Summary
이 기사에서는 H2052/484 중피종 세포를 면역 손상된 심질 마우스의 흉막 강내로 이식함으로써 인간 흉막 중피종의 정형외 마우스 모델의 생성을 설명합니다. 내림두근 종양의 발달에 대한 종방향 모니터링은 비침습적 다중모달[18F]-2-플루오로-2-디옥시-D-포도당 양면 방출 단층 촬영 및 컴퓨터 단층 촬영 영상에 의해 평가되었다.
Abstract
악성 흉막 중피종 (MPM)은 폐, 심장 및 흉강을 덮는 중피에서 발생하는 희귀하고 공격적인 종양입니다. MPM 개발은 주로 석면과 관련이 있습니다. 치료는 평균 생존 평균이 진단 의 시간에서 9-18 개월이기 때문에 단지 겸손한 생존을 제공합니다. 따라서 보다 효과적인 치료법을 식별해야합니다. 새로운 치료 표적을 기술하는 대부분의 데이터는 시험관 내 실험으로부터 수득되었으며 생체 내 전임상 모델에서 신뢰할 수 있는 유효성을 검사할 필요가 있다. 이 논문은 면역 결핍 항진 마우스의 흉막 구멍 내로 인간 MPM 세포주 H2052/484를 주사한 후에 얻은 이러한 신뢰할 수 있는 MPM 정형화 모델 중 하나에 대해 설명합니다. 정형외 부위에서의 이식은 생체 내 자연적인 환경에서 종양의 진행을 연구할 수 있게 한다. 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 (PET/CT) 분자 이미징 임상[18F]-2-deoxy-D-glucose([18F]FDG) 방사선 추적기는 MPM을 가진 환자를 검사하기위한 선택의 진단 방법입니다. 따라서,[18F]FDG-PET/CT는 H2052/484 정형화 모델의 질병 진행을 세로로 모니터링하는 데 사용되었다. 이 기술은 종양 발달을 비침습적으로 모니터링할 수 있고 필요한 동물의 수를 현저히 감소시킬 수 있기 때문에 높은 3R 전위(R euce 동물의 수,R efine는 통증 및 불편함을 완화하고, 대안을 가진 Replace 동물 실험)를 가지고 있다.
이 모델은 높은 개발 속도, 급속한 종양 성장을 표시하며 비용 효율적이며 신속한 임상 번역을 가능하게합니다. 이 직교 이종이식 MPM 모델을 사용하여, 연구원은 치료 내정간섭 다음 신뢰할 수 있는 MPM 모형의 생물학 반응을 평가할 수 있습니다.
Introduction
악성 흉막 중피종 (MPM)은 석면 섬유1,2,3에노출과 가장 자주 관련된 암입니다. 대부분의 서구 국가에서 석면이 금지되어 있지만4,5,6,MPM의 발생률은 여전히7,8증가하고 있습니다. 최근, 탄소 나노튜브에 마우스의 노출은 인간9,10에서상당한 건강 위험을 초래할 수 있음을 시사한다. 데이터는 이 제품에 노출이 악성 중피종에 진행의 밑에 있는 만성 염증 및 분자 변경 (예를 들면, 종양 억제기 통로의 손실)를 유도할 수 있다는 것을 건의합니다. 현재 멀티월 탄소 나노튜브는 나노 기술의 가장 중요한 제품 중 하나이며 복합 재료, 에너지 저장 재료, 의학, 전자 및 환경 개선 재료와 같은 다양한 제품에 점점 더 많이 통합되고 있습니다.
MPM은 예후가 좋지 않은 암이며, 대부분의 환자는 현재 치료 양식의 제한된 효능으로 인해 진단 후 2년 이내에 사망한다11. MPM에 대한 치료의 선택은 암 단계에 달려 있습니다. 대부분의 초기 단계 MPM(단계 1 및 아마도 몇몇 단계 2 또는 3 종양)을 위해, 임상 접근은 방사선 요법 및 화학요법과 관련되었던 종양의 외과 적 절제술을 포함하는 다중 모달 치료이다12. 시스플라틴 및 페미터xed와 결합된 화학요법은 진행성 국소 침습질환으로 진단된 대부분의 환자들의 치료를 위해, 즉 외과적 절제술에 대한 의무가 없거나, 그렇지 않으면 치료수술 후보가 아닌13,14. 따라서 MPM 환자를 위한 보다 효과적인 치료법을 개발할 긴급한 필요성이 있습니다. 그러나, MPM의 임상적 관련성을 반영하는 생체내 동물 모델에서 검증된 것은 거의 없다. 몇몇 murine MPM 모형은 개발되었지만 그들 대부분은 MPM 종양 미세환경15,16,17,18의복잡한 양상을 충실하게 되풀이하지 않습니다. 마우스에서 석면 유도 MPM의 사용, 유전자 조작 MPM 마우스 모델, 또는 뮤린 MPM 세포주의 합성 이식의 모델은 근본적인 표현형 및 기능적 차이에 의해 제한되며, 결과적으로, 제대로 새로운 발견을 클리닉에 번역. 그밖 전임상 뮤린 MPM 모형은 주로 면역 결핍 마우스에 있는 인간 적인 세포주 의 피하 또는 복막 이종이식에 의존합니다. 이러한 모델은 기본적인 데이터를 모니터링하고 제공하기 쉽지만, 이러한 이종이식의 미세환경은 이러한 전임상 연구의 대부분인17,19의번역력을 손상시키는 인간 종양에 필적하지 않는다. 반대로, 정형외 이종이식은 원래 종양부위(16)에서발견되는 것과 유사한 미세환경으로 둘러싸여 있기 때문에 환자 종양 거동 및 치료에 대한 반응을 더 잘 반영한다.
[18F]FDG-PET/CT에 의한 분자 이미징은 MPM20,21을가진 환자에서 질병 진행을 세로로 모니터링하는 방법이다. 따라서, 이러한 비침습적 이미징 방법에 의존하면 전임상 연구의 임상시험(16,22)의번역을 크게 촉진한다. 더욱이, 각 동물은 시간이 지남에 따라 자신의 통제를 나타내기 때문에 필요한 동물 수를 줄이는 데 도움이됩니다.
이 문서에서는, 우리는 인간 MPM 세포주 H2052/484를 항성 마우스의 흉막 구멍 내로 주입한 후에 얻은 신뢰할 수 있는 정형외 이종이식 MPM 모델을 제시한다. [18F]FDG-PET/CT 이미징과 결합된 이 모델은 인간 MPM에 대한 새로운 진단 전략 및 치료법의 기능적 및 기계적 효과를 연구하는 귀중하고 재현 가능한 방법입니다.
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Protocol
아래에 설명된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 스위스 제네바 수의사 주 사무소(승인 GE/106/16)에 의해 승인되었습니다. MPM 세포주 H2052/484는 콜린 DJ 및 외23의기사에서 자세히 설명된 바와 같이 당사의 실험실에서 확립및 특징화되었다. 간단히, H2052/484 세포주는 면역 결핍 누드 마우스로 NCI-H2052 (ATCC) 세포의 내림부절 주입 후에 얻은 흉부 종양으로부터 확립되었다.
1. 실험적인 디자인
- 통계적 전력 계산(예: http://powerandsamplesize.com/Calculators/)을사용하여 실험에 따라 필요한 마우스 수를 결정합니다.
- 이식 하기 최소 1주일 전에, 8~10주 령 의 심질 암컷 누드 마우스 Foxn1nu nu/nu를 구입하고 적어도 1주일 동안 특정 병원균이 없는(SPF) 환경에 보관한다.
2. 이식을 위한 세포의 준비
- 각 마우스가 1 x 106 셀(1.1단계)으로 주입될 때 필요한 H2052/484 셀 수를 계산합니다. 마우스에 주사로 세포의 여분의 수를 준비 주사기 샘플링을 포함 할 것이다.
- RPMI 1640 배지에서 MPM H2052/484 세포주를 10% (v/v) 태아 소 혈청(FBS), 100 단위/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 조직 배양 인큐베이터에서 5%CO2로보충하였다.
- 약 80% 합류에 이식하기 위한 배양 세포 (~7 x 106 세포 15 cm 페트리 접시 당).
- 이식하기 약 1 시간 전에 세포를 준비하십시오.
- 매질을 버리고, 칼슘과 마그네슘(15 cm 페트리 접시당 10 mL)이 없는 멸균 PBS로 세포를 세척하고 0.05% 트립신-2 mM EDTA(15 cm 페트리 접시당 2 mL)로 5분 동안 배양하여 세포를 분리한다.
- RPMI 배지 (15 cm 페트리 접시 당 10 mL)에서 세포를 수집하고 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 1.2단계에 따라 계산된 것으로 고려하여 주입되는 마우스의 수에 대한 적절한 수의 세포를 수집한다.
- 300 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 FBS없이 RPMI 배지의 10 mL에서 세포 펠릿을 씻고 3 분 동안 300 x g에서 다시 원심 분리기를 씻습니다.
- 각 마우스가 50 μL의 부피로 주입되어야 하기 때문에 FBS 없이 적절한 양의 RPMI 배지에서 50 μL당 1 x 106 세포의 농도로 세포를 재중단시다.
3. 종양 세포 이식
- 이식 전에 모든 표면에 소독제로 살포하여 마취 시스템 및 수술 부위를 층류 후드에 준비하십시오. 마취 시스템, 마우스 체온을 유지하는 가열 패드, 폴리비돈 요오드 용액, 30 G 해밀턴 주사기 (예를 들어, 705RN 주사기, 30 G 바늘-20 mm-Point Style 4)를 포함하는 층류 후드에 멸균 또는 소독 된 소모품을 준비하십시오. 멸균 거즈 및 면봉, 멸균 일회용 메스 및 수술 도구, 멸균 마이크로 파이펫 및 팁.
- 소독된 유동 후드에서 미세 절연 된 SPF 케이지를 유지하고 열고 접목 속도에 따라 한 마우스를 차례로 마취시킵니다. 접목 기간은 실험 기술자의 경우 약 5-10분입니다.
- 먼저 4-5% 이소플루란으로 유도하여 마우스를 마취시다. 그런 다음 3 % 이소플루란으로 접목하는 동안 가열 패드에서 마취하에 유지하십시오. 마우스에 의한 권리 반사의 손실에 의해 마취의 깊이를 결정합니다.
- 일단 마우스가 마취되면, 피하 0.05 mg/kg buprenorphine를 진통제/수술 후 통증 완화로 주입하십시오.
- 가열 패드의 오른쪽(오른쪽 측면 데큐비티)에 마우스를 놓습니다.
- 폴리비드원 요오드 용액으로 수술 부위를 청소하고 5mm 의 절개를 하고 둔한 가위로 주변 지방과 근육을 깨끗하게 하여 갈비뼈를 노출시십시오.
- FBS 없이 RPMI 배지의 50 μL당 1 x 106 세포의 농도로 세포 현탁액을 균질화하고 해밀턴 주사기로 현탁액의 50 μL을 로드합니다. 기포를 피하고 세포의 비 정형 파 이식을 피하기 위해 70 % 알코올로 바늘을 닦으하십시오. 각 주입 전에 세포 현탁액을 균질화합니다.
- 천천히 30 ° 각도와 늑간 근육 바로 아래 2-3mm의 깊이와6 과7 갈비 사이의 흉막 구멍에 세포를 주입. 갈비뼈 바로 아래에 바늘을 유지하여 폐에 주입하지 않도록하십시오. 바늘은 근육을 통해 투명하게 볼 수 있어야합니다(그림 1A).
- 흡수성 봉합사 3~4개로 상처를 닫습니다.
- 생쥐가 깨어날 때까지 따뜻한 환경에 보관하십시오.
- 다음 날, 부프레노르핀 주사를 반복하십시오. 실험 설계 및 허가에 따라 마우스를 모니터링합니다.
4.[18F]FDG-PET/CT 이미징
참고: 아래에 설명된 모든 절차는 현지 동물 수용 및 이미징 시설의 승인을 받아야 합니다. 방사성 물질을 현지 방사선 안전 규칙(예: 재고 용액 활동, 차폐 후드 취급)에 따라 수입, 보관 및 취급해야 합니다. SPF 조건은 동물을 층류 후드에서 조작하고 SPF 호환 스캐너 베드에 적재함으로써 유지될 수있다(도 1B, C).
- H2052/484 세포를 이식한 후 7일째부터 일주일에 한 번 PET/CT 이미징을 수행하는 종양 발달을 모니터링합니다. 각 동물은 시간이 지남에 따라 자신의 제어를 나타냅니다.
- 마우스를 이미징 시설 하우징으로 운반하거나 시설 가까이에 두어 이미징 전에 동물의 고통을 피하십시오.
- 배경 신호를 감소[18F] FDG-PET / CT 전에 12-16 시간 빠른 마우스. [18F]FDG-PET/CT 스캔에 대한 동물 취급의 영향을 설명한 Fueger24를 참조하십시오.
- 현지 규칙에 따라 생쥐 침대를 오염 제거하고 보관하십시오.
- SUV를 계산할 수 있도록 방사능 투여량 측정, 주사 및 PET 스캔의 모든 시간을 기록합니다.
- 30°C에서 30분 동안 미리 온난마우스[18F]FDG를 주입하여 갈색 지방조직(BAT) 대사를 감소시킨다. 예를 들어, 가열 패드를 사용하거나 적외선 램프를 사용하여, 난방 챔버에서 미리 따뜻하게.
- [18F]FDG의 3-4 MBq 투여량을 1 mL 인슐린 주사기에서 식염수 150-200 μL의 스톡 용액으로부터 용량 교정기사용법을 사용하여 준비한다. 인슐린 주사기는 거의 죽은 부피가 없는 장점이 있으며 주사 후 남은 활성의 측정을 피할 수 있습니다.
- 3.3단계에서 기재된 바와 같이 이소플루란으로 마우스를 마취시하였다. 마우스를 계량한 다음 정맥 내 3-4 MBq[18F]FDG를 주입합니다. 레트로 궤도 주입은 빠르고 쉽고 꼬리 정맥 주사 문제 또는 복강 내 주사의 지연 된 섭취를 피하기 때문에 선택의 방법입니다.
- 주사 후, 3.5 단계에서 시작된 따뜻한 조건하에서 케이지에서 45 분 동안 마우스를 깨어 둡니다. [18F]FDG 섭취량의 지속 시간은 1 시간; 15 분은 일반적으로 침대에 마우스를로드하고 PET 전에 CT를 수행하기에 충분하다.
- 3.3단계에서 설명한 바와 같이 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 스캐너 베드에 적재하였다(그림1B).
- 침대를 스캐너로 옮기고 동물을 폐를 중심으로 CT 스캔으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 한다. 74mm(1.6배 배율, 승리 획득 예)의 시야를 가진 360° 회전 동안 80kVp, 160 μA, 1024 투영에서 스캔을 획득합니다(그림1C).
- 침대를 PET 서브시스템으로 옮기고 15분 동안[18F]FDG 주사 후 1시간 후에 획득을 시작한다. 대부분의 PET/CT 시스템을 사용하면 침대를 CT에서 PET로 자동으로 이동하여 FOV를 동일한 영역 의 중심에 유지할 수 있습니다.
- 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 케이지에서 회복할 수 있도록 하십시오.
- 현지 규칙에 따라 방사성 부패에 전념하는 지역에 마우스를 보관하십시오.
5.[18F]FDG-PET/CT 스캔 분석
- 512의 매트릭스와 0.144 mm의 복셀 크기 (필터링 된 다시 프로젝션 - FBP 알고리즘, 내장 소프트웨어)로 위에서 언급 한 조건에서 수행 된 CT 스캔을 재구성합니다. 정렬된 하위 집합 최대-3 차원-OSEM3D 알고리즘의 20회 반복을 사용하여 PET 스캔을 재구성합니다. 팬텀 실린더를 스캔하여 Bq/mL의 이미지를 보정합니다. 내장 된 소프트웨어 솔루션에 따라 CT 및 PET 스캔을 자동으로 공동 등록하십시오.
- 분석소프트웨어(재료 표)를사용하여 폐 체적을 분석합니다.
- 데이터 열기 아이콘을 클릭하여 CT 데이터를참조(참조)로로드합니다. 그런 다음 추가 데이터 아이콘을 클릭하여 PET 데이터를입력(Inp1)으로로드합니다.
- 시각적 검사를 위해 CT 및 PET의 색상 스케일("WL")을 대비이미지로 조정합니다.
