Summary
肌细胞是增殖前体细胞，分化形成多核肌管，并最终骨骼肌肌纤维。在这里，我们提出了一个协议，从年轻的成年小鼠骨骼肌肉有效隔离和培养原发性肌体。该方法支持对培养中的肌肉细胞进行分子、遗传和代谢研究。
Abstract
原发性肌体是骨骼肌的无差别增殖前体。它们可以作为肌肉前体培养和研究，或诱导分化到肌肉发育的后期阶段。此处提供的协议描述了一种强大的方法，用于从年轻的成年小鼠骨骼肌外植体中分离和培养高度增殖的肌细胞群。这些细胞可用于研究不同小鼠模型骨骼肌的代谢特性，以及其他下游应用，如外源DNA转染或病毒表达载体转导。这些细胞的分化水平和代谢特征取决于暴露的长度，以及用于诱导月细胞分化的介质的组成。这些方法为研究小鼠肌肉细胞外体代谢提供了强有力的系统。重要的是，与体内模型不同，本文描述的方法提供了一个细胞群，可以扩展和研究具有高重复性。
Introduction
虽然经常被引证为整体代谢健康的指示，但多项研究表明，老年人的身体质量指数（BMI）与较高的死亡率风险并不一致。迄今为止，唯一与降低这一种群死亡率相一致的因素是增加肌肉质量1。肌肉组织是体内胰岛素敏感细胞的最大来源之一，因此对维持整体代谢平衡至关重要。通过运动激活骨骼肌组织与增加局部胰岛素敏感性和整体代谢健康3相关。虽然体内模型对于研究肌肉生理学和肌肉功能对综合代谢的影响至关重要，但肌管的主要培养物提供了一个可处理的系统，可降低动物研究的复杂性。
从产后肌肉衍生的肌末代酶可用于以高度可重复的方式研究多种治疗和生长条件的影响。这早已得到承认，几种方法的月经隔离和文化已经描述了4，5，6，7，8，9。其中一些方法使用新生儿肌肉，产生相对较少的肌体5，8，需要几种动物进行更大规模的研究。此外，大多数广泛使用的培养霉细胞的方法使用"预镀"来丰富于于其他细胞类型粘附性较差的细胞。我们发现这里描述的替代富集方法对于丰富高度增殖的美洲人群体更有效和可重复。总之，该协议允许从年轻的成人肌肉外植分离高增殖性肌体，通过生长到培养培养。月子可以反复收获，在几天内，迅速扩大，并诱导分化成近管。该协议可重复产生大量健康的肌细胞，这些细胞会强力分化成自发抽搐肌细胞。它使我们能够研究各种基因型小鼠的原发性月管的代谢和昼夜节律。最后，我们采用96孔板中耗氧率的测量方法，为氧化代谢研究制备肌管。
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Protocol
该协议遵循斯克里普斯研究的动物护理指南。
1. 肌肉组织外泄的收集和处理
- 解剖前一天，对所有解剖设备（钳子、剃须刀和剪刀）进行消毒，并准备所有必需的介质：磷酸盐缓冲盐水（PBS）、甲基溴电镀介质（DMEM 12.5 mL、HAMS F12 12 12.12 mL、20 mL 热灭活胎牛血清 （FBS）， 5 mL 羊水介质补充剂） 和涂层溶液 （24 mL DMEM， 24 mL HAMS F12， 1.7 mL 胶原蛋白， 1 mL 母体凝胶）.
- 解剖当天，为要解剖的每个肌肉涂上一个6厘米的碟子。"在每个板的表面加入2 mL的涂层溶液，轻轻摇动，在表面形成均匀的涂层，并在4°C下用溶液孵育板1小时。
- 从板中取出涂层溶液，然后返回库存解决方案。
注：涂层溶液可重复使用长达六个月，应储存在4°C。 - 用2 mL的PBS冲洗板两次，以去除未结合的胶原蛋白和母蛋白。
- 在解剖过程中，将板放在37°C组织培养箱中。
- 将 2-3 张厚吸水纸放入塑料袋或无菌 15 厘米的盘子中，并使用移液器用无菌水将纸张表面弄湿，从而准备湿室。
- 将腔室置于紫外线下 5 分钟进行消毒。
- 从4到8周大的老鼠中切除所需的肌肉。要对肌肉组织进行消毒，在含有40μg/mL的温霉菌的PBS中轻轻冲洗。
注：对于四头肌和胃肠肌肉，每盘板一个肌肉。对于鞋底，植物和EDL，结合两条腿的肌肉在一个盘子里。 - 使用无菌钳将肌肉转移到无菌的 10 厘米非涂层培养皿中。在肌肉上添加0.5-1.0 mL的电镀介质，使组织湿润但不漂浮（图1A）。
- 使用无菌手术刀或剃刀刀片轻轻地将肌肉切成小碎片（约1-3毫米3）。
注：重要的是要尽量减少处理肌肉组织，以获得最佳效果。 - 使用钳子或移液器将肌肉碎片转移到预涂覆的 6 厘米板的表面。非常轻轻地覆盖额外的0.8 mL的电镀介质在组织上。应该有足够的介质来保持组织块的水分，而不是浮动 （图1B）。
- 将含有肌肉碎片的6厘米盘子放入潮湿室内，并返回到孵化器（37°C，5%CO2）48小时（图1C）。
注：至关重要的是，肌肉碎片坚持在板的表面，允许肌末体生长。请勿移动板/室至少 48 小时。 - 48小时后，仔细检查板，以确保肌肉碎片粘附。覆盖2 mL的电镀介质，注意不要移开碎片。
注：如果板上有明显污染或碎屑，请小心清洗肌肉块。板 2 mL 的 PBS/gentamicin 溶液在板的边缘，并轻轻笔尖在肌肉组织上冲洗。拆下 PBS 并重复洗涤步骤。第二次清洗后，覆盖 2 mL 的电镀介质。 - 在收获霉杆菌之前，将板保持在37°C培养箱中，最多3天（从原始解剖开始5天）。每隔一天检查一次，了解有其功能性生长。
注：从肌肉外植株中产生的细胞的出现将是可变的和异质的。原发性细胞以小细胞、圆形细胞和亮细胞出现。然而，在这个阶段，通过它们的外观来识别它们既不必要，也不可靠（图2）。
2. 收获生长的二代
- 准备和预加热的Myoblast介质（17.5 mL的DMEM，17.5 mL的HAMS F12，10mL的FBS，5mL的羊水介质补充剂），胰蛋白酶，和PBS/gentamicin。涂覆一个 T25 烧瓶每个肌肉组正在收获与涂层解决方案和步骤 1.2 中所述（见表 1）。
- 去除电镀介质，用 2 mL 的 PBS/gentamicin 轻轻冲洗肌肉外部。快速取出 PBS（一次冲洗一个板，不要让板位于 PBS 中此步骤）。
- 轻轻加入1 mL的PBS/gentamicin，并将板放入37°C培养箱中1分钟。
- 使用 P1000 移液器在 15 mL 离心管中收集 PBS/细胞。
- 将1mL的胰蛋白酶加入板中，返回37°C培养箱3分钟。 轻轻敲击板以去除肌体。收集胰蛋白酶/细胞，并与PBS集合结合。将 8 mL 的 Myoblast 介质添加到离心管中，然后轻轻反转以混合。
- 轻轻地在肌肉板上覆盖 2 mL 的电镀溶液，并返回到 37°C 培养箱。
- 在200 x g下旋转离心机管，在离心机中旋转含有细胞3分钟。
- 吸气上清液至+1 mL，小心避免细胞颗粒。轻轻加入Myoblast介质（见表1），并将细胞转移到预涂覆的烧瓶中，并放置在37°C培养箱中。这是P0收获。如果在显微镜下观察，细胞可能非常少（图3）。
- 每隔一天重复上述收获，最多三次。第三次收获后，丢弃植物。
3. 增殖的二代细菌的扩展和丰富
注：P0收获将是异构的（+60%的异体体）。接下来的2个段落使用PBS选择性地收获myoblast。许多更粘附的细胞将被抛在后面，迅速增殖的细胞在2个通道内纯度为+95%。一旦建立近子，它们应保持在低密度，以避免自发分化。
- 对于第 2 节中每个 T25 烧瓶的 ±40-50% 汇入电池，涂覆一个 T75 烧瓶，涂上 5 mL 的涂层溶液，并在 4°C 下放置 1-4 小时。
- 从烧瓶中取出涂层溶液，然后返回库存溶液。用2 mL的PBS/gentamicin冲洗烧瓶两次，并放置在37°C培养箱中。
- 从 P0 吸气杆菌 T25 烧瓶中吸出介质。用2 mL的温热PBS/gentamicin短暂冲洗细胞。从烧瓶中吸出PBS。
注：此步骤 （3.3） 的目的是减少细菌污染的可能性。如果执行快速和轻轻地，它不应该导致失去的异位。如果需要，可以省略它以最大化近地巴保存。 - 将2 mL的暖PBS（不是胰蛋白酶）移液器放入每个含有肌布的烧瓶中。将带有 PBS 的烧瓶放入 37°C 培养箱中 3 分钟。
注：与PBS一起，除肖器应很容易从烧瓶中分离出来。在此步骤中使用PBS而不是胰蛋白酶对于减少肌细胞群与其他细胞类型的污染至关重要。 - 从 37°C 培养箱中取出细胞，并牢牢敲打烧瓶的一侧以排出细胞。在光学显微镜下检查自由漂浮的布有无忘。
- 将烧瓶直立放在组织培养罩中，用 10 mL 的 Myoblast 介质冲洗瓶底 2-3 次，以确保所有细胞都脱落。
- 在 15 mL 离心管中收集细胞/介质混合物。在200 x g下离心3分钟。
- 将介质吸至约1 mL，小心避免细胞颗粒。轻轻地将适量的Myoblast介质加入离心管，然后轻轻混合。
- 将细胞混合物分配到新的T75烧瓶中。在每个新的 T75 烧瓶中添加 10 mL 的 Myoblast 介质。轻轻水平摇动烧瓶，将细胞分布在37°C培养箱中过夜。
- 两天后，再次通过PBS，将每个T75瓶分成三个T75瓶。
注：不要让霉杆菌变成超过50%-60%的康体，因为这将导致它们开始区分，失去亲脂能力。 - 对于其他段落，请使用胰蛋白酶。通过两次与PBS收益率 >95% 的球基器;试图进一步提高纯度往往导致较差的分化。
4. 原微量骨与近管的分化
- 镀层板 P2（或更高版本）在涂层板上的 Myoblast 介质中的表 P2（或更高版本）的表（参见表 1，了解建议的涂层和电镀体积和电池数量）。两三天后，当细胞在70-80%的汇合时，将介质更改为分化介质（24 mL的DMEM，24 mL的HAMS F12，1.5 mL的热灭活马血清，0.5 mL的胰岛素-硒-转移素）。
- 在将原发性月月管分化到近管期间，每隔一天改变分化介质。分化通常在第4-5天完成，并将由自发抽搐的隆长融合细胞标记。在6天内对差异化的月管进行实验。通常细胞在开始分化后五到六天被测定。
5. 测量96孔板中近型或微管的耗氧率
- 涂装 96 孔板，每孔涂层溶液为 25 μL。将板在 58 x g下离心 1 分钟，以去除任何气泡。
- 在 4°C 下在涂层溶液中孵育板 1-4 小时。使用多通道移液器去除涂层溶液，在 25 μL 冷 PBS/gentamicin 中洗涤三次。离心机至少其中一个这些软管，以确保没有气泡被困。
- 在每个井中添加 40 μL 的分化介质。在 58 x g下将无细胞的涂层板上的介质离心 1 分钟，以避免气泡并消除表面张力，以获得均匀的介质层。
- 将悬浮在另外40μL介质中的细胞添加到每个井中。在 58 x g下再次旋转。
注：电镀的一致性对于获得最佳结果非常重要，每口孔的镀层细胞数量应针对每个实验设置进行优化，并且可能在 96 孔板的每孔微分介质中镀有 ±10，000-25，000 的表细胞。 - 在分化期间，每天轻轻更换介质。不要吸气介质，而要用移液器将其取出，留下少量的体积，以避免将细胞移开或将其暴露在空气中。例如，一次更换 50 μL，重复三次，而不是一次更换全部 80 μL。
- 每个条件使用 8-15 口井。如果细胞不形成一个均匀的月管层，可能有必要省略一些井。
注：在板的边缘省略井，因为它们极易蒸发。改变实验复制的板设置，以避免系统错误。 - 在完全分化后的1-2天内对差异化的异位胎执行所需的测定（从分化开始开始第4-6天）。用于测量耗氧率的推荐仪器和试剂列在材料表中。
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Representative Results
按照所提供的协议第 1 节，应产生从植物外部产生的原细胞，这些细胞将在标准光显微镜下可见（图 2）。异质细胞群将生长在除外每个肌肉组织外部和周围。微球体将显示为小，圆，明亮的球体。根据协议第2节，将产生从组织外植的细胞细胞的早期收获，这将包含很少的细胞，并且将是异质的（图3）。该协议第3节描述了用PBS（而不是胰蛋白酶）进行传早收获，这将提供相对纯净的肌布组，以便进一步培养。遵循协议第4节将产生完全分化的月管，用于进一步的实验操作。肌细胞的分化通常需要4-6天，在此期间，细胞的形态将从单一的圆形球体变为细长、熔融、多核化纤维（图4）。根据协议第5节，将在96孔板中产生分化的电管，以便根据耗氧量的变化和细胞外酸化率10（图5）实现各种代谢表征。
图1：四头肌的解剖和处理。（A） 在转移到10厘米的菜盘之前，已经新鲜解剖并用PBS冲洗的四头肌。1 mL 的电镀介质已覆盖以进行处理。（B） 四头肌组织片后转移到预涂6厘米板。（C） 在37°C培养箱中放置之前，在潮湿室内放置6厘米板。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：出月性人。从四头肌外植的肌分量生长。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：早期通过性百岁。P0 转印后与 T25 烧瓶连接后， P0 功能。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：原胎电镀和分化。（A） 在开始接触分化介质后一天，会形成一种功能。（B，C）在开始分化后五 （B） 或六 （C） 天分化的月管.请点击此处查看此图的较大版本。
图5：用于测量耗氧率的电管。完全分化的月管在96孔细胞培养微孔板的每个孔中电镀20，000个细胞细胞后五天。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
骨骼肌对于建立和维护代谢平衡11至关重要。肌肉生理学的研究因个体间变异性以及获取样本的困难而变得复杂，特别是在人类研究中。培养的原发性肌管已被证明可以重述肌肉生理学的许多特征，包括钙平衡12、受损肌肉组织的再生5、对运动13的代谢改变，糖尿病等疾病引起的新陈代谢的改变。小鼠的肌细胞和肌管的主要培养能够研究含有明确基因操作的肌肉细胞，并为从人类肌肉活检中衍生的肌管研究提供补充12，15 ， 16.因此，小鼠原发性肌细胞和肌管的分离和培养方法对于实现肌肉细胞功能外体可重复的高通量调查至关重要。此处描述的协议允许在各种实验操作下建立和研究原原小鼠异位动物和近管。
虽然以前的协议描述了肌肉干细胞从外植培养物的分离，但该协议为成功分离肌细胞从多种不同类型的肌肉组织提供了一种方法。此外，这种方法产生大量干细胞，用于进一步的实验操作。此外，这种方法已被验证为产生分化肌管，表达成熟肌肉细胞17的标记，并表现出正常的生理，如昼夜节律17和mitogen激活蛋白激酶（MAPK）信号转导18.
协议的关键步骤是解剖和处理肌肉组织外植，以及避免收获之间的污染。应注意避免组织过度处理。虽然较小的肌肉块产生更多的肌细胞，但过度切割肌肉可以防止干细胞外生长。虽然一旦被镀出外植株，不要将其除去，但用PBS/gentamicin仔细清洗板材对于减少污染至关重要。收获的月子细胞可冷冻为P2细胞在冷冻使用10%DMSO/90%的Myoblast介质混合物。虽然月基于流细胞不需要维持在高密度，以促进生长，但建议在40-50%的汇合处冷冻细胞。通常，一个T75烧瓶产生4个细胞的冷冻。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
作者感谢墨尔本大学的马修·瓦特博士和约翰霍普金斯大学的阿纳斯塔西娅·克拉利博士，他们根据莫克贝尔等人6号的工作，协助采纳这一协议。我们还感谢萨宾·乔丹博士协助在我们的实验室中制定和通过这一议定书。这项工作由美国国家卫生研究院R01s DK097164和DK112927资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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