Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett robust protokoll för att kvantifiera 40 föreningar som är involverade i Central kol-och energimetabolism i cell fria proteinsyntes reaktioner. Den cell fria syntes blandningen är derivatiserad med anilin för effektiv separation med hjälp av omvänd fas vätskekromatografi och sedan kvantifieras med masspektrometri med isotopiskt märkta interna standarder.

Abstract

Cell fri proteinsyntes (CFPS) är en framväxande teknik i system och syntetisk biologi för in vitro-produktion av proteiner. Men om CFPS kommer att gå bortom laboratoriet och bli en utbredd och standard just i tid tillverkningsteknik, måste vi förstå Prestandagränser för dessa system. Mot denna fråga utvecklade vi ett robust protokoll för att kvantifiera 40 föreningar som deltar i glykolys, pentos fosfat vägen, trikarboxylsyra cykeln, energimetabolism och kofaktor förnyelse i CFPS reaktioner. Metoden använder interna standarder märkta med 13c-Aniline, medan föreningar i provet är derivatized med 12c-anilin. De interna standarderna och provet blandades och analyserades av omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri (LC/MS). Co-elueringen av föreningar elimineras Jon dämpning, vilket möjliggör korrekt kvantifiering av metabolitkoncentrationer över 2-3 storleksordningar där den genomsnittliga korrelationskoefficienten var 0,988. Fem av de 40 föreningarna var omärkta med anilin, men de upptäcktes fortfarande i CFPS provet och kvantifierades med en standardkurva metod. Den kromatografiska körningen tar ca 10 min att färdigställa. Sammantaget har vi utvecklat en snabb, robust metod för att separera och korrekt kvantifiera 40 föreningar inblandade i CFPS i en enda LC/MS Run. Metoden är en heltäckande och noggrann metod för att karakterisera cellfri metabolism, så att vi i slutändan kan förstå och förbättra utbytet, produktiviteten och energieffektiviteten i cell fria system.

Introduction

Cell fri proteinsyntes (CFPS) är en lovande plattform för tillverkning av proteiner och kemikalier, en applikation som traditionellt har reserverats för levande celler. Cell-fria system härrör från rå cell extrakt och eliminera komplikationer i samband med celltillväxt1. Dessutom möjliggör CFPS direkttillgång till metaboliter och biosyntetiska maskiner utan inblandning av en cellvägg. Men en grundläggande förståelse för Prestandagränser för cell-fria processer har saknats. Metoder med högt dataflöde för kvantifiering av metaboliten är värdefulla för karakterisering av metabolism och är avgörande för byggandet av metaboliska beräkningsmodeller2,3,4. Vanliga metoder som används för att bestämma metabolismkoncentrationer inkluderar kärnmagnetisk resonans (NMR), Fouriertransform-infraröd spektroskopi (ft-IR), enzymbaserade analyser och masspektrometri (MS)5,6,7 ,8. Emellertid, dessa metoder är ofta begränsade av deras oförmåga att effektivt mäta flera föreningar på en gång och kräver ofta en urvalsstorlek större än typiska cell fria reaktioner. Till exempel kan enzym-baserade analyser ofta endast användas för att kvantifiera en enda förening i en körning, och är begränsade när Urvalsstorleken är liten, till exempel i cell fria proteinsyntes reaktioner (vanligtvis körs på en 10-15 μL skala). Samtidigt kräver NMR ett högt överflöd av metaboliter för detektion och kvantifiering5.  Mot dessa brister ger kromatografimetoder tillsammans med masspektrometri (LC/MS) flera fördelar, bland annat hög känslighet och förmåga att mäta flera arter samtidigt9; den analytiska komplexiteten ökar dock avsevärt med antalet och mångfalden av de arter som mäts. Det är därför viktigt att utveckla metoder som till fullo inser potentialen för hög kapacitet i LC/MS-system. Föreningar i ett prov separeras med vätskekromatografi och identifieras genom masspektrometri. Signalen av föreningen beror på dess koncentration och jonisering effektivitet, där jonisering kan variera mellan föreningar och kan också bero på provet matrisen.

Att uppnå samma joniseringseffektivitet mellan provet och standarderna är en utmaning när man använder LC/MS för att kvantifiera analyter. Ytterligare, kvantifiering blir mer utmanande med metabolit mångfald på grund av signal uppdelning och heterogenitet i Proton samhörighet och polaritet10. Slutligen kan Co-eluting matris av provet också påverka jonisering effektivitetsvinster av föreningarna. För att lösa dessa problem, metaboliter kan vara kemiskt derivatized, öka separation upplösning och känslighet av LC/MS-system, samtidigt minska signalen uppdelning i vissa fall10,11. Kemisk derivatisering fungerar genom att tagga specifika funktionella grupper av metaboliter för att justera deras fysiska egenskaper som laddning eller vattenavvisande egenskaper att öka jonisering effektivitet11. Olika märknings agenter kan användas för att rikta olika funktionella grupper (t. ex. aminer, hydroxyls, fosfater, karboxylsyror, etc.). Aniline, en sådan derivatisering agent, riktar flera funktionella grupper på en gång, och lägger till en hydrofoba komponent i hydrofila molekyler, vilket ökar deras separation upplösning och signal12. För att ta itu med co-eluting Matrix Ion suppression effekt, Yang och medarbetare utvecklat en teknik som bygger på gruppspecifika intern standard Technology (gsist) märkning där standarder är märkta med 13C anilin isotoper och blandas med provet 12,13. Metaboliten och motsvarande interna standard har samma joniseringseffektivitet eftersom de Co-elute, och deras intensitet förhållandet kan användas för att kvantifiera koncentrationen i det experimentella provet.

I denna studie, vi utvecklat ett protokoll för att upptäcka och kvantifiera 40 föreningar som deltar i glykolys, den pentos fosfat vägen, den trikarboxylsyracykeln Acid cykel, energimetabolism och kofaktor förnyelse i CFPS reaktioner. Metoden bygger på GSIST-metoden, där vi använde 12c-anilin och 13c-anilin för att tagga, detektera och kvantifiera metaboliter med hjälp av omvänd fas LC/MS. Det linjära sortimentet av alla föreningar sträckte 2-3 storleksordningar med en genomsnittlig korrelationskoefficient på 0,988. Således är metoden en robust och noggrann metod för att förhöra cellfri metabolism, och möjligen hel cells extrakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av reagenser för anilin märkning

  1. Bered en 6 M anilin lösning vid pH 4,5. Arbeta i en huva, kombinera 550 μL anilin med 337,5 μL av LCMS grade vatten och 112,5 μL av 12 M saltsyra (HCl) i ett centrifugeringsrör. Vortex brunn och förvara vid 4 ° c.
    Obs: anilin kan förvaras vid 4 ° c i 2 månader.
    FÖRSIKTIGHET: anilin är mycket giftigt och bör arbetas med i en draghuv. Saltsyra är mycket frätande
  2. Bered en 6 M 13C anilin lösning vid pH 4,5. Kombinera 250 mg 13C6-anilin med 132 μL vatten och 44 μl av 12 M HCl. Vortex väl och förvara vid 4 ° c.
  3. Bered 200 mg/mL N-(3-dimetylaminopropyl)-N-etylcarbodiimidhydroklorid (EDC) lösning. Lös 2 mg EDC i 10 μL vatten för varje prov som ska märkas och vortexta väl.
    Anmärkning: EDC lösning bör förberedas samma dag som reaktionen. EDC fungerar som en katalysator för derivatisering av föreningar med anilin12.

2. utarbetande av standarder

  1. Gör separata lagerlösningar av alla föreningar lösta i LC/MS grade vatten (tabell 1).
  2. Beredning av intern standard stamlösning
    1. Kombinera alla föreningar utom nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD), nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP), Flavin-adenin-dinukleotid (FAD), acetyl-coenzym A (ACA) och glycerol 3-fosfat (Gly3P), med lämpliga volymer för att skapa en 2 mM lagerlösning av alla föreningar.
  3. Kombinera NAD, NADP, FAD, ACA och Gly3P med lämpliga volymer för att skapa en 2 mM stamlösning.

3. beredning av provet (figur 1)

  1. Släcka och fälla ut proteinerna i en cellfri proteinsyntes reaktion genom att tillföra en lika mängd iskall 100% etanol till reaktionen. Centrifugera provet på 12 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt centrifugeringsrör.
    Anm.: prover kan förvaras vid-80 ° c vid denna tidpunkt och analyseras vid ett senare tillfälle

4. märkning reaktion

  1. Märkning prov med 12C-Aniline lösning
    1. Överför 6 μL prov till ett nytt centrifugeringsrör och flytta volymen till 50 μL med vatten.
      Obs: volym provstorleken kan bero på den specifika CFPS-reaktionen.
    2. Tillsätt 5 μL 200 mg/mL EDC-lösning.
    3. Tillsätt 5 μL 12C-anilin-lösning.
      Obs: anilin-lösningen skiljs åt i två faser. Blanda väl innan du lägger till reaktionen.
    4. Vortex reaktionen med skonsam skakning för 2 h vid rumstemperatur.
    5. Efter 2 h, ta bort rören från skakapparaten och tillsätt 1,5 μL trietylamin (te) till reaktionen i en draghuv.
      Anmärkning: trietylamin höjer pH i lösningen som stoppar anilin taggning reaktion och stabiliserar föreningarna.
      FÖRSIKTIGHET: trietylamin är giftigt och orsakar irritation i ögon och andningsvägar.
    6. Centrifugera vid 13 500 x g i 3 min.
  2. Märkning interna standarder med 13C-Aniline lösning
    1. Späd den interna stamlösningen till 80 μM med en slutlig volym på 50 μL.
      Anmärkning: koncentrationen av interna standarder kan justeras till nivåer nära det experimentella provet.
    2. Tillsätt 5 μL 200 mg/mL EDC-lösning.
    3. Tillsätt 5 μL 13C-anilin-lösning.
    4. Vortex reaktionen med skonsam skakning för 2 h vid rumstemperatur.
    5. Efter 2 h, ta bort rören från skakapparaten och tillsätt 1,5 μL te till reaktionen i ett draghuv.
    6. Centrifugera vid 13 500 x g i 3 min.
  3. Kombinera taggade interna standard och märkta Sample
    1. Blanda 25 μL av 12c-anilin märkt prov med 25 μl 13c-anilin märkt standard.
    2. Överför till en injektionsflaska med automatisk sampler och analysera enligt LC/MS-proceduren.
  4. Skapa en standardkurva för otaggade metaboliter
    1. Späd stamlösning av otaggade metaboliter (NAD, NADP, FAD, ACA och Gly3P) till slutliga koncentrationer på 320 μM, 80 μM, 20 μM och 5 μM med en volym på 50 μL.
    2. Tillsätt 5 μL 200 mg/mL EDC-lösning.
    3. Tillsätt 5 μL 12C-anilin-lösning.
    4. Vortex reaktionen med skonsam skakning för 2 h vid rumstemperatur.
    5. Efter 2 h, ta bort rören från skakapparaten och tillsätt 1,5 μL te till reaktionen i ett draghuv.
    6. Centrifugera vid 13 500 x g i 3 min.
    7. Överför supernatanten till en auto-sampler injektionsflaska och analysera genom LC/MS-proceduren.
      Anmärkning: de otaggade metaboliterna följer samma procedur som exemplet för att replikera prov matrisen för att bibehålla liknande joniseringseffektivitet.

5. inställning av LC/MS-procedur

  1. Beredning av lösningsmedel
    1. Bered 5 mM Tri-BUTYLAMIN (TBA) vattenlösning justerad till pH 4,75 med ättiksyra.
      Obs: TBA i den mobila fasen hjälper analyterna uppnå god upplösning och separation14.
    2. Bered 5 mM TBA i acetonitril (ACN).
    3. Förbered tvättvätskan med 5% vatten och 95% ACN.
    4. Förbered PURGE lösningsmedel med 95% vatten och 5% ACN.
  2. Inställning av MS-villkor
    1. Ställ in masspektrometern till negativ jon läge med en sond temperatur på 520 ° c, negativ kapillärspänning på-0,8 kV, positiv kapillärspänning på 0,8 kV, och Ställ in programvaran för att förvärva data vid 5 Poäng/s.
    2. Ställ in valda Jon inspelningar (SIR) för varje metabolit med specificerade kon spänningar och massa över laddning (m/z) värden. Se tabell 1.
  3. Initiering av LC/MS enligt tillverkarens anvisningar
    1. Prime lösningsmedel linjer i lösningsmedels hanteraren för 3 min.
    2. Prime Wash lösningsmedel (5% vatten, 95% ACN) och PURGE lösningsmedel (95% vatten, 5% ACN) för 15 s i 5 cykler.
    3. Ställ in prov hanteraren på 10 ° c.
    4. Installera en C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 150MM) kolumn och initiera kolumn med 100% ACN på 0,3 mL/min i 10 min.
    5. Villkora kolonnen på 95% vatten och 5% ACN på 0,3 mL/min i 10 min innan du introducerar lösningsmedel med buffertar.
    6. Villkora kolonnen på 95% spädningsvätska A (5mM TBA aqueous, pH 4,75) och 5% spädningsvätska B (5 mM TBA i ACN) på 0,3 mL/min för 10 min.
    7. Ställ in ett övertoningsprotokoll med elueringen från och med 95% spädningsvätska A och 5% spädningsvätska B, upphöjt till 70% spädningsvätska B i 10 min, upphöjd till 100% spädningsvätska B i 2 min och hålls på 100% spädningsvätska B i 3 min. återgång till initial betingelser (95% spädningsvätska A , 5% spädningsvätska B) under 1 min och håll i 9 min för att åter equilibrate kolonnen.
    8. Villkora kolonnen med gradientprotokollet 3 gånger före eventuella injektioner på kolonnen.
  4. Injicera prov och standarder
    1. Injicera 5 μL av provet i kolonnen och skaffa lämpliga m/z-jonintensiteter för det 12C-anilin-märkta provet.
    2. Injicera 5 μL av samma prov igen, men denna gång förvärva m/z Ion intensiteter för 13C-anilin märkta standarder.
      Obs: vårt LC/MS-system kan inte förvärva både 12c och 13c m/z-INTENSITETER vid angivna Sir tidsfönster, eftersom det är för mycket data att förvärva i den angivna tidsfönstret. Därför injicerar vi samma prov två gånger.
    3. Injicera otaggade metabolit standarder från lägsta koncentration till högsta och registrera lämpliga m/z-jonintensiteter.

6. kvantifiering

  1. Skapa export metod
    1. I datainsamlingsprogram väljer du arkiv ≫ ny metod ≫ export metod.
    2. Ange ett filnamn, till exempel AnilineTagging_Date.
    3. Kontrollera export ASCII -filen och välj en katalog för att exportera textfilen till.
    4. I rapporttypväljer du Sammanfattning av alla.
    5. I avgränsare, för kolumn Välj a ,. För radväljer du [CR] [IF].
    6. I tabellväljer du Exportera och sedan Redigera tabell för att inkludera samplename, område, höjd, belopp och enheter.
    7. Spara exportmetod.
  2. Kvantifiera metaboliter med interna standarder med hjälp av datainsamlingsprogram
    1. Under fliken exempel uppsättningar högerklickar du på motsvarande LC/MS Run och väljer Visa som > kanaler.
    2. Välj alla SIR kanaler för 13C-Aniline interna standarder för en injektion, högerklicka och välj Granska.
    3. Om fönstret LC bearbetningsmetod layout inte visas automatiskt går du till Visa ≫ bearbetnings metodens layout.
    4. I bearbetning metod layout, gå till fliken integration och ange apextrack som algoritmen.
    5. Gå till fliken utjämning och ange typ till medelvärde och utjämningsnivå till 13.
      Alla utjämningsnivån kan väljas så länge de är konsekventa i alla exempel.
    6. På fliken MS Channel inaktiverar du MS 3D - bearbetning.
    7. I SIR-kanalfönstret integrerar du varje topp, en kanal i taget. När en topp är integrerad, gå till alternativ ≫ Fyll från resultatet och detaljerna i toppen kommer att fyllas i fliken komponenter . ändra topp namnet till motsvarande sammansatta namn.
    8. När alla SIR-kanalerna har utvärderats sparar du bearbetningsmetoden och stänger fönstret.
    9. Välj alla SIR kanaler av 13c-Aniline och 12c-Aniline taggade provet, högerklicka och välj process.
    10. Markera rutan process , Välj Använd angiven bearbetningsmetodoch välj den bearbetningsmetod som just sparats. Kontrollera också Exportera rutan, Välj Använd angiven exportmetod och välj den sparade exportmetoden som skapades tidigare. Klicka på OK.
    11. Öppna den exporterade textfilen med Excel och beräkna koncentrationen av den okända föreningen med:
      Equation 1
      där Cx, i är koncentrationen av det okända provet för metabolit i, ax, i är det integrerade området av den okända metaboliten i, enStd, i är det integrerade området av den inre standarden av metaboliten i, CStd, jag är den koncentrationen av den interna standarden för metabolit i och D är utspädningsfaktorn.
  3. Kvantifiera otaggade metaboliter med standardkurva
    1. Under fliken exempel uppsättningar HÖGERKLICKAR du på motsvarande LC/MS Run och väljer Visa som > kanaler.
    2. Välj alla SIR kanaler för otaggade standarder för en injektion, högerklicka och välj Granska.
    3. Om fönstret LC bearbetningsmetod layout inte visas automatiskt går du till Visa ≫ bearbetnings metodens layout.
    4. I bearbetning metod layout, gå till fliken integration och ange apextrack som algoritmen.
    5. Gå till fliken utjämning och ange typ till medelvärde och utjämningsnivå till 13.
      Alla utjämningsnivån kan väljas så länge de är konsekventa i alla exempel.
    6. På fliken MS Channel inaktiverar du MS 3D - bearbetning.
    7. I SIR-kanalfönstret integrerar du varje topp, en kanal i taget. När en topp är integrerad, gå till alternativ ≫ Fyll från resultatet och detaljerna i toppen kommer att fyllas i fliken komponenter . ändra topp namnet till motsvarande sammansatta namn.
    8. När alla SIR-kanalerna har utvärderats sparar du bearbetningsmetoden och stänger fönstret.
    9. Under fliken exempel uppsättningar högerklickar du på prov uppsättningen och väljer Alter Sample.
    10. Välj belopp i det nya fönstret.
    11. Välj Kopiera från process Metod och välj den process metod som just sparades.
    12. Ange koncentrationen av varje metabolit för varje injektionsflaska och ange enheten som < μM för varje komponent (eller motsvarande enhet) och välj OK.
    13. Välj prov uppsättningen igen, högerklicka, Visa som ≫ kanaler.
    14. Välj alla SIR kanaler av otaggade metaboliter för standarderna, högerklicka och välj process.
    15. Markera rutan process och välj Använd angiven bearbetningsmetod. Välj lämplig bearbetningsmetod och klicka på OK.
    16. Välj SIR kanaler för alla otaggade metaboliter för proverna, högerklicka och välj process.
    17. Markera rutan process , Välj Använd angiven bearbetnings metod och välj den bearbetningsmetod som just sparades. Kontrollera också Exportera rutan, Välj Använd angiven exportmetod och välj den sparade exportmetoden som skapades tidigare. Klicka på OK.
    18. Kvantifiera otaggade metaboliter med standardkurvan och exportera resultaten till en textfil till den angivna katalogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som ett proof-of-koncept, använde vi protokollet för att kvantifiera metaboliter i en E. coli baserade CFPS system som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP).  CFPS-reaktionen (14 μL) släcktes och deproteiniserades med etanol. CFPS provet var sedan märkta med 12c-Aniline, medan standarderna var märkta med 13c-Aniline. Det taggade provet och standarderna kombinerades sedan och injicerades i LC/MS (figur 1). I protokollet upptäcktes och kvantifierades 40 metaboliter som var involverade i Central kol-och energimetabolism med hjälp av interna standarder, medan en standardkurva för 5 av de metaboliter som inte var märkta med anilin också utvecklades (figur 2). De olika metaboliter som är involverade i dessa vägar var en klass av fosforylerade sockerarter, fosfokarboxylsyror, karboxylsyra, nukleotider och kofaktorer. Derivatiseringen med anilin introducerade en hydrofobisk beståndsdelen i hydrofila molekyler som underlättade en mer effektiv separation med hjälp av omvänd fas-kromatografi12. Dessutom möjliggjorde metoden separation av strukturella isomerpar såsom glukos 6-fosfat och fruktos 6-fosfat i en enda LC/MS-körning. Varje sammansatt massa över laddning (m/z) förhållande och retentionstid identifierades före experimentet genom att injicera 1 mM av en förening i taget och jämföra massan spektrum till det tomma (tabell 1).