- 드롭다운 메뉴에서 3D ROI 도구를 선택하고 ROI 추가를 클릭하고 파일 폐의 이름을 지정합니다. 세분화 알고리즘을 클릭합니다 | 이웃 임계값. 입력을 배경및 이미지를 참조로정의합니다. 마우스 폐 밀도 값( 전형적으로 -800 및 -300 HU)에 따라 최소 및 최대를 입력합니다. vtk 아이콘을 클릭하여 3D 렌더링 된 폐를 검사하고 테이블 아이콘 표시를클릭하여 생성 된 테이블의 볼륨을 검색합니다.
- 최대 표준 섭취 값 (SUVmax)을 추출하여 종양에서[18F]FDG 섭취량을 분석하십시오.
- 드롭다운 메뉴에서 산술 연산을 선택하여 Bq/mL로 보정된 PET 이미지를 SUV로 변환한 다음, 스칼라곱을 선택하고 선택된 대로 inp1을 사용하고 스칼라는 다음과 같이 계산된 Bq/mL이며, SUV = (Bq/mL)/(주입 용량(Bq/mL)))을 계산합니다.
- 드롭다운 메뉴에서 3D ROI 도구를 선택하고 ROI 추가를 클릭하고 파일 종양의 이름을 지정합니다. 3D 페인트 모드를 클릭 | 구. 2D만선택을 취소합니다. 모양의 크기를 조정하고 종양을 둘러싸는다. 예를 들어 심장에서 오는 간섭 신호를 포함하지 않도록하십시오. 테이블 아이콘 표시아이콘을클릭하여 생성된 테이블에서 SUVmax 값을 검색합니다.
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Representative Results
H2052/484 정형고토토피 모델
배양된 암세포의 흉부 내 주사에 의한 정형외 MPM 모델, 특히 H2052/484 세포는 비교적 설치가 용이하다. 위에서 설명한 다른 단계는 겸손한 세포 배양 지식만을 필요로 하며 수술 단계는 적당히 훈련된 동물 실험가들에게 접근할 수 있습니다. 누드 마우스와 세포는 이식의 결과를 최대화하기 위해 멸균 조건하에서 조작되어야합니다. 짧은 마취와 최소한의 수술을 포함하는이 프로토콜을 주의 깊게 따라, 우리는 다른 MPM 세포주로 주입 된 266 마우스 중 단지 1 개의 죽음을 만났습니다. 종양 세포의 기흉 또는 폐 내 이식은 설명된 바와 같이 신중하게 주입된 이들 266마리 의 마우스 들 사이에서 관찰되었다. 구체적으로, H2052/484 세포주의 정형종양 발병률은 주입된 마우스의 93.8%가 종양을 개발한 이후 높다(n=118). H2052/484 종양은 주사 후 14일로부터 PET/CT 이미징에 의해 검출될 수 있으며, 우리의 종점 기준에 따른 실험의 중간 지속 시간은 대표적인 실험21일이었다. 우리가 이 다른 연구21에서설명한 바와 같이, 종양은 흉강 내에 국한되었고, 폐, 흉부 근육, 대동맥 아치 또는 열등한 정맥에 자유롭게 분배되거나 부착되었다. 전이를 찾을 수 없습니다.
[18F]FDG-PET/CT 이미징에 의한 MPM 모니터링
정형외 MPM은 고도로 신진 대사 종양에 축적되는 널리 사용되는 방사선 추적기[18F]FDG와 결합된 PET/CT 이미징에 의해 매주 모니터링되었다. 종방향 해부학 CT 스캔은 폐의 형태에 MPM 개발의 영향을 시각화 할 수 있었습니다. CT 검사에 고도로 대조폐의 자동 분할은 주변 조직에 비해 그들의 낮은 밀도 때문에 간단합니다. 3D 렌더링은 종양의 국소화 및 폐의 세로 부피의 개요를 추출할 수있다(도 2A). CT에 의한 폐 부피 측정은 인트라플러럴(ipl) H2052/484 종양을 가진 마우스의 MPM 주입 후 시간이 지남에 따라 현저히 감소하였다(도2B). 실제로 MPM 종양은 흉막 강 내부에서 자라며 폐에 압력을 가하여 부피를 줄입니다. 상관 관계 분석은 폐 부피가 0.8의 판정R2계수로 모니터링하는 시간과 반비례한다는 것을 입증하였다(도2C). 이러한 데이터는 모두 이 MPM 모델의 개발을 모니터링하기 위한 CT 스캔의 신뢰성을 보여줍니다.
CT와 결합하면[18F]FDG-PET 스캔은 MPM 종양의 대사 상태에 대한 추가적이고 귀중한 정보를 제공합니다. 때로는 CT와 PET가 이미지를 스스로 해석하는 것이 복잡할 수 있지만, 특히 초기 시점에서 두 양식의 조합은 진단에 더 견고함을 제공합니다. 실제로, 대표적인 경도[18F]FDG-PET/CT 모니터링은 ipl H2052/484 종양을 가진 마우스의 10일 및 44일 사이에서 수행된 종양이 이식 후 2주 후에 구별되기 시작한다는 것을보여준다(도 3A). 이 예는 흉강 의 주변에 위치하고 심장 큰 혈관 (흰색 화살표)을 따라 종양의 성장과[18F]FDG 열렬함을 강조합니다. 【18F 】 종양에서의 FDG 섭취량은 CT 스캔의 도움으로 종양 위에 그려진 ROI에서 SUVmax를 추출하여 정량화하였고, 그들의 포도당 대사의 상당한 시간 의존적 증가를나타낸다(그림 3B). 상관관계 분석은 SUVmax가 0.7(그림3C)의판정R2 계수와 모니터링 시간과 긍정적으로 상관관계가 있음을 보여주었다. 이러한 데이터는[18F]FDG-PET 스캔의 신뢰성을 입증하여 H2052/484 정형종양의 운명을 모니터링한다. 마지막으로, 폐 부피 및[18F]FDG 열렬함은 각각 CT 및 PET에 의해 분석되고, MPM 정형외 종양 개발을 연구하기 위해 이들 측정의 강도를 지지하는 0.6의 R2와 서로 상관관계가 있다(도4).
그림 1: 누드 마우스 정형외 이종이식 모델. (a)프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 인간 MPM 세포를 좌흉막 내로 주사하는 내체(ipl). (B, C) 마우스는 마취되고 적층 류 후드에 PET /CT 침대에적재된 다음 스캐너로 옮겨냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CT에 의해 모니터링된 정형포피 H2052/484 MPM 모델의 종양 성장. (a)Ct 스캔의 대표적인 3D 재구성은 H2052/484 MPM ipl 종양및 이식 후 며칠 동안 다양한 시간에 폐 부피(Vp)에 미치는 영향을 보여준다. 흰색 화살촉은 MPM ipl 종양의 위치를 표시합니다. (B)바이올린 플롯은 폐 부적(VL), n =6의 대표적인 시간 과정을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 통계가 있는 단방향 ANOVA 테스트가 표시됩니다. 문자는 각각 D10, D16, D23, D29, D36 및 D44를 나타내는 a, b, c, d, e, f를 가진 모델 간의 상당한 차이를 나타냅니다. 해당 p 값: x, p< 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p & 0.001; xxxx, p & 0.0001. (C)ipl MPM 발달과 관련된 폐 부피의 감소와 주사 후의 시간 사이의 상관관계. 선형 회귀는 두꺼운 색상 선으로 플롯되고 SD는 파선된 검은색 선으로 표시됩니다. 그래프와 통계 분석은 소프트웨어로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: ipl MPM 모델의 종양 대사 뒤에[18F]FDG-마이크로PET/CT. (A)MPM ipl 종양을 나타내는 대표적인 PET/CT 스캔. PET/CT 이미지는[18F]FDG-열렬한 종양을 포함하는 가슴 영역의 트랜스 축 조각을 보여주고, CT (회색 척도)는 해부학 정보를 제공하고 PET (교정 된 의사 색 척도)는 높은 종양 및 장기 포도당 활용의 위치와 강도를 보여줍니다. 주입 후 일 표시 됩니다. CT: CT 중간 창; 【18F 】 FDG-PET/CT: PET 및 CT 스캔의 융합 이미지. 백색 화살촉은 MPM ipl 종양을 보여줍니다. L = 폐, H = 심장, BAT = 갈색 지방 조직. (B)MPM 대사에 연결된 SUVmax의 대표적인 시간 과정을 보여주는 바이올린 플롯, n =6. Tukey의 다중 비교 통계가 있는 단방향 ANOVA 테스트가 표시됩니다. 문자는 각각 D10, D16, D23, D29, D36 및 D44를 나타내는 a, b, c, d, e, f를 가진 모델 간의 상당한 차이를 나타냅니다. 해당 p 값: x, p< 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p & 0.001; xxxx, p & 0.0001. (C)ipl MPM 종양에서 SUV최대의 증가와 주사 후 시간 사이의 상관관계. 선형 회귀는 두꺼운 색상 선으로 플롯되고 SD는 파선된 검은색 선으로 표시됩니다. 그래프와 통계 분석은 소프트웨어로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 폐 부피 및 대사 종양 활성에 의해 모니터링되는 MPM 발달 사이의 상관관계. SUVmax와 폐 부피(VL)간의 상관관계는 두꺼운 컬러 라인과 관련 SD를 파선블랙선으로 플롯된 선형 회귀로 표시한다. 그래프와 통계 분석은 소프트웨어로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 Athymic 마우스의 흉막 구멍에 주입된 MPM H2052/484 세포의 본래 정형화 모델과 작은 동물 PET/CT 이미징에 의한 모니터링 방법을 설명합니다. 이 모델은 적당한 동물 취급 및 수술 기술로 구현될 수 있고 아주 좋은 발달 비율을 표시합니다. 주사 후 2주 일찍 종양의 치료되지 않은 마우스 및 비침습적 세로 검출에서 약 10주 정도의 큰 실험 창을 허용한다.
정형 화 모델은 종양의 초기 환경에 직접 살아있는 세포 또는 조직의 이식에 의존. 널리 사용되는 피하 또는 복강 내 MPM 모델과 내부 복굴수 모델의 주요 차이점은 미세 환경에 있습니다. 실제로, 종양의 미세 환경은 암세포25이외에 다중 기질 세포 유형 (섬유아세포, 백혈구, 대식세포)을 포함합니다. 이 기질 세포는 종양 성장을 조절하는 종양 미세 환경에 기여하는 성장 인자와 사이토카인을 분비합니다. 종양 미세 환경은 정형외 이종이가 피하1개(25)보다치료에 다르게 반응할 것이라는 것을 시사하는 해부학적 부위에 따라 다릅니다. 따라서, 정형외 이종이식은 MPM 환자에서 발견되는 것과 유사한 미세환경으로 둘러싸여 있기 때문에, 그들의 행동 및 치료에 대한 반응은 임상 상황을 더 잘 반영해야 한다17,19.
암 연구에 있는 많은 전임상 모형은 인간 적인 이종이식 성공을 지키기 위하여 면역 결핍 마우스를 연루합니다. 누드 마우스는 성숙한 흉선(26)의중요한 부분이 부족합니다. 누드 마우스는 성숙한 흉선(thymus)을 소유하지 않고 결과적으로 T 세포에서 결핍되지만, 그들은 성숙한 림프구 B, 호중구, 단핵구 및 대식세포를 보다 관대하고 매우 결핍된 SCID마우스(26)와대조적으로 흉막 미세환경으로 제시한다. MPM 개발의 초기 단계에서, 조절 T 세포는 중요한 억제 역할을 갖는다. 그러나, 더 진보된 단계에서, 호중구 및 대식세포를 포함하는 골수성 세포는 Treg 세포를 대체합니다; 이 기능에서, 조절 T 세포의 억제 역할은 MPM 발달23,27의초기 단계에서만 중요하다. 따라서, 완전한 면역 반응을 관련시키는 연구 결과 (예를 들면, T 반응을 관련시키는 면역 요법)는 여기에서 제시된 모형에서 공부될 수 없더라도, 우리는 이 직교 모형이 MPM의 새로운 처리 또는 새로운 진단 공구를 평가하기 위하여 모든 관심을 유지한다는 것을 가설합니다.
방법론적 관점에서, 인트랩 내 MPM 종양의 발달을 최대화하기 위해 명심해야 할 중요한 단계가 있다. 마우스 모델을 확립하기 전에 기하급수적으로 성장하는 세포(세포주에 따라 80% 이하의 동률)와 8~10개월 의 적응된 마우스에 접근할 수 있습니다. 실제로, 젊은 작은 마우스를 주입 하는 것은 어렵고 자 궁 성 주사 귀 착될 수 있고 생존을 변경. 이식 절차 도중, 표준 수술 예방 조치를 취해야 하고, 무딘 가위는 동물의 죽음으로 이끌어 낼 수 있는 출혈을 피하기 위하여 절개할 때 특히 이용되어야 합니다. 여기서 제시된 주사기(예를 들어, 여기에 설명된 모델)와 프로토콜의 선택은 종양 세포를 포함하는 소량의 소량의 정확하고 부드러운 주입을 허용하여 내림두부주 주입(30° 각도, 2-3 mm 깊이)을 보장한다.
정형외 MPM 모델의 종방향 모니터링은 이미징 기술에 의해서만 비침습적으로 수행될 수 있습니다. PET/CT는 MPM을 진단하기 위한 임상 실습에서 권장되는 방법이며, 결과적으로 이 연구에서20,21에사용되었습니다. 널리 사용되는 광학 이미징에 비해 PET/CT 이미징은 방사성 화합물의 사용을 수반하므로 안전성, 방사성 추적기의 물류 및 비용28로인해 설치에 더 섬세합니다. 그럼에도 불구하고, PET/CT 화상 진찰은 종양 세포의 유전 수정에 의존하지 않으며 고해상도 단층 촬영, 해부학 및 분자 정보를 제공합니다. 광학 화상 진찰은 또한 PET/CT 보다는 더 단단 그러나 이 문서에 제시된 화상 진찰 시스템은 3 마우스 침대를 관련시키고 대략 20 마우스는 수집된 정보를 고려하여 적당한 처리량인 매일 스캔될 수 있습니다. 고가용성 임상 방사선 추적기[18F]FDG의 사용은 이 기술로 수행된 연구에 높은 번역력을 보증한다29. 비록[18F]FDG-PET 스캔 판독 및 분석 때문에 주변 심장과 갈색 지방 조직에 높은 섭취 의 일부 경험을 필요로 할 수 있습니다, CT와의 조합은 진단을 정제. [18F]FDG PET/CT 실험 동안, 금식 및 온난화 마우스뿐만 아니라 1h의[18F]FDG의 섭취 시간을 수행할 뿐만 아니라 스캔 조건이 매우 영향을 미치는 PET 대조를 이미 설명한 바와 같이 종양의 시각화를 크게 향상시킬 수 있다24. [18F]플루오로티미딘(FLT) 또는[18F]플루오로미다졸(FMISO)과같이 임상적으로 사용되는 다른 방사성 추적기를 포함하는 전임상 정형외 모델에 대한 추가 연구는 각각 증식 및 저산소증을 모니터링하는, 이러한 신뢰할 수 있는 정형토토피토피론 MPM 모델29에대한 자세한 정보를 제공할 수 있었다.
마지막으로, 비침습적 이미징과 결합된 이러한 관련 번역 모델은 3R 개념과 완벽하게 일치한다: R은 동물의 수를 에두프, Refine은 통증과 불편함을 감소시키고 R eplace동물 실험을대안22로실험한다. 실제로, 동물의 동일한 세트 내에서, 치료 후속 및 반응은 실험 을 통해 세로 측정을 허용 비 침습적으로 모니터링 할 수 있습니다, 따라서 실험 당 필요한 동물의 수를 감소. 더욱이, 각 동물은 시간이 지남에 따라 자체 적인 제어를 나타내므로, 비침습적 이미징또한 통계적 힘을 크게 증가시켜 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 필요한 동물의 수를 감소시킵니다16.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 리그 제네보이스 콘트레 르 암 (V.S.-B.) 및 제네바와 로잔의 대학 및 병원의 생물 의학 이미징 센터 (CIBM)에 의해 투자되었다 (D.J.C., O.B. 및 S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
- Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
- Mossman, B. T., Gee, J. B.
- Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
- Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
- LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
- Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
- Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
- Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
- Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
- Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
- Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A.
- Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
- Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
- Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
- Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
- de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
- Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
- Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
- Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
- Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
- Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
- Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).
