Summary

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Published: October 25, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

Abstract

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא טכנולוגיה מתפתחים במערכות ובביולוגיה סינתטית לייצור מתורבת של חלבונים. עם זאת, אם CFPS הולך לנוע מעבר למעבדה ולהיות מקובל וסטנדרטי רק בטכנולוגיית ייצור הזמן, אנחנו חייבים להבין את גבולות הביצועים של מערכות אלה. לקראת שאלה זו, פיתחנו פרוטוקול חזק כדי לכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה משתמשת בתקנים פנימיים המתויגים עם 13ג-אנילין, ואילו תרכובות במדגם הן ללעג עם 12ג-אנילין. הסטנדרטים הפנימיים והמדגם היו מעורבים ונותחו על-ידי כרומטוגרפיה ברמה הפוכה-ספקטרומטריה (LC/MS). שיתוף של תרכובות הדיכוי יון מסולק, המאפשר כימות מדויקת של ריכוזי מטבוליט מעל 2-3 הזמנות של גודל שבו מקדם המתאם הממוצע היה 0.988. חמישה מתוך 40 תרכובות לא היו מתוייגות עם אנילין, עם זאת, הם עדיין זוהו במדגם CFPS וכימות עם שיטת עקומה סטנדרטית. לרוץ כרומטוגרפי לוקח בערך 10 דקות להשלים. יחד, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי להפריד ומדויק לכמת 40 תרכובות מעורבות CFPS בריצה LC/MS אחת. השיטה היא גישה מקיפה ומדויקת לאפיון חילוף חומרים ללא תא, כך שבסופו של דבר, אנו יכולים להבין ולשפר את התשואה, הפרודוקטיביות ויעילות האנרגיה של מערכות ללא תא.

Introduction

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא פלטפורמה מבטיחה עבור ייצור של חלבונים וכימיקלים, יישום שהיה שמור באופן מסורתי עבור תאים חיים. מערכות ללא תא נגזרות מתמציות תאים גולמי ומבטלות את הסיבוכים המשויכים לצמיחת התאים1. בנוסף, CFPS מאפשר גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא הפרעה של קיר התא. עם זאת, חסרה הבנה בסיסית של מגבלות הביצועים של תהליכים ללא תא. שיטות תפוקה גבוהה עבור הקוונט מטבוליזם הם יקרי ערך לאפיון של חילוף החומרים והם קריטיים לבניית מודלים מטבולית חישובית2,3,4. שיטות נפוצות המשמשות לקביעת ריכוזי מטבוליט כוללות תהודה מגנטית גרעינית (nmr), התמרת פורייה-ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (FT-IR), assays מבוסס אנזימים, וספקטרומטר המסה (MS)5,6,7 ,8. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם למדוד ביעילות תרכובות מרובות בבת אחת ולעתים קרובות דורשים גודל מדגם גדול יותר מאשר התגובות הרגילות ללא תא. לדוגמה, בחני המבוססת על אנזימים יכולים לעתים קרובות לשמש רק כדי לכמת מתחם אחד בהפעלה, ומוגבלים כאשר גודל המדגם קטן, כגון תגובות סינתזה של חלבון תא (בדרך כלל הפעלה בקנה מידה של 10-15 μl). בינתיים, NMR דורש שפע רב של מטבוליטים לאיתור וכימות הכמת5.  לגבי חסרונות אלה, שיטות כרומטוגרפיה במשולב עם ספקטרומטר מסה (LC/MS) מספקות מספר יתרונות, כולל רגישות גבוהה ויכולת למדוד מינים מרובים בו9; עם זאת, המורכבות האנליטית גדלה במידה ניכרת עם המספר והמגוון של המינים הנמדדים. לפיכך, חשוב לפתח שיטות הממש את פוטנציאל התפוקה הגבוהה של מערכות LC/MS. תרכובות במדגם מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. האות של המתחם תלוי הריכוז שלה ויעילות האינון, שבו האינון יכול להשתנות בין תרכובות יכול להיות גם תלוי במטריצה לדוגמה.

השגת אותו יעילות אינון בין המדגם והתקנים הוא אתגר בעת שימוש LC/MS לכמת מנתחי. עוד, הקוונפיקציה הופכת מאתגרת יותר עם גיוון מטבוליט בשל פיצול האות ו טרוגניות באהדה פרוטון וקוטביות10. לבסוף, מטריצת שיתוף הפעולה של המדגם יכול גם להשפיע על היעילות יינון של תרכובות. כדי לטפל בנושאים אלה, מטבוליטים יכול להיות לריקי כימית, להגדיל את הרזולוציה ואת הרגישות של מערכות LC/MS, ובמקביל להקטין את האות פיצול במקרים מסוימים10,11. העבודה הכימית עובד על ידי תיוג קבוצות פונקציונליות ספציפיות של מטבוליטים כדי לכוונן את המאפיינים הפיזיים שלהם כמו תשלום או hydrophobicity כדי להגדיל את יעילות יינון11. סוכני תיוג שונים יכולים לשמש כדי למקד קבוצות פונקציונליות שונות (למשל, amines, הידרוקסילס, פוספטים, חומצות קרבוקסילית וכו ‘). אנילין, אחד הסוכנים האלה ללעג, מטרות קבוצות פונקציונליות מרובות בבת אחת, ומוסיף רכיב הידרופובי למולקולות הידרופילית, ובכך מגדיל את רזולוציית ההפרדה שלהם ואת האות12. כדי לטפל באפקט הדיכוי המיני-מטריצות של המטריצה, יאנג ועמיתים פיתחו טכניקה המבוססת על התווית הפנימית של התקן הפנימי (GSIST) לתיוג שבו התקנים מתויגים עם 13ג אנילין איזוטופים ומעורבב עם המדגם 12,13. החