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Biology

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60235

Summary

Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per studiare il comportamento fototattica larvale della Drosophila. In questo analisi, un punto luce viene generato come stimolazione della luce e il processo di prevenzione della luce larvale è registrato da un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa.

Abstract

Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. La fototassia larvale della Drosophila può essere usata come modello per studiare il comportamento di evitamento degli animali. Questo protocollo introduce un saggio spot per studiare il comportamento fototattico larvale. Il set-up sperimentale include due parti principali: un sistema di stimolazione visiva che genera la luce leggera e un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa che registra il processo di prevenzione della luce larvale. Questo analisi consente di tracciare il comportamento della larva prima di entrare, durante l'incontro e dopo aver lasciato il punto luce. I dettagli del movimento larvale, tra cui decelerazione, pausa, colata e tornitura della testa, possono essere catturati e analizzati utilizzando questo metodo.

Introduction

Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. Drosophila fototaxis larvaè è stato in fase di indagine, soprattutto negli ultimi 50 anni1,2,3,4,5,6,7 ,8. Negli ultimi anni, nonostante il fatto che 1) molti neuroni che mediano l'elusione della luce larvale sono stati identificati4,5,9,10,11,12 e 2) il connettoma completo del sistema visivo larvale alla risoluzione delle sinapsi è stato stabilito13, i meccanismi neurali alla base della fototaxis larvale rimangono in gran parte poco chiari.

Un certo numero di saggi comportamentali sono stati utilizzati nello studio fototassi larvali. Possono essere in gran parte divisi in due classi: una che coinvolge gradienti di luce spaziale e l'altra che coinvolge gradienti di luce temporale. Per i saggi di gradiente di luce spaziale, l'arena è divisa in un numero uguale di sezioni in chiaro e buio. L'arena può essere divisa in metà chiara e scura2,4 o quadranti chiari e scuri14,15, o può anche essere separato in quadrati luminosi e scuri alternativi come su una scacchiera7. Di solito, piastre di agar sono utilizzati per il saggio di gradiente di luce spaziale, ma tubi che sono divisi in sezioni chiare e scure alternate possono anche essere utilizzati10,14.

Nella versione precedente dei saggi, l'illuminazione leggera proviene generalmente da sotto le larve. Tuttavia, l'illuminazione nelle versioni più recenti ha origine in gran parte dall'alto, poiché gli occhi larvali (ad esempio, gli organi del Bolwig sensibili alle intensità di luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyngeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalofario opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalophariongeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media16 la parte anteriore superiore. Questo rende le larve più sensibili alla luce dalle direzioni anteriori superiori rispetto al basso dietro le direzioni7. Per i saggi di sfumatura di luce temporale, l'intensità della luce è spazialmente uniforme nell'arena, ma l'intensità cambia nel tempo. Oltre alla luce temporale ad onde quadrate (cioè lampeggiante on/off o luce forte/debole3,7), la luce temporaneamente variabile che si conforma ad una rampa lineare di intensità viene utilizzata anche8 per misurare la sensibilità delle larve ad un temporaneamente cambiando lo stimolo leggero.

Un terzo tipo di analisi fototaxis è la navigazione direzionale del paesaggio leggero, che coinvolge l'illuminazione dall'alto con un angolo di 45s7. Prima del lavoro di Kane et al.7, solo parametri grossolani come il numero di larve nelle regioni chiare e scure, la frequenza di tornitura e la lunghezza del sentiero sono stati calcolati in analisi fototassis larvali. Dal lavoro di questo stesso gruppo, con l'analisi della registrazione video ad alta risoluzione temporale per fototassi larvali, la dinamica dettagliata del movimento larvale durante il phototaxis (cioè velocità istantanee di diverse parti del corpo larvale, direzione di direzione, angolo di tornitura e la corrispondente velocità angolare) sono stati analizzati7. Così, più dettagli del comportamento fototassi larva sono stati in grado di essere scoperti. In questi saggi, le larve sono testate in gruppi in modo che gli effetti di gruppo non siano esclusi.

Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per lo studio delle risposte comportamentali larve alla stimolazione della luce individuale. Il principale set-up sperimentale consiste in un sistema di stimolazione visiva e in un sistema di imaging a luce infrarossa. Nel sistema di stimolazione visiva, una sorgente luminosa a LED genera un punto luminoso rotondo di 2 cm di diametro su una piastra di agar, dove viene testata la larva. L'intensità della luce può essere regolata utilizzando un driver LED. Il sistema di imaging include una telecamera a infrarossi che cattura il comportamento della larva oltre a tre LED a infrarossi da 850 nm che forniscono illuminazione per la fotocamera. L'obiettivo della fotocamera è coperto da un filtro passa-banda di 850 nm per impedire che la luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva entri nella fotocamera, mentre la luce infrarossa può entrare nella fotocamera. Pertanto, l'interferenza della stimolazione visiva sull'imaging è prevenuta. In questo saggio, i dettagli comportamentali delle risposte veloci delle singole larve entro un periodo compreso prima, durante e dopo l'immissione della luce vengono registrati e analizzati.

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Protocol

1. Preparazione delle larve di Drosophila

  1. Preparare il mezzo standard costituito da farina di mais bollito (73 g), agar (5,6 g), farina di soia (10 g), lievito (17,3 g), sciroppo (76 mL) e acqua (1000 mL).
  2. Sollevare tutte le mosche a 25 gradi centigradi su un supporto standard in una stanza con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h.

2. Preparazione di piatti di agar

  1. Preparare la soluzione agar 1.0%. Pesare 3 g di agar in un becher da 500 mL con una bilancia, quindi aggiungere 300 mL di acqua distillata. Posizionare una carta stagnola sopra l'interruttore per evitare che l'acqua evapora. Riscaldare il becher in un forno a microonde a ebollizione.
  2. Estrarre il becher e mescolare bene con una verga di vetro, quindi riscaldare in un forno a microonde a ebollizione. Ripetere fino a quando il liquido è completamente trasparente e fluido.
    NOTA: La soluzione finale di agar caldo dovrebbe essere priva di bolle d'aria; in caso contrario, versando l'agar nella piastra si tradurrà in superficie irregolare e ammaccata della piastra di agar, che influenzerà i successivi test del comportamento larvale. La concentrazione della soluzione agar non deve essere troppo alta o bassa. Se la concentrazione è troppo alta, la luce diffusa riflessione sulla piastra di agar sarà forte e spalmare il confine di luce / scuro. Se la concentrazione è troppo bassa, le larve lasceranno tracce sulla piastra. Entrambi questi errori ostacoleranno l'elaborazione video più avanti nel protcol.
  3. Versare lentamente la soluzione di agar caldo in una piastra Petri (diametro 15 cm) fino a quando il fondo è coperto uniformemente con uno strato di agar (4 mm di spessore), e raffreddare a temperatura ambiente (RT) fino a quando la soluzione agar è solidificata.
  4. Piatto di agar deve essere utilizzato quando è appena preparato. In caso contrario, versare uno strato d'acqua sulla superficie e conservarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi per un uso successivo.

3. Configurazione del sistema di stimolazione visiva

  1. Selezionare la sorgente luminosa a LED: luce blu LED collimata a 470 nm o luce bianca calda.
    NOTA: La sorgente luminosa può essere sostituita con una luce LED di qualsiasi altra lunghezza d'onda. In questo esperimento, la luce blu LED viene utilizzata come esempio.
  2. Arrotolare un pezzo spesso di foglio di alluminio o cartone nero (assicurare l'opacità) per formare un cilindro aperto di 12 cm di lunghezza con un diametro simile a quello del LED blu-luce con un diametro di 3 cm. Lasciare che l'estremità superiore del cilindro copra l'estremità anteriore del LED a luce blu. Coprire l'estremità inferiore con un cartone nero con un piccolo foro rotondo (0,5 cm di diametro) al centro. Questo costituisce il sistema di sorgente luminosa impostato.
  3. Fissare la sorgente luminosa preparata sul telaio di ferro con una clip, assicurandosi che la luce LED si sciolga verso il desktop. Inclinare leggermente il cilindro. L'angolo tra il piano del cilindro e il piano verticale è di circa 10 gradi (vedere la figura 1). Collegare la luce LED blu da 470 nm alla spina "LED1" del driver LED ad alta potenza. Accendere il driver, girare la manopola nell'angolo superiore destro del driver per selezionare il canale 470 nm, quindi fare clic su LED. Quindi, quando sullo schermo viene visualizzato il messaggio """ sul desktop verrà visualizzato un punto luce blu.
    NOTA: Se il cilindro perde luce oltre al piccolo foro rotondo, si consiglia di utilizzare nastro nero sulle parti che perdono per assicurarsi che solo il foro possa passare la luce.
  4. Fare clic su OK e ruotare la manopola per regolare l'intensità della luce. Ruotare la manopola a un'intensità di luce superiore di 50 mA. Misurare e registrare lo spettro della luce con uno spettrometro.
  5. Spostare la posizione della sorgente luminosa verso l'alto e verso il basso per regolare il diametro del punto luce a 2 cm. Il desktop deve essere nero per un migliore effetto di contrasto.
  6. Ruotare la manopola per scegliere l'intensità della luce in base alle esigenze sperimentali. Utilizzare una console compatta misuratore di potenza con un sensore di potenza fotodiode standard per misurare la potenza di luce massima e minima nel posto, registrarlo, misurare tre volte e prendere il valore medio.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare un sensore di potenza fotodiode per misurare l'intensità della luce per la luce di una specifica lunghezza d'onda e utilizzare un sensore di potenza termica per misurare l'intensità della luce per la luce bianca.
  7. Calcolare l'intensità della luce nel punto luce dividendo la potenza della luce misurata per l'area del sensore.
    NOTA: Ad esempio, se la potenza della luce misurata nel passaggio 2,6 è 20 pW e l'area del sensore è 0,81 mm2, l'intensità della luce è 24,69 pW/mm2 (dividendo 20 pW per 0,81 mm2).

4. Configurazione del sistema di imaging

  1. Bloccare una webcam ad alta risoluzione con una clip di ferro, a circa 10 cm sopra il punto luce sul desktop (Figura 1).
  2. Regolare l'orientamento dell'obiettivo della fotocamera verso il desktop. Collegare la fotocamera a un computer tramite un'interfaccia USB.
  3. Posizionare una piastra di agar sul desktop proprio sotto la fotocamera.
  4. Aprire il software "Amcap9.22" sul computer con Windows 7 e il punto luce verrà visualizzato automaticamente nella finestra di AMcap. Spostare la fotocamera leggermente a sinistra o a destra per assicurarsi che il punto luce si trova vicino al centro della finestra. Assicurarsi che la fotocamera non blocchi il percorso della luce. Il punto luce deve essere completo e rotondo.
    NOTA: il software è disponibile allhttp://amcap.en.softonic.com/.
  5. Fissare un filtro a bande da 850 nm e 3 nm con una clip a 5-7 mm proprio sotto la fotocamera.
    NOTA: il diametro del filtro è di circa 2,5 cm e l'obiettivo della fotocamera ha meno di 1 cm di diametro, quindi il filtro può coprire il campo visivo della fotocamera. Con il filtro sotto la fotocamera, il punto luce non dovrebbe essere visto nella finestra di AMcap.
  6. Posizionare in modo uniforme tre LED che generano infrarossi (lunghezza d'onda centrale e 850 nm) in modo uniforme intorno alla piastra dell'agar. Ogni LED dovrebbe essere a circa 5 cm di distanza dal bordo della piastra di agar, e la faccia dell'obiettivo del LED dovrebbe essere ad un angolo verso il basso di 70 gradi verso la piastra di agar. Collegare i LED all'alimentazione tramite il convertitore da AC a DC.
    NOTA: È meglio fissare le posizioni e gli angoli dei LED luminosi infrarossi per garantire la coerenza della luminosità del campo in varie prove sperimentali e facilitare l'elaborazione video successiva.
  7. Mettere una scheda nera tra il computer e il dispositivo. Impostare la luminosità dello schermo del computer per evitare che la luce dello schermo del computer influisca sull'esperimento.
    NOTA: mantenere l'ambiente scuro durante la misurazione della lunghezza d'onda o dell'intensità della luce.

5. Impostazione dei parametri di imaging

  1. Nel menu del software AMcap, scegliere Opzioni Dispositivo video Formato di acquisizionee impostare le dimensioni in pixel del video acquisito su 800 x 600 e la frequenza fotogrammi a 60 fps.
  2. Rimuovere il filtro da sotto la fotocamera, mettere un righello sotto la fotocamera e regolare la messa a fuoco della fotocamera per rendere la linea di scala chiara e parallela alla larghezza del campo visivo video.
  3. Fare clic su Acquisizione . Proprietà Set up ( Configurazione) Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, fare clic su Avvia registrazione, registrare la distanza effettiva corrispondente a 600 pixel e calcolare il rapporto di ogni pixel con la distanza effettiva.

6. Registrazione video del comportamento di prevenzione della luce

  1. Mantenere una temperatura di 25,5 gradi centigradi attraverso tutti gli esperimenti. Controllare la temperatura della stanza con un condizionatore d'aria, se necessario. Mantenere l'umidità costantemente al 60% con un umidificatore.
  2. Fai un breve video della posizione dell'area luminosa denominata "lightarea1". Quindi, spostare indietro il filtro 850 nm - 3 nm per coprire l'obiettivo della fotocamera.
    NOTA: durante la registrazione del comportamento larvale, l'obiettivo della fotocamera è coperto dal filtro da 850 nm e 3 nm in modo che il punto luce non venga visualizzato nel video. Il punto luce può essere ricostruito in video con larve in seguito con Matlab. Non modificare la posizione della fotocamera ed evitare di cambiare il rapporto tra ogni pixel e la distanza effettiva misurata nel passaggio 4.3.
  3. Accendere una luce (cioè una luce di stanza) lontano dal dispositivo sperimentale. Abbassare la luce il più basso possibile, purché le larve possano essere chiaramente viste con gli occhi. Togliere le larve dal mezzo di coltura con un cucchiaio, scegliere delicatamente una larva di terza stella e lavarla pulita con acqua distillata. Fare attenzione a lavare la larva uno alla volta per evitare interferenze dalla fame. Un singolo esperimento richiede almeno 20 larve.
  4. Trasferire la larva al centro della piastra di agar posta sotto la fotocamera durante il passaggio 3.3. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla larva con un pennello o utilizzare la carta gonfia per rimuovere l'acqua dalla larva per evitare la riflessione della luce sotto la lente. Spegnere la luce della stanza e lasciare che la larva acclimatare per 2 min in ambiente buio.
  5. Accendere la luce LED per generare luce infrarossa, e spazzolare delicatamente la larva al centro della piastra. Quando la larva inizia a strisciare dritto, ruotare la piastra per rendere la testa della larva verso il punto di luce. Assicurarsi che striscia dritto dall'inizio, altrimenti potrebbe non ottenere l'accesso al punto luce.
  6. Fare clic su Acquisizione . Proprietà Set up ( Configurazione) Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, quindi fare clic su Avvia registrazione per registrare. Lasciare che la larva striscia verso il punto di luce, entrare nel punto di luce, quindi lasciare il punto di luce fino a quando non è quasi fuori dal campo visivo. Fare clic su Interrompi registrazione. Se la larva si allontana dal punto luce prima di avvicinarsi, fare clic direttamente su Interrompi registrazione.
  7. Allontanare il filtro dalla fotocamera. Prendere un breve video della posizione del punto luce denominato "lightarea2" e confrontarlo con "lightarea1" per assicurarsi che la posizione della luce non venga modificata. Se si osserva un'ovvia modifica della posizione, eliminare i dati.

7. Analisi dei dati

  1. Utilizzare SOS17 per estrarre i parametri di contorno e movimento del corpo animale dai video utilizzando i metodi di elaborazione delle immagini come descritto in precedenza17.
    NOTA: Sono stati utilizzati parametri quali headSpeed (velocità della testa larvale), tailSpeed (velocità della coda larvale), midSpeed (velocità del punto medio larvale della linea scheletrica) e cmSpeed (velocità del centroide larvale). Parametri tra cui headTheta (l'angolo tra le linee di head-midpoint e midpoint-tail) e headOmega (la velocità di cambio di headTheta) sono stati utilizzati per misurare la flessione larvale del corpo e la velocità angolare della piegatura.

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Representative Results

Secondo il protocollo, il saggio di luce è stato utilizzato per studiare il comportamento di elusione della luce della terza larva instella che sono stati allevati a 25 gradi centigradi su un mezzo standard in una stanza con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h. Una singola larva w1118 è stata testata utilizzando l'assaggio del punto luce a 25,5 gradi centigradi. L'intensità media della luce del punto luce generata da un LED di 460 nm è stata di 0,59 w/cm2. L'intero processo di entrata e uscita larvale del punto luce è stato registrato e analizzato utilizzando il software SOS e gli script scritti personalizzati12,17. Le curve temporali della velocità della coda, l'angolo di piegatura del corpo e la velocità angolare della piegatura del corpo di una larva rappresentativa sono mostrate nella Figura 2 e nel film 1.

Per studiare gli effetti dei neuroni octopaminergici sull'evitare la luce larvale, le larve instar terze con neuroni poltopaminergici inibiti dall'espressione della tossina del tetano (UAS-TNTG) con un driver Tdc2-Gal4 sono state testate con il test della luce. Come mostrato nella Figura 3, la dimensione della testa larvale lanciata (angolo di flessione massimo del corpo) è stata significativamente ridotta rispetto ai controlli parentali, indicando che i neuroni Tdc2-Gal4 sono necessari per una normale risposta alla luce larvale.

Figure 1
Figura 1: configurazione sperimentale. (A) Rappresentazione schematica dell'allestimento per il saggio phototaxis veloce a base di macchie luminose. Le linee blu rappresentano i percorsi di luce visibile utilizzati come stimolazione visiva, mentre le linee rosse rappresentano i percorsi della luce infrarossa. Le frecce indicano la direzione della luce. Il filtro a bande di 850 nm consente il passaggio della luce infrarossa, ma blocca la luce visibile. (B) Un'immagine del set-up per il saggio spot luminoso. Va notato che l'immagine è stata scattata in condizioni di luce per una migliore visualizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Descrizione quantitativa della reazione di una larva quando si entra in un punto luce. (A) Un diagramma che mostra i parametri utilizzati nella misurazione del movimento del corpo larvale. Il contorno di una larva è mostrato in linea sottile. La linea spessa mostra lo scheletro del contorno del corpo larvale assottigliato. Le due estremità e il punto medio della linea scheletro sono assegnati come posizioni di testa larvale, punto medio e coda. L'angolo tra la linea dalla testa al punto medio e la linea dal punto medio alla coda è l'angolo di piegatura del corpo. La velocità del cambiamento dell'angolo di piegatura del corpo nel tempo è definita come velocità angolare della testa larvale lanciata. Qui sono rappresentati la velocità della coda (B, velocità di coda), la velocità angolare lanciata dalla testa (C, headomega) e l'angolo di piegatura del corpo (D, headtheta) di una larva w1118 che entra e esce da un punto luce. Le linee verdi indicano il punto temporale in cui la testa larvale è entrata e ha lasciato il punto luce. L'intervallo di tempo di un forte periodo di decelerazione è in giallo. Le teste di freccia indicano i periodi di decelerazione e i picchi correlati nella testa proiettano la velocità angolare e l'angolo di piegatura del corpo. Il processo di comportamento è illustrato nel filmato 1. Questa cifra è stata modificata da Gong etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Inibire i neuroni etichettati Tdc2-Gal4 utilizzando la tossina tetano TNTG riduce la dimensione della testa larvale lanciata in risposta all'ingresso del punto luce. P < 0,01, n : 81, 52, 92; È stato utilizzato il test Kruskal-Wallis seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Dunn. Questa cifra è stata modificata da Gong etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Film 1: Una larva w1118 entra e lascia un punto luce nel saggio della luce. La macchia chiara con bordo levigato è in bianco. Viene mostrata la traccia della testa larvale. Le curve corrispondenti di velocità della coda larvale, headtheta e headomega vengono giocate contemporaneamente. Questo film è stato modificato da Gong etal. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

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Discussion

Questo protocollo presenta il saggio light spot per testare la capacità delle larve di Drosophila di fuggire dalla luce. Questo analisi consente di tracciare il comportamento delle larve prima di entrare, durante l'incontro e dopo aver lasciato un punto luce. I dettagli del movimento larvale possono essere catturati e analizzati. L'anamante del punto luce è molto semplice e possiede una forte praticabilità. Il costo dell'intero dispositivo non è elevato. Nell'esperimento, la luce LED viene utilizzata come sorgente luminosa. Può essere sostituito con sorgenti luminose di diverse lunghezze d'onda, se necessario. L'intensità della luce può anche essere regolata dall'azionamento LED. L'intensità di luce più bassa nel punto può raggiungere 1,80 pW/mm2 (luce bianca fredda). Anche a una tale bassa intensità di luce, le larve possono ancora percepire la luce e mostrare comportamenti che evitano la luce11.

Va notato che la concentrazione della piastra di agar è controllata tra lo 0,8% e l'1,0%. Se la concentrazione è troppo alta, la dispersione della luce sulla piastra di agar può essere grave e la dimensione del punto luce riconosciuto nel video è esagerato. Pertanto, la luminosità del punto non dovrebbe essere troppo alta. Poiché le larve in un punto luce sono difficilmente visibili, se la luce visibile viene utilizzata per l'illuminazione, è necessario utilizzare la luce infrarossa per illuminare la larva e aggiungere un filtro a banda 850 nm sulla fotocamera per impedire ai segnali luminosi di entrare nella fotocamera. Il video della risposta larvale alle macchie di luce può essere sintetizzato in seguito sulla base dei video solo larva e luce-spot.

Il saggio di luce spot possiede tre virtù principali: 1) il processo di elusione della luce larvale può essere monitorato e analizzato in dettaglio; 2) la risposta della luce larvale viene testata una sola volta, in modo che possa essere escluso il possibile coinvolgimento dell'adattamento della luce; e 3) possono essere esclusi i possibili effetti sulla risposta alla luce da altre larve. Un evidente svantaggio di questo test è che è bassa produttività, dal momento che viene testata una sola larva alla volta. Anche se questo saggio viene utilizzato qui principalmente a bassa intensità di luce11,12, può anche applicare all'elusione larvale in forte luce che può eccitare i neuroni di classe IV DA che piastrellano la superficie delle pareti del corpo16.

Il nostro dispositivo sperimentale può essere utilizzato anche per l'optogenetica. Il filtro a bande-pass di 850 nm può bloccare la luce di eccitazione, come per il segnale del punto luminoso, in modo che la fotocamera possa registrare chiaramente i comportamenti larvali prima, durante e dopo la stimolazione della luce rossa. In particolare, quando la luce rossa 620 nm viene utilizzata in combinazione con Chrimson per la stimolazione optogenetica, le metà basse dei LED a luce infrarossa devono essere mascherate e la direzione della luce rossa deve essere ben controllata per l'immagine chiaramente delle larve. Nel frattempo, i livelli moderati di segnali rumorosi provenienti dalla luce rossa nell'immagine possono essere utilizzati per giudicare i tempi di stimolazione on / off. In breve, il test spot luminoso fornisce un metodo di addizione per monitorare e analizzare le proprietà spaziali e temporali dettagliate del rapido comportamento di evitamento della luce larvale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato dalla fondazione di scienze naturali della Cina (31671074) e dai Fondi di Ricerca fondamentali per le Università Provinciali di zhejiang (2019X-X003-12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED Thorlabs, USA PM100A Compatible Sensors: Photodiode and Thermal
Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W
Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz
Bandwidtha: DC-100 kHz
Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA
Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter Thorlabs, USA S120VC Aperture Size: Ø9.5 mm
Wavelength Range: 200-1100 nm
Power Range: 50 nW-50 mW
Detector Type: Si Photodiode (UV Extended)
Linearity: ±0.5%
Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter Thorlabs, USA DC2100 LED Current Range: 0-2 A
LED Current Resolution: 1 mA
LED Current Accuracy: ±20 mA
LED Forward Voltage: 24 V
Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave
Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light  ELP, China USBFHD01M Max. Resolution: 1920X1080
F6.0 mm
Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console  Ocean Optics, USA USB2000+(RAD) Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm
Weight: 190 g
Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array)
Wavelength range: 200-850 nm
Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical)
Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition
Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal)
Dark noise: 50 RMS counts
Grating: 2 (250 – 800 nm)
Slit: SLIT-50
Detector collection lens: L2
Order-sorting: OFLV-200-850
Optical resolution: ~2.0 nm FWHM
Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm
Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver Minhongshi, China MHS-48XY Working voltage: DC12V
Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera Thorlabs, USA MWWHL4 Color: Warm White
Correlated Color Temperature: 3000 K
Test Current for Typical LED Power: 1000 mA
Maximum Current (CW): 1000 mA
Bandwidth (FWHM): N/A
Electrical Power: 3000 mW
Viewing Angle (Full Angle): 120?
Emitter Size: 1 mm x 1 mm
Typical Lifetime: >50 000 h
Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C
Storage Temperature: -40 to 70 °C
Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White Mega-9, China BP850/22K Ø25.4(+0~-0.1) mm
Bandwidth: 22±3nm
Peak transmittance:80%
Central wavelength: 850nm±3nm 
Spectrometer  Noel Danjou Amcap9.22 AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor  Super Dragon, China YGY-122000 Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A
Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor  Thorlabs, USA M470L3-C1 Color: Blue
Nominal Wavelengtha: 470 nm
Bandwidth (FWHM): 25 nm
Maximum Current (CW): 1000 mA
Forward Voltage: 3.2 V
Electrical Power (Max): 3200 mW
Emitter Size: 1 mm x 1 mm
Typical Lifetime: 100 000 h
Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C
Storage Temperature: -40 to 70 °C
Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor  Thorlabs, USA S401C Wavelength range: 190 nm-20 μm
Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb)
Input aperture size: Ø10 mm
Active detector area: 10 mm x 10 mm
Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.)
Linearity: ±0.5%

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References

  1. Grossfield, J. Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).
  2. Godoy-Herrera, R. C. L. D. The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation. Animal Behaviour. 37, (1989).
  3. Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions. Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).
  4. Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293 (2005).
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Biologia Numero 151 Drosophila larva phototaxis analisi spot leggero registrazione video sistema visivo
Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di <em>Drosophila</em> Larval Phototaxis
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Sun, Y., Zhou, P., Zhao, Q., Gong,More

Sun, Y., Zhou, P., Zhao, Q., Gong, Z. Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis. J. Vis. Exp. (151), e60235, doi:10.3791/60235 (2019).

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