Detektionsgränsen och räckvidden för linearitet för alla föreningar beräknades genom att man producerade en standardkurva som varierade mellan 0,10 μM och 400 μM (tabell 2). Den genomsnittliga korrelationskoefficienten (R2) för alla föreningar var 0,988 och de flesta föreningar hade ett linjärt utbud av 3-storleksordningar. Tre föreningar hade anmärkningsvärda mättnadseffekter, speciellt alfa-ketoglutarat som hade ett linjärt intervall från 0,1 μM till 25 μM. Isocitrat och citrat hade också mättnadseffekter över 100 μM.

Figure 1
Figur 1: schematiskt arbetsflöde för anilin-märkning. Den cell-fri proteinsyntes reaktionen är extrakt och märkta med 12c-Aniline, medan en standardlager blandning är märkta med 13c-anilin. Båda blandningarna blandas sedan med en 1:1 volymetrisk ratio och analyseras av LC/MS. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: överlappade valda jonkromatogram för 40 metaboliter. Maskromatogram från en enda LC/MS-körning av en standard blandning på 40 μM av 40 metaboliter. Toppar identifierades av deras retentionstid och m/z-värden för varje förening. Fullständiga sammansatta namn och deras förkortningar listas i tabell 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Högsta antal Metabolit Förkortning KEGG ID Retentionstid (min) 12C m/z 13C m/z nonlabel m/z Cv MS arter
1 Glycerol 3-fosfat Gly3P C00093 3,85 153 10 M – H2O – H
2 Nikotinamid-adenin-dinukleotid Nad C00003 3,96 698 10 M + cl – H
3 Glukos Glc C00031 4,06 289,9 296 15 M + A + cl-H
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 5,41 364 370 10 M + A – H
5 Fruktos 6-fosfat F6P C00085 5,48 334 340 10 M + A – H
6 Guanosinmonofosfat Gmp C00144 5,57 437,05 443 10 M + A – H
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 5,58 304 310 10 M + A – H
8 Cytidin monofosfat Cmp C00055 5,59 397,09 403 10 M + A – H
9 Laktat Lac C00186 5,77 164,05 170 10 M + A – H
10 Adenosinmonofosfat Amp C00020 5,85 421,1 427,1 10 M + A – H
11 Uridin monofosfat Ump C00105 5,88 398,07 404 10 M + A – H
12 Nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat Nadp C00006 6,39 724 10 M-H2O – H
13 3-fosfoglycersyra 3PG C00197 6,63 242 248,06 15 M + A – H2O – H
14 Cytidindifosfat Cdp C00112 6,72 477 483 10 M + A – H
15 Guanosindifosfat Bnp C00035 6,87 517 523 10 M + A – H
16 Adenosindifosfat Adp C00008 6,94 501 507 10 M + A – H
17 Uridindifosfat Udp C00015 6,97 478 484 10 M + A – H
18 Flavin adenin-dinukleotid Modefluga C00016 7,03 784,15 15 M – H
19 Fruktos 1, 6-bisfoshate F16P C05378 7,1 395,95 402,1 10 M + A – H2O – H
20 Glukonat 6-fosfat 6PG C00345 7,11 425,1 437 10 M + 2A – H
21 Nikotinamid-adenin-dinukleotid reducerad Nadh C00004 7,23 633,13 639,08 10 M + A + H2O – nikotinamid – H
22 Glukos-6-fosfat G6P C00668 7,32 409,1 421,1 10 M + 2A – H
23 Ribose 5-fosfat R5P C00117 7,54 379,1 391,1 15 M + 2A – H
24 Erytrose 4-fosfat E4P C00279 7,71 348,9 361 10 M + 2A – H
25 Cytidin trifosfat Ctp C00075 7,84 557 563 5 M + A – H
26 Guanosintrifosfat Gtp C00044 7,93 597 603 5 M + A – H
27 Oxalacetat OAA C00036 7,94 281 293 25 M + 2A – H
28 Alfa-ketoglutarat Akg C00026 7,95 295 307,1 15 M + 2A – H
29 Uridin trifosfat Utp C00075 7,97 558 564 10 M + A – H
30 Adenosintrifosfat Atp C00002 8,03 581 587 15 M + A – H
31 Tenofovirdisoproxilfumarat FUM C00122 8,09 265 277,1 10 M + 2A – H
32 Pyruvat Pyr C00022 8,09 162 168 25 M + A – H
33 Malate MAL C00149 8,09 283,06 295,15 10 M + 2A – H
34 D-glyceraldehyde 3-fosfat Gap C00118 8,09 319 331,1 5 M + 2A – H
35 Acetyl-coenzym A Aca C00024 8,16 790 10 M – H2O – H
36 Nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat reducerad Nadph C00005 8,23 694,92 700,82 10 M + A – nikotinamid – H
37 Fosfoenolpyruvat Pep C00074 8,28 317 329,1 20 M + 2A – H
38 Succinat GÄST C00042 8,64 267,07 279,1 15 M + 2A – H
39 Isocitrate KOMMUNAL C00311 10,13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 Citrat Cit C00158 10,46 416,1 434,06 20 M + 3A – H

Tabell 1: identifiering och märkning resultat av metaboliter. Varje sammansatt motsvarande högsta antal, retentionstid, m/z värde för omärkta, 12c och 13c märkta, och MS arter. MS arter, en står för Aniline tagg.

Peak No. Metabolit Förkortning KEGG ID Koncentration (mM) SD (n = 3) Detektionsgräns (μM) Gräns för linjärt intervall (μM) R ^ 2
1 Glycerol 3-fosfat Gly3P C00093 0,377 0,034 0,1 400 0,995
2 Nikotinamid-adenin-dinukleotid Nad C00003 0,052 0,010 0,39 400 0,993
3 Glukos Glc C00031 0,002 0,000 0,1 400 0,997
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 0,007 0,000 0,16 400 0,988
5 Fruktos 6-fosfat F6P C00085 0,029 0,004 0,1 400 0,986
6 Guanosinmonofosfat Gmp C00144 0,007 0,001 0,39 100 0,992
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 0,035 0,002 0,39 400 0,996
8 Cytidin monofosfat Cmp C00055 0,045 0,001 0,1 100 0,992
9 Laktat Lac C00186 2,134 0,048 0,1 400 0,988
10 Adenosinmonofosfat Amp C00020 0,020 0,002 0,1 100 0,992
11 Uridin monofosfat Ump C00105 0,021 0,000 0,1 100 0,997
12 Nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat Nadp C00006 0,014 0,002 0,34 400 0,950
13 3-fosfoglycersyra 3PG C00197 6,125 0,239 0,1 100 0,996
14 Cytidindifosfat Cdp C00112 0,202 0,029 0,39 400 0,997
15 Guanosindifosfat Bnp C00035 0,146 0,027 1,5625 400 0,984
16 Adenosindifosfat Adp C00008 0,797 0,161 0,39 400 0,995
17 Uridindifosfat Udp C00015 0,212 0,036 0,39 400 0,991
18 Flavin adenin-dinukleotid Modefluga C00016 0,008 0,001 0,1 400 0,958
19 Fruktos 1, 6-bisfoshate F16P C05378 3,643 0,105 0,39 400 0,989
20 Glukonat 6-fosfat 6PG C00345 0,017 0,001 0,39 400 0,989
21 Nikotinamid-adenin-dinukleotid reducerad Nadh C00004 0,063 0,028 0,39 100 0,972
22 Glukos-6-fosfat G6P C00668 0,046 0,002 0,1 400 0,984
23 Ribose 5-fosfat R5P C00117 0,055 0,005 0,39 100 0,999
24 Erytrose 4-fosfat E4P C00279 0,038 0,007 0,39 400 0,979
25 Cytidin trifosfat Ctp C00075 0,896 0,078 6,25 100 0,998
26 Guanosintrifosfat Gtp C00044 0,870 0,109 6,25 100 0,993
27 Oxalacetat OAA C00036 0,023 0,008 0,56 400 0,997
28 Alfa-ketoglutarat Akg C00026 0,391 0,020 0,1 25 0,979
29 Uridin trifosfat Utp C00075 0,845 0,092 1,5625 400 0,998
30 Adenosintrifosfat Atp C00002 1,557 0,188 1,5625 400 0,991
31 Tenofovirdisoproxilfumarat FUM C00122 0,576 0,100 1,5625 100 0,999
32 Pyruvat Pyr C00022 5,813 0,804 0,39 400 0,993
33 Malate MAL C00149 2,548 0,269 0,1 400 0,991
34 D-glyceraldehyde 3-fosfat Gap C00118 2,194 0,367 0,1 100 0,974
35 Acetyl-coenzym A Aca C00024 0,196 0,044 0,1 100 0,991
36 Nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat reducerad Nadph C00005 0,006 0,010 0,14 100 0,990
37 Fosfoenolpyruvat Pep C00074 3,442 0,345 0,1 100 0,962
38 Succinat GÄST C00042 5,683 0,573 0,1 320 0,999
39 Isocitrate KOMMUNAL C00311 0,003 0,006 0,39 100 0,998
40 Citrat Cit C00158 0,002 0,001 0,1 100 0,981

Tabell 2: kvantifiering av metaboliten i ett representativt CFPS-prov. Koncentrationen av varje metabolit och standardavvikelsen. Detektionsgräns, rad linearitet och korrelationskoefficienten som identifierats från standardkurvor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cell fria system har ingen cellvägg, vilket innebär att det finns direkttillgång till metaboliter och biosyntetiska maskiner utan behov av komplext provberedning. Men mycket lite arbete har gjorts för att utveckla noggranna och robusta protokoll för att kvantitativt förhöra cell-Free reaktionssystem. I denna studie utvecklade vi en snabb och robust metod för att kvantifiera metaboliter i cell fria reaktionsblandningar och potentiellt i hel cells extrakt. Individuell kvantifiering av metaboliter i komplexa blandningar, såsom de som återfinns i cell fria reaktioner, eller hel cells extrakt, är utmanande av flera skäl. Centralt bland dessa skäl är kemisk mångfald. Utbudet av funktionella grupper som samtidigt förekommer i dessa blandningar (t. ex. karboxylsyror, aminer, fosfater, hydroxyler etc.) ökar avsevärt den analytiska komplexiteten. För att kringgå detta använde vi en anilin derivatisering metod i kombination med 13C interna standarder för att införa hydrofoba komponenter till metaboliten blandningar. Med den här metoden detekterade vi robust och kvantifierade 40 metaboliter i en cellfri reaktion i en enda LC/MS-körning. Protokollet taggade 35 av 40 föreningar i denna studie, medan de återstående 5 föreningarna kvantifierades med en standardkurva metod. Tidigare arbete föreslog reaktionen villkor bildade en Intramolekylär salt mellan Amin och fosfatgrupp som hämmade derivatisering12. Reaktionsbetingelser identifierades inte för samtidig derivatisering av alla 40 föreningar; det aktuella alternativet är dock kvantifiering med en standardkurva metod. Medan vi demonstrerade denna teknik i en cell-fri reaktionsblandning, det kan också sannolikt tillämpas på hela cell extrakt, således, potentiellt möjliggör en absolut kvantifiering av intracellulära metaboliter koncentrationer. Den sistnämnda ansökan har relevans för en rad viktiga frågor inom bioteknik och människors hälsa.

Den metod som presenteras här baserades på en tidigare teknik (gsist) som tillämpades på hela cell extrakt av jästen S. cerevisiae12,13. I denna studie utvidgade vi antalet föreningar som kunde upptäckas och kvantifieras, inklusive alla 12 nukleotider (xMP, xDP, xTP, där x är A, C, G och U). Tillsats av dessa föreningar kan ha viktiga biologiska konsekvenser. Till exempel, dessa nukleotider är starkt involverade i transkription och översättningsprocesser, som är en av de centrala processer av intresse för CFPS applikationer, och mer allmänt föreningarna är viktiga i en mängd olika fysiologiska funktioner. Dessutom kunde vi upptäcka ättiksyra som är en viktig metabolit när man undersöker overflow metabolism. Emellertid, vi inte inkludera det i studien eftersom det fanns en signifikant minskning av signalen i flera föreningar, särskilt nikotinamid adenin dinukleotid reduceras (NADH) och nikotinamid adenin dinukleotid fosfat reduceras (NADPH) när ättiksyra till standard blandningen. Ättiksyra hade en hög detektionsgräns på 612 μM, vilket på dessa höga nivåer hade en negativ effekt på de andra metaboliternas signaler. Trots detta kan ättiksyra fortfarande upptäckas och kvantifieras i prover genom att skapa en standardkurva med bara ättiksyra i flaskan. Ättiksyra hade ett m/z-värde på 134,0, retentionstid på 5,78 min, och ett linjärt intervall från 612 μM till 5000 μM (R2 = 0,986) när märkta med 12C-anilin. De återstående metaboliterna förändrade inte varandras Jon signal och representerar en omfattande blandning för att karakterisera CFPS metabolism. Det protokoll som presenteras här är begränsat till metaboliter som är involverade i Central kol-och energimetabolism. Sålunda, den nuvarande metoden är oförmögen att mäta metabolit överflöd från andra vägar som kan vara av betydelse, såsom fettsyra och aminosyra metabolism.

Sammantaget utvecklade vi ett snabbt, robust protokoll för karakterisering och absolut kvantifiering av 40 föreningar involverade i glykolys, pentofosfatvägen, trikarboxylsyracykeln, energimetabolism och kofaktor förnyelse i CFPS Reaktioner. Metoden förlitade sig på interna standarder märkta med 13c-Aniline, medan provet var märkta med 12c-Aniline. De interna standarderna och prov föreningarna Co-eluerade och elimineras Jon-suppression effekter som möjliggjorde korrekt kvantifiering av enskilda metaboliter i komplexa metabolit blandningar. Vi identifierade sammanlagt 40 föreningar (41, om bland annat ättiksyra) som kan detekteras och kvantifieras i en cell fri reaktionsblandning; förteckningen över metaboliter kan dock utökas ytterligare och justeras mot den särskilda biokemiska processen av intresse. Således ger metoden en robust och noggrann metod för att karakterisera cellfri metabolism, vilket är potentiellt avgörande för att förbättra avkastningen, produktiviteten och energieffektiviteten i cell fria processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Det arbete som beskrivs stöddes av centrum för fysiken i cancer metabolism genom tilldelning nummer 1U54CA210184-01 från National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på National Cancer Institute eller National Institutes of Health. Finansiärer hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Tags

Biokemi cellfri proteinsyntes vätskekromatografi-masspektrometri anilin märkning Central kol energimetabolism intern standard metabola nätverk isotop märkning
Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter