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Chemistry

약물 약동 및 독성 평가를 위한 장/간 미생물학 시스템

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

우리는 아세트아미노펜 (APAP)에 장과 간 오르가노이드를 가진 미생물 계통 (MPS)를 드러나. 이 문서에서는 MPS의 오르가노이드 생산 및 APAP 약동 및 독성 특성 평가를 위한 방법을 설명합니다. 또한 결과를 검증하는 데 필요한 조직 기능 분석을 설명합니다.

Abstract

최근에 도입된 미생물시스템(MPS)은 인간 유기체를 육성하는 것이 유전적으로 인간적이고 조직 간의 상호 작용을 재구성하기 때문에 약물 개발 과정의 전임상 시험 단계에서 동물보다 더 나은 성능을 발휘할 것으로 예상된다. 본 연구에서, 인간 장 장벽(Caco-2 및 HT-29 세포의 공동 배양에 의해 에뮬레이트됨) 및 간 등가(분화된 HepaRG 세포 및 인간 간 석래 세포로 만든 스페로이드에 의해 에뮬레이트됨)는 일부 아세트아핀(Pcoinophen)을 평가하기 위해 2기관 칩(2-OC) 미세 유체 장치로 통합되었다. MPS는 세 개의 어셈블리를 했다: 장 만 2-OC, 간 만 2-OC, 그리고 내장/간 2-OC 두 오르가노이드를 perfusing 동일한 미디어와. PK 평가를 위해, 우리는 12 μM및 2 μM에서 장 장벽 (경구 경로를 에뮬레이션) 또는 매체 (정맥 경로를 에뮬레이션)를 통해 그것을 관리 한 후 사전 설정 된 시점에서 미디어에 APAP를 투여했습니다. 미디어 샘플은 반전 단계 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석되었다. 오르가노이드는 유전자 발현, TEER 값, 단백질 발현 및 활성을 위해 분석한 다음 형태학적 평가 집합에 수집, 고정 및 제출하였다. MTT 기술은 오르가노이드 생존가능성을 평가하는 데 잘 수행되었지만, 높은 함량 분석(HCA)은 APAP 처리에 응하여 매우 초기 독성 이벤트를 감지할 수 있었습니다. 우리는 미디어 흐름이 APAP 흡수에 크게 영향을 미치지 않는 반면 간 동등한 기능을 크게 향상시키는지 확인했습니다. APAP 인간 장 흡수 및 간 물질 대사 MPS에 에뮬레이트 될 수 있습니다. MPS 데이터와 실리코 모델링 의 연관성은 체외 방법의 예측 가능성을 개선하고 약동 및 독성 연구에서 동물 모델보다 더 나은 정확도를 제공 할 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

Introduction

유전체학 및 프로테오믹 차이로 인해 동물 모델은 여러 인간의 결과에 대한 예측 가치가 제한적입니다. 또한, 그들은 시간이 많이 소요, 비싸고 윤리적으로 의심1. MPS는 예측 능력을 개선하고 임상 전 테스트에 소요되는 비용과 시간을 줄이는 것을 목표로 하는 비교적 새로운 기술입니다. 그들은 오르가노이드 오르가노이드 통신을 촉진하는 미디어 흐름하에서 오르가노이드 (장기의 인공 마메틱 기능 단위)를 육성하는 미세 유체 장치입니다. 인간 세포로 만든 오르가노이드는 번역 관련성2,3,4를증가시다. MPS는 유전적으로 인간이며 조직 간의 상호 작용을 재구성하기 때문에 동물 실험보다 더 잘 수행 될 것으로 예상됩니다. 완벽하게 작동하면 MPS는 더 높은 속도로 더 의미 있는 결과를 제공하고 비용과 위험을4로낮출 것입니다. 많은 그룹은 여러 목적을 위해 MPS를 개발하고 있다, 특히 질병의 모델은 약물의 효능을 테스트.

노출 수준은 약물 효능 및 독성5,6,7,8,9,10,11,12를평가하기 위한 가장 중요한 매개변수 중 하나입니다. MPS는 전신 노출을 에뮬레이트하는 오르간성 통합을 허용하고 전통적인 2D 인간 조직 배양보다 더 잘 수행 될 것으로 예상된다. 이 기술은 화합물 장 흡수 및 간 대사4의예측을 크게 향상시킬 수 있습니다.

장과 간의 인간 동등한 모델을 통합하는 MPS는 약물 생체 이용률 및 전신 노출13,14,15에서이 두 기관의 중심 역할을 고려하여 좋은 출발점이다. APAP는 신장과 동등한 신장이 없는 MPS를 연구하기 위한 매력적인 약물로, 대사화는 주로 간16,17에의해 수행된다.

상기 2-OC는마이크로채널(16)에의해 상호 연결된 두 개의 상이한 인간 동등한 조직/오르가노이드의 배양에 적합한 2챔버 미세유체 장치이다. 약물의 체외 인간 구두/정맥 투여를 모방하고 APAP 약동학에 대한 장과 간 등가물의 교차 이야기의 효과를 평가하기 위해, 오르가노이드 기능성 및 생존가능성 외에도, 3개의 다른 MPS 어셈블리가 수행되었다: (1) Caco-2 + HT-29 세포 공동 배양을 포함하는 배양 삽입에 기초한 장 등가물로 구성된 "내장 2-OC MPS", 2-OC 장치에 통합; (2) 2-OC 장치에 통합된 HepaRG + HHSteC(인간 간 Stellate 세포)로 구성된 간 스페로이드로 구성된 "간 2-OC MPS"; 및 (3) "내장/간 2-OC MPS"는 마이크로 유체 채널을 통해 매체흐름에 의해 다른 장치 구획과 동등한 간구획으로 구성된다.

모든 아세이는 기계적 자극(압축, 스트레칭 및 전단)의 충격으로 인해 정적(유동 없음) 및 동적(흐름 없음) 조건하에서 수행되었다(압축, 스트레칭 및 전단) 세포 생존능력 및기능성(18,19,20). 본 기사는 인간 장 및 간 등가 모델을 포함하는 2-OC MPS에서 APAP 경구/정맥 투여 에뮬레이션 및 각각의 흡수/물질 대사 및 독성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

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Protocol

1. 2-OC에서 재배에 대한 조직 등가물의 생산

  1. 소장 장벽 동등한 생산
    1. 장 등가 매체를 사용하여 Caco-2 및 HT-29 세포를 유지하십시오: DMEM은 10% FBS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균증으로 보충되고, 1% 비필수 아미노산, 이는 이 원고에서 "DMEM S"로 명명된다.
    2. 매체를 제거하고, 1x DPBS로 두 번 세척하고 세포 배양 플라스크에서 자란 카코-2 세포를 해리하기 위해 0.25% 트립신/EDTA의 8mL을 추가한다(175cm2). 37°C에서 5분 동안 배양하고 트립신 억제제의 이중 부피를 적어도 첨가하여 반응을 중지한다. HT-29 세포에 대해 동일한 절차를 수행하여 이러한 세포의 양이 적어 더 작은 플라스크(75cm2)로유지되므로 시약 볼륨을 조정합니다.
    3. 원심분리기는 250 x g에서 5분 동안 두 튜브에서 상퍼를 제거하고, DMEM S. 카운트 세포의 10mL에서 세포 펠릿을 재보일시하여 80% 이상의 세포 생존가능성을 보장한다. 무균은 이전에 혈관 측 (인간 혈류를 나타내는)에서 잘 당 DMEM S의 400 μL로 채워진 24 웰 플레이트에 세포 배양 삽입을 통합합니다.
    4. 9:121의비율로 Caco-2 및 HT-29 세포를 공동 경배한다. DMEM S의 최종 부피 200 μL의 최종 부피에서 각 장에 상응하는 2.25 x 10 5 Caco-2 및2.5 x 104 HT-29 세포를 사용하십시오. 조심스럽게 섞입니다.
    5. 각 삽입의 apical 측(인간 장 루멘 측을 나타내는)에 세포 용액의 Pipette 200 μL을 삽입당 250,000개의 세포를 시드합니다. 3주 동안 인서츠에서 세포를 공동경작한다. 일주일에 세 번 이상 배지를 변경하여 멸균 파스퇴르 파이펫으로 무형 및 바식사이드 모두에서 스컬쳐하여 그대로 세포 장벽을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
      참고: 세포 장벽을 만지지 않도록 apical 측의 포부를 진행합니다(셀 인서트의 플라스틱 테두리에 파스퇴르 파이펫을 지원하여 흡인).
    6. 제조업체의 지시에 따라 볼트계23을사용하여 3일마다 TEER(전피 전기 저항)를 측정하여 단단한 단층 형성을 확인하십시오.
      1. 빈 을 수행, 세포 배양에 걸쳐 저항을 측정 세포 없이 삽입, 하지만 동일한 세포 배지와 동일한 세포 판에.
      2. 조직-동등한 저항으로부터 빈 저항을 빼서 조직 저항을 계산하고, 필터 멤브레인(0.6cm2)의유효 표면적으로 증식한다. 좋은 장 장벽 저항은 150에서 400 Ω
        참고: 21일 후에 는 세포를 완전히 분화하고 장 장벽이 형성되어야 하므로 장 등가물은 MPS에 통합될 준비가 되어 있습니다.
  2. 간 등가물 생산
    1. 간 동등한 매체를 사용하여 HepaRG 세포를 유지, 이는 윌리엄의 중간 E로 보충 10% 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민, 100 단위 /mL 페니실린, 100 μg/mL 연쇄상 구균, 5 μg/mL 인간 인슐린 과 5 x 10-5 M 하이드로코톤, 이 이름 HepaRG 배지를 2-3일마다 갱신하고 간세포 및 담고옥시테에서 분화를 시작하기 위해 2주 동안 세포 배양을 유지한다.
    2. 처음 2 주 후, 세포 분화24,25를완료하기 위해 추가 2 주 동안 HepaRG의 매체에 2 %DMSO를추가합니다. Stellate 세포 미디어(SteC CM)에서 HHSTeC를 성장시키고, 폴리 L-리신 코팅 세포 배양 플라스크를 사용하여 2~3일마다 미디어를 변화시다.
    3. 매체를 제거하고, 1x DPBS로 두 번 세척하고 0.05% 트립신/EDTA의 8mL을 추가하여 세포 배양 플라스크(175cm2)에서자란 HepaRG 세포를 해리시화한다. 37°C에서 5 내지 10분 동안 배양하고 트립신 억제제의 부피를 적어도 두 배 이상 첨가하여 반응을 중지한다. HHSTeC에 대해 동일한 수행, 이러한 세포의 작은 양이 필요하고 그들은 작은 플라스크 (75cm2)에서유지 될 수 있기 때문에 시약 볼륨을 적응.
    4. 원심분리기는 5분 동안 250 x g에서, 상류체를 제거하고 윌리엄스 E S 배지의 세포 펠릿을 재연한다. 셀을 계산하여 80% 이상의 세포 생존가능성을 보장합니다.
    5. HepaRG와 HHSTeC 세포를 각각 24:1의 비율로 결합한 간 스페로이드를 생성하여 윌리엄스 E S배지(16)에서생성한다. 4.8 x104 분화 된 HepaRG 및 0.2 x 104 HHSTeC를 추가하여 50,000 세포의 각 간 스페로이드를 80 μL의 부피로 구성합니다. 조심스럽게 섞입니다.
    6. 멀티채널 파이펫을 사용하여 384개의 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰에 결합된 셀 풀의 80 μL을 분배하며, 이는 둥근 바닥 형상을 가지고 있습니다.
      참고: 4일 후 약 300μm의 스페로이드가 형성됩니다.
    7. 넓은 보어 팁을 사용하여 간 스페로이드를 초저 부착 6 웰 플레이트로 옮기면 필요한 "일대일" 계산이 가능합니다.

2. 2-OC MPS에서 장과 간 등가물의 통합

  1. 흡수 분석용 장 2-OC MPS 어셈블리
    1. DMEM S의 파이펫 500 μL은 더 작은 구획에 2-OC 및 300 μL의 더 큰 구획으로 들어갑니다. 24 개의 우물 판에 해당하는 각 장 장벽의 바소포탈 및 정량 적 매체를 흡인하십시오. 멸균 집게를 사용하여 2-OC 회로당 하나의 인서트를 통합하여 특히 더 큰 구획에 통합합니다. 내장 배지의 200 μL을 정측에 적용합니다.
      참고: 오간노이드를 MPS에 통합할 때 거품이 형성되는 것을 피하십시오.
    2. MPS를 가압 공기 공급에 연결해야 하는 제어 장치에 연결합니다. 매개 변수 설정: 약, ±300 바및 0.3Hz의 펌핑 주파수의 압력. 시험 물질 투여 전에 24시간 흐름을 시작합니다. 다음 날, APAP 치료를 수행합니다.
  2. 간 2-OC MPS 조립 물질 대사 분석
    1. 윌리엄스 E S의 파이펫 650 μL은 큰 구획으로 들어가고 350 μL을 더 작은 구획으로 들어가 스페로이드를 받게 됩니다. 초저 부착 6 웰 플레이트에서 와이드 보어 팁을 사용하여 스페로이드를 계산합니다. 각 간 등가물은 20개의스페로이드(26)로구성된다. 오르가노이드만 전달할 수 있는 와이드 보어 팁을 사용하여 회로당 20개의 간 등가물을 통합하여 2-OC의 작은 구획으로 옮습니다.
    2. MPS를 가압 공기 공급에 연결해야 하는 제어 장치에 연결합니다. 매개 변수 설정: 약, ±300 바및 0.3Hz의 펌핑 주파수의 압력. 시험 물질 투여 전에 24시간 흐름을 시작합니다. 다음 날, APAP 치료를 수행합니다.
  3. 흡수 및 신진 대사 분석에 대한 장 / 간 2-OC MPS 조립
    1. 두 개의 미디어(장과 간)를 1:4 비율로 결합하여 장 내 DMEM S200 μL과 바소측에 있는 윌리엄스 E S의 800 μL을 의미합니다. 2-OC에서 장과 간 등가물을 동시에 통합합니다.
    2. MPS를 가압 공기 공급에 연결해야 하는 제어 장치에 연결합니다. 매개 변수 설정: 약, ±300 바및 0.3Hz의 펌핑 주파수의 압력. 시험 물질 투여 전에 24시간 흐름을 시작합니다. 다음 날, APAP 치료를 수행합니다.
      참고: 모든 실험의 경우 세 개의 분리된 2-OC 회로(예: 1 및 1/2 2-OC 장치)를 의미하는 triplicate에서 각 시간 점을 수행합니다. 각 2-OC 회로의 총 부피는 1mL입니다.

3. 아세트아미노펜 (APAP) 준비

  1. 절대 에탄올에서 APAP를 용해, APAP 주식 솔루션을 준비합니다. 실험 당일, 각 배지(APAP 용액)에서 APAP를 희석하여 "경구 투여"와 "정맥 투여"에 대한 2 μM의 농도로 희석한다.
  2. 차량 제어 및 치료 용액에서 에탄올의 최종 농도가 두 행정부모두에 0.5%인지 확인합니다. 양수 조절(100mM APAP)의 경우 에탄올 농도는 2%이다.

4. 약물 관리 및 미디어 샘플링 테스트

  1. APAP "구두" 관리 및 미디어 샘플링
    1. 적절한 배양 배지의 2-OC. Pipette 500 μL에서 각 장 장벽의 바소포 및 정계 배지를 유기성 바식측의 큰 구획으로 배양하고 300 μL을 작은 구획에 흡인한다.
    2. 거품을 확인하고 경구 투여를 모방하여 시험 물질과 함께 장 장벽 동등한 치료를 진행한다. APAP "구두" 투여는 장 내 "루멘 측"(도1B)을나타내는 장 배양 인서트의 정황 측에 12 μM APAP 용액의 200 μL을 첨가하여 투여한다. MPS를 제어 장치에 연결합니다.
    3. 다음 시점에서 apical 및 바소쪽 측면에서 총 볼륨을 수집 : 0 h, 5 분, 15 분, 30 분, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h15,27. 정적 및 동적 조건에서 triplicate에서 모든 실험을 수행하고 별도의 마이크로 튜브에서 각 삼중 기류의 각 샘플을 수집합니다. HPLC/UV를 사용하여 샘플을 분석합니다.
      참고: 별도의 정문 및 바소포탈 샘플을 분리합니다.
  2. APAP "정맥" 관리 및 미디어 샘플링
    1. 2 μM APAP 용액을 간 구획에 직접 투여하여 "정맥 내" 경로를 에뮬레이트합니다. 모든 2-OC 중간 콘텐츠를 흡인. 테스트 물질을 대형 구획에 함유하고 있으며 동일한 매체의 350 μL을 포함하는 윌리엄스 E S의 Pipette 650 μL이 20개의 스페로이드를 포함하는 작은 구획에 들어갑니다. 0h, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간,24h 27,28: 다음 시점에서 모든볼륨을수집합니다.
    2. 정적 및 동적 조건에서 트리플리케이트로 모든 실험을 수행합니다. 각 삼중항의 각 샘플을 별도의 마이크로튜브로 수집합니다. HPLC/UV를 사용하여 샘플을 분석합니다.

5. 계측 및 크로마토그래피 조건

  1. HPLC 분석
    1. 표 1에따라 HPLC 분석에 대한 모든 관련 매개 변수를 설정합니다.
    2. 진공 상태에서 0.45 μm 멤브레인 필터를 통해 이동 단계를 필터링합니다. 0.22 μm 모공 크기 PVDF 주사기 필터(직경 13mm)를 통해 샘플을 필터링하고 유리병에 보관합니다. 측정을 시작합니다.
  2. 스톡 솔루션, 교정 표준 및 품질 관리(QC) 샘플
    1. 암모늄 아세테이트 버퍼(100mM, pH 6.8)로 APAP 스톡 솔루션 10m를 준비하고, 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)로 희석된 DMEM S 및 윌리엄스 E S 세포 배양 배지로 더욱 희석하여 0.25에서 100.00 μM까지 다양한 작업 솔루션을 달성한다.
    2. 삼중 교정에 교정 샘플 세트와 트리플리케이트의 4개 수준에서 품질 관리 샘플을 포함합니다. 직렬 희석으로 이러한 표준을 준비합니다.
    3. APAP 명목 표준 농도에 비해 APAP 피크 영역의 교정 곡선을 만듭니다. 각 교정 곡선에 대한 선형 회귀 적합을 결정합니다. 육안 검사, 상관 계수, 인터-런 정확도 및 정밀도 값으로 다양한 교정 모델의 적합성을 평가합니다.
    4. DMEM S와 윌리엄스 E S 미디어의 빈 샘플을 심모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)에서 희석하여 sextuplicate에 주입합니다. 0.50(LOQ), 4.50, 45.00 및 90.00 μM의 APAP 농도에 대해 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)로 희석된 DMEM S 및 Williams E S 미디어에서 품질 관리 샘플의 트리클리카를 준비합니다.
    5. 품질 관리 샘플이 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 것과 다른 새로운 스톡 솔루션에서 제조되었는지 확인합니다. 품질 관리 샘플을 사용하여 실행 내 및 실행 간 변형을 조사합니다.
  3. 유효성 검사 절차
    1. 이전에 보고된절차(29,30)에따라 생체 분석 방법 검증을 수행한다. 각각 윌리엄스 E S와 DMEM S 세포 배양 매체를 고려하여 5~6개의 별도 경우에 크로마토그래피 실행을 수행한다.
    2. APAP의 0.25내지 100.00 μM에 이르는 교정지점, DMEM S 또는 윌리엄스 E S 세포 배양 배지에서 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)에서 희석된 교정 지점이 각각의 명목 농도(축)에 대한 APAP(축 y)의 피크 영역에 따라 플롯되도록 한다. 이러한 표준 교정 곡선의 경사면을 암모늄 아세테이트 버퍼에서 제조한 교정 곡선의 경사면을 비교합니다. 모든 교정 곡선의 상관 관계 값이 0.998 이상인지 확인합니다.
    3. 5일 또는 6일 동안 4개의 서로 다른 레벨 LLOQ, 낮음, 중간 및 고품질 제어에서 복제를 사용하여 대리 매트릭스의 별분(내부 및 인터-런)에 대한 정밀도와 정확도(내부 및 인터런)를 결정합니다. 0.50, 4.50, 45.00 및 90.00 μM APAP 농도(n= 3)를 포함하는 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)에서 희석된 DMEM S 또는 Williams E S 세포 배양 배지에서 같은 날 에 대한 정밀도 및 정확도 측정을 수행합니다.
    4. 최근에 획득한 교정 곡선에서 APAP 농도를 포함하는 각 품질 관리 샘플 집합을 평가합니다. 간섭 성분에 의한 관심 화합물및 가능한 다른 크로마토그래피 피크의 분리 정도에 의해 분석의 선택성을 테스트한다.
  4. 정량화(LLOQ) 하한 및 검출 제한(LOD)
    1. 응답 및 경사 접근 방식의 표준 편차를 기준으로 정량화(LLOQ)의 하한을 결정합니다. α y-intercept및 S의 표준 편차는 교정곡선(29,30)을 플로팅하여 얻어진 직선의 경사인 수식(10α/S)을 사용하여 계산한다. 교정곡선(29,30)의경사로 나눈 빈칸의 표준 편차의 3.3배를 고려하여 검출한계(LOD)를추정한다.

6. 조직 등가물 생존/기능

  1. Mtt
    1. MTT 분석기를 수행하여 MPS 분석의 모든 시간 지점에서 오르가노이드 생존가능성을 평가합니다. 음의 제어로 셀 미디어와 차량을 사용합니다. 양성 조절으로서, 세포 배지에서 희석된 100mMM APAP 및 1% NaOH로 오르가노이드를 치료한다.
    2. 96웰 플레이트에서 개별 우물에 대해 각각 복제된 각 의 20개의 스페로이드를 전송하고, 소장 등가물을 포함하는 세포 배양 삽입물을 24개의 웰 셀 플레이트로 이송하여, 1장의 소장을 웰당 동등한 1개를 배치한다. 1x DPBS로 티슈 등가물을 세 번 세척합니다.
    3. 1 mg/mL MTT 용액의 300 μL을 각 셀 배지에 희석하여 양면으로 추가합니다. 표준 세포 배양 조건에서 플레이트를 3시간 동안 배양한다.
    4. 배관하여 MTT 용액을 각 에서 신중하게 제거합니다. 4°C에서 하룻밤 사이에 200 μL의 이소프로판올을 사용하여 장 및 간 등가물에서 MTT 포르마잔을 추출한다.
      참고: 증발을 방지하기 위해 뚜껑을 밀봉합니다.
    5. 각 수퍼중의 200 μL을 96개의 잘 마이크로 테스트 플레이트에서 미리 확인된 각각의 음부로 이송한다. 이소프로판올을 빈 칸으로 사용하십시오.
    6. 570 nm에서 플레이트 리더의 포르마잔 흡광도를 읽으십시오. MTT를 줄이기 위해 세포의 상대적 능력을 계산합니다(%) 100% 셀 생존가능성으로 간주되는 음극과 비교하여 각 시간점의 평균 광학 밀도를 사용한다.
  2. 세포화학/히스토로지
    1. 장 및 간 등가물을 실온에서 25분 동안 수정하여 0.1M 인산염 식염수 버퍼, pH 7.4에서 4%(w/v) 파라포름알데히드를 사용합니다. 매번 10분 동안 PBS 버퍼에서 오가노이드를 5회 세척합니다. 장과 간 등가물을 테트라메틸로다민 이소티오카네이트-팔로이신 또는 알렉사 플루오르 647 폰로이드인, PBS31에서1:50을 염색한다.
    2. 완전한 동결 될 때까지 액체 질소로 전송하기 전에 RT에서 적응하기 위해 몇 분 동안 OCT 동결 매체로 전송합니다. 저온을 사용하여 약 10-12 μm 두께의 간 스페로이드 저온 섹션을 수행합니다.
    3. DAPI를 장착하는 배지에 조직 섹션을 마운트합니다. 공초점 형광 현미경 검사법에 의해 그들을 검사하십시오.
    4. 확립된 프로토콜에 따라 헤마톡시린 및 에오신 염색을 수행하기 위해 고정 후 오르가노이드를 동결한다. 전술한 바와 같이 조직을 잘라낸 후 장착 매체로 슬라이드를 마운트하고 광학 현미경을 사용하여 조직학적 이미지를 취합니다.
  3. 높은 함량 분석
    1. 세포의 미토콘드리아 및 핵 염색
      1. DMSO의 lyophilized 분말을 재구성하여 1 mM 미토콘드리아 염색 스톡 솔루션(예: 미토트래커 딥 레드 FM)을 만듭니다. 빛으로부터 보호 -20 °C에 알리 인용 재고 솔루션을 저장합니다. 1mM 미토콘드리아 염색 스톡 용액을 예동(37°C) 조직 배양 배지에서 최종 농도(200nM)로 희석한다.
      2. 세포 배양 매체를 제거합니다. 미토콘드리아 염색 용액을 추가하여 5%CO2로가습된 대기에서 37°C에서 15-45분 동안 샘플을 완전히 커버하고 세포를 배양한다.
      3. 미토콘드리아 염색 작업 용액을 조심스럽게 제거하고 실온에서 15 분 동안 PBS에서 2-4 % 파라 포름 알데히드 고정으로 대체하십시오.
      4. 고정 된 셀을 PBS로 부드럽게 헹구십시오 5 분 동안. 세탁 과정을 두 번 반복합니다.
      5. 초순수 10mL에서 10mg/mL(16.23M) 핵산 염색 스톡 용액을 100 mg의 Hoechst 33342 염료100 mg을 용해하여 준비한다.
        참고: 주식 용액은 -20°C에서 빛으로부터 보호된 알리인용 및 저장되어야 합니다.
      6. PBS에서 0.2-2.0 μg/mL 핵산 염색 작업 용액을 준비하고 실온에서 10분 동안 핵산 염색 작업 용액으로 고정된 세포를 배양한다.
      7. 핵산 염색 작업 용액을 제거하고 PBS로 세포를 부드럽게 헹구십시오. 세포는 빛으로부터 보호되는 4°C에서 PBS로 보관해야 합니다.
    2. 미토콘드리아 및 핵 염색 분석
      1. 핵산 얼룩에 적합한 필터 세트로 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석합니다(λEx/λEm: 361/497 nm) 및 미토콘드리아 얼룩(λEx/λEm: 644/665 nm). 핵산 양성 염색에 의해 세포를 찾아 세포 수를 정량화한다. 미토콘드리아의 미토콘드리아 얼룩 형광 강도를 정량화합니다.
  4. ImageJ의 형태 측정(스페로이드 계산)
    1. 높은 콘텐츠 분석(HCA) 이미지를 콜럼버스 소프트웨어의 *.flex 파일로 내보냅니다. Bio-Formats 플러그인32를사용하여 ImageJ에서 회색 스케일로 .flex 파일을 가져오기 : 파일 > 가져오기 > 바이오 포맷.
    2. 가져오기 옵션 창에서 하이퍼스택 보기를 선택하고 분할 아래의 분할 채널을 별도의 창으로 사용하도록 설정합니다. 이 옵션을 사용하면 특정 채널(예: DAPI, 미토트래커 등)의 모든 파일에 액세스할 수 있습니다. 메모리 관리 에서 가상 스택 사용을 선택하지 마십시오.
      참고: 배양 배지가 UV 파장(예: 405 nm)에서 감소함에 따라 이미지에서 DAPI 채널을 "먼지"로 사용하는 것이 바람직하다.
    3. .flex 파일의 임베디드 값에 따라 로드되지 않은 경우 픽셀 크기조정(분석 및 설정 배율)을조정합니다. 가우시안 블러 필터를 적용하여 과도한 소음을 제거하고 모양 윤곽의 요철을 피하십시오. 공정 > 필터 > 가우시안 블러. 2.0에서 3.0 사이의 시그마(반지름)의 높은 값은 대부분의 경우에 이상적입니다. 스택에 여러 이미지가 있는 경우 모든 이미지에 적용합니다(프로세스 스택 창에서 예 선택).
    4. 임계값을 사용하여 배경 및 오르가노이드(개체)를 분리하는 이진 이미지를 생성합니다. 이미지 및 gt를 클릭하고 조정 > 임계값을 클릭합니다. 빨간색 마스크를 사용하여 이미지의 강도에 따라 값을 조정하고, 오르가노이드 모양에 맞게 형태가 그대로 유지됩니다. 이미지에 흰색 배경이 있는 경우 어두운 배경을 사용하지 않도록 설정합니다. 적용을클릭합니다.
    5. 이진 창으로 스택 변환에서 임계값 메서드를 선택합니다. 일반적으로 이러한 종류의 이미지 처리에서 기본값 또는 삼각형이 선호됩니다. 배경을 어둡게유지합니다. 스택에 여러 이미지가 있는 경우 각 이미지에 대한 임계값 계산을 선택합니다.
    6. 프로세스 및 gt; 바이너리 > 채우기 구멍을 선택합니다. 선택적으로 백그라운드에서 구멍을 제거합니다. 프로세스 > 바이너리 > 옵션s에서 블랙 배경을 선택하고 채우기 구멍을 다시 실행합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 검은색 배경 옵션을 사용하지 않도록 설정합니다.
    7. 객체를 분리합니다. 오르가노이드의 경우 분수령 방법은 좋은 선택입니다. 프로세스 및 gt; 바이너리 > 유역클릭. 셰이프 분석을 실행합니다.
      1. 분석 및 측정 설정을 선택합니다. 몇 가지 옵션을 사용할 수 있습니다(https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html 세부 정보). 오가노이드의 경우 영역, 평균 회색 값, 최소 및 최대 회색 값 및 셰이프 설명자 선택합니다. 선택적으로 표시 레이블을 선택하여 이미지 및 과학적 표기서의개체를 식별합니다. 확인을 클릭합니다.
      2. 분석 및 gt를 선택하고 입자를 분석합니다. 크기 및 순환 제한을 선택합니다. 이미지의 모든 오브젝트를 측정하려면 각각 0-infinity 및 0.00-1.00을 유지합니다. 쇼에서객체를 식별할 수 있도록 윤곽선을 선택합니다. 결과를 출력할 수 있도록 표시 결과를 사용하도록 설정합니다. 테두리에 닿는 객체를 제외하려면 모서리에 제외합니다. 구멍을 포함하므로 오브젝트의 최종 내부 구멍이 주 모양의 일부로 간주됩니다.
    8. 모든 이미지 스택에 대해 모양 분석을 반복하면 결과가 단일 테이블에 추가됩니다. 결과 테이블을 파일 > 저장으로 쉼표(.csv) 파일로 내보냅니다.
  5. 실시간 PCR
    1. 페놀과 구아니오티오카네이트의 단면식 용액을 사용하여 조직 등가물에서 RNA를 추출하여 제조업체의 지시에 따라 추출합니다.
    2. 총 RNA의 1 - 2 μg의 역전사에 의해 cDNA 합성을 수행한다.
    3. 유전자 특이적 프라이머(표5)를사용하여 모든 표적을 증폭하여 실시간 정량적 PCR을 수행합니다. 각 qRT-PCR에는 역전사 RNA 30ng및 각 프라이머의 100nM이 포함되어 있습니다.
    4. PCR 조건을 따르십시오 : 3 분 동안 50 °C (1 주기); 5 분 동안 95 °C (1 주기); 95°C30초, 59°C45초, 72°C는 45초(35~40사이클)에 대해 서한다.
  6. CYP 분석
    1. 간 2-OC 어셈블리에 대한 섹션 2.2를 따르십시오. 실험군은 12시간, 24시간, 차량 제어를 위한 노셀 제어, APAP 2 μM 치료제이다. APAP 2 μM 준비 및 치료를 위해 섹션 3.3 및 4.2를 따르십시오.
      참고: 모든 샘플이 CYP 분석에 대해 동시에 준비되도록 하려면 24시간 치료를 시작한 후 12시간 동안 치료를 시작합니다. CYP 활성의 세포 없음 제어를 0.5% 에탄올 용액과 차량 제어로 처리합니다.
    2. 실온에서 3m mM 발광 기판 스톡 솔루션을 해동하고 윌리엄의 E S. 빛으로부터 1:1000 희석을 합니다.
    3. 스페로이드를 수집하고 각 실험 군을 96웰 플레이트의 우물로 옮기다. 매체를 제거하고 1x DPBS의 100 μL로 두 번 세척하고 우물당 3 μM 기판 용액의 80 μL을 추가하십시오. 윌리엄의 E S 배지에서 세포 없음 제어를 유지합니다. 배경 제어를 위해 스페로이드 나 기판 솔루션없이 우물을 저장합니다. 37°C에서 30-60분 동안 5% CO2로배양하여 빛으로부터 보호합니다.
    4. 에스트라아제와 재구성 버퍼를 사용하여 류필립루시페린 검출 시약(LDR)을 평형화한다. 소용돌이 또는 반전하여 섞습니다. 다음 단계까지 적절한 볼륨을 실온에 저장합니다.
      참고: 재구성된 LDR은 실온에서 24시간 또는 활동 손실 없이 1주 동안 4°C로 보관할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 -20°C에 보관하십시오.
    5. 잠복 후 흰색 불투명 96 웰 마이크로 플레이트의 세 가지 다른 우물에서 그대로 스페로이드의 상체 25 μL을 전송합니다. 우물당 LDR 25 μL을 추가하고 균질화합니다.
    6. 20 분 동안 실온에서 흰색 접시를 배양. 발광계에서 발광을 읽어보십시오. 불소계를 사용하지 마십시오.
    7. 테스트 복합 처리 및 처리되지 않은(차량 제어) 값에서 백그라운드 발광 값(셀 제어 없음)을 빼서 순 신호를 계산합니다. CYP3A4 활동의 백분율 변화를 순 처리값을 처리되지 않은 값으로 나누고 100으로 곱하여 계산합니다.
  7. 웨스턴 블로팅
    1. 확인된 1.5 mL 마이크로튜브로 간 스페로이드를 전달한다. 중간을 제거하고 1x DPBS의 100 μL로 두 번 세척하십시오.
    2. 간 스페로이드를 100 μL의 세포 용해 RIPA 버퍼를 4°C에서 20분 동안 용해합니다. 원심분리기는 15분, 4°C 및 11000 rpm에 대한 것입니다. 상체를 다른 식별된 1.5 mL 마이크로튜브로 전송합니다.
    3. 브래드포드 방법을 통해 얻은 단백질의 양을 정량화한다. 그라데이션 폴리아크릴아미드 겔3-15%의 정량화된 세포 용액으로부터 10~50μg의 단백질을 적재하고 SDS-PAGE를 수행한다.
    4. 전자에서 0.22 μm PVDF 멤브레인으로 하중 된 단백질을 반건조 시스템 장비를 통해 전달합니다. 50m Tris-HCl 및 192m 글리신의 전송 용액을 사용하십시오. 전송할 젤 수(한 번에 1~2개)에 따라 장비 파라미터를 설정합니다.
    5. TBS-T 버퍼에서 3-5% 탈지 우유 용액으로 PVDF 멤브레인에 대한 비특이적 상호 작용을 차단합니다: 트웬 20의 0.1%로 보충된 Tris-Buffered Saline(50m Tris pH 7.6, 150mM MM 나트륨 염화나트륨). 실온에서 1 시간 동안 부드럽게 일정한 흔들림 아래 멤브레인을 유지합니다.
    6. 실온에서 3-5 분 동안 부드럽게 일정한 흔들림 아래 TBS-T로 씻으십시오. 이 세탁 단계를 두 번 반복하십시오.
    7. TBS-T에서 알부민 및 비골민 1차 항체를 각각 1:1000 및 1:2000으로 희석한다. 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체로 멤브레인을 배양하여 부드럽게 일정한 흔들림을 가합니다.
      참고: 항상 제조업체의 지침을 따라 항체를 희석시합니다.
    8. 1 차적인 항체및 세척막을 3회(단계 6.7.6)를 제거한다. TBS-T에서 ECL 항마우스 IgG 이차 항체를 1:5000으로 희석시. 실온에서 2 시간 동안 부드럽게 일정한 흔들림 아래 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.
    9. 이차 항체를 제거하고 멤브레인을 세척하십시오(6.7.6 단계). ECL 웨스턴 블로팅 기판을 사용하여 단백질 검출을 수행합니다. 30~30분 동안 자동방사선 필름을 노출합니다. 삼중피에서 면역 블로팅 검출을 수행합니다.

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Representative Results

2-OC MPS에서 PK APAP 테스트를 수행하기 위해, 첫 번째 단계는 인간 장 및 간 등가물(organoids)을 제조하는 것이다. PK APAP 분석기 시작 전에 2-OC 미세유체장치(도 1A)24h에 통합된다. 다음 날, 매체가 변경되고 모델이 APAP에 노출됩니다. 도 1은 2-OC장치(도 1B)및 APAP PK 실험 시간과정(도 1C)에내장 및 간 등가물을 도시한다. 우리는 MTT 분석, TEER 측정, HCA, 실시간 PCR, 서부 블로팅, 조직학 및 공초점 형광 현미경을 2D 배양 및 3D 오르간노이드에서 수행하여 조직의 생존가능성을 확인하고 가능한 APAP 독성 효과를 감지했습니다. 공초점 형광 현미경 이미지에서, DAPI 및 Phalloidin으로 염색된 장 등가 시료(핵 및 액틴각각)는 비처리(도2A)와12μM APAP 처리 샘플(도2B)에대한 인접 장벽으로 제시되었다. 도 2C에서볼 수 있듯이, MTT 분석은 70% 이상의 상대 세포 생존 능력 수준을 보였으며, 12 μM 농도33,34,35,36,37에서APAP 노출에 대한 반응으로 관련 세포독성 효과가 없음을 나타낸다. 양성 대조군(100mMMM)은 상당한 세포사멸(생존5%) 미만을 유도하였다. 카코-2/HT-29 생존가능성 및 적절한 분화뿐만 아니라 장등장벽 무결성은 차별화 기간 동안 TEER 진화에 의해확인되었다(도 2D). APAP는 도 2E에도시된 대로 TEER 값에 어떠한 변경도 일으키지 않았다. 활성 나트륨 결합 포도당 수송기 SLC5A1, 다약물 내성 수송기 MDR1 및 나트륨 칼륨 ATPase의 발현을 분석하여 세포 장벽 형성 및 기저 기능에 대한 APAP 치료 영향을 검증하였다. 도 2F-H에서입증된 바와 같이, 비처리 및 APAP 치료 장 등가물은 모두 SLC5A1 및 NaKATPase의 유사한 표현을 보여주었습니다. 유도된 12μM APAP의 경구 투여는 24h(도2H)이후장 등가물에서 MDR1 mRNA 수준이 증가하는 것을 표시하였다. 우리는 또한 핵및 미토콘드리아 질량 함량에 대한 플루오로포레 염료 혼합물에 의한 세포 페노티픽 변화의 HCA를 수행했습니다. 양성 제어는 100mM APAP와 1% NaOH였습니다.

또한, 우리는 12 μM APAP가 2D Caco-2/HT-29 공동 배양에 세포 독성을 유도할 수 있는지 여부를 분석했습니다. 도 2I에 도시된 형광 현미경으로 획득한 장 세포 이미지는 MTT 데이터를 확증하며, 이는 12 μM APAP가 Caco-2/HT-29 장 등가물에서 상당한 세포 독성을 일으키지 않았다는 것을 입증하였다.

2 μM APAP에 반응하여 간 스페로이드 기저 생존력 및 세포 독성의 평가는 공초점 형광 현미경 검사법, H&E 조직학 및 HCA 분석법에 의한 MTT 분석 및 형태 분석에 의해 수행되었다. 도 3A에도시된 바와 같이, MTT 분석체는 정적 및 동적 조건 하에서 간 2-OC 어셈블리에서 채취한 샘플에서 2 μm APA 치료에 대한 응답으로 임의의 관련 세포 독성을 식별할 수 없었다. 세포 생존율은 감소했지만 12h와 24h 타임 포인트33,34,35,36, 37모두에서 80 % 이상 머물렀다. 양성 대조군 치료(100mM APAP 및 1% NaOH)는 상당한 조직 손상(10% 미만의 생존율)을 유도하였다. 현미경 공초점 심상은 기저 또는 APAP 처리 조건 둘 다에 있는 간 스페로이드에 있는 괴사 센터의 부재를 나타내고, 중요한 죽음 비율의 아무 기록도(그림 3B-C). 그러나, HCA 분석기를 통해 2D HepaRG/HHSteC 공동문화에서 차량 또는 2μM APAP 투여에 따른 다중 세포 피노티픽 변화를 분석한 결과, 100mMM APAP(C+)를 양성 대조군으로 사용하여, MTT 분석의 결과에모순되게, 간 세포는 2μMAPAP(2μM APAP)에 대한 초기 세포독성 반응을 입증하였다. 24시간 이후에는 핵영역에서 세포 수가 감소하고 미토콘드리아 질량이 증가하였다. 또한, Hoechst 33342 및 미토트래커 딥 레드를 함유한 플루오로퍼염료 칵테일을 사용하여 3D 간 스페로이드(도3J)를염색하였다. 피지 소프트웨어는 여러 구형 아키텍처(그림 3E-I)중균질성을 평가하는 데 사용되었다. 그림 3E에 표시된 그래픽은 간 스페로이드 총 면적 간의 유사성을 보여줍니다. 종횡비(도3F)는약 1은 스페로이드의 과자 과정에서 편견이 없다는 것을 의미한다. 평가는 또한 스페로이드의 대다수가 대략 둥근 것을 나타냈다(도 3G). 형태 둘레 및 세포 분포의 평가는 각각순환(도 3I)및 견고성 계산(도3H)에의해 수행되었다. 우리는 간 구체를 과자하는 방법론이 매끄러운 둘레로 오르가노이드를 생성했다는 결론을 내렸으며, 구형 성장과 호환, 편견, 또는 괴사.

도 4A-B에서입증된 바와 같이, 간 스페로이드는 각각 상대기 고수준의 알부민 및 GST mRNA 발현을 나타내며 적절한 기저 기능을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 24h에 대한 2μM APAP 치료는 알부민과 GST mRNA 발현 레벨의 감소를 유도하여 APAP 치료의 24시간 시점에서 기능적으로 간 스페로이드의 손상을 시사한다.

CYP3A4 및 UGT1A1 mRNA 발현 수준의 검출은 간 등가물 대사 용량을 보여줍니다. CYP3A4 mRNA 기저수준(도4C)은이전 보고서6과일치하였다. APAP 치료는 APAP 처리에 반응하여 CYP3A4 mRNA 및 UGT1A1 발현(도4C-D)의감소 추세를 다시 한번 APAP 치료의 24시간 시점에서 기능적으로 간 스퍼로이드의 손상의 가설을 확증하는 경향을 유도하였다.

또한, 서양 블로팅 및 체외 효소 활성의 실험은 기저 및 APAP 치료 조건에서 간 등가물에서 의 CYP 3A4 활성뿐만 아니라 알부민 단백질 발현을 분석하기 위해 수행되었다. 우리는 간 2-OC MPS에서 수행 된 2 μM APAP 치료가 정적(도 4E)및 동적(도 4F)조건에서 12 h 및 24 h 시간 지점에서 간 동등한 총 알부민 발현의 감소를 유도한 것으로 나타났습니다. 한편, 역학적 조건에서 간 등가물 샘플은 정적인조건(도 4G)에비해 알부민의 단백질 발현 수준을 더 높은 수준으로 제시하는 경향을 보였다. CYP 3A4는 간 2-OC MPS로부터 간 등가물에서 수행된 체외 분석서에서 12h 또는 24h에 대한 2μM APAP 치료가 정적 및 동적 조건 모두에서 CYP 3A4 활성의 견고하고 유의한 손상을 유도할 수 있음을보여주었다(그림 4H-I). 더 흥미로운 것은, 미디어 흐름(dynamic)의 존재는 간 등가물 CYP 3A4 활성 수준이 순환 배지(정적 조건)의 부재에서 유지된 조건에 비해 상당한 개선을 유도하였다(도4J).

HPLC 분석에 관한 가장 민감한 분석 조건을 찾기 위해, 모바일 위상의 조성, 유형 및 첨가제의 농도를 포함하는 여러 매개 변수를 조사하였다. 아세토나이트는 메탄올보다 크로마토그램 해상도와 적절한 보존 시간을 더 잘 준 것으로 나타났습니다. C18 반전 상열을 사용하여 APAP의 빠르고 재현 가능한 분리를 얻었다. APAP 보유 시간(Rt) 값은 9.27 ± 0.19분이었습니다. APAP에 대한 선택성은 최고점의 모양 및 대칭 해상도뿐만 아니라 DMEM 및 윌리엄스 세포 배양 배지의 간섭 피크의 부족에 의해 표시됩니다.

APAP 표준 농도는 0.25에서 100.00 μM에 이르는 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)로 희석된 DMEM S 및 윌리엄스 E S 세포 배양 배지에서 보정 곡선을 구축하는 데 사용되었다. 이 방법의 선형성은 9개의 농도 수준에서 결정되었다. 데이터는 표 2 및 표 3에표시됩니다. APAP 농도와 피크 영역 사이의 관계는 선형 회귀 방정식에 의해 설명되었다: y = 16106*x + 3579.8 (R2=1), DMEM 배지) 및 y =16397*x + 2475.1 (R2=1, 윌리엄스 배지), 있는 "x"는 μM 및 "y"에서 APAP 명목 농도가 AU에서 APAP의 크로마토그램 피크 영역이다. 정량화의 상한선(즉, 100.00 μM)에서 백분율 편차 및 실행 간 가변성 값은 2.50% 미만이었습니다. 0.50 μM(LLOQ)을 제외한 9개의 농도 수준에 대한 정확도와 정밀도는 7.00% 미만의 DEV 및 C.V. 값으로 허용 범위 내에있었다(표 2 및 표 3).

4개의 시험된 농도에서 분석 방법은 생체 분석법에 대한 일반적으로 허용되는 기준 내에서 떨어졌다. 이 방법의 재현성은 0.50(LLOQ), 4.50, 45.00 및 90.00 μM의 APAP 품질 관리 샘플의 복제를 분석하여 평가하였다. 실행 내 및 실행 간 평균 결과는 표 4에보고됩니다. 분석의 정확성과 정밀도는 DEV 값 ≤ 15.00%와 C.V. 값이 각각 7.00%≤ 표시됩니다.

LOD는 신호 대 잡음 비율(S/N)이 3보다 크고 0.25 μM APAP에 대응하는 샘플로 결정되었습니다. 한편, 0.50 μM APAP 샘플로 추정되는 LLOQ는 S/N 비율이 10에 해당하는 것으로 나타났다. 또한 정확도 값(DEV%)을 발견했습니다. 명목 농도 값의 ≤ 19.00 % 이내로 배열. C.V. ≤ 18.77%, 표 2, 표 3 및 표 4)29,30에도시된 바와 같이 대내 및 실행 간 변동성이 나타났다.

APAP PK 분석은 세 가지 다른 2-OC MPS 어셈블리에서 수행되었다: 1) 내장 2-OC, 내장 동등한만 포함; 2) 간 2-OC, 간 스페로이드만 포함 하 고 3) 장/간 2-OC 창 자 장벽과 간 스페로이드.

흡수 연구를 위해, 경구 경로는 장 등가측에 12 μM APAP의 투여에 의해 모방되었다. APAP 농도는 HPLC/UV에 의해 측정되었으며, 중간 샘플에서 정적이고 역동적인 조건에서 정압 및 바식쪽 장 등가물 측면에서 수집하였다. 정압 및 바소라탈 측에서 수집된 매체의 APAP 역학은 장 모델이 APAP를 흡수할 수 있었다는 것을 입증하였다. 항문측(도5A)에서점진적인 APAP 농도가 감소하여 장 내 바소포탈측(도 5B)에서APAP 농도가 증가하였다. 매체의 최대 농도(Cmax)는 투여(Tmax)의 12h 이후 정적 및 동적 조건 모두에 대해 약 2μM이었다.

신진 대사 연구를 위해, 정맥 투여는 간 구획의 매체에 2 μM APAP의 응용에 의해 모방되었다. 정적 및 동적 조건 하에서 미디어의 APAP 농도 역학은 동적 조건에서만 APAP 농도의 감소를 검출할 수 있음을 나타내며, 2 μM APAP 투여 후 0.87 μM APAP 12h에 도달하였다(T1/2 = 12h). 간 등가물은 정적 조건하에서 최소한의 대사 효율을보였다(도 5C). APAP 농도는 APAP 투여 후 1.7 μM 12h에 도달했습니다. APAP 흡수 및 신진 대사 평가와 같은 통합된 전신은 내장/간 2-OC 모델에서 수행되었다. APAP는 경구 경로를 에뮬레이트하여 장과 동등한 의 정압 측을 통해 투여되었다. 중간 샘플은 장 내측면과 간 구획에서 모두 수집하였다. 도 5D는 정적 및 동적 조건에서 정압 측에서 APAP 농도의 점진적 붕괴를 나타낸다.

도 5E는 구별 가능한 흡수 및 신진 대사 단계를 나타낸다. 흐름은 또한 장 흡수에 영향을 미쳤다. 배지내의 APAP Cmax는 "내장 2-OC"(도5B)어셈블리의 2μM에서 동적 "내장/간 2-OC"(도5E)에대해 1.7 μM로 변경되었습니다. 도 5F는 1000 mg(블랙 커브 및 y축)의 단일 경구 투여 후 인간에서 얻은 동적 "내장/간 2-OC" 미생물 계통(적색 곡선 및 y축)에서 APAP의 농도-시간 프로파일과 인간에서 얻은 대표적인 프로파일 사이의 직접적인 비교를 나타낸다.

Figure 1
그림 1: 2-OC MPS에서 PK 연구를 위한 회로도 단계 편집. A)2-OC MPS의 회로도 도면, 상향식 보기에서 장 및 간 인간 조직 등가물을 보여주는. B)2-OC MPS 사진은 대표적인 광학 현미경 이미지와 함께 상향식 보기로 장치에 통합된 장 및 간 등가물을 가진 사진입니다. C)조직 등가물 제제, APAP 처리 및 배양 배지 수집 단계의 타임 라인, 및 약동및 독성 평가. 이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 장 등가물의 생존 가능성 및 독성 평가. A)세포 핵및 액틴 필라멘트로 염색된 비처리 Caco-2/HT-29 세포의 대표적인 공초점 형광 현미경 이미지 (DAPI 및 Phalloidin 각각); 63x 배율, 확대/축소 2.6. B)대표적인 공초점 형광 현미경 이미지는 24시간 동안 12μM APAP로 처리된 Caco-2/HT-29 세포의 현미경 이미지, 핵 및 액틴 필라멘트로 염색된 형광염(DAPI 및 Phalloidin 각각); 63x 배율, 확대/축소 2.6. C)정전 및 동적 조건에서 MTT 분석에 의한 장 등가성 평가. 그래프의 막대로 표시되는 값은 차량 제어(0으로 명명된 시간 점)*P&0.05 0 대 처리에 비해 백분율로 계산됩니다. D)21일 동안 의 TEER 진화. *P&0.05 일 1 일 대 다른 일. E)동적 조건하에서 APAP 투여 후 TEER 값을 내장 2-OC MPS로 입력합니다. 내장에 있는 유전자 발현은 등가합니다. 장 장벽의 흡수 전위 및 12μM APAP의 동적 조건 하에서 24시간 동안 의 가능한효과는 SLC5A1(F), Na-K-ATPase(G) 및 MDR1(H) 발현에 의해 검증되었다. 값은 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냅니다. 결과는 가사 GAPDH에 대한 비율로 표현된다. *P&0.05 차량 대 APAP. I)콜럼버스가 수행한 오페레타 이미지 기반 HCA® 2.4.0. 소프트웨어. 12 μM APAP 처리 후 다른 시간 지점에서 2D 장 공동 배양의 대표적인 이미지. 음의 제어는 중간(0h) 또는 차량(0.5% 에탄올)이었다. 여기에 표시된 긍정적 인 컨트롤은 100 mM APAP입니다. 이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 간 등가물의 생존력 및 독성 평가. A)간은 정적 및 동적 조건에서 MTT 분석에 의한 생존 가능성 평가에 해당합니다. 그래프의 막대로 표시되는 값은 차량 제어(0으로 명명된 시간 점) *P&0.05 0 대 처리에 비해 백분율로 계산됩니다. B)대표 공초점 이미지는 차량에서 캡처 한 2 μM APAP 24 h 내부 섹션에서 간 스페로이드를 치료. C)대표 H&E (헤마톡슬린 과 에오신 염색) 차량에서 캡처 한 이미지와 2 μM APAP 24 h 내부 섹션에서 간 스페로이드를 치료. 스케일 바 = 50 μm. D)2 μM APAP 치료 후 다른 시간 지점에서 2D 간 공동 배양의 대표적인 이미지. 차량으로 처리되고 2μM APAP로 처리된 견본은 이 분석에서 고려되었습니다. 불소 염색 혼합물에는 핵 염색을 위한 Hoechst및 미토콘드리아 질량 염색을 위한 미토트래커 딥 레드가 포함됩니다. 음의 제어는 중간(0h) 또는 차량(0.5% 에탄올)이었다. 양성 컨트롤은 100mM APAP였습니다. 캡처된 전체 스페로이드 이미지의 측정은 피지 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. E)영역 F)종횡비, G)원단, H)견고성, I)원형의 주파수 분포. N = 85. *p&05. J)LWD 10x 목표를 사용하여 오페레타가 획득한 3D 간 스페로이드의 대표적인 이미지. 이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 간 생존가능성/기능성 및 2 μM APAP의 가능한 효과는 유전자 및 단백질 발현 및 효소 활성에 의해 확인되었다. a)알부민 유전자 발현. B)GSTA2 유전자 발현. 간 기능 단계 I 및 단계 II 대사 및 2 μM APAP의 가능한 효과 24 그것에 걸쳐 동적 조건하에서 CYP3A4(C)및 UGT1A1(D)의유전자 발현에 의해 각각 검증되었다. E)정적 상태에서 총 알부민 단백질 발현. F)동적 조건 하에서 총 알부민 단백질 발현. 조건. G)정적인 또는 동적 조건하에서 재배및 처리된 간 등가물에서 총 알부민 발현의 차이를 보여주는 비교 그래프. H)CYP 3A4는 정적인 조건 하에서 체외 효소 활성. I)CYP 3A4는 동적 조건하에서 체외 효소 활성. J)간 등가물에서 CYP 3A4 활성의 차이를 보여주는 비교 그래프는 정적 또는 동적 조건하에서 재배 및 처리된다. 값은 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냅니다. 유전자 발현의 데이터는 가사 GAPDH에 대한 비율로 표현된다. 단백질 발현의 데이터는 비컬린 단백질에 대한 비율로 표현된다. * P&0.05 차량 대 APAP 치료. 이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 2-OC MPS에서 APAP 약동학의 분석. APAP 흡수 프로파일은 12 μM APAP 투여 후 내장 2-OC MPS 제제의 정면에서 투여한다. 장 장벽은 카코-2/HT-29세포주(A)정전기 측으로부터 배지에서 정적 및 동적 APAP 농도의 공동 배양으로 만들어졌다(인간 장 루멘 측을 대표함). (B)바소포측으로부터 의 배지내의 정적 및 동적 APAP 농도(인간 장혈류 측을 대표). * P&0.05 정적 대 동적 조건. C)HepaRG/HHSTeC 간 스페로이드에 의해 간 2-OC MPS에서 APAP 대사 프로필. 2 μM APAP 투여 후 정적 및 동적 조건을 매체로 비교합니다. *P&0.05 0h vs 6h, 12h, 24h APAP 치료. APAP 흡수 및 대사 프로파일은 장/간 2-OC MPS 제제의 장 장벽 정측에 12 μM 투여 후. 이것은 구두 경로를 에뮬레이트합니다. 장 장벽은 카코-2/HT-29 세포주및 HepaRG/HHSTeC 세포주의 스페로이드로 만들어진 간 동등한 것으로 만들어졌습니다. (D)장/간 2-OC APAP 농도는 정적 및 동적 조건 하에서 장 장벽의 정압적인 면에서 농도가 된다. (E)정적이고 역동적인 조건하에서 배지내장/간 2-OC APAP 농도. * P&0.05 정적 대 동적 조건. (F)우리의 미생물 계통에서 APAP의 농도-시간 프로파일(적색 곡선 및 y축)과 1000 mg(블랙 커브 및 y축)의 단일 경구 투여 후 인간에서 얻은 대표적인 프로파일 간의 비교. 데이터는 웹플롯디젠라이저 4.2(https://automeris.io/WebPlotDigitizer)를 사용하여 플롯에서 추출되었습니다. 이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

HPLC 시스템 워터스 얼라이언스 2695 (미국 미국 밀포드) 사분위 펌프, 샘플 매니저 및 드가저 장착
탐지기 210-400 nm 범위에서 설정 된 워터스 2996 Uv-Vis
시스템 제어, 데이터 수집 및 처리 워터스 파워 파워 2002 크로마토그래피 소프트웨어
열 반전 단계 루나 C18
(150 x 4.6 mm I.D.; 5mm 입자 크기)
현상제
가드 컬럼 반전 위상 루나 C18 (4 x 3mm)
현상제
모바일 단계 용매 A- 아세토닐트릴
용매 B- 0.10 M 암모늄 아세테이트, pH 6.8
동면 상태 시간 A (%) B (%)
(분)
15 5 95
흐름 1.0 mL/분
사출 볼륨 25 μL
온도 25 °C
APAP 탐지 UV @ 243 및 254 nm
런타임 15분

표 1: 배양 배지 행렬에서 APAP의 HPLC-UV 분석에 사용할 조건 및 매개 변수.

명목 농도 계산된 APAP 농도(μM) 평균(μM) S.D.b C.V. Dev
(μM) (각 농도의 삼중량) (μM) (%)c (%)d
분석 번호 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46.05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6.65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0.03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

표 2: 인터런 변화 – 6개의 별도 저술에서 0.10M 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)를 가진 DMEM 배지의 혼합물로 제조된 표준 곡선 샘플의 정확도, 정밀도 및 선형성. a
a 선형 곡선은 실험에 설명된 바와 같이반응(APAP)대 이론적 농도에 대한 데이터에 장착되었다. 계산된 농도는 교정 곡선에 대한 각 표준 샘플에 대한 응답을 판독하여 파생되었다. 각 항목(분석 1-6)은 트리플리케이트 분석의 평균 값에 해당합니다.
b SD = 표준 편차.
c C.V. (변화의 계수. 정밀도).
d 정확도(DEV%) = 명목값으로부터 계산된 농도의 편차.
이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019).

명목 농도 계산된 APAP 농도(μM) 평균 S.D.b C.V. Dev
(μM) (각 농도의 삼중량) (μM) (μM) (%)c (%)d
분석 번호 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14.97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6.85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1.56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0.01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0.05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

표 3: 6개의 별도 해석에서 0.10M 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)를 가진 윌리엄스 배지의 혼합물로 제조된 표준 곡선 샘플의 정확도, 정밀도 및 선형성 - 인터-런 변화. a
a 선형 곡선은 실험에 설명된 바와 같이반응(APAP)대 이론적 농도에 대한 데이터에 장착되었다. 계산된 농도는 교정 곡선에 대한 각 표준 샘플에 대한 응답을 판독하여 파생되었습니다. 각 항목(분석 1-5)은 트리플리케이트 분석의 평균 값에 해당합니다.
b SD = 표준 편차.
c C.V. (변화의 계수. 정밀도).
d 정확도(DEV%) = 명목값으로부터 계산된 농도의 편차.
이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019).

윌리엄스 매체 명목 농도 측정 된 농도 Sd. C.V. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
인트라 런(n=3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1.77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8.37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8.57
인터런(n=15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14.97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2.99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5.88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
DMEM 매체 명목 농도 측정 된 농도 Sd. C.V. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
인트라 런(n=3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1.69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4.00
인터런(n=12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7.75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

표 4: 품질 관리 샘플에서 APAP의 장내 및 인터런 정밀도와 정확성. a
a 데이터는 평균으로 표시됩니다. SD (표준 편차). C.V. (변동의 계수. 정밀도) 및 정확도(백분율 편차) DEV%).
이 그림은 마린 외에서 수정되었습니다. 장/간 미생물 계통에서 아세트아미노펜 흡수 및 대사. 화학 바이오엘 상호 작용. 299,59-76 (2019).

프라이머 (5' → 3')
조직 유전자 전달 역방향
내장 SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTGTCCCAC CAggCTCCAACACAgACggT
나K-ATPase ACCgCCCAgAAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCCCC
MDR1 TggATgTtTtCGTTggag TgCTgTgTgATTTgg
간 알부민 TgCAAggCTgATAAg TTTAgACAgggTgTggCTTTTTTTACAC
GSTA2 CTgAgAACAAATgCCAAgC AgCAgAgGAAggCTggAATAAtAAg
CPY3A4 ggAAgggACCCAgAAcTgC TTACgCCATCCCTGAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAGAC ggTCCTgTgAAggCTggAg

표 5: 장 및 간 조직을 위한 2-OC 배양에서 mRNA 수준에서 유전자 전사를 평가하는 실시간 qPCR 프라이머

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Discussion

조사 신약의 약리학적 특성에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 평가는 다음 개발 단계의 위험을 줄이는 데 중요합니다. MPS는 예측 능력을 개선하고 전임상 테스트에 소요되는 비용과 시간을 줄이는 것을 목표로 하는 비교적 새로운 기술입니다. 우리 그룹은 납 최적화에 주로 필요한 약동및 독성 특성의 평가에 발전하고 있습니다. 우리는 두 개의 챔버가있는 2-OC 미세 유체 장치와 협력하여 두 개의 오르가노이드를 통합 할 수 있었습니다. APAP는 고품질의 인간 데이터를 많이 가지고 있기 때문에 선택되었으며, 대부분 간에서 대사되며 간 독성 특성을 표시합니다. 연구 프로토콜은 약물이 자원 봉사자에게 구두로 투여되는 인간 상 I 임상 시험의 몇 가지 단계를 모방하는 것을 목표로하고, 주기적인 혈액 샘플은 약동적 특성및 생화학 및 임상 매개 변수를 알기 위해 약물의 농도를 평가하기 위해 그려져 안전성과 내성을 평가하기 위해 수집됩니다. 따라서 MPS가 신뢰할 수 있는 예측을 제공할 만큼 충분히 진화하면 I 단계 예심에서 실패의 위험을 크게 줄일 수 있습니다. 미래에 질병 모형을 추가함으로써, 동일 가정은 가능하게 단계 II 및 III 임상 시험에 적용될 것입니다.

모든 연구는 세 가지 모델에서 수행되었다: 장 2-OC (APAP 구두 투여), 간 2-OC (정맥 투여), 그리고 내장 / 간 2-OC (구두 투여). 제1 모델은 흡수를 격리하고, 두 번째 신진 대사, 세 번째 는 둘 다 통합했다. 우리는 먼저 오르가노이드를 생산하고 미세 유체 장치에 통합하고, 두 번째로 APAP를 투여하고 미디어 샘플을 수집했으며, 마지막으로 세포 생존력과 기능 및 APAP 노출의 독성 적 영향을 평가하기 위한 일련의 테스트를 수행했습니다. 약동학 연구를 위해, 우리는 매체에 있는 APAP 정량화를 위한 크로마토그래피 방법을 개발하고 검증했습니다. 유효성 검사는 FDA29,30에의해 설명된 바와 같이 특이성, 선형성, 정량화 한계(LOQ), 검출 한계(LOD), 매트릭스 효과, 정밀도 및 정확도에 관한 생체 분석 방법 검증에 대한 가이드라인을 준수하였다. 특이성은 두 개의 다른 소스에서 빈, 풀, 및 개별 생물학적 샘플로 확립되었다. 이 방법은 분석 중에 수용적으로 수행되었으며, 데이터는 APAP를 분리하고 정량화하는 간단한 동위 이동 단계의 능력을 확인하였다.

장과 간 오르가노이드의 생존/기능성은 다른 기술에 의해 평가되었다. 장 등가물, 공초점 형광 현미경검사(도 2A-B),MTT 분석(도2C),유전자 발현 평가(도2D-F)또는 HCA 실험, APAP 노출 후 24시간 독성을 검출하지 못했다. 마찬가지로, MTT 분석은 간 등가물(도3A)에서APAP에 의해 유도된 독성 모욕을 검출하지 않았다. 그러나, HCA 기술은 간 세포에 대한 매우 초기 독성 이벤트(APAP 노출 후 24시간)의 검출 가능성을 추가하, 세포 페노티픽 변화의 관찰에 의해, 일부 기계론적단서(도 3D). 한편, 공초점형 현미경검사(도3B)및 조직학(도3C)은인간 조직의 등가물의 생존 상태를 조사하는 데 유용한 보완도구가 된 것으로 나타났다. 간 세포의 경우, 다른 기술의 동시 사용은 매우 유리했다. MTT 분석, 전에 언급 한 바와 같이, APAP 노출 후 HCA 24 h에 의해 검출 된 APAP 세포 독성을 검출 할 수 없었다. 유전자 발현 분석은 APAP 치료 후 기저 및 24시간 모두에서장(도 2D-F)과간 오르가노이드(도4A-D)의기능을 평가하였다. 기저 조건하에서, 장 및 간 특정 마커의 일반적인 수준이 있었다, 적절한 기능을 제안. APAP 노출의 24 시간 후에, 알부민의 다운 규제가 있었다, GST mRNA 수준, 간 동등한 조직에서 CYP3A4 유전자 발현을 감소시키는 경향, APAP 초기 세포 독성을 나타내는. 이러한 연구 결과를 부식시키고, 서양 블로팅 실험은 APAP 치료에 대한 응답으로 간 총 알부민 단백질 발현의 강력한 감소를 동반한 유전자 발현의감소(도 4E-F)를동반하여 APAP에 노출됨으로써 간 조직에 부과된 독성 모욕을 확인하는 것으로 나타났다. 이에 따라, 체외 효소 활성의 실험은 APAP 치료에 의해 유도된 CYP 3A4 활성 수준에서 견고하고 점진적인 감소를보였다(도 4H-I).

구도형의 형태통계는 이미지 J(그림3E-I)에서수행하였다. 이 영역은 분석된 모든 오르가노이드에 2D 크기가 얼마나 가까운지 보여 주며, 이는 이 프로토콜의 표준화로 사용될 수 있어 편견없는 결과를 생성할 수 있습니다. '셰이프 설명자'는 형상 형태에 정확하게 대응하는 통계를 공개합니다. 종횡비는 주요 축과 작은 축을 사용하는 인덱스이므로 1 주위의 결과는 오르가노이드 형성 중에 바이어스(즉, 우대 증가)를 나타내지 않습니다. 원원성 값(×[영역]/ (π × [주요축] 2))는 주요 축으로 드러나는 우대 성장에 매우 민감합니다. 견고성([영역]/ ([볼록 영역])은 볼록 영역(=봉투)을 사용하기 때문에 국경의 요철에 의해 영향을 받지 않기 때문에 총 형태를 보여주는 데 필수적입니다. 1.0을 중심으로 한 분포는 구형 성장을 나타냅니다. 반대로 순환도(4× π[영역]/[둘레]2)는복잡한 경계에 매우 민감하므로 "구멍" 또는 "포켓"이 이 인덱스에 영향을 미칩니다. 따라서, 원형도 1은 또한 적절한 오르가노이드 기능과 호환되는 구형 성장을 확증한다.

분석 결과 MPS는 배설 단계 없이 생체 내에서 생산된곡선(도 5F)에필적하거나 분리되거나 통합된 APAP 흡수 및 대사 특성을 에뮬레이트할 수 있음을 보여주었다. APAP 흡수는 정적인 및 동적조건(그림 5A-B,도 5D-E)에서장 내 MPS 또는 장/간 MPS 모델 모두에 경구 투여 후 유사하였다. 둘 다, 정적 및 동적 조건에 대한 큰 차이없이, 바식 측에서 증가에 수반되는 정점에서 APAP 농도가 감소했다. 대조적으로, APAP 간 물질 대사는 이 조건의 밑에 달랐습니다. MPS의 순환 매체는 오르가노이드 대사 능력을 향상시키는 것같았다(도 5C 및 도 5E). 유동 없이는 보이지 않는 APAP 부패 하류가 있었습니다. 흥미롭게도,체외에서, CYP3A4 활성 실험은 시스템에 흐름의 존재가 인간 간 등가물의 기능을 증가시킨다는 가설을 확증한다. 도 4J의그래프에 나타난 바와 같이, CYP 3A4의 활성은 기저 및 APAP 치료 조건에서 흐름하에서 유지된 간 등가물에서 현저히 높았다. 마찬가지로, 간 등가물은 유량(dynamic)하에 보관되어 있으며, 기준선 또는 APAP 처리조건(도 4G)에서모두 유동(static)없이 유지된 것과 비교했을 때 알부민의 단백질 발현을 증가시키는 경향을 보였다.

인간에게 APAP의 경구 투여 후 농도 시간 프로파일과 비교했을 때, 우리의 미생물 시스템은 훨씬 더 큰 t1/2 (반감기 시간)(그림 5F)를나타낸다. 이것은, 전에 언급한 바와 같이, 우리가 약물을 흡수하고 대사할 수 있는 장 및 간 등가물을 가진 2기관 체계가 있기 때문에, 플라즈마 구획에서 APAP 및 그것의 대사산물을 배설하는 것과 동등한 신장이 없기 때문에38. 그 외에도, 미생물 계통은인간(그림 5F)에대해 일반적으로 관찰되는 것보다 더 작은 Cmax(피크 플라즈마 농도) 및 더 큰 tmax(Cmax에 도달하는 시간)를 나타낸다. 이것은 시험관 내 및 생체 내 실험의 규모차이의 결과입니다. 전반적으로, 인간에게 APAP의 경구 투여 후 얻은 미생물 학적 시스템과 프로파일을 사용하여 얻은 농도-시간 프로파일 사이에는 세 가지 주요 차이점이 있습니다: 더 큰 t1/2,더 작은 C최대 및 더 큰 t최대 (그림 5F). 더 큰 t1/2는 플라즈마 동등한에서 APAP 와 그 대사 산물에 해당하는 신장의 부재 때문이지만, 더 작은 C최대 및 더 큰 t최대는 인체에 비해 실험의 작은 규모의 결과입니다. 미세 생리 시스템을 구축하고 운영하기위한 최고의 스케일링 전략은 여전히 연구의 활성 영역이며 단일 접근 방식이 모든 시스템에 가장 적합한 것(39). 또한, 수학 모델링 또는 기계 학습은인체에서관찰된 생체 내 비질에 대한 미생물 계통으로 얻은 생체외 데이터를 추정하기 위해 교정을 적용하거나 마이크로 스케일에서 본격적인 스케일로 매핑을 학습하는 데 사용될 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 크리스티 구겐 -기요루조 박사, 단위 522 INSERM에서 박사 필립 그리폰과 생물 물질의 사용을위한 단위 271 INSERM에서 박사 크리스티안 트레포에 감사하고 학술 연구를 수행하기 위해 우리를 위해 다음 사용할 수 있도록.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

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