2, таблице 3 и таблице 4)29,30.

Анализы APAP PK были проведены в трех различных 2-OC MPS сборки: 1) Кишечник 2-OC, содержащий кишечник эквивалент только; 2) Печень 2-OC, содержащий только сфероиды печени и 3) кишечник / печень 2-OC как с кишечным барьером и сфероидов печени.

Для исследований поглощения, устный маршрут был имитирован администрацией 12 ЗМ APAP на кишечнике эквивалентно апической стороне. Концентрации APAP измерялись HPLC/UV в средних образцах, собранных из апиальных и базолатеральных кишечных эквивалентов, как в статических, так и в динамических условиях. Кинетики APAP в среде, собранной из апической и базолатеральной стороны показали, что модель кишечника была в состоянии поглощать APAP. Существовал прогрессивное снижение концентрации APAP в апической стороне(рисунок 5A) сопутствуя APAP увеличение концентрации на кишечной базолатеральной стороне(рисунок 5B). Максимальные концентрации (Cmax) в среде составили около 2 МКм как для статических, так и для динамических условий, после 12 ч администрации (Tmax).

Для исследования метаболизма, внутривенное введение было имитировано применением 2 ЗМ APAP в среде отсека печени. Кинетики концентрации APAP в средствах массовой информации как в статических, так и в динамических условиях показали, что только в динамических условиях можно обнаружить снижение концентрации APAP, достигнув 0,87 МКМ АПАП 12 ч после 2 МКМ АПАП администрации (T1/2 и 12 ч). Эквиваленты печени показали минимальную метаболическую эффективность в статических условиях(рисунок 5C). Концентрация APAP достигла 1,7 МКМ 12 ч после введения APAP. Интегрированная, системная, как поглощение APAP и оценка метаболизма была выполнена в модели Intestine/Liver 2-OC. APAP вводили по апиальной стороне кишечника эквивалент, подражая устной маршрут. Средние образцы были собраны как с кишечной стороны, так и из отсека печени. Рисунок 5D показывает прогрессивный распад концентрации APAP на апической стороне как в статических, так и в динамических условиях.

На рисунке 5E показаны различимые фазы поглощения и метаболизма. Поток также влияет на поглощение кишечника. APAP Cmax в среде изменился с 2 МКм на "Intestine 2-OC"(рисунок 5B) сборки до 1,7 МКМ для динамического "Китон / Печень 2-OC" (Рисунок 5E). Рисунок 5F показывает прямое сравнение между концентрацией времени профиля APAP в нашей динамической "Китон / Печень 2-OC" микрофизиологической системы (красная кривая и у оси) и репрезентативный профиль, полученный в организме человека после одной устной дозы 1000 мг (черная кривая и у оси).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая компиляция шага для исследований ПК в 2-OC MPS. A)Схематический рисунок 2-OC MPS, показывающий эквиваленты кишечной и печеночной тканей человека в представлении снизу вверх. B) 2-OC MPS фотография с кишечными и печеночной эквиваленты интегрированы в устройство в снизу вверх зрения, с репрезентативной оптической микроскопии изображений. C)Хронология подготовки тканевых эквивалентов, лечения APAP и фаз среднего сбора культуры для органоидного производства, а также фармакокинетических и токсикологических оценок. Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Жизнеспособность и токсикологическая оценка эквивалентов кишечника. A)представительные конфокальные микроскопические изображения микроскопических изображений необработаваемых клеток Caco-2/HT-29, окрашенных ядрами клеток и актиновых нитей флуоресцентного красителя (DAPI и фаллоидин соответственно); 63x Увеличение, зум 2.6. B)репрезентативные конфокальные микроскопические изображения микроскопических изображений клеток Caco-2/HT-29, обработанных 12 МК АПАП на 24 ч, окрашенных ядрами и актиновых нитей флуоресцентного красителя (DAPI и фаллоидин соответственно); 63x Увеличение, зум 2.6. C)Оценка жизнеспособности кишечника по анализу MTT как в статических, так и в динамических условиях. Значения, представленные барами на графике, рассчитываются в процентах по отношению к управлению транспортным средством (точка времени, названная как 0)»P'lt;0.05 0 против лечения. D) ЭВОЛЮЦИЯ TEER в течение 21 дня дифференциации. «Пя lt;0.05 день 1 по сравнению с другими днями. E) TEER значения после APAP администрации в кишечнике 2-OC MPS в динамических условиях. Экспрессия генов в кишечнике эквиваленты. Абсорбционный потенциал кишечного барьера и возможные эффекты 12 ЗМ APAP на 24 ч при динамическом состоянии были проверены экспрессией SLC5A1(F),Na-K-ATPase(G) и MDR1(H). Значения представляют среднее ± SEM трех независимых экспериментов. Результат выражается в соотношении к ведению домашнего хозяйства GAPDH. Автомобиль «Пзт;0,05 против АПАП». I) Оперетта на основе изображения HCA в исполнении Колумба® 2.4.0. Программного обеспечения. Репрезентативные изображения 2D кишечника совместной культуры в разных точках времени после 12 ЗМ APAP лечения. Отрицательный контроль был средним (0 ч) или транспортным средством (0,5% этанола). Положительные элементы управления показано здесь 100 мМ APAP. Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Жизнеспособность и токсикологическая оценка эквивалентов печени. A) Оценка жизнеспособности печени по анализу MTT как в статических, так и в динамических условиях. Значения, представленные барами на графике, рассчитываются в процентах по отношению к управлению транспортным средством (точка времени, названная как 0) (P'lt;0.05 0 против лечения. B) Представители конфокальные изображения, снятые с транспортного средства и 2 МК APAP 24 ч лечение сфероидов печени из внутренней части. C) Представители H и E (гематоксилин и эозин окрашивание) изображения, снятые с транспортного средства и 2 МК APAP 24 ч лечение сфероидов печени из внутренней части. Шкала бар No 50 мкм . D) Представитель изображения 2D печени совместно культуры в разных точках времени после 2 ЗМ АПАП лечения. В этих анализах были рассмотрены образцы, обработанные с помощью транспортного средства, и с 2 ЗМ АПАП. Смесь красителя фторфора включает в себя Hoechst для ядерного окрашивания и Mitotracker Deep Red для массового окрашивания митохондрий. Отрицательный контроль был средним (0 ч) или транспортным средством (0,5% этанола). Положительный контроль был 100 мМ АПАП. Измерения изображений целых сфероидов были проведены с использованием программного обеспечения Фиджи. E) Частотные распределения соотношения сторон области F, G) округость, H) прочность, I) круговорот. N No 85. 0,05 евро. J) Репрезентативные изображения 3D сфероидов печени, приобретенных Опереттой с использованием цели LWD 10x. Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Жизнеспособность печени/функциональность и возможные эффекты 2 МК АПАП в статических и динамических условиях над ней были проверены экспрессией генов и белков и ферментативной активностью. A) экспрессия генов альбумин. B) экспрессия гена GSTA2. Способность печени выполнять метаболизм фазы I и фазы II и возможные эффекты 2 МК APAP для 24 ч при динамическом состоянии над ним были проверены экспрессией генов CYP3A4(C) и UGT1A1(D) соответственно. E) Полное выражение белка альбумин в статическом состоянии. F) Полное выражение белка альбумин в динамических условиях. Состояние. G)Сравнительный график, иллюстрирующий разницу в общем выражении альбумин в эквивалентах печени, культивируемых и обработанных в статических или динамических условиях. H) CYP 3A4 в пробирке энзиматической активности в статических условиях. I)CYP 3A4 в пробирке энзиматической активности в динамических условиях. J)Сравнительный график, иллюстрирующий разницу в активности CYP 3A4 в эквивалентах печени, культивируемых и обработанных в статических или динамических условиях. Значения представляют среднее ± SEM трех независимых экспериментов. Данные экспрессии генов выражаются в соотношении к ведению домашнего хозяйства GAPDH. Данные экспрессии белка выражаются в соотношении к винкулиновому белку. «Пзт;0.05 транспортное средство против лечения APAP. Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ фармакокинетики APAP в 2-OC MPS. Профиль поглощения APAP после 12 администрирования APAP на апической стороне подготовки Intestine 2-OC MPS. Кишечный барьер был сделан из кокультуры caco-2/HT-29 клеточных линий(A) Статические и динамические концентрации APAP в среде с апической стороны (представляющей сторону желудочно-кишечного люмена человека). (B) Статические и динамические концентрации APAP в среде с базолатеральной стороны (представляющей сторону кишечного кровотока человека). Статические и динамические условия. C) APAP метаболизм профиля в печени 2-OC MPS по HepaRG / HHSTeC печени сфероидов. Сравнение статических и динамических условий после администрирования APAP в 2 МКМ в среду. 0,05 0ч против 6 ч, 12 ч и 24 ч терапии АПАП. APAP поглощения и метаболизма профиля после 12 ЗМ администрации на кишечном барьере апической стороне кишечника / печени 2-OC MPS подготовки. Это эмулирует устный маршрут. Кишечный барьер был сделан из линий клеток Caco-2/HT-29 и эквивалента печени из сфероидов клеточных линий HepaRG/HHSTeC. (D) Кишечные / Печень 2-OC APAP концентрации в апической стороне кишечного барьера в статических и динамических условиях. (E) Кишечные / Печень 2-OC APAP концентрации в среде в статических и динамических условиях. Статические и динамические условия. (F) Сравнение между концентрацией времени профиля APAP в нашей микрофизиологической системы (красная кривая и у оси) и репрезентативный профиль, полученный в организме человека после одной устной дозы 1000 мг (черная кривая и у оси). Данные были извлечены из участков с помощью WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Система HPLC Уотерс Альянс 2695 (Милфорд, Массачусетс, США), оснащенный четвертичных насосов, образец менеджера и degasser
Детектор Воды 2996 Uv-Vis установлен в диапазоне 210-400 нм
Системный контроль, сбор данных и обработка Уотерс Empower 2002 хроматографии программного обеспечения
Столбца Обратная фаза Луна C18
(150 x 4.6 мм I.D.; размер частицы 5 мм)
Феноменекс
Гвардейская колонна Обратная фаза Луна C18 (4 x 3 мм)
Феноменекс
Мобильная фаза Растворитель А- Ацетонитрил
Растворитель B- 0.10 M ацетат аммония, рН 6.8
Изократические условия Время A (%) B (%)
(мин.)
15 5 95
Потока 1,0 мл/мин
Объем инъекций 25 мкл
Температура 25 КК
Обнаружение APAP УФ No 243 и 254 нм
Время бежать 15 минут

Таблица 1: Условия и параметры, которые будут использоваться для анализа APAP HPLC-UV в матрицах среды культуры.

Номинальная концентрация Рассчитанная концентрация APAP (ЗМ) Среднее значение (МКМ) S.D.b К.В. Dev
(Ям) (Трипликат каждой концентрации) (Ям) (%)c (%)d
Номер анализа 1 2 3 4 5 6
0,25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 46,05 евро
0,50 (ЛЛОЗ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 17,08 евро
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 6,65 евро
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 0,09 евро
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 0,03 евро
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Таблица 2: Межголовая вариация – точность, точность и линейность стандартных образцов кривой, подготовленных в смеси среды DMEM с буфером ацетата аммония 0.10 M (1:1, v/v) из шести отдельных анализов. a
a Линейная кривая была установлена на данные для ответа(APAP) по сравнению стеоретической концентрацией, как описано в Экспериментальном. Рассчитанная концентрация была получена на основе чтения ответа для каждого стандартного образца на кривую калибровки. Каждая запись (анализ 1-6) соответствует среднему значению тройного анализа.
б Стандартное отклонение SD.
c C.V. (коэффициент вариации. точность).
d г Точность (DEV %) - отклонение расчетной концентрации от номинального значения.
Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019).

Номинальная концентрация Рассчитанная концентрация APAP (ЗМ) Средняя S.D.b К.В. Dev
(Ям) (Трипликат каждой концентрации) (Ям) (Ям) (%)c (%)d
Номер анализа 1 2 3 4 5
0,25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 26,03 евро
0,50 (ЛЛОЗ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 14,97 евро
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 6,85 евро
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 1,56 евро
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 0,01 евро
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 0,05 евро
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Таблица 3: Межуголовая вариация - точность, точность и линейность стандартных образцов кривой, подготовленных в смеси среды Williams с буфером ацетата аммония 0.10 M (1:1, v/v) из шести отдельных анализов. a
a Линейная кривая была установлена на данные для ответа(APAP) по сравнению стеоретической концентрацией, как описано в Экспериментальном. Рассчитанная концентрация была получена на основе чтения ответа для каждого стандартного образца на кривой калибровки. Каждая запись (анализ 1-5) соответствует среднему значению тройного анализа.
б Стандартное отклонение SD.
c C.V. (коэффициент вариации. точность).
d г Точность (DEV %) - отклонение расчетной концентрации от номинального значения.
Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019).

Уильямс средний Номинальная концентрация Измеренная концентрация Памяти. К.В. Dev
(Ям) (Ям) (Ям) (%) (%)
Внутриутробный (n-3) 0,50 (ЛЛОЗ) 0.49 0.08 15.55 1,77 евро
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 8,37 евро
90.00 82.29 1.75 2.13 8,57 евро
Межгонаутовный (n-15) 0,50 (ЛЛОЗ) 0.43 0.05 10.99 14,97 евро
4.50 4.37 0.19 4.42 2,99 евро
45.00 42.35 0.82 1.93 5,88 евро
90.00 85.22 2.25 2.65 5,31 евро
DMEM средний Номинальная концентрация Измеренная концентрация Памяти. К.В. Dev
(Ям) (Ям) (Ям) (%) (%)
Внутриутробный (n-3) 0,50 (ЛЛОЗ) 0.47 0.09 18.77 6,35 евро
4.50 4.45 0.30 6.63 1,04 евро
45.00 44.24 1.59 3.58 1,69 евро
90.00 86.40 4.09 4.73 4,00 евро
Межгонаутовный (n-12) 0,50 (ЛЛОЗ) 0.46 0.08 17.81 7,75 евро
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Таблица 4: Внутри- и межучрежреждие точность и точность ДЛЯ APAP в образцах контроля качества. a
a Данные отображаются как средние. SD (стандартное отклонение). C.V. (коэффициент вариации. точность) и точность (процентное отклонение. ДЕВ%).
Эта цифра была изменена с Марин и др. Ацетаминофен поглощения и метаболизма в кишечнике / печени микрофизиологической системы. Chem Biol Взаимодействие. 299, 59-76 (2019).

Праймер (5' → 3')
Ткани Ген Вперед Обратный
Кишечника SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgACggT
NA-K-ATPase ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggag TgTgggCTgCTGATTTTgg
Печени Альбумина TgCAAggCTgATAAggAg TTTAGAGagggTtTggCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC АгкагаггаагкггААТААГ
CPY3A4 ggAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgGAAggCTggAg

Таблица 5: В режиме реального времени qPCR праймеры для оценки транскрипции генов на уровне мРНК в 2-OC культур для кишечника и тканей печени

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Точная и надежная оценка фармакологических свойств новых препаратов имеет решающее значение для снижения риска на следующих этапах развития. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностической мощности и сокращение затрат и времени, затраченных на доклинтические испытания. Наша группа продвигается в оценке фармакокинетических и токсикологических свойств, в основном необходимых для оптимизации свинца. Мы работали с 2-OC микрофлюидным устройством, которое имеет две камеры, что позволяет интеграцию двух органоидов. APAP был выбран потому, что он имеет много высококачественных человеческих данных, в основном метаболизируется печенью, а также отображает гепатотоксические свойства. Протокол исследования, направленный на подражание некоторым шагам человеческой фазы I клинических испытаний, где препарат вводится устно добровольцам, и периодические образцы крови взяты для оценки концентрации препаратов, чтобы знать фармакокинетические свойства и биохимические и клинические параметры собираются для оценки безопасности и переносимости. Поэтому, когда MPS развивается достаточно, чтобы обеспечить надежные прогнозы, это значительно снизит риск сбоя в фазе I судебного разбирательства. Добавляя модели заболеваний в будущем, то же предположение, возможно, будет применяться к фазам II и III клинических испытаний.

Все исследования проводились в трех моделях: Intestine 2-OC (APAP устное введение), Печень 2-OC (внутривенное введение), и кишечник / печень 2-OC (устное введение). Первая модель изолировала поглощение, вторая - обмен веществ, а третья интегрировала и то, и другое. Сначала мы произвели органоиды и включили в микрофлюидное устройство, во-вторых, ввели APAP и собрали образцы мультимедиа, а в последний раз провели набор тестов для оценки жизнеспособности и функциональности клеток и токсикологического воздействия воздействия APAP. Для фармакокинетических исследований мы разработали и подтвердили хроматографический метод количественной оценки APAP в среде. Проверка соответствовала Директиве по биоаналитическому методу Проверки относительно специфичности, линейности, предела количественной оценки (ЛОЗ), предела обнаружения (LOD), матричного эффекта, точности и точности, как указано FDA29,30. Специфика была установлена с пустыми, объединяются, и отдельные биологические образцы из двух различных источников. Метод, выполненный приемлемо в ходе анализа, и данные подтвердили способность простой изократической мобильной фазы отделять и количественно APAP.

Жизнеспособность/функционально органоидов кишечника и печени оценивалась различными методами. Для кишечника эквивалент, конфокальные флуоресценциимикроскопии ( Рисунок 2A-B), MTT анализ (Рисунок 2C), оценка экспрессии генов (Рисунок 2D-F) или HCA эксперимент, не обнаружили токсичности 24 ч после воздействия APAP. Аналогичным образом, MTT анализ не обнаружил токсичных оскорблений, вызванных APAP в печени эквиваленты (Рисунок 3A). Тем не менее, метод HCA добавил возможность обнаружения очень ранних токсичных событий (24 ч после воздействия APAP) для клеток печени, путем наблюдения за клеточными фенотипическими изменениями, с некоторыми механистическими подсказками(рисунок 3D). С другой стороны, конфокальные микроскопиифлуоресценции (рисунок 3B) игистологии ( рисунок 3C) были показаны, чтобы быть полезным дополнительным инструментом в исследовании статуса жизнеспособности эквивалентов человеческой ткани. Для клеток печени, одновременное использование различных методов было очень выгодно. Анализ МТТ, как упоминалось ранее, не смог обнаружить цитотоксичность APAP, обнаруженную HCA 24 h после воздействия APAP. Анализ экспрессии генов оценивал функциональность кишечника(рисунок 2D-F)и органоидов печени(рисунок 4A-D)как на базальной, так и на 24 ч после лечения APAP. В базальных условиях, были нормальные уровни кишечных и печени конкретных маркеров, предлагая надлежащую функциональность. После 24 ч воздействия APAP произошло снижение уровня альбумин, GST mRNA и тенденция к снижению экспрессии генов CYP3A4 в тканях, эквивалентных печени, что указывает на раннюю цитотоксичность APAP. Подтверждая эти выводы, западные blotting эксперименты показали, что сокращение экспрессии генов также сопровождается устойчивым сокращением печени общее выражение белка альбумин в ответ на лечение APAP (Рисунок 4E-F), подтверждающие токсичные оскорбления, наложенные на ткани печени путем воздействия APAP. Соответственно, эксперименты ферментативной активности in vitro показали надежное и прогрессивное снижение уровня активности CYP 3A4, вызванного лечением APAP, в эквивалентах печени(рисунок 4H-I).

Морфометрическая статистика органоидов была выполнена на изображении J(рисунок 3E-I). Область показывает, насколько близок 2D размер для всех органоидов проанализированы, которые могут быть использованы в качестве стандартизации в этом протоколе, так что беспристрастный результат может быть произведено. «Дескрипторы формы» раскрывают статистику, соответствующую именно морфологии формы. Коэффициент аспекта является индексом, который использует основные и незначительные оси, так что результаты около 1 указывают на отсутствие смещения (т.е. преференциального роста) во время органоидного образования. Значения округоя (4 ×/(π × (основнаяось) 2)) очень чувствительны к преференциальному росту, который будет показан в качестве основной оси. Твердость (область)) имеет важное значение для отображения валовой морфологии, поскольку она не зависит от нарушений в границах, поскольку она использует вытявную область (envelope). Распределения вокруг 1.0 указывают на сшативый сферический рост. И наоборот, циркулярность (4× π «область»/«периметр»2) очень чувствительнак сложному периметру, поэтому «полости» или «карманы» повлияют на этот индекс. Таким образом, циркулярность вокруг 1 также подтверждает предположительной сферической роста, совместимой с надлежащей органоидной функциональности.

Аналитические результаты показали, что MPS может эмулировать apAP поглощения и метаболизма свойства, как изолированные или интегрированы в кривой сопоставимы с тем, что производится in vivo(рисунок 5F) без фазы выделения. Поглощение APAP было похоже после устного введения как кишечника MPS или кишечника / печени MPS моделей, как в статических и динамическихусловиях (рисунок 5A-B, Рисунок 5D-E). В обоих случаях концентрация APAP уменьшается на апической стороне, сопутствуя ее увеличению на базолатеральной стороне, без существенной разницы для статических и динамических условий. В отличие от этого, АПАП печеночная метаболизма отличается в этих условиях. Циркулирующие средства массовой информации в MPS, казалось, улучшить органоидные метаболическиевозможности (рисунок 5C и рисунок 5E). Был значительный APAP распада под поток не видел без потока. Интересно, что эксперименты по активности in vitro , CYP3A4 подтверждают гипотезу отом, что наличие потока в системе увеличивает функциональность эквивалентов печени человека. Как показано на графике на рисунке 4J, активность CYP 3A4 была значительно выше в эквивалентах печени поддерживается под потоком как в базальных и APAP условиях лечения. Аналогичным образом, эквиваленты печени, которые хранятся под потоком (динамический) показали тенденцию к увеличению экспрессии белка альбумин по сравнению с теми, которые хранятся без потока (статические) как на базовом уровне или в APAP обработанных условиях (Рисунок 4G).

По сравнению с профилем концентрации времени после устного введения APAP для человека, наша микрофизиологическая система показывает гораздо больше т1/2 (половина жизни) (Рисунок 5F). Это происходит, как упоминалось ранее, потому что в то время как у нас есть двухохордная система с кишечником и печенью эквиваленты, которые могут поглощать и усваивать препарат, нет почки эквивалентно выделять APAP и его метаболиты из плазменногоотсека 38. В дополнение к этому, микрофизиологическая система показывает меньше Cmax (пик концентрации плазмы) и больше tmax (время для достижения Cmax), чем то, что обычно наблюдается для человека(рисунок 5F). Это является следствием различий в масштабе экспериментов in vitro и in vivo. Обще, 3 главным образом разницы между профилем концентрации-времени полученным используя микрофизиологическую систему и профили полученные после устного введения APAP к людям: большле t1/2,более малый максимум cи болеебольшой t макс(рисунок 5F). В то время какбольше т 1 / 2 связано с отсутствием почки эквивалент выделять APAP и его метаболитов из плазменного эквивалента, меньше Cмакс и больше тмакс являются последствиями малого масштаба эксперимента по сравнению с человеческим телом. Наилучшие стратегии масштабирования для создания и эксплуатации микрофизиологических систем по-прежнему являются активной областью исследований, и маловероятно, что единый подход является оптимальным для всехсистем 39. Кроме того, математическое моделирование или машинное обучение может быть использовано для применения исправлений или изучения картирования от микромасштаба до полного масштаба, чтобы экстраполировать данные in vitro, полученные с помощью микрофизиологических систем, на поведение in vivo, наблюдаемоеу человека 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Кристи Гуген-Гийозо, д-ра Филиппа Грипона в подразделении 522 INSERM и доктора Кристиана Трепо в подразделении 271 INSERM за использование биологического материала (клетки Hepa RG) и за то, что он был доступен для нас для проведения научных исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

Химия выпуск 166 Микрофизиологическая система Ацетаминофен ADMETox Органоиды
Микрофизиологическая система кишечника/печени для фармакокинетической и токсикологической оценки лекарственных препаратов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter