Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS'de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.

Abstract

Yakın zamanda tanıtılan mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) insan organoidlerini yetiştiren, genetik olarak insan oldukları ve dokular arasındaki etkileşimi yeniden özetledikleri için ilaç geliştirme sürecinin klinik öncesi test aşamasında hayvanlardan daha iyi performans göstermesi beklenmektedir. Bu çalışmada, insan bağırsak bariyeri (Caco-2 ve HT-29 hücrelerinin ortak kültürü ile taklit) ve karaciğer eşdeğeri (farklılaştırılmış HepaRG hücreleri ve insan hepatik stellat hücrelerinden oluşan küresel ler tarafından taklit edilmiştir) bazı asetaminofen (APAP) farmakinetik (PK) ve toksik özellikleri değerlendirmek için iki organlı çip (2-OC) mikroakışkan cihaza entegre edilmiştir. MPS üç derlemeleri vardı: Bağırsak sadece 2-OC, Karaciğer sadece 2-OC, ve Bağırsak / Karaciğer 2-OC aynı ortam her iki organoidperile. PK değerlendirmeleri için, apap'ı bağırsak bariyerinin üzerinden (sözlü rotayı taklit) veya medyada (intravenöz rotayı taklit ederek) uyguladıktan sonra, amedia'ya sırasıyla 12 μM ve 2 μM dozladık. Ortam örnekleri ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz edildi. Organoidler gen ekspresyonu, TEER değerleri, protein ekspresyonu ve aktivitesi için analiz edildi ve daha sonra toplandı, düzeltildi ve bir dizi morfolojik değerlendirmeye sunuldu. MTT tekniği organoid canlılığı değerlendirmede iyi performans gösterdi, ancak yüksek içerik analizleri (HCA) APAP tedavisine yanıt olarak çok erken toksik olayları tespit edebildi. Medya akışının APAP emilimini önemli ölçüde etkilemediğini, ancak karaciğereşdeğerinin işlevselliğini önemli ölçüde iyileştirdiğini doğruladık. APAP insan bağırsak emilimi ve hepatik metabolizma MPS taklit edilebilir. MPS verileri ile silico modelleme arasındaki ilişki, in vitro yöntemlerin öngörülebilirliğini artırmak ve farmakokinetik ve toksikolojik çalışmalarda hayvan modellerinden daha iyi doğruluk sağlamak için büyük bir potansiyele sahiptir.

Introduction

Genomik ve proteomik farklılıklar nedeniyle, hayvan modelleri çeşitli insan sonuçları için sınırlı tahmin değerine sahiptir. Ayrıca, onlar zaman alıcı, pahalı ve etik şüpheli1. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testler ile harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Organoid-organoid iletişimi teşvik eden medya akışı altında organoidler (organların yapay mimetik fonksiyonel birimleri) yetiştiren mikroakışkan cihazlardır. İnsan hücrelerinden yapılan organoidler çeviri alakaartış 2,3,4. MPS'nin hayvan testlerinden daha iyi performans göstermesi beklenmektedir çünkü genetik olarak insandırlar ve dokular arasındaki etkileşimi özetlerler. Tam olarak işlevsel olduğunda, MPS daha anlamlı sonuçlar sağlayacaktır, daha yüksek hızda ve daha düşük maliyetler ve riskler4. Birçok grup çeşitli amaçlar için MPS geliştiriyor, özellikle hastalığın etkinliğini test etmek için hastalık modelleri.

Maruz kalma düzeyi ilaç etkinliği ve toksisite değerlendirmek için en kritik parametrelerden biridir5,6,7,8,9,10,11,12. MPS sistemik maruziyet taklit organoid entegrasyonu sağlar ve geleneksel 2D insan doku kültüründen daha iyi performans bekleniyor. Bu teknoloji önemli ölçüde bileşik bağırsak emilimi ve karaciğer metabolizması tahmin artırabilir4.

Bağırsak ve karaciğer insan eşdeğer modeli entegre bir MPS iyi bir başlangıç noktasıdır, ilaç biyoyararlanım ve sistemik maruz kalma bu iki organın merkezi rolü göz önüne alındığında13,14,15. APAP onun metaboliti karaciğer tarafından ağırlıklı olarak yapılır çünkü bir MPS okumak için cazip bir ilaçtır16,17.

2-OC iki farklı insan eşdeğer doku / organoidler mikrokanallar16ile birbirine kültür için uygun iki odalı mikroakışkan cihazdır. Bir ilacın in vitro insan oral/intravenöz yönetimini taklit etmek ve bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri arasındaki çapraz konuşmanın APAP farmakokinetiği üzerine etkilerini değerlendirmek için, organoidlerin işlevselliği ve canlılığının yanı sıra, üç farklı MPS derlemesi gerçekleştirildi: (1) 2-OC cihazına entegre edilmiş Caco-2 + HT-29 hücre koculture içeren bir kültür eklemesine dayalı bir bağırsak eşdeğerinden oluşan bir "Bağırsak 2-OC MPS"; (2) 2-OC cihazına entegre edilmiş HepaRG + HHSteC (İnsan Hepatik Stellat Hücreleri) içeren karaciğer küresellerinden oluşan bir "Karaciğer 2-OC MPS"; ve (3) bir cihaz bölmesinde bağırsak eşdeğeri oluşan bir "Bağırsak / Karaciğer 2-OC MPS" mikroakışkan kanallar aracılığıyla medya akışı ile diğer karaciğer eşdeğeri ile iletişim.

Tüm tahliller statik altında yapıldı (hiçbir akış) ve dinamik (akış ile) mekanik uyaranların etkisi nedeniyle (sıkıştırma, germe, ve kesme) hücre canlılığı ve işlevleri18,19,20. Bu makalede, insan bağırsağı ve karaciğer eşdeğeri modelleri içeren 2-OC MPS'de APAP oral/intravenöz uygulama öykünme protokolü ve ilgili emilim/metabolizma ve toksikolojik analizler açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 2-OC'de ekim için doku eşdeğerlerinin üretimi

  1. İnce bağırsak bariyereşdeğerüretimi
    1. Bağırsak eşdeğer imasını kullanarak Caco-2 ve HT-29 hücrelerini koruyun: DMEM %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ve bu el yazmasında "DMEM S" olarak adlandırılan esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiştir.
    2. Ortayı çıkarın, 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve hücre kültürü şişelerinde yetiştirilen Caco-2 hücrelerini ayırmak için %0,25 Tripsin/EDTA'dan 8 mL ekleyin (175 cm2). 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve en az çift hacimli tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurun. HT-29 hücreleri için aynı işlemi uygulayın, bu hücrelerin daha küçük bir miktar gerekli olduğundan ve daha küçük şişelerde muhafaza edildiğiiçin reaktif hacimlerini ayarlayın (75 cm2).
    3. 5 dk için 250 x g santrifüj, her iki tüpten supernatant çıkarın ve DMEM S. Count hücrelerinin 10 mL hücre pelet leri yeniden askıya, bir hücre canlılığı% 80'den daha yüksek güvence. Daha önce basolateral tarafta (insan kan dolaşımını temsil eden) kuyu başına 400 μL DMEM S ile doldurulmuş 24 kuyulu bir plakaya hücre kültürünü entegre edin.
    4. Co-9:121oranında Caco-2 ve HT-29 hücreleri yetiştirmek . 2.25 x 105 Caco-2 ve 2.5 x 104 HT-29 hücrelerini dmem S.'nin 200 μL'lik son hacminde her bağırsağa eşdeğer kullanın. Dikkatlice karıştırın.
    5. Pipet 200 μL hücre çözeltisi her kesici tarafına (insan bağırsak lümeni tarafını temsil eder), kesici uç başına 250.000 hücre tohumlama. Üç hafta22için ekler hücreleri yetiştirmek . Orta yı haftada en az üç kez değiştirin, steril pasteur pipetiyle hem apikal hem de bazolateral kenarlardan aspire edin, bozulmamış hücre bariyerine zarar vermemeye özen.
      NOT: Hücre bariyerine dokunmamak için aspirasyona devam edin (hücre ucunun plastik kenarındaki Pasteur pipetini destekleyerek aspire edin).
    6. Üreticinin talimatlarına göre, her üç günde bir23voltmetre kullanarak TEER (transepitelyal elektrik direnci) ölçerek sıkı monolayer oluşumunu kontrol edin.
      1. Hücre olmadan, aynı hücre ortası ve aynı hücre plakası ile bir hücre kültürü eklemek boyunca direncini ölçerek, boş gerçekleştirin.
      2. Doku eşdeğeri dirençboş direnci çıkararak doku direncini hesaplayın ve filtre membranının etkili yüzey alanı (0.6 cm2)ile çarpın. İyi bir bağırsak bariyerdirenci 150 ila 400 Ω cm2arasındadır.
        NOT: 21 gün sonra hücreler tam olarak ayırt edilmeli ve bağırsak bariyeri oluşmalıdır, böylece bağırsak eşdeğerleri MPS'ye entegre edilmeye hazırdır.
  2. Karaciğer eşdeğerleri üretimi
    1. William'ın Orta E%10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 100 adet/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 5 g/mL insan insülini ve 5 x 10-5 M hidrokortizon ile desteklenen ve bu el yazmasında "Williams E S" olarak adlandırılan karaciğer eşdeğer imasını kullanan HepaRG hücrelerini koruyun. HepaRG ortamını 2-3 günde bir yenileyin ve hepatosit ve kolanjiyositlerde farklılaşmayı başlatmak için iki hafta hücre kültürünü koruyun.
    2. İlk iki hafta sonra, hücre farklılaşması24,25tamamlamak için ek bir iki hafta boyunca HepaRG orta% 2 DMSO ekleyin. Stellate Cell Media 'da (SteC CM) POLI-L-lizin kaplı hücre kültürü şişelerini kullanarak, her iki veya üç günde bir ortam değiştirerek HHSTeC'i büyütün.
    3. Hücre kültürü şişelerinde yetişen HepaRG hücrelerini ayrıştırmak için ortayı çıkarın, 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve 8 mL %0,05 Tripsin/EDTA ekleyin (175 cm2). 37 °C'de 5 ila 10 dakika kuluçkaya yatırın ve tripsin inhibitörü hacminin en az iki katını ekleyerek reaksiyonu durdurun. Bu hücrelerin daha küçük bir miktar gerekli ve daha küçük şişelerde muhafaza edilebilir beri reaktif hacmi adapte, HHSTeC için aynı gerçekleştirin (75 cm2).
    4. 5 dk için 250 x g hem santrifüj, supernatant kaldırmak ve Williams E S orta hücre pelet resuspend. Hücreleri sayarak hücrenin canlılığını %80'in üzerinde sağlar.
    5. HepaRG ve HHSTeC hücrelerini 24:1 oranında birleştiren karaciğer küresellerini sırasıyla Williams E S orta16'daüretin. 4.8 x 104 diferansiye HepaRG ve 0.2 x 104 HHSTeC ekleyin, 50.000 hücreden oluşan her karaciğer küreseloidini 80°L hacimde oluşturun. Dikkatlice karıştırın.
    6. Çok kanallı bir pipet kullanarak, yuvarlak dip geometrisine sahip 384 küresel mikroplakanın her kuyununda kombine hücre havuzunun 80 μL'sini dağıtın.
      NOT: Dört gün sonra yaklaşık 300 μm'lik küresel ler oluşur.
    7. Geniş delikli ipuçları kullanarak, gerekli "bire bir" sayma sağlayan ultra-düşük bağlı 6 iyi plakalar, karaciğer sferoidleri aktarın.

2. Bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerinin 2-OC MPS ile entegrasyonu

  1. Emilim için bağırsak 2-OC MPS montajı
    1. Pipet 500 μL DMEM S 2-OC ve 300 μL daha büyük bölmesi içine küçük bir. 24 kuyu plakasında ki her bağırsak bariyerinin eşdeğeri olan bazolateral ve apikal ortamı aspire edin. Steril çöçler kullanarak, 2-OC devrebaşına bir kesici uç, özellikle büyük bölmeye entegre edin. Apical tarafında bağırsak orta 200 μL uygulayın.
      NOT: Organoidleri MPS'ye entegre ederken kabarcıkoluşumundan kaçının.
    2. MPS'yi basınçlı hava beslemesine bağlanması gereken kontrol ünitesine bağlayın. Parametreleri ayarlayın: yaklaşık 300 bar ± basınç ve 0,3 Hz bir pompalama frekansı. Test maddesi yönetiminden önce akışı 24 saat başlatın. Ertesi gün, APAP tedavisini gerçekleştirin.
  2. Metabolizma teşrisi için karaciğer 2-OC MPS montajı
    1. Pipet 650 μL Williams E S büyük bölme içine ve 350 μL küçük bölmeiçine, hangi küresel alacak. Ultra-düşük eki 6 kuyu plakalarında, geniş delikli ipuçları kullanarak küreselleri sayın. Her karaciğer eşdeğeri yirmi spheroidsoluşur 26. Sadece organoidlerin 2-OC'nin daha küçük bölmesine aktarılmasına izin veren geniş uçlu ipuçları nı kullanarak devre başına yirmi karaciğer eşdeğerini entegre edin.
    2. MPS'yi basınçlı hava beslemesine bağlanması gereken kontrol ünitesine bağlayın. Parametreleri ayarlayın: yaklaşık 300 bar ± basınç ve 0,3 Hz bir pompalama frekansı. Test maddesi yönetiminden önce akışı 24 saat başlatın. Ertesi gün, APAP tedavisini gerçekleştirin.
  3. Emilim ve metabolizma teşrisi için bağırsak/Karaciğer 2-OC MPS montajı
    1. İki media (bağırsak ve karaciğer) 1:4 oranında birleştirin, bu da bağırsak apical tarafında 200 μL DMEM S ve bazolateral tarafta Williams E S 800 μL anlamına gelir. Bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini aynı anda 2-OC'ye entegre edin.
    2. MPS'yi basınçlı hava beslemesine bağlanması gereken kontrol ünitesine bağlayın. Parametreleri ayarlayın: yaklaşık 300 bar ± basınç ve 0,3 Hz bir pompalama frekansı. Test maddesi yönetiminden önce akışı 24 saat başlatın. Ertesi gün, APAP tedavisini gerçekleştirin.
      NOT: Tüm deneylerde, üç ayrı 2-OC devresi (yani, 1 ve 1/2 2-OC cihazlar) anlamına gelen triplicate'de her zaman noktasını gerçekleştirin. Her 2-OC devrenin toplam hacmi 1 mL'dir.

3. Asetaminofen (APAP) hazırlık

  1. APAP stok çözeltisini hazırlayın, APAP'ı mutlak etanolde eritin. Deney günü, apap'ı ilgili ortamda (APAP çözeltisi) seyreltin, "oral uygulama" için 12 μM ve "intravenöz uygulama" için 2 m konsantrasyona kadar seyreltin.
  2. Araç kontrol ve tedavi çözeltisindeki son etanol konsantrasyonunun her iki yönetim için de %0,5 olduğundan emin olun. Pozitif kontrol için (100 mM APAP), etanol konsantrasyonu %2'dir.

4. Madde yönetimi ve ortam örneklemetest

  1. APAP "sözlü" yönetimi ve medya örneklemesi
    1. 2-OC. Pipet 500 μL'lik uygun kültür ortamının her bağırsak bariyerindeki basolateral ve apikal ortamı organoid bazolateral taraftaki büyük bölmeye ve 300°L'lik küçük bölmeye aspire edin.
    2. Kabarcıklar için kontrol edin ve oral uygulama taklit, apikal tarafında test maddesi ile bağırsak bariyereşdeğer tedavi ile devam edin. Bağırsak kültürü eklerin apikal tarafına 12 μM APAP çözeltisinin 200 μL'lik kısmını ekleyerek APAP "oral" yönetimini taklit edin (Şekil 1B). MPS'yi kontrol ünitesine bağlayın.
    3. Aşağıdaki zaman noktalarında apikal ve bazolateral kenarlardan toplam hacmi toplamak: 0 h, 5 dk, 15 dk, 30 dk, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, ve 24 h15,27. Tüm deneyleri, statik ve dinamik koşullarda triplicate olarak gerçekleştirin ve her üç katının her örneğini ayrı bir mikrotüpte toplayın. Örnekleri HPLC/UV kullanarak analiz edin.
      NOT: Ayrı apikal ve bazolateral örnekler.
  2. APAP "intravenöz" yönetimi ve medya örneklemesi
    1. 2 μM APAP çözeltisini doğrudan karaciğer bölmesi içine vererek "intravenöz" rotayı taklit edin. Tüm 2-OC orta içeriği aspire. Pipet 650 μL Williams E S büyük bölme içine test maddesi içeren ve 20 küresel içeren küçük bölme içine aynı ortam 350 μL. Aşağıdaki zaman noktalarında tüm hacimleri toplayın: 0 h, 30 dk, 1 saat, 2 saat, 3 saat, 6 h, 12 saat ve 24 h27,28.
    2. Tüm deneyleri üç katı, statik ve dinamik koşullarda gerçekleştirin. Her bir örnek, her üçkif, ayrı bir mikrotüp içinde toplayın. Örnekleri HPLC/UV kullanarak analiz edin.

5. Enstrümantasyon ve kromatografik koşullar

  1. HPLC analizi
    1. HPLC analizi için ilgili tüm parametreleri Tablo 1'egöre ayarlayın.
    2. Mobil fazı vakum altında 0,45 μm membran filtreden filtreleyin. Numuneleri 0,22 m gözenek boyutunda PVDF şırınga filtresinden (çap 13 mm) filtreleyin ve bir şişede saklayın. Ölçümü başlatın.
  2. Stok çözümleri, kalibrasyon standartları ve kalite kontrol (QC) numuneleri
    1. 0,25 ile 100,00 μM arasında değişen çalışma çözümlerini elde etmek için amonyum asetat tamponu (100 mM, pH 6.8) ve Amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S ve Williams E S hücre kültürü ortamı ile 10 mM APAP stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Üç aylık kalibrasyon örneklerinin yanı sıra üç aylık dört seviyedeki kalite kontrol örneklerini de dahil edin. Seri seyreltme ile bu standartları hazırlayın.
    3. APAP tepe alanlarının kalibrasyon eğrilerini APAP nominal standart konsantrasyonlarına karşı oluşturun. Her kalibrasyon eğrisi için doğrusal regresyon uygun belirleyin. Çeşitli kalibrasyon modellerinin uygunluk larını görsel muayene, korelasyon katsayısı, çalışma içi ve inter-run doğruluk ve hassas değerlerle değerlendirin.
    4. DMEM S ve Williams E S ortam amonyum asetat tampon (1:1, v / v) sextuplicate seyreltilmiş boş örnekleri enjekte. 0,50 (LOQ), 4.50, 45.00 ve 90.00 μM APAP konsantrasyonları için amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S ve Williams E S ortamlarında kalite kontrol örneklerinin triplicates hazırlayın.
    5. Kalite kontrol örneklerinin standart bir eğri oluşturmak için kullanılandan farklı olarak yeni bir stok çözeltisinden hazırlandığından emin olun. Çalışma içi ve iç-çalışma varyasyonlarını araştırmak için kalite kontrol örneklerini kullanın.
  3. Doğrulama yordamları
    1. Daha önce bildirilen yordamları29,30aşağıdaki biyoanalitik yöntem doğrulama gerçekleştirin. Williams E S ve DMEM S hücre kültürü ortamı nı göz önünde bulundurarak, beş ya da altı ayrı olayda kromatografik koşuları gerçekleştirin.
    2. Amonyum asetat arabelleği (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S veya Williams E S hücre kültürü ortamlarında 0,25 ile 100,00 μM arasında değişen kalibrasyon noktalarının, ilgili nominal konsantrasyonlara (x ekseni) karşı APAP'ın (eksen y) tepe alanlarına göre çizilmesini sağlayın. Bu standart kalibrasyon eğrilerinin eğimlerini amonyum asetat tamponu içinde hazırlanan kalibrasyon eğrisi eğimleri ile karşılaştırın. Tüm kalibrasyon eğrilerinin en az 0,998 korelasyon değerine sahip olduğundan emin olun.
    3. Beş veya altı farklı günde lloq, düşük, orta ve yüksek kalite de çoğaltıcılar kullanarak vekil matris analiziçin kesinlik ve doğruluk (intra ve inter-run) belirleyin. 0.50, 4.50, 45.00 ve 90.00 μM APAP konsantrasyonları (n= 3) içeren amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) seyreltilmiş DMEM S veya Williams E S hücre kültür ortamlarında aynı gün intra-run hassas ve doğruluk ölçümleri yapın.
    4. Yakın zamanda elde edilen kalibrasyon eğrilerinden APAP konsantrasyonlarını içeren her kalite kontrol numunesini değerlendirin. Tahlillerin seçiciliğini, bileşenlerin karışması sonucu oluşan ilgi bileşiğinin ve olası diğer kromatografik zirvelerin ayrılması derecesine göre test edin.
  4. Alt ölçüleme sınırı (LLOQ) ve algılama sınırı (LOD)
    1. Yanıtın standart sapmasını ve eğim yaklaşımını temel alan alt nicelik sınırını (LLOQ) belirleyin. α y-intercept standart sapma ve S kalibrasyon eğrileri29,30çizerek elde edilen düz çizgi eğimi olan formül 10α/S kullanarak hesaplayın. Kalibrasyon eğrisi29,30eğimi ile bölünmüş, boş standart sapma 3,3 kez dikkate alarak algılama sınırı (LOD) tahmin.

6. Doku eşdeğerleri canlılık/işlevsellik

  1. Mtt
    1. MPS tayininin tüm zaman noktalarında organoid canlılığı değerlendirmek için bir MTT tayini yapın. Negatif kontrol olarak, hücre ortamı artı araç kullanın. Pozitif kontrol olarak organoidleri 100 mM APAP ve hücre ortasında seyreltilmiş %1 NaOH ile tedavi edin.
    2. 96 kuyu plakasında ki her bir kuyunun 20 küresel ini aktarımı ve bağırsak eşdeğerlerini içeren hücre kültürü, kuyu başına bir bağırsak eşdeğeri yerleştirerek 24 kuyu hücresi plakasına yerleştirin. Doku eşdeğerlerini 1x DPBS ile üç kez yıkayın.
    3. 1 mg/mL MTT çözeltisinin 300 μL'sini ekleyin, her kuyu başına ilgili hücre ortasında seyreltilir. Standart hücre kültürü koşullarında plakaları 3 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Borular üzerinde mtt çözeltisini dikkatlice her kuyudan çıkarın. 4 °C'de bir gecede her kuyuda 200 μL isopropanol kullanarak bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerinden MTT formazan ayıklayın.
      NOT: Buharlaşmayı önlemek için kapağı kapatın.
    5. Her bir süpernatantın 200 μL'sini 96 kuyulu mikro test plakasında önceden tanımlanmış olana aktarın. Boş olarak isopropanol kullanın.
    6. 570 nm bir plaka okuyucu formazan absorban okuyun. MTT azaltmak için hücrelerin göreli yeteneğini hesaplamak (%) her zaman noktasının ortalama optik yoğunluğunu kullanarak, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, 100% hücre canlılığı olarak kabul.
  2. Sitokimya/Histoloji
    1. 0,1 M fosfat-salin tamponunda %4 (w/v) paraformaldehit kullanarak, oda sıcaklığında 25 dakika boyunca bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini düzeltin, pH 7.4. Organoidleri her seferinde 10 dakika PBS tamponunda 5 kez yıkayın. Leke tetramethylrhodamine izotiyoyanat-phalloidin veya Alexa Fluor 647 phalloidin, PBS311:50 ile bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri .
    2. Tam donma kadar sıvı nitrojen onları transfer etmeden önce RT de alışmak için birkaç dakika için OCT dondurma ortamına aktarın. Bir kriyostat kullanarak, yaklaşık 10-12 μm kalınlığında karaciğer sferoidler kriyokesitgerçekleştirin.
    3. DAPI ile montaj orta dokubölümleri monte. Konfokal floresan mikroskopi ile inceleyin.
    4. Belirlenen protokollere göre hematoksilin ve eozin boyama gerçekleştirmek için fiksasyon sonrası organoidleri dondurun. Yukarıda açıklandığı gibi doku dilimleme sonra montaj ortamı ile slaytlar monte ve optik mikroskop kullanarak histolojik görüntüler almak.
  3. Yüksek içerik analizi
    1. Hücrelerin mitokondriyal ve nükleer boyama
      1. 1 mM mitokondriyal boyama stoğu çözeltisi (örneğin, MitoTracker Deep Red FM) yapmak için DMSO'daki lyophilized tozunu yeniden oluşturun. Aliquoted stok çözeltisi ışıktan korunan -20 °C'de saklayın. 1 mM mitokondriyal boyama stoğunu, önceden ısıtılmış (37 °C) doku kültürü ortamında serumsuz son konsantrasyona (200 nM) seyreltin.
      2. Hücre kültürü ortamını kaldırın. Mitokondriyal boyama çözeltisini ilave ederek numuneyi tamamen kaplayacak ve %5 CO2ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 15-45 dakika boyunca inkübhücreleri ekleyin.
      3. Mitokondriyal boyama çalışma çözeltisini dikkatlice çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika pbs'de %2-4 paraformaldehit fiksatif ile değiştirin.
      4. Sabit hücreleri PBS ile 5 dakika hafifçe durulayın. Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.
      5. 10 mg/mL (16.23 M) nükleik asit boyama çözeltisi hazırlayın ve 10 mL ultra saf suda 100 mg Hoechst 33342 boyaer.
        NOT: Stok çözeltisi -20 °C'de ışıktan korunmalıdır.
      6. PBS'de 0.2-2.0 μg/mL nükleik asit boyama çalışma çözeltisi hazırlayın ve sabitlenmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca nükleik asit boyama çözeltisi ile inkübe edin.
      7. Nükleik asit boyama çalışma çözeltisini çıkarın ve hücreleri PBS ile 5 dakika üç kez hafifçe durulayın. Hücreler PBS'de 4 °C'de tutulmalı ve ışıktan korunmalıdır.
    2. Mitokondriyal ve nükleer boyama analizi
      1. Hücreleri nükleik asit lekesi (λEx/ λEm: 361/497 nm) ve mitokondriyal leke (λEx/ λEm: 644/665 nm) için uygun filtre setleri ile floresan mikroskobu kullanarak analiz edin. Nükleik asit pozitif boyama ile hücreleri bulmak ve hücre sayısını ölçmek. Mitokondride mitokondriyal leke floresan yoğunluğunu ölçün.
  4. ImageJ'de morfometrik ölçümler (küresel hesaplamalar)
    1. Columbus yazılımından *.flex dosyaları olarak Yüksek İçerik Analizi (HCA) görüntülerini dışa aktarın. Bio-Formats eklentisi32kullanarak ImageJ'de gri tonlama olarak .flex dosyalarını alma : Dosya > İçe Aktar > Bio-Formatlar.
    2. İçe Alma Seçenekleri penceresinde, Hyperstack görüntülemeyi seçin ve Split altındaki Split kanallarını ayrı pencerelere bölmeyi etkinleştirin. Bu seçenek, belirli bir kanaldaki tüm dosyalara (örneğin, DAPI, mitotracker, vb.) erişim sağlar. Bellek yönetimi altında sanal yığını kullan'ı seçmeyin.
      NOT: UV dalga boyunda (örneğin 405 nm) kültür ortamı azaldıkça görüntülerde DAPI kanalının "toz" olarak kullanılması tercih edilir.
    3. .flex dosyasındaki katıştırılmış değerlere göre yüklenmediyse piksel boyutunu(Analyze > Set Scale)ayarlayın. Gürültü fazlalarını gidermek ve şekil konturundaki düzensizlikleri önlemek için Gaussian Blur filtresi uygulayın. İşlem > Filtreler > Gaussian Bulanıklığı. Sigma (yarıçapı) 2,0 ve 3,0 arasında yüksek bir değer çoğu durumda için idealdir. Yığının birden çok görüntüsü varsa, hepsine uygulayın (İşlem Yığını penceresinde Evet'i seçin).
    4. Bir eşik kullanarak arka plan ve organoidleri (nesneleri) ayırmak için ikili bir görüntü oluşturun. Resim > Ayarla > Eşik' itıklatın. Kırmızı maskeyi kullanarak görüntüyü yoğunluğuna göre değerleri ayarlayın, organoid şekle uyacak şekilde morfolojiyi sağlam tutarak kullanın. Görüntünün beyaz bir arka planı varsa Koyu arka planı devre dışı edin. Uygula'yıtıklatın.
    5. Yığın'ı İkili pencereye dönüştür ünde Eşik yöntemini seçin. Genellikle, Varsayılan veya Üçgen görüntü işleme bu tür tercih edilir. Arka Planı KaranlıkOlarak Tutun. Yığında birden fazla resim varsa, her görüntü için Hesapla eşleği'ni seçin.
    6. İşlem > İkili > Boşlukları doldurun' useçin. İsteğe bağlı olarak, arka plandaki delikleri kaldırın. İşlem > İkili > Seçeneks'de Siyah arka planı seçin ve Boşlukları Yeniden Doldurun'u çalıştırın. Bir sonraki adıma geçmeden önce Siyah arka plan seçeneğini devre dışı kaltın.
    7. Ayrı nesneler. Organoidler için havza yöntemi iyi bir seçimdir. İşlem > İkili > Havza'yıtıklatın. Şekil çözümlemesi yürütmek.
      1. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'yıseçin. Çeşitli seçenekler mevcuttur (ayrıntılar https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Organoidler için Alan, Ortalama gri değeri, Min & max gri değeri ve Şekil tanımlayıcılarıseçin. İsteğe bağlı olarak, görüntüdeki nesneleri ve Bilimsel gösterimitanımlamak için Görüntü etiketini seçin. Tamam'ıtıklatın.
      2. Analiz > Parçacıkları Analiz Et'iseçin. Boyut ve Döngü sınırlarını seçin. Görüntüdeki tüm nesneleri ölçmek için sırasıyla 0-sonsuzve 0,00-1,00'i tutun. Göster'de,nesnelerin tanımlanması için Anahatlar'ı seçin. Sonuçları çıktıya Görüntülemeyi etkinleştirin; Kenarlıklara dokunan nesneleri hariç tutmak için kenarlarda hariç tutma; Nesnelerde nihai iç delikler ana şeklin bir parçası olarak kabul edilir böylece delikleri ekleyin.
    8. Her görüntü yığını için Şekil Çözümlemesi'ni tekrarlayın ve sonuçlar tek bir tabloya eklenir. Dosya > Virgülle Ayrılmış Değerler (.csv) dosyasında sonuç tablosunu Kaydet... olarak dışa aktar.
  5. Gerçek Zamanlı PCR
    1. Üreticinin talimatlarına uyarak fenol ve guanidin izotiyosiyanatmonohasic çözeltisi kullanarak doku eşdeğerlerinden RNA ayıklayın.
    2. Toplam RNA'nın 1 - 2 μg'lik ters transkripsiyonu ile cDNA sentezini gerçekleştirin.
    3. Gerçek zamanlı nicel PCR gerçekleştirmek için genözel astarlar(Tablo 5)kullanarak tüm hedefleri yükseltin. Her qRT-PCR 30 ng ters transkripsiyonu RNA ve her astar 100 nM içerir.
    4. PCR koşullarını takip edin: 50 °C 3 dakika (1 döngü); 95 °C 5 dakika (1 döngü); 30 saniye için 95 °C, 45 saniye için 59 °C ve 45 saniye (35 - 40 devir) için 72 °C.
  6. CYP tsur
    1. Karaciğer 2-OC montajı için bölüm 2.2'yi takip edin. Deney grupları hücre dışı kontrol, 12 saat, 24 saat için APAP 2 μM tedaviler ve araç kontrolütür. APAP 2 μM hazırlama ve tedavisi için 3.3 ve 4.2 bölümlerini takip edin.
      NOT: Tüm numunelerin CYP teşrisi için aynı anda hazır olmasını sağlamak için, 24 saatlik tedaviye başladıktan 12 saat sonra 12 saatlik tedaviye başlayın. CYP aktivitesinin hücresiz kontrolünü %0,5 etanol çözeltisi ile ve araç kontrolüyle tedavi edin.
    2. Oda sıcaklığında 3 mM luminojenik substrat stok çözeltisi çözülür ve William'ın E S.'sinde 1:1000 seyreltme yapın ışıktan koruyun.
    3. Küresel leri toplayın ve her deney grubunu 96 kuyuluk bir kuyuya aktarın. Ortayı çıkarın, 100 μL 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve kuyu başına 80 μL 3 m substrat çözeltisi ekleyin. William'ın E S ortasında ki hücre siz kontrolü tutun. Bir arka plan kontrolü için küresel veya substrat çözeltisi olmadan bir kuyu kaydedin. 37 °C'de %5 CO2ile 30-60 dk inkübasyon, ışıktan korunur.
    4. Östrojen ile Reconstitution Tampon kullanarak liyophilized Luciferin Algılama Reaktifi (LDR) dengeleyin. Girdap veya ters çevirerek karıştırın. Uygun hacimdeki hacmi bir sonraki adıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Yeniden oluşturulan LDR oda sıcaklığında 24 saat veya 4 °C'de 1 hafta aktivite kaybı olmadan saklanabilir. Uzun süreli depolama için –20 °C'de saklayın.
    5. Kuluçkadan sonra beyaz opak 96-kuyu mikroplakasının üç farklı kuyusunda bozulmamış küresel sferoidlerin süpernatantının 25 μL'sini aktarın. Kuyu başına 25 l LL ekleyin ve homojenize edin.
    6. Beyaz tabağı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bir luminometre üzerinde parlaklık okuyun. Florometre kullanmayın.
    7. Test bileşik işlenmiş ve işlenmemiş (araç kontrolü) değerlerinden arka plan parlaklık değerlerini (hücre kontrolü yok) çıkararak net sinyalleri hesaplayın. CYP3A4 aktivitesinin yüzde değişimini, net işlem görmüş değerleri net işlenmemiş değerlere bölerek ve 100 ile çarparak hesaplayın.
  7. Batı lekeleme
    1. Karaciğer küresellerini tanımlanmış 1,5 mL mikrotüpe aktarın. Ortayı çıkarın ve 1x DPBS'nin 100 μL'si ile iki kez yıkayın.
    2. 20 dakika boyunca 4 °C'de 100 μL hücreli RIPA tamponunda karaciğer küreseloidlerini incele. 15 dakika, 4 °C ve 11000 rpm için santrifüj. Supernatant'ı başka bir tanımlanan 1,5 mL mikrotüpe aktarın.
    3. Bradford yöntemi ile elde edilen protein miktarını ölçün. Bir degrade poliakrilamid jelin in de başına ölçülen hücre lisatından 10 ila 50 μg arasında protein yükleyin ve bir SDS-PAGE gerçekleştirin.
    4. Yüklü proteini jelden yarı kuru sistem ekipmanı aracılığıyla 0,22 μm PVDF membrana aktarın. 50 mM Tris-HCl ve 192 mM glisin aktarım çözeltisi kullanın. Ekipman parametrelerini aktarılacak jel sayısına göre ayarlayın (bir seferde 1-2).
    5. TBS-T tamponunda %3-5 yağsız süt çözeltisi ile PVDF membranındaki spesifik olmayan etkileşimleri engelleyin: Tris-Tamponlu Salin (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM sodyum klorür) Tween 20'nin %0.1'i ile desteklenmiştir. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sürekli sallayarak membran altında tutun.
    6. Oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca hafifçe sürekli sallayarak altında TBS-T ile yıkayın. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın.
    7. TBS-T'de sırasıyla 1:1000 ve 1:2000'e kadar seyreltik albumin ve vinkülin primer antikorları. Membranı bir gecede 4 °C'de, hafifçe sürekli titreme altında birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
      NOT: Her zaman antikorları seyreltmek için üreticinin talimatlarına uyun.
    8. Primer antikor ve yıkama zarını 3 kez çıkarın (adım 6.7.6). Seyreltik ECL anti-fare IgG ikincil antikor 1:5000 TBS-T. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe sürekli sallayarak altında ikincil bir antikor ile membran kuluçka.
    9. Sekonder antikor çıkarın ve membranyı yıkayın (adım 6.7.6). ECL Western Blotting Substrat kullanarak protein algılama gerçekleştirin. 30 s- 30 dk otoradyografik filmleri ortaya çıkar. Triplicate immünoblot algılama gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2-OC MPS PK APAP testleri gerçekleştirmek için, ilk adım insan bağırsağı ve karaciğer eşdeğerleri (organoidler) üretmektir. PK APAP tkalasına başlamadan önce 2-OC mikroakışkan cihaza(Şekil 1A) 24 saat entegre edilmiştir. Ertesi gün ortam değiştirilir ve model APAP'a maruz kalır. Şekil 1, 2-OC cihazının içine yerleştirilen bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini(Şekil 1B)ve APAP PK deney zaman dilimini(Şekil 1C)göstermektedir. 2D kültürde MTT tetkik, TEER ölçümleri, HCA, gerçek zamanlı PCR, western blotting, histoloji ve konfokal floresan mikroskobu ve 3D organoidleri dokuların canlılığını kontrol etmek ve olası APAP toksik etkilerini saptamak için gerçekleştirdik. Konfokal floresan mikroskopi görüntülerinde, DAPI ve Phalloidin ile boyanmış bağırsak eşdeğeri örnekler (sırasıyla çekirdekler ve aktin için) tedavi edilmeyenler için bitişik bir bariyer olarak sunulmuştur (Şekil 2A) ve 12 μM APAP tedavi örnekleri(Şekil 2B). Şekil 2C'degörüldüğü gibi, MTT tetkiklerinde göreceli hücre canlılığı düzeyleri %70'in üzerinde, 12 μM konsantrasyonda APAP maruziyetine yanıt olarak ilgili sitotoksik etkilerin olmadığını gösteren33,34,35,36,37. Pozitif kontrol (100 mM) önemli hücre ölümüne (sağkalım %5'in altında) neden oldu. Caco-2/HT-29 canlılığı ve uygun farklılaşma nın yanı sıra bağırsak eşdeğer bariyer bütünlüğü farklılaşma döneminde TEER evrimi ile doğrulandı(Şekil 2D). APAP, Şekil 2E'degösterildiği gibi TEER değerlerinde herhangi bir değişiklik yapmamiştir. Aktif sodyum-çift glikoz taşıyıcıları SLC5A1, multidrug direnç taşıyıcı MDR1 ve sodyum-potasyum ATPAz ekspresyonu, hücre bariyerleri oluşumu ve bazal işlevsellik üzerinde APAP tedavi etkisini doğrulamak için analiz edildi. Şekil 2 F–H'degösterildiği gibi, hem tedavi edilmeyen hem de APAP tedavi edilen bağırsak eşdeğerleri SLC5A1 ve NaKATPase'nin benzer ekspresyonunu göstermiştir. 12 μM APAP'ın oral uygulaması, 24 saat sonra bağırsak eşdeğerlerinde MDR1 mRNA düzeylerinde artış alabilen bir artışa işaret etti (Şekil 2H). Ayrıca çekirdekler ve mitokondriyal kitle içeriği için florofor boya karışımı ile hücre fenotipik değişikliklerinin HCA'sını gerçekleştirdik. Pozitif kontroller 100 mM APAP ve %1 NaOH idi.

Ayrıca, 12 μM APAP'ın 2D Caco-2/HT-29 ortak kültüründe sitotoksisiteye neden olup olmadığını analiz ettik. Şekil 2I'de gösterilen floresan mikroskopi ile elde edilen bağırsak hücreleri görüntüleri, 12 μM APAP'ın Caco-2/HT-29 intestinal eşdeğerlerinde önemli sitotoksisiteye neden olmadığını gösteren MTT verilerini doğrular.

Hepatik küreseloidlerin bazal canlılık ve 2 μM APAP'a yanıt olarak sitotoksisite nin değerlendirilmesi MTT tahlilleri ve konfokal floresan mikroskopi, H&E histolojisi ve HCA tahlilleri ile morfolojik analizler yapıldı. Şekil 3A'dagösterildiği gibi, MTT teşalimi hem statik hem de dinamik koşullarda Karaciğer 2-OC montajından alınan örneklerde 2 μm APA tedavisine yanıt olarak ilgili sitotoksisite yi tespit edemedi. Hücre canlılığı azaldı ama hem 12 saat ve 24 saat zaman-noktaları33,34,35,36,37için% 80 üzerinde kaldı. Pozitif kontrol tedavileri (100 mM APAP ve %1 NaOH) önemli doku hasarları (canlılık %10'un altında) neden oldu. Mikroskobik konfokal görüntüler hem bazal hem de APAP tedavi koşullarında karaciğer spheroidlerinde nekrotik bir merkezin bulunmadığını ve önemli ölüm oranlarına dair bir bulgu olmadığını göstermektedir(Şekil 3B-C). Ancak, HCA tahsini ile 2D HepaRG/HHSteC kokültürde araç veya 2 μM APAP uygulamasından sonra birden fazla hücresel henotik değişiklik analiz ettiğimizde, 100 mM APAP (C+) pozitif kontrol olarak, MTT testi nin sonuçlarıyla çelişen bir şekilde, hepatik hücreler 2 μM APAP tedavisine erken sitotoksik yanıtlar göstermiştir(Şekil 3D). 24 saat sonra, hücre sayısında bir azalma oldu, nükleer alanda ve mitokondriyal kitle bir artış. Ayrıca, 3D hepatik küresel sferoidleri lekelemek için Hoechst 33342 ve MitoTracker Deep Red içeren florofor boya kokteyli kullanılmıştır(Şekil 3J). Fiji yazılımı çeşitli küresel mimari homojenliği değerlendirmek için kullanılmıştır(Şekil 3E-I). Şekil 3E'de gösterilen grafik, karaciğer küreseloidlerinin toplam alanı arasındaki benzerliği göstermektedir. En boy oranı (Şekil 3F) etrafında 1 spheroids şekerleme işlemi sırasında önyargı yokluğu anlamına gelir. Değerlendirme ayrıca küreseloidlerin çoğunluğunun kabaca yuvarlak olduğunu göstermiştir(Şekil 3G). Morfoloji çevresi ve hücre dağılımının değerlendirilmesi sırasıyla dairesellik (Şekil 3I) ve katılık hesaplaması(Şekil 3H)ile yapılmıştır. Karaciğer küreseloidlerinin şekerleme metodolojisinin, süreç boyunca küresel büyüme, önyargısız veya nekroz ile uyumlu, pürüzsüz bir çevreye sahip organoidler ürettiği sonucuna vardık.

Şekil 4 A-B'degösterildiği gibi, karaciğer spheroidleri sırasıyla göreceli bazal yüksek albumin ve GST mRNA ekspresyonu gösterdiler ve uygun bazal işlevselliği gösterdiler. Bununla birlikte, 24 saat için 2 μM APAP tedavisi albümin ve GST mRNA ekspresyon düzeylerinde bir azalmaya neden olarak, APAP tedavisinin 24 saat zaman noktasında fonksiyonel olarak karaciğer spheroidlerinin bozulmasını düşündürmektedir.

CYP3A4 ve UGT1A1 mRNA ekspresyon düzeylerinin saptanması karaciğer eşdeğerlerinin metabolik kapasitesini göstermektedir. CYP3A4 mRNA bazal seviyesi(Şekil 4C)önceki raporlarla uyumluydu6. APAP tedavisi, APAP tedavisine yanıt olarak hem CYP3A4 mRNA hem de UGT1A1 ekspresyonunda azalma eğilimini ortaya çıkardı(Şekil 4C-D)bir kez daha apap tedavisinin 24 saatlik zaman noktasında karaciğer spheroidlerinin bozukluğu hipotezini doğruladı.

Ayrıca, bazal ve APAP tedavi koşullarında karaciğer eşdeğerlerinde CYP 3A4 aktivitesinin yanı sıra albumin protein ekspresyonunu analiz etmek için batı lekeleme ve in vitro enzimatik aktivite deneyleri yapıldı. Karaciğer 2-OC MPS'de yapılan 2 μM APAP tedavisinin, hem statik(Şekil 4E)hem de dinamik(Şekil 4F)koşullarında 12 saat ve 24 saat zaman noktalarında karaciğer eşdeğeri total albumin ekspresyonunda azalmaya neden olduğunu saptTık. Öte yandan, dinamik koşullardan alınan karaciğer eşdeğerleri, statik koşullara kıyasla albüminin daha yüksek protein ekspresyonunu gösterme eğilimi göstermiştir(Şekil 4G). Karaciğer 2-OC MPS'den karaciğer eşdeğerlerinde yapılan CYP 3A4 in vitro analizi, 12 saat veya 24 saat için 2 μM APAP tedavisinin hem statik hem de dinamik koşullarda CYP 3A4 aktivitesinde sağlam ve önemli bir bozulmaya neden olduğunu göstermiştir(Şekil 4H-I). Daha ilginç, medya akışının varlığı (dinamik) karaciğer eşdeğerleri CYP 3A4 aktivite düzeylerinde önemli bir iyileşme indükledi hangi karaciğer eşdeğerleri dolaşan ortam yokluğunda tutuldu koşulları ile karşılaştırıldığında (statik koşullar)(Şekil 4J).

HPLC analizi ile ilgili en hassas analitik durumu bulmak için, mobil fazın bileşimi, katkısının türü ve konsantrasyonu dahil olmak üzere çeşitli parametreler araştırıldı. Bu asetonitril metanol daha iyi kromatogram çözünürlüğü ve uygun tutma süresi verdi bulundu. APAP'ın hızlı ve tekrarlanabilir ayrıştırma kısmı C18 ters faz sütunu kullanılarak elde edildi. APAP bekletme süresi (Rt) değeri 0,19 dakika ± 9,27 idi. APAP için seçicilik, tepenin şekli ve simetrik çözünürlüğü ve DMEM ve Williams hücre kültürü medyasının engellediği zirvelerin olmamasıile gösterilir.

Kalibrasyon eğrilerini oluşturmak için 0.25 ile 100.00 μM arasında değişen amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S ve Williams E S hücre kültür ortamlarında APAP standart konsantrasyonları kullanıldı. Yöntemin doğrusallığı dokuz konsantrasyon düzeyinde belirlendi. Veriler Tablo 2 ve Tablo 3'tegösterilmiştir. APAP konsantrasyonu ile pik alanlar arasındaki ilişki doğrusal regresyon denklemleri ile tanımlanmıştır: y = 16106*x + 3579.8 (R2=1, DMEM ortamda) ve y = 16397*x + 2475.1 (Williams ortasında R2=1), "x" μM'deki APAP nominal konsantrasyonu ve "y" apap'ın en yüksek noktasıdır. Nicelemenin üst sınırında (yani 100.00 μM), yüzde sapma ve inter-run değişkenlik değerleri %2.50'nin altındaydı. 0,50 μM (LLOQ) hariç dokuz konsantrasyon seviyesinin doğruluğu ve hassasiyeti, DEV ve C.V. değerleri %7,00'den az olan kabul edilebilir bir aralıktaydı(Tablo 2 ve Tablo 3).

Analizsel yöntem inter-ve intra-run doğruluk ve hassasiyet, dört test konsantrasyonları, biyoanalitik tahliller için genel olarak kabul edilen kriterler içinde düştü. Yöntemin tekrarlanabilirliği 0.50 (LLOQ), 4.50, 45.00 ve 90.00 μM APAP kalite kontrol örneklerinin kopyaları analiz edilerek değerlendirildi. Çalışma içi ve intra-run ortalaması Tablo 4'tebildirilmiştir. Tamacın doğruluğu ve hassasiyeti, %15,00 ≤ DEV değerleri ve sırasıyla %7,00'≤ C.V. değerleri ile gösterilmiştir.

LOD, sinyal-gürültü oranı (S/N) 3'ten biraz fazla olan ve 0,25 μM APAP'a karşılık gelen örnek olarak belirlendi. Diğer taraftan, 0,50 μM APAP örneği ile tahmin edilen LLOQ, 10'a eşit S/N oranı gösterdi. Ayrıca doğruluk değerlerini (DEV%) bulduk. nominal konsantrasyon değerlerinin %19,00'≤ arasında değişmektedir. İç ve inter-rundeğişkenlikleri, Tablo 2, Tablo 3 ve Tablo 4' de gösterildiği gibi % 18,77'≤ C.V. tarafından gösterilmiştir.

APAP PK analizleri üç farklı 2-OC MPS derlemesinde yapıldı: 1) Sadece bağırsak eşdeğerini içeren 2-OC; 2) Karaciğer 2-OC, sadece karaciğer sferoidleri içeren ve 3) Bağırsak/ Karaciğer 2-OC hem bağırsak bariyeri ve karaciğer sferoidleri ile.

Emilim çalışmaları için, oral yol bağırsak eşdeğer apikal tarafında 12 μM APAP uygulanması ile taklit edildi. APAP konsantrasyonları hplc/UV ile ölçüldü, orta örneklerde, apikal ve bazolateral intestinal eşdeğerlerinden toplanan, statik ve dinamik koşullarda. Apikal ve bazolateral kenarlardan toplanan ortamdaki APAP kinetik, bağırsak modelinin APAP'ı absorbe edebildiğini göstermiştir. Apikal tarafta progresif APAP konsantrasyonu azalması(Şekil 5A) intestinal bazolateral tarafta APAP konsantrasyonu artışına eşlik etti (Şekil 5B). Ortadaki maksimum konsantrasyonlar (Cmax), uygulamanın 12 saat inden (Tmax) sonra hem statik hem de dinamik koşullar için 2 μM civarındaydı.

Metabolizma çalışmaları için, intravenöz uygulama karaciğer kompartmanının orta 2 μM APAP uygulaması ile taklit edildi. Hem statik hem de dinamik koşullarda ortamdaki APAP konsantrasyonkisi, sadece dinamik koşullarda APAP konsantrasyonundaki düşüşlerin tespit edilebildiğini ve 2 μM APAP uygulamasından sonra 0,87 μM APAP 12 saate ulaştığını göstermiştir (T1/2 = 12 saat). Karaciğer eşdeğerleri statik koşullarda en az metabolik verimlilik gösterdi(Şekil 5C). APAP konsantrasyonu APAP uygulamasından sonra 1.7 μM 12 saate ulaştı. İnflamasyon, APAP emilimi ve metabolizma değerlendirmesi bağırsak/karaciğer 2-OC modelinde yapıldı. APAP, bağırsağın apikal tarafı üzerinden oral yolu taklit ederek uygulandı. Orta örnekler her iki bağırsak tarafından ve karaciğer bölmesi de toplandı. Şekil 5D, apikal taraftaki APAP konsantrasyonunun hem statik hem de dinamik koşullarda aşamalı olarak çürümesini göstermektedir.

Şekil 5E ayırt edilebilir emilim ve metabolizma evrelerini gösterir. Akış aynı zamanda bağırsak emilimini de etkiledi. Ortamdaki APAP Cmax, dinamik "Bağırsak/Karaciğer 2-OC"(Şekil 5E)için "Bağırsak 2-OC"(Şekil 5B)montajında 2 μM'den 1.7 μM'ye değiştirildi. Şekil 5F, dinamik "Bağırsak/Karaciğer 2-OC" mikrofizyolojik sistemimizde (kırmızı eğri ve y ekseni) APAP'ın konsantrasyon-zaman profili ile 1000 mg (siyah eğri ve y ekseni) tek bir oral dozdan sonra insanlarda elde edilen temsili profil arasında doğrudan bir karşılaştırma göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: 2-OC MPS'de PK çalışmaları için şematik adım derlemesi. A) 2-OC MPS şematik çizim, aşağıdan yukarıya görünümünde bağırsak ve hepatik insan dokusu eşdeğerleri gösteren. B) 2-OC MPS fotoğraf ile bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri aşağıdan yukarıya görünümünde cihaza entegre, temsili optik mikroskopi görüntüleri ile. C)Doku eşdeğerlerinin hazırlanması, APAP tedavisi ve organoid üretimi için kültür orta koleksiyonları aşamaları ile farmakokinetik ve toksikolojik değerlendirmelerin zaman çizelgesi. Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bağırsak eşdeğerlerinin canlılık ve toksikolojik değerlendirmesi. A) Tedavi edilmeyen Caco-2/HT-29 hücrelerinin hücre çekirdekleri ve aktin filamentleri floresan boya (sırasıyla DAPI ve Phalloidin) ile boyanmış temsili konfokal floresan mikroskobu görüntüleri; 63x Büyütme, zoom 2.6. B) Caco-2/HT-29 hücrelerinin 24 saat boyunca 12 μM APAP ile tedavi edilen, çekirdek ve aktin filamentleri floresan boya (SıRASıYLa DAPI ve Phalloidin) ile boyanmış temsili konfokal floresan mikroskobu görüntüleri; 63x Büyütme, zoom 2.6. C)Hem statik hem de dinamik koşullarda MTT ttokisi ile bağırsak eşdeğerleri canlılık değerlendirmesi. Grafikteki çubuklar tarafından temsil edilen değerler araç kontrolüne göre yüzde olarak hesaplanır (zaman noktası 0 olarak adlandırılır)*P<0.05 0 vs tedavi. D)TEER evrimi 21 gün farklılaşma sırasında. *P<0.05 gün 1 vs diğer günler. E) APAP uygulamasından sonra TEER değerleri dinamik koşullarda Bağırsak içine 2-OC MPS. Bağırsaklarda gen ekspresyonu eşdeğerleri. Bağırsak bariyerinin emilim potansiyeli ve dinamik durumda 24 saat için 12 μM APAP olası etkileri SLC5A1 (F), Na-K-ATPaz (G) ve MDR1 (H) ekspresyonu ile doğrulandı. Değerler, üç bağımsız denemenin ortalama ± SEM'ini temsil ediyor. Sonuç, gapdh temizlik çisi olarak ifade edilir. *P<0.05 araç vs APAP. I) Kolomb tarafından gerçekleştirilen Operetta görüntü tabanlı HCA® 2.4.0. Yazılım. 12 μM APAP tedavisinden sonra farklı zaman noktalarında 2D bağırsak ko-kültürünün temsili görüntüleri. Negatif kontroller orta (0 saat) veya araç (%0.5 etanol) idi. Burada gösterilen pozitif kontroller 100 mM APAP'tır. Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Karaciğer eşdeğerlerinin canlılık ve toksikolojik değerlendirilmesi. A) Karaciğer eşdeğerleri hem statik hem de dinamik koşullarda MTT tsay ile canlılık değerlendirmesi. Grafikteki çubuklar tarafından temsil edilen değerler araç kontrolüne göre yüzde olarak hesaplanır (zaman noktası 0 olarak adlandırılır) *P<0.05 0 vs tedavi. B) Araçtan çekilen konfokal görüntüleri ve iç kısımdan 2 μM APAP 24 saat tedavi edilen karaciğer küresel lerini tamamlar. C) Araçtan çekilen H&E (hematoksilin ve eozin boyama) görüntüleri ve iç kısımdan 2 μM APAP 24 saat tedavi edilen karaciğer küreselleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. D) 2 μM APAP tedavisinden sonra farklı zaman noktalarında 2D karaciğer ko-kültürünün temsili görüntüleri. Bu analizlerde araç ve 2 μM APAP ile tedavi edilen numuneler değerlendirildi. Florofor boya karışımı nükleer boyama için Hoechst ve mitokondri kitle boyama için Mitotracker Deep Red içerir. Negatif kontroller orta (0 saat) veya araç (%0.5 etanol) idi. Pozitif kontroller 100 mM APAP idi. Yakalanan tüm küresel görüntülerin ölçümleri Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. E) Alanın frekans dağılımları F) en boy oranı, G) yuvarlaklık, H) katılık, I) dairesellik. N = 85 olarak. *p < 0,05. J) LWD 10x hedefi kullanılarak Operet tarafından elde edilen 3D karaciğer küreseloidlerinin temsili görüntüleri. Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Statik ve dinamik koşullar altında 2 μM APAP'ın karaciğer canlılığı/işlevselliği ve olası etkileri gen ve protein ekspresyonu ve enzimatik aktivite ile doğrulandı. A) albümin gen ekspresyonu. B) GSTA2 gen ekspresyonu. Karaciğer yeteneği faz I ve faz II metabolizması gerçekleştirmek için ve dinamik durum altında 24 saat için 2 μM APAP olası etkileri cyp3A4 gen ekspresyonu ile doğrulandı(C) ve UGT1A1 (D) sırasıyla. E) Statik durum altında total albumin protein ekspresyonu. F) Dinamik koşullar altında total albumin protein ekspresyonu. Durum. G) Statik veya dinamik koşullarda yetiştirilen ve tedavi edilen karaciğer eşdeğerlerinde total albumin ekspresyonundaki farkı gösteren karşılaştırmalı grafik. H) CYP 3A4 statik koşullar altında in vitro enzimatik aktivite. I) CYP 3A4 dinamik koşullar altında in vitro enzimatik aktivite. J)Statik veya dinamik koşullarda yetiştirilen ve tedavi edilen karaciğer eşdeğerlerindeki CYP 3A4 aktivitesi arasındaki farkı gösteren karşılaştırmalı grafik. Değerler, üç bağımsız denemenin ortalama ± SEM'ini temsil ediyor. Gen ekspresyonunun verileri GAPDH'nin temizlikçisine oran olarak ifade edilir. Protein ekspresyonunun verileri vinkülin proteinine oran olarak ifade edilir. *P<0.05 araç vs APAP tedavisi. Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: 2-OC MPS'de APAP farmakokinetiğinin analizi. Bağırsak 2-OC MPS preparatının apikal tarafında 12 μM APAP uygulamasından sonra APAP emilim profili. Bağırsak bariyeri, apikal taraftan orta daki Caco-2/HT-29 hücre hatlarının(A)Statik ve dinamik APAP konsantrasyonlarının bir kokültüründen (insan bağırsak lümeni tarafını temsil eden) yapılmıştır. (B) Kosolateral taraftan orta statik ve dinamik APAP konsantrasyonları (insan bağırsak kan dolaşımı tarafını temsil eder). *P<0.05 statik vs dinamik koşullar. C)HepaRG/HHSTeC karaciğer sferoidleri tarafından Karaciğer 2-OC MPS'de APAP metabolizma profili. 2 μM APAP uygulamasından sonra statik ve dinamik koşulların ortama karşılaştırılması. *P<0.05 0h vs 6 saat, 12 saat ve 24 saat APAP tedavisi. Bağırsak/Karaciğer 2-OC MPS preparatının intestinal bariyer apical tarafında 12 μM uygulamadan sonra APAP emilimi ve metabolizma profili. Bu sözlü rota öyküner. Bağırsak bariyeri Caco-2/HT-29 hücre hatlarından ve HepaRG/HHSTeC hücre hatlarının küresel lerinden yapılan karaciğer eşdeğerinden yapılmıştır. (D) Statik ve dinamik koşullar altında intestinal bariyerin apikal tarafında intestinal/karaciğer 2-OC APAP konsantrasyonları. (E) Statik ve dinamik koşullar altında orta bağırsak/Karaciğer 2-OC APAP konsantrasyonları. *P<0.05 statik vs dinamik koşullar. (F) Mikrofizyolojik sistemimizde (kırmızı eğri ve y ekseni) APAP'ın konsantrasyon-zaman profili ile 1000 mg (siyah eğri ve y ekseni) tek bir oral dozdan sonra insanlarda elde edilen temsili profil arasında karşılaştırma. Veriler WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer) kullanılarak çizimler elde edildi. Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

HPLC sistemi Waters Alliance 2695 (Milford, MA, ABD), kuaternary pompa, numune yöneticisi ve degasser ile donatılmıştır
Dedektörü Sular 2996 Uv-Vis 210-400 nm aralığında ayarlanır
Sistem kontrolü, veri toplama ve işleme Waters Empower 2002 kromatografi yazılımı
Sütun Ters faz Luna C18
(150 x 4.6 mm I.D.; 5mm partikül boyutu)
Fenomen
Koruma Sütunu Ters faz Luna C18 (4 x 3 mm)
Fenomen
Mobil faz Çözücü A- Asetonitril
Çözücü B- 0.10 M amonyum asetat, pH 6.8
İokratik koşullar Saat A (%) B (%)
(dk.)
15 5 95
Akışı 1,0 mL/dk
Enjeksiyon hacmi 25 μL
Sıcaklık 25 °C
APAP Algılama UV @ 243 ve 254 nm
Çalışma süresi 15 dakika

Tablo 1: Kültür orta matrislerinde APAP'ın HPLC-UV analizlerinde kullanılacak koşullar ve parametreler.

Nominal konsantrasyon Hesaplanan APAP konsantrasyonu (μM) Ortalama (μM) S.D.b C.v. DEV
(μM) (Her konsantrasyonun triplicate) (μM) (%)c (%)d
Atama numarası 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17,08 ile
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0,09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0,03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tablo 2: Altı ayrı tahlilden 0,10 M amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile DMEM ortamının karışımında hazırlanan standart eğri örneklerinin doğruluk, hassasiyet ve doğrusallığı. bir
bir Deneysel'de açıklandığı gibi bir yanıt(APAP)karşı teorik konsantrasyon için verilere doğrusal bir eğri yerleştirildi. Hesaplanan konsantrasyon, kalibrasyon eğrisine karşı her standart numune için yanıtın okunmasından elde edilmiştir. Her giriş (tahlil 1-6) triplicate analizinin ortalama değerine karşılık gelir.
b SD= Standart sapma.
c C.V. (varyasyon katsayısı. hassasiyet).
d Doğruluk (DEV %) = hesaplanan konsantrasyonun nominal değerden sapması.
Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019).

Nominal konsantrasyon Hesaplanan APAP konsantrasyonu (μM) Ortalama S.D.b C.v. DEV
(μM) (Her konsantrasyonun triplicate) (μM) (μM) (%)c (%)d
Atama numarası 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26,03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0,01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tablo 3: Altı ayrı tahlilden 0,10 M amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile Williams ortamının karışımında hazırlanan standart eğri örneklerinin doğruluk, hassasiyet ve doğrusallığı ile çalıştırılan varyasyon. bir
bir Deneysel'de açıklandığı gibi bir yanıt(APAP)karşı teorik konsantrasyon için verilere doğrusal bir eğri yerleştirildi. Hesaplanan konsantrasyon, her standart numuneiçin bir kalibrasyon eğrisine karşı yanıtın okunmasından elde edilmiştir. Her giriş (tahlil 1-5) triplicate analizinin ortalama değerine karşılık gelir.
b SD= Standart sapma.
c C.V. (varyasyon katsayısı. hassasiyet).
d Doğruluk (DEV %) = hesaplanan konsantrasyonun nominal değerden sapması.
Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019).

Williams orta Nominal konsantrasyon Ölçülen konsantrasyon S.d. C.v. DEV
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
İç-çalıştırma (n=3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8,37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Inter-run (n=15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5,31
DMEM orta Nominal konsantrasyon Ölçülen konsantrasyon S.d. C.v. DEV
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
İç-çalıştırma (n=3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6,35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4.00
Inter-run (n=12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tablo 4: Kalite kontrol numunelerinde APAP için intra-ve inter-run hassasiyeti ve doğruluğu. bir
bir Veriler ortalama olarak gösterilir. SD (standart sapma). C.V. (varyasyon katsayısı. hassasiyet) ve doğruluk (yüzde sapma. DEV%).
Bu rakam Marin ve ark. Bir bağırsak / karaciğer mikrofizyolojik sistemde asetaminofen emilimi ve metabolizma. Chem Biol Etkileşim. 299, 59-76 (2019).

Astar (5' → 3')
Doku Gen Ileri Ters
Bağırsak SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAGCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgACggT
NA-K-ATP'ler ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg
Karaciğer Albümin TgCAAggCTgATAGgAg TTTAgAGAgggTgTGgCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgAgggAAggCTggAATAAg
CPY3A4 ggAAGgTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAAggCTggAg

Tablo 5: Bağırsak ve karaciğer dokuları için 2-OC kültürlerinde gen transkripsiyonlarını mRNA düzeyinde değerlendirmek için gerçek zamanlı qPCR astarları

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Araştırmacı yeni ilaçların farmakolojik özelliklerinin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, aşağıdaki geliştirme adımlarında riski azaltmak için kritik öneme sahiptir. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testlerle harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Grubumuz çoğunlukla kurşun optimizasyonu için gerekli olan farmakokinetik ve toksikolojik özelliklerin değerlendirilmesinde ilerlemektedir. İki odası olan ve iki organoidin entegrasyonuna olanak sağlayan 2-OC mikroakışkan cihazla çalıştık. APAP yüksek kaliteli insan verilerinin bol olduğu için seçildi, çoğunlukla karaciğer tarafından metabolize edilir, ve aynı zamanda hepatotoksik özellikleri görüntüler. Çalışma protokolü, bir ilacın gönüllülere ağızdan verildiği ve farmakokinetik özelliklerinin bilinmesi için ilaçların konsantrasyonunun değerlendirilmesi için periyodik kan örneklerinin alındığı, biyokimyasal ve klinik parametrelerin güvenlik ve tolere edilebilirliği değerlendirmek için toplandığı insan faz ı klinik deneyinin bazı adımlarını taklit etmeyi amaçlamaktadır. Bu nedenle, MPS güvenilir tahminler sağlamak için yeterli geliştiğinde, önemli ölçüde faz I deneme başarısızlık riskini azaltacaktır. Gelecekte hastalık modelleri ekleyerek, aynı varsayım muhtemelen evreleri II ve III klinik çalışmalar için geçerli olacaktır.

Tüm çalışmalar üç modelde yapıldı: Bağırsak 2-OC (APAP oral uygulama), Karaciğer 2-OC (İntravenöz uygulama) ve Bağırsak/Karaciğer 2-OC (oral uygulama). İlk model emilimi izole, ikinci metabolizma, ve üçüncü her ikisi de entegre. İlk olarak organoidleri ürettik ve mikroakışkan cihaza dahil ettik, ikincisi APAP'ı uyguladık ve medya örneklerini topladık, ve en son hücre canlılığını, işlevselliğini ve APAP maruziyetinin toksikolojik etkisini değerlendirmek için bir dizi test gerçekleştirdik. Farmakokinetik çalışmalar için, ortamda APAP nicelliği için bir kromatografik yöntem geliştirdik ve doğruladık. Doğrulama, FDA29,30tarafından özetlenen özgüllük, doğrusallık, nicellik sınırı (LOQ), algılama sınırı (LOD), matris etkisi, hassasiyet ve doğruluk ile ilgili Biyoanalitik Yöntem Doğrulama Kılavuzu'na uygundur. Özgüllük iki farklı kaynaktan boş, havuzlu ve bireysel biyolojik örneklerle oluşturulmuştur. Yöntem analiz sırasında kabul edilebilir bir şekilde gerçekleştirildi ve veriler basit bir hareketsiz mobil fazın APAP'ı ayırma ve ölçme yeteneğini doğruladı.

Bağırsak ve karaciğer organoidlerinin canlılığı/fonksiyonelliği farklı tekniklerle değerlendirildi. Bağırsak eşdeğeri için konfokal floresan mikroskopi(Şekil 2A-B),MTT testi (Şekil 2C), gen ekspresyonu değerlendirmesi (Şekil 2D-F) veya HCA deneyi, APAP maruziyetinden sonra herhangi bir toksisite 24 saat saptanmadı. Aynı şekilde, MTT titretisi karaciğer eşdeğerlerinde APAP tarafından indüklenen toksik hakaretleri tespit etmedi(Şekil 3A). Ancak HCA tekniği, bazı mekanistik ipuçları ile, hücre phenotik değişiklikleringözlem ile, karaciğer hücreleri için çok erken toksik olayların (24 saat sonra APAP maruz ilerlik) tespit imkanı eklendi(Şekil 3D). Öte yandan, konfokal floresan mikroskobu(Şekil 3B)ve histoloji(Şekil 3C)insan dokusunun eşdeğerlerinin canlılık durumunun araştırılmasında yararlı bir tamamlayıcı araç olarak gösterildi. Karaciğer hücreleri için, farklı tekniklerin eşzamanlı kullanımı çok avantajlı oldu. MTT titreti, daha önce de belirtildiği gibi, APAP maruziyetinden sonra HCA 24 h tarafından saptanan APAP sitotoksisitesini tespit edemedi. Gen ekspresyonu analizleri, APAP tedavisinden sonra hem bazal hem de 24 saat olarak hem de 24 saat olarak bağırsak(Şekil 2D-F)ve karaciğer organoidlerinin(Şekil 4A-D)işlevselliğini değerlendirdi. Bazal koşullar altında, bağırsak ve karaciğere özgü belirteçlerin normal düzeyleri vardı, uygun işlevselliği düşündüren. 24 saat APAP maruziyetinden sonra albümin, GST mRNA düzeylerinin azalması ve karaciğer eşdeğer dokularında CYP3A4 gen ekspresyonunu azaltma eğilimi, APAP erken sitotoksisiteyi gösteriyordu. Bu bulguları doğrulayan Batı lekeleme deneyleri, gen ekspresyonundaki azalmanın, APAP tedavisine(Şekil 4E-F)yanıt olarak karaciğer total albumin protein ekspresyonunda sağlam bir azalma nın eşlik ettiğini ve APAP'a maruz kalarak karaciğer dokusuna uygulanan toksik hakaretleri doğruladığını göstermiştir. Buna göre, in vitro enzimatik aktivite deneyleri, APAP tedavisi ile indüklenen CYP 3A4 aktivite düzeylerinde karaciğer eşdeğerlerinde sağlam ve ilerleyici bir azalma göstermiştir(Şekil 4H-I).

Organoidlerin morfometrik istatistikleri Resim J üzerinde yapılmıştır (Şekil 3E-I). Alan, 2B boyutun analiz edilen tüm organoidlere ne kadar yakın olduğunu ortaya koymaktadır ve bu protokolde standartlaştırma olarak kullanılabilir, böylece tarafsız bir sonuç elde edilebilir. 'Şekil tanımlayıcıları', şekil morfolojisine tam olarak karşılık gelen istatistikleri ortaya çıkarır. En Boy Oranı, majör ve minör ekseni kullanan bir indekstir, bu nedenle 1 civarındaki sonuçlar organoid oluşumu sırasında önyargı (yani tercihli büyüme) olmadığını gösterir. Yuvarlaklık değerleri (4 ×[alan]/ (π × [ana eksen]2)) tercihli büyümeye karşı çok hassastır ve bu da ana eksen olarak ortaya çıkabilir. Katılık ([alan]/ ([konveks alanı])) eksvex alanı (=zarf) kullandığı için sınırlardaki düzensizliklerden etkilenmediğinden brüt morfolojinin gösterilmesi esastır. 1.0 civarında ortalanan dağılımlar putatif küresel büyümeyi gösterir. Tersine, Dairesellik (4× π [alan]/[çevre]2) karmaşık bir çevreye karşı çok hassastır, bu nedenle "boşluklar" veya "cepler" bu dizini etkiler. Böylece, 1 etrafında dairesellik de putatif küresel büyüme, uygun organoid işlevselliği ile uyumlu doğrular.

Analitik sonuçlar, MPS'nin amilim aşaması olmadan in vivo(Şekil 5F)ile karşılaştırılabilecek bir eğride hem izole edilmiş hem de entegre edilmiş APAP emilimi ve metabolizma özelliklerini taklit edebileceğini göstermiştir. APAP emilimi hem statik hem de dinamik koşullarda hem Bağırsak MPS hem de Bağırsak/Karaciğer MPS modellerine oral uygulama dan sonra benzerdi (Şekil 5A-B, Şekil 5D-E). Her ikisinde de, apikal tarafta statik ve dinamik koşullar için anlamlı bir fark olmadan, bazolateral taraftaki artışa eşlik eden bir APAP konsantrasyonu azalma lar vardı. Buna karşılık, APAP hepatik metabolizma bu koşullar altında farklı. MPS'de dolaşan ortam organoid metabolik yeteneğini geliştirmek gibi görünüyordu (Şekil 5C ve Şekil 5E). Akış olmadan görülmeyen önemli bir APAP çürüme sakımı vardı. İlginçtir, in vitro, CYP3A4 aktivite deneyleri sistemde akış varlığı insan karaciğer eşdeğerlerinin işlevselliğini artırır hipotezi doğrular. Şekil 4J'dekigrafikte gösterildiği gibi, HEM bazal hem de APAP tedavi koşullarında akış altında tutulan karaciğer eşdeğerlerinde CYP 3A4 aktivitesi anlamlı olarak daha yüksekti. Aynı şekilde, akış altında tutulan karaciğer eşdeğerleri (dinamik) hem taban çizgisinde hem de APAP tedavi koşullarında(Şekil 4G)akışsız (statik) tutulanlara kıyasla albuminprotein ekspresyonunu artırma eğilimi göstermiştir ( Şekil 4G ).

APAP'ın insanlara oral uygulamadan sonra konsantrasyon süresi profili ile karşılaştırıldığında, mikrofizyolojik sistemimiz çok daha büyük t1/2 (yarı ömür)(Şekil 5F)göstermektedir. Bu olur, daha önce de belirtildiği gibi, biz absorbe ve ilaç metabolize bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri ile iki organ sistemi varken, plazma bölmesi APAP ve metabolitleri çıkarmak için hiçbir böbrek eşdeğeri yoktur38. Buna ek olarak, mikrofizyolojik sistem daha küçük Cmax gösterir (pik plazma konsantrasyonu) ve daha büyük tmax (Cmax ulaşmak için zaman) genellikle insanlar için gözlenen ne daha(Şekil 5F). Bu in vitro ve in vivo deneylerin ölçeğindeki farklılıkların bir sonucudur. Genel olarak, mikrofizyolojik sistem kullanılarak elde edilen konsantrasyon-zaman profili ile APAP'ın insanlara oral uygulamadan sonra elde edilen profiller arasında üç ana fark vardır: daha büyük t1/2, daha küçük Cmax ve daha büyük tmax (Şekil 5F). Büyük t1/2 plazma eşdeğeri APAP ve metabolitleri salgılamak eşdeğer bir böbrek yokluğunda n içindeyken, daha küçük Cmax ve daha büyük tmax insan vücudu ile karşılaştırıldığında deneyin küçük ölçekli sonuçları vardır. Mikrofizyolojik sistemlerin oluşturulması ve işletilmesi için en iyi ölçekleme stratejileri hala aktif bir araştırma alanıdır ve tek bir yaklaşımın tüm sistemler için en uygun olması olası değildir39. Ayrıca, matematiksel modelleme veya makine öğrenimi düzeltmeler uygulamak veya insanlarda gözlenen in vivo davranış mikrofizyolojik sistemler ile elde edilen in vitro verileri tahmin etmek için mikro ölçekten tam ölçek için haritalama öğrenmek için kullanılabilir40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Unit 522 INSERM'den Dr. Philippe Gripon ve Ünite 271 INSERM'den Dr. Christian Trepo'ya Biyolojik Materyalin (Hepa RG hücreleri) kullanımı ve akademik araştırmayapmak için bize sunulması için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

Kimya Sayı 166 Mikrofizyolojik Sistem Asetaminofen ADMETox Organoidler
İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter