Summary
Questo articolo descrive la generazione di un modello di topo ortotopico di mesotelioma plechiologico umano mediante l'impianto di cellule di mesotelioma H2052/484 nella cavità peuale dei topi atimmici immunocompromessi. Il monitoraggio longitudinale dello sviluppo di tumori intrapleurali è stato valutato dalla tomografia a emissione di positroni non invasivi [18F]-2-fluoro-2-deossia-D-glucosio e dall'imaging tomografia tomografico computerizzata.
Abstract
Il mesotelioma pleeuristico maligno (MPM) è un tumore raro e aggressivo che sorge nel mesotelio che copre i polmoni, il cuore e la cavità toracica. Lo sviluppo di MPM è principalmente associato all'amianto. I trattamenti forniscono solo una sopravvivenza modesta poiché la media di sopravvivenza mediana è di 9-18 mesi dal momento della diagnosi. Pertanto, devono essere identificati trattamenti più efficaci. La maggior parte dei dati che descrivono nuovi obiettivi terapeutici sono stati ottenuti da esperimenti in vitro e devono essere convalidati in modelli preclinici in vivo affidabili. Questo articolo descrive uno di questi modelli ortotopici MPM affidabili ottenuti dopo l'iniezione di una linea cellulare umana MPM H2052/484 nella cavità pleurica di topi atimici immunodeficienti. Il trapianto nel sito ortotopico permette di studiare la progressione del tumore nell'ambiente naturale in vivo. Tomografia a emissione di positroni/tomografia molecolare computerizzata (PET/CT) utilizzando il radiotracciatore clinico [18F]-2-fluoro-2-deossi-D-glucosio([18F]FDG) è il metodo di diagnosi di scelta per esaminare i pazienti con MPM. Di conseguenza, [18F]FDG-PET/CT è stato utilizzato per monitorare longitudinalmente la progressione della malattia del modello ortotopico H2052/484. Questa tecnica ha un alto potenziale 3R (Reduce il numero di animali, Refine per ridurre il dolore e il disagio, e Replace sperimentazione animale con alternative) dal momento che lo sviluppo del tumore può essere monitorato in modo non invasivo e il numero di animali necessari potrebbe essere significativamente ridotto.
Questo modello mostra un alto tasso di sviluppo, una rapida crescita del tumore, è conveniente e consente una rapida traduzione clinica. Utilizzando questo modello MPM ortotopico xenotrapianto, i ricercatori possono valutare le risposte biologiche di un modello MPM affidabile in seguito a interventi terapeutici.
Introduction
Il mesotelioma pletoroma pleziale maligno (MPM) è un cancro più spesso associato all'esposizione alle fibre di amianto1,2,3. Anche se l'amianto è stato vietato nella maggior parte dei paesi occidentali4,5,6, l'incidenza di MPM è ancora in aumento7,8. Recentemente, l'esposizione dei topi ai nanotubi di carbonio suggerisce che possono comportare un rischio significativo per la salute negli esseri umani9,10. I dati suggeriscono che l'esposizione a questi prodotti può indurre infiammazione cronica e cambiamenti molecolari (ad esempio, perdita di vie tumorali-soppressori) che sono alla base della progressione nel mesotelioma maligno. Attualmente, i nanotubi di carbonio multiwall sono uno dei prodotti più importanti della nanotecnologia e sono sempre più incorporati in vari prodotti come i compositi, i materiali di stoccaggio dell'energia, la medicina, l'elettronica e i materiali di bonifica ambientale.
L'MPM è un cancro con prognosi infausta e la maggior parte dei pazienti muore entro due anni dalla diagnosi a causa di una limitata efficacia delle attuali modalità di trattamento11. La scelta del trattamento per MPM dipende dallo stadio di cancro. Per la maggior parte dell'MPM in fase iniziale (stadio 1 e possibilmente alcuni tumori dello stadio 2 o 3), l'approccio clinico è una terapia multimodale che include la resezione chirurgica dei tumori, associata alla radioterapia e alla chemioterapia12. Una chemioterapia combinata con cisplatin e pemetrexed è indicata per il trattamento della maggior parte dei pazienti diagnosticati con malattia invasiva locale avanzata, che non è suscettibile di resezione chirurgica, o che altrimenti non sono candidati per la chirurgia curativa13,14. Vi è quindi un'urgente necessità di sviluppare trattamenti più efficaci per i pazienti affetti da MPM. Tuttavia, ci sono pochi modelli animali in vivo convalidati che riflettono la rilevanza clinica di MPM. Diversi modelli murine MPM sono stati sviluppati, ma la maggior parte di loro non ricapitola fedelmente gli aspetti complessi del microambiente tumorale MPM15,16,17,18. L'uso di MPM indotta dall'amianto in topi, modelli murini genetici geneticamente ingegnerizzati o modelli di trapianto singenico di linee cellulari murine MPM sono limitati da differenze fenotipiche e funzionali fondamentali e, di conseguenza, traducono male nuove scoperte nella clinica. Altri modelli mmpM murini preclinici si basano principalmente su xenografi sottocutanei o peritoneali di linee cellulari umane in topi immunovoluti. Mentre questi modelli sono facili da monitorare e fornire dati fondamentali, il microambiente di questi xenoinnesti non è paragonabile ai tumori umani che compromettono il potere traslazionale della maggior parte di questi studi preclinici17,19. Al contrario, gli xenoincitra ortotopici riflettono meglio il comportamento del tumore del paziente e la risposta al trattamento in quanto sono circondati da un microambiente simile a quello trovato nel sito tumorale originale16.
L'imaging molecolare di [18F]FDG-PET/CT è il metodo di scelta per monitorare longitudinalmente la progressione della malattia nei pazienti con MPM20,21. Pertanto, ricorrere a questo metodo di imaging non invasivo promuove notevolmente la traduzione di studi preclinici agli studi clinici16,22. Inoltre, aiuta a ridurre il numero richiesto di animali in quanto ogni animale rappresenta il proprio controllo nel tempo.
In questo articolo, presentiamo un modello mpM xenotrapianto ortotopico affidabile ottenuto dopo l'iniezione della linea cellulare umana MPM H2052/484 nella cavità pleuriale dei topi atimmici. Accoppiato con l'imaging[18F]FDG-PET/CT, questo modello è un metodo prezioso e riproducibile per studiare gli effetti funzionali e meccanicistici di nuove strategie diagnostiche e trattamenti per l'MPM umano.
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Protocol
Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e dall'ufficio di Stato veterinario di Ginevra, Svizzera (Autorizzazione GE/106/16). La linea cellulare MPM H2052/484 è stata stabilita e caratterizzata nel nostro laboratorio come descritto nell'articolo di Colin DJ e et al.23. In breve, la linea cellulare H2052/484 è stata stabilita da un tumore toracico ottenuto dopo un'iniezione intrapleurale di cellule NCI-H2052 (ATCC) in topi nudi immunodeficienti.
1. Progettazione sperimentale
- Determinare quanti topi sono necessari in base all'esperimento utilizzando il calcolo statistico della potenza (ad esempio http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
- Almeno una settimana prima dell'impianto, acquistare topi nudi femminili da otto a dieci settimane femminili Foxn1nu nu/nu e alloggiarli in un ambiente specifico-patogeno-free (SPF) per almeno una settimana.
2. Preparazione delle cellule per l'impianto
- Calcolare quante celle H2052/484 sono necessarie quando ogni mouse viene iniettato con 1 x 106 celle (passaggio 1.1). Preparare un numero supplementare di cellule come iniezione ai topi comporterà il campionamento delle siringhe.
- Cultura la linea cellulare MPM H2052/484 in RPMI 1640 medio integrato con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL penicillina e 100 g/mL streptomicina in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi centigradi con 5% CO2.
- Cellule di coltura per l'impianto a circa l'80% di confluenza (7 x 106 cellule per piatto Petri da 15 cm).
- Circa 1 h prima dell'innesto, preparare le cellule.
- Scartare i supporti, lavare le cellule con PBS sterile senza calcio e magnesio (10 mL per 15 cm piatto Petri) e staccare le cellule incubando per 5 min con 0,05% di metapsin-2 mM EDTA (2 mL per 15 cm piatto Petri).
- Raccogliere le cellule in formato RPMI medio (10 mL per 15 cm piatto Petri) e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Raccogliere il numero appropriato di cellule per il numero di topi da iniettare considerando come calcolato in base al punto 1.2.
- Centrifuga a 300 x g per 3 min, lavare il pellet cellulare in 10 mL di mezzo RPMI senza FBS e centrifugare di nuovo a 300 x g per 3 min.
- Risospendere le cellule in un volume appropriato di mezzo RPMI senza FBS a una concentrazione di 1 x 106 cellule per 50 -L come ogni topo deve essere iniettato con un volume di 50 L.
3. Impianto di cellule tumorali
- Prima dell'impianto, preparare il sistema di anestesia e l'area chirurgica in un cappuccio a flusso laminare spruzzando tutte le superfici con un disinfettante. Preparare forniture sterili o disinfettate nel cofano di flusso laminarce, tra cui il sistema di anestesia, il pad per il riscaldamento per mantenere la temperatura corporea del topo, la soluzione di iodio polividone, una siringa Da 30 G Hamilton (ad esempio, siringa 705RN, 30 G ago-20 mm-Point Style 4), garza sterile e tamponi di cotone, bisturi usa e getta sterili e strumenti chirurgici e micropipette sterili e punte.
- Tenere e aprire le gabbie SPF microisolate nella cappa di flusso disinfettata e anaterare un topo dopo l'altro in base alla velocità di innesto. La durata dell'innesto è di circa 5-10 min per i tecnici sperimentati.
- Anasthetize topi inducendo prima con 4-5% isoflurane. Quindi mantenere in anestesia sul pad di riscaldamento durante l'innesto con 3% isoflurane. Determinare la profondità dell'anestesia dalla perdita del riflesso di raddorqui per topo.
- Una volta che un topo è anestesizzato, iniettare sottocutaneamente 0,05 mg/kg buprenorfina come analgesico/ post-operatorio sollievo dal dolore.
- Posizionare il mouse sul lato destro (decubito laterale destro) sul pad di riscaldamento.
- Pulire l'area chirurgica con soluzione di iodio polividone e fare un'incisione di 5 mm della pelle e grasso circostante chiaro e muscoli con forbici smussate per esporre le costole.
- Omogeneizzare la sospensione cellulare ad una concentrazione di 1 x 106 celle per 50 - L di mezzo RPMI senza FBS e caricare 50 L della sospensione con la siringa Hamilton. Evitare bolle d'aria e pulire l'ago con 70% alcol per evitare l'innesto non ortotopico delle cellule. Omogeneizzare la sospensione cellulare prima di ogni iniezione.
- Iniettare lentamente le cellule nella cavità plerica tra le costole 6th e 7th con un angolo di 30 gradi e una profondità di 2-3 mm appena sotto i muscoli intercostali. Assicurarsi di non iniettare nei polmoni mantenendo l'ago appena sotto le costole. L'ago deve essere visibile dalla trasparenza attraverso i muscoli (Figura 1A).
- Chiudere la ferita con tre o quattro suture assorbibili.
- Conservare i topi in un ambiente caldo fino a quando non si svegliano.
- Il giorno dopo, ripetere l'iniezione di buprenorphina. Monitorare i mouse in base alla progettazione sperimentale e all'autorizzazione.
4. [18F]FDG-PET/CT Imaging
NOT: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere approvate da impianti locali di allestimento e imaging degli animali. Assicurarsi che i materiali radioattivi siano importati, immagazzinati e gestiti in base alle norme locali di sicurezza delle radiazioni (ad esempio, attività di soluzioni di stock, gestione delle cofanelle schermate). Le condizioni SPF possono essere mantenute manipolando gli animali in una cappa di flusso laminare e caricandoli in un letto scanner compatibile con SPF (Figura 1B, C).
- Monitorare lo sviluppo del tumore eseguendo l'imaging PET/TC, una volta alla settimana, a partire dal giorno 7 dopo l'impianto delle cellule H2052/484. Ogni animale rappresenta il proprio controllo nel tempo.
- Evitare il disagio degli animali prima dell'imaging trasportando i topi nell'alloggiamento dell'impianto di imaging, se disponibile, o tenerli vicini alla struttura.
- Topi veloci per 12-16 h prima di [18F]FDG-PET/CT che riduce i segnali di fondo. Vedere Fueger24 che ha descritto l'impatto della manipolazione animale sulle scansioni[18F]FDG-PET/CT.
- Decontaminare e conservare il letto dei topi secondo le regole locali.
- Registrare tutti i tempi delle dosi di radioattività che misurano, iniezioni e scansioni PET per poter calcolare i SUV.
- Topi preriscaldati a 30 gradi centigradi per 30 minuti prima dell'iniezione di [18F]FDG che riduce il metabolismo del tessuto adiposo marrone (BAT). Ad esempio, pre-caldo in camere di riscaldamento, utilizzando pastiglie di riscaldamento o utilizzando lampade a infrarossi.
- Preparare 3-4 dosi mBq di [18F]FDG dalla soluzione di stock in 150-200 - L di salina in 1 mL di siringhe di insulina utilizzando un calibratore di dose. Le siringhe di insulina hanno il vantaggio di non avere quasi nessun volume morto e potrebbero evitare la misurazione dell'attività rimanente dopo l'iniezione.
- Anasthetizzare i topi con isoflurane come descritto al passaggio 3.3. Pesare i topi e poi iniettare per via endovenosa 3-4 MBq [18F]FDG. L'iniezione retroorbitale è un metodo di scelta in quanto è veloce, facile ed evita problemi di iniezione della vena della coda o assorbimento ritardato dell'iniezione intraperitoneale.
- Dopo l'iniezione, lasciare i topi svegli per 45 min nelle loro gabbie nelle condizioni calde iniziate al passo 3.5. La durata dell'assorbimento dell'FDGèdi 1 h; 15 min sono normalmente sufficienti per caricare i topi sul letto ed eseguire la TC prima del PET.
- Anasthetize topi con isoflurane come descritto nel passaggio 3.3 e caricarli sul letto dello scanner (Figura 1B).
- Trasferire il letto allo scanner e sottoporre gli animali a una TAC centrata sui polmoni. Acquisire scansioni a 80 kVp, 160 proiezioni a, 1024 durante una rotazione a 360 gradi, con un campo visivo di 74 mm (1,6x ingrandimento, esempio di acquisizione Triumph) (Figura 1C).
- Spostare il letto nel sottosistema PET e avviare l'acquisizione 1 h dopo [18F]FDG iniezione per una durata di 15 min. Con la maggior parte dei sistemi PET/CT, il letto può essere spostato automaticamente dal CT al PET per mantenere il FOV centrato sulla stessa area.
- Togliere i topi dalla camera di imaging e lasciare che si riprendano nella loro gabbia.
- Tenere i topi in un'area dedicata al decadimento radioattivo secondo le regole locali.
5. Analisi delle scansioni[18F]FDG-PET/CT
- Ricostruire le scansioni TC eseguite nelle condizioni di cui sopra con una matrice di 512 e una dimensione voxel di 0,144 mm (algoritmo Filtered Back Projection-FBP, software integrato). Ricostruire le scansioni PET utilizzando un 20 iterazioni di un algoritmo Dimension-OSEM3D di aspettativa di sottogruppo ordinato. Calibrare le immagini in Bq/mL mediante la scansione di un cilindro fantasma. Registra automaticamente le scansioni TC e PET in base alla tua soluzione software integrata.
- Analizzare i volumi dei polmoni utilizzando il software di analisi (Tabella dei materiali).
- Caricare i dati CT come riferimento (Rif) facendo clic sull'icona Apri dati. Quindi caricare i dati PET come input (Inp1) facendo clic sull'icona Aggiungi dati.
- Regolare le scale dei colori ("WL") di TC e PET per confrontare le immagini per l'ispezione visiva.
- Selezionare 3D ROI Tool dal menu a discesa, fare clic su Aggiungi ROI e denominare il file Lungs. Fare clic su Algoritmi di segmentazione Soglia di quartiere. Definire l'input come sfondo e immagine come riferimento. Immettere Min e Max in base ai valori di densità polmonare del topo, in genere -800 e -300 HU. Esaminare i polmoni sottoposti a rendering 3D facendo clic sull'icona vtk e recuperare il volume nella tabella generata facendo clic su Mostra icona tabella.
- Analizzare [18F]Assorbimento FDG in tumori estraendo i valori massimi di assorbimento standard (SUVmax).
- Convertire le immagini PET calibrate in Bq/mL in SUV selezionando Aritmetica dal menu a discesa, quindi Moltiplica scalare e utilizzare inp1 come Selezionato e Scalare è Bq/mL in fattore SUV calcolato come segue: SUV (Bq/mL)/(dose iniettata (Bq)/peso del corpo(g)).
- Selezionare 3D ROI Tool dal menu a discesa, fare clic su Aggiungi ROI e denominare il file Tumori. Fare clic sulla modalità di vernice 3D Sfera. Deselezionare Solo 2D. Regolare la dimensione della forma e circondare i tumori. Assicurarsi di non includere eventuali segnali interferenti provenienti dal cuore, ad esempio. Recuperare il valore SUVmax nella tabella generata facendo clic su Mostra icona tabella.
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Representative Results
Il modello ortotopico H2052/484
I modelli ortotopici MPM mediante iniezione intra-toracica di cellule tumorali coltivate, in particolare cellule H2052/484, sono relativamente facili da installare. I diversi passaggi descritti in precedenza richiedono solo modeste conoscenze di coltura cellulare e le fasi chirurgiche sono accessibili agli sperimentatori di animali moderatamente addestrati. I topi e le cellule nude devono essere manipolati in condizioni sterili per massimizzare l'esito degli impianti. Seguendo attentamente questo protocollo, che comporta l'anestesia breve e la chirurgia minima, abbiamo incontrato solo 1 morte tra 266 topi iniettati con diverse linee cellulari MPM. Nessun pneumotorace o impianto intra-polmonare di cellule tumorali sono stati osservati tra questi 266 topi iniettati con cura come descritto. In particolare, il tasso di sviluppo del tumore ortotopico della linea cellulare H2052/484 è alto poiché il 93,8% dei topi iniettati ha sviluppato tumori (n . 118). I tumori H2052/484 possono essere rilevati mediante imaging PET/TC a partire da 14 giorni dopo l'iniezione e la durata mediana dell'esperimento secondo i nostri criteri endpoint è stata di 31 giorni in un esperimento rappresentativo21. Come abbiamo descritto in questo altro studio21, i tumori sono stati localizzati nella cavità toracica, liberamente distribuiti o attaccati ai polmoni, ai muscoli toracici, all'arco aortico o alla vena cava inferiore. Le metastasi non sono state trovate.
Monitoraggio MPM con [18F]Imaging FDG-PET/CT
L'MPM ortotopico è stato monitorato settimanalmente mediante l'imaging PET/CT combinato con il radiotracer ampiamente utilizzato [18F]FDG che si accumula nei tumori altamente metabolici. Le scansioni tC anatomiche longitudinali hanno permesso di visualizzare l'impatto dello sviluppo MPM sulla morfologia dei polmoni. La segmentazione automatica dei polmoni altamente contrastati sulle scansioni TC è semplice a causa della loro bassa densità rispetto ai tessuti circostanti. I rendering 3D forniscono una panoramica della localizzazione dei tumori e possono essere estratti volumi longitudinali di polmoni (Figura 2A). Le misurazioni dei volumi polmonari per TC sono diminuite significativamente nel tempo dopo l'iniezione di MPM di topi con tumori intrapleurali (ipl) H2052/484 (Figura 2B). Infatti, i tumori MPM crescono all'interno della cavità plechiana e creano pressioni sui polmoni, riducendo ne i volumi. Le analisi di correlazione hanno dimostrato che i volumi polmonari erano inversamente correlati al tempo di monitoraggio con un coefficiente di determinazione R2 di 0,8 (Figura 2C). Complessivamente, questi dati mostrano l'affidabilità della scansione TC per monitorare lo sviluppo di questo modello MPM.
In combinazione con la TC, una scansione FDG-PET[18F]fornisce informazioni aggiuntive e preziose sullo stato metabolico dei tumori MPM. Anche se a volte può essere complicato interpretare la TC e il PET scansiona le immagini da sole, soprattutto nei primi momenti, una combinazione di entrambe le modalità fornisce ulteriore robustezza alla diagnosi. Infatti, il monitoraggio longitudinale rappresentativo [18F]FDG-PET/CT eseguito tra 10 giorni e 44 giorni di un topo con tumori ipl H2052/484 mostra che i tumori cominciano ad essere distinguibili 2 settimane dopo l'innesto (Figura 3A). Questo esempio evidenzia la crescita e l'avidità di[18F]FDG di tumori situati alla periferia della cavità toracica e lungo il cuore grandi vasi (frecce bianche). [18F] L'assorbimento di FDG nei tumori è stato quantificato estraendo SUVmax in ROI disegnati su tumori, con l'aiuto di scansioni TC, e mostra significativi aumenti dipendenti dal tempo del loro metabolismo del glucosio (Figura 3B). Le analisi di correlazione hanno dimostrato che SUVmax era positivamente correlato al tempo di monitoraggio con un coefficiente di determinazione R2 di 0,7 (Figura 3C). Questi dati dimostrano l'affidabilità delle scansioni[18F]FDG-PET per monitorare il destino dei tumori ortotopici H2052/484. Infine, i volumi polmonari e l'avidità di FDG [18F], rispettivamente, analizzati da TC e PET, sono correlati tra loro con una R2 di 0,6 che supporta la forza di queste misurazioni per studiare lo sviluppo di tumori ortotopici MPM (Figura 4).
Figura 1: modello di xenotrapianto ortotopico del topo nudo. (A) Iniezione intrapleurale (ipl) di cellule MPM umane nella cavità plerica sinistra, come descritto nella sezione del protocollo. (B, C) I topi vengono anestesizzati e caricati nel letto PET/CT in un cappuccio a flusso laminare e poi trasferiti allo scanner. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Crescita tumorale del modello ortotopico H2052/484 MPM monitorato dalla TC. (A) Ricostruzioni 3D rappresentative delle scansioni TC che mostrano i tumori dell'ipl H2052/484 MPM e il loro effetto sul volume polmonare (Vp) in vari momenti nei giorni successivi all'impianto. Le punte di freccia bianche mostrano la posizione dei tumori IPl MPM. (B) La trama del violino mostra un corso temporale rappresentativo dei volumi polmonari (VL), n . È indicato il test ANOVA unidirezionale con le statistiche sui confronti multipli di Tukey. Le lettere indicano differenze significative tra i modelli con a, b, c, d, e, f che indicano rispettivamente D10, D16, D23, D29, D36 e D44. Valori p corrispondenti: x, p < 0,05; xx, p < 0,01; xxx, p < 0.001; xxxx, p < 0.0001. (C) Correlazione tra la diminuzione del volume polmonare correlato allo sviluppo dell'IPM MPM e il tempo dopo l'iniezione. La regressione lineare viene tracciata come una linea colorata spessa e la SD correlata come linee nere tratteggiate. Grafici e analisi statistiche sono stati eseguiti con il software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metabolismo tumorale del modello ipl MPM seguito da [18F]FDG-microPET/CT. (A) Scansioni PET/TC rappresentative che mostrano tumori IPl MPM. Le immagini PET/CT mostrano fette transassiali della zona toracica contenente i tumori [18F]FDG-avid, con la TC (scala di grigi) che fornisce informazioni anatomiche e PET (scala pseudo-colore calibrata) che mostra la posizione e l'intensità dell'elevato utilizzo del tumore e del glucosio dell'organo. Sono indicati i giorni successivi all'iniezione. CT: Finestra mediastinale CT; [18F] FDG-PET/CT: immagine fusa di scansioni PET e TC. Le punte di freccia bianche mostrano i tumori dell'ipl MPM. L - polmone, H - cuore, BAT - tessuto adiposo marrone. (B) La trama del violino mostra un corso di tempo rappresentativo del SUVmax legato al metabolismo MPM, n . È indicato il test ANOVA unidirezionale con le statistiche sui confronti multipli di Tukey. Le lettere indicano differenze significative tra i modelli con a, b, c, d, e, f che indicano rispettivamente D10, D16, D23, D29, D36 e D44. Valori p corrispondenti: x, p < 0,05; xx, p < 0,01; xxx, p < 0.001; xxxx, p < 0.0001. (C) Correlazione tra l'aumento del SUVmax nei tumori IPl MPM e il tempo dopo l'iniezione. La regressione lineare viene tracciata come una linea colorata spessa e la SD correlata come linee nere tratteggiate. Grafici e analisi statistiche sono stati eseguiti con il software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Correlazione tra sviluppo mpM monitorato dal volume polmonare e dall'attività metabolica del tumore. Correlazione tra SUVmax e volume polmonare (VL)visualizzata come una regressione lineare tracciata come una linea colorata spessa e la relativa SD come linee nere tratteggiate. Grafici e analisi statistiche sono stati eseguiti con il software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive un modello ortotopico originale delle cellule MPM H2052/484 iniettate nella cavità pleurica dei topi atimici e un metodo di monitoraggio mediante l'imaging PET/CT animale piccolo. Questo modello può essere implementato con una moderata manipolazione degli animali e capacità chirurgiche e mostra un ottimo tasso di sviluppo. Permette una grande finestra sperimentale di circa 10 settimane in topi non trattati e rilevamento longitudinale non invasivo di tumori già 2 settimane dopo l'iniezione.
I modelli ortotopici si basano sull'impianto di cellule viventi o tessuti direttamente nell'ambiente iniziale del tumore. La differenza principale tra modelli MPM sottocutanei o intraperitoneali ampiamente utilizzati e modelli intrapleurali risiede nel loro microambiente. Infatti, il microambiente dei tumori contiene più tipi di cellule stromali (fibroblasti, leucociti, macrofagi) oltre alle cellule tumorali25. Queste cellule stromali secernono fattori di crescita e citochine che contribuiscono al microambiente tumorale che modulano la crescita del tumore. Il microambiente tumorale varia con il sito anatomico suggerendo che uno xenotrapianto ortotopico si svilupperà e risponderà in modo diverso a un trattamento rispetto a uno sottocutaneo25. Pertanto, poiché gli xenoinnesti ortotopici sono circondati da un microambiente comparabile a quello trovato nei pazienti affetti da MPM, il loro comportamento e la risposta al trattamento dovrebbero riflettere meglio la situazione clinica17,19.
Molti modelli preclinici nella ricerca sul cancro implicano topi immunodeficienti per garantire il successo del xenotrapianto umano. I topi nudi non possiedono il timo maturo e non hanno una parte vitale del microambiente tumorale26. Sebbene i topi nudi non possiedano il timo maturo e siano quindi carenti nelle cellule T, presentano linfociti maturi B, neutrofi, monociti e macrofagi nel loro microambiente pleurico in contrasto con i topi SCID più permissivi e altamente carenti26. Nelle prime fasi dello sviluppo MPM, le cellule T regolatorie hanno un importante ruolo soppressivo. Tuttavia, in stadi più avanzati, le cellule mieloidi, tra cui neutrofili e macrofagi, sostituiscono le cellule Treg; in questa funzione, il ruolo soppressivo delle cellule T regolatorie è importante solo durante le prime fasi dello sviluppo MPM23,27. Di conseguenza, anche se gli studi che coinvolgono una risposta immunitaria completa (ad esempio, le immunoterapie che coinvolgono una risposta T) non possono essere studiati nel modello qui presentato, postulamo che questo modello ortotopico mantenga tutto il suo interesse per valutare nuovi trattamenti o nuovi strumenti diagnostici di MPM.
In un punto di vista metodologico, ci sono passi critici da tenere a mente per massimizzare lo sviluppo di tumori MPM intrapleurali. Prima di stabilire modelli di topi, hanno accesso a cellule in crescita esponenziale (confluenza di meno dell'80%, a seconda delle linee cellulari) e a topi acclimatati da 8 a 10 mesi. Infatti, iniettare topi piccoli più giovani è difficile e può provocare iniezioni ectopiche e alterare la sopravvivenza. Durante la procedura di impianto, devono essere prese precauzioni chirurgia standard, e forbici smussate devono essere utilizzate soprattutto quando incisi per evitare sanguinamento, che potrebbe portare alla morte di animali. La scelta della siringa (ad esempio, il modello qui descritto) e il protocollo qui presentato consentono un'iniezione precisa e delicata di un piccolo volume di cellule tumorali contenenti mezzi per garantire un'iniezione intrapleurale (angolo 30, profondità di 2-3 mm).
Il monitoraggio longitudinale dei modelli mMPontopici può essere eseguito solo in modo non invasivo da tecniche di imaging. PET/TC è il metodo consigliato nella pratica clinica per diagnosticare MPM ed è stato quindi utilizzato in questo studio20,21. Rispetto all'imaging ottico ampiamente utilizzato, l'imaging PET/CT comporta l'uso di composti radioattivi ed è quindi più delicato da installare a causa della sicurezza, della logistica dei radiotracciatori e del suo costo28. Tuttavia, l'imaging PET/CT non si basa sulla modificazione genetica delle cellule tumorali e fornisce informazioni tomografiche, anatomiche e molecolari ad alta risoluzione. L'imaging ottico è anche più veloce del PET/CT, ma il sistema di imaging presentato in questo articolo prevede un letto a 3 topi e circa 20 topi possono essere scansionati al giorno, che è una produttività ragionevole considerando le informazioni raccolte. L'uso del radiotracer clinico ad alta disponibilità [18F]FDG garantisce un elevato potere traslazionale per la ricerca eseguita con questa tecnica29. Anche se [18F]Le letture e le analisi della scansione FDG-PET potrebbero richiedere una certa esperienza a causa dell'elevato assorbimento nei tessuti adiposi circostanti e cardiaci, la sua combinazione con la TC affina la diagnosi. Durante gli esperimenti[18F]FDG PET/CT, i topi di digiuno e riscaldamento, nonché l'esecuzione di un tempo di assorbimento di [18F]FDG di 1 h può migliorare significativamente la visualizzazione dei tumori poiché le condizioni di scansione hanno un impatto elevato sui contrasti PET come già descritto24. Ulteriori studi su modelli ortotopici preclinici che coinvolgono altri radiotracer clinicamente utilizzati come [18F]Fluorothymidine (FLT) o [18F]Fluoromisonidazole (FMISO), che monitora rispettivamente la proliferazione e l'ipossia, potrebbero fornire maggiori informazioni su tali modelli iptotopici umidi29.
Infine, questo rilevante modello traslazionale combinato con l'imaging non invasivo è perfettamente in linea con il concetto di 3R: Reduce il numero di animali, Refine per ridurre il dolore e il disagio e la sperimentazione animale di Replace con alternative22. Infatti, all'interno dello stesso insieme di animali, il follow-up terapeutico e la risposta possono essere monitorati in modo non invasivo permettendo misurazioni longitudinali durante gli esperimenti, riducendo così il numero di animali necessari per esperimento. Inoltre, poiché ogni animale rappresenta il proprio controllo nel tempo, anche l'imaging non invasivo aumenta notevolmente la potenza statistica riducendo il numero di animali necessari per ottenere dati affidabili16.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da Ligue Genevoise contre le Cancer (a V.S.-B.) e dal Center for Biomedical Imaging (CIBM) delle Università e Ospedali di Ginevra e Losanna (a D.J.C., O.B. e S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
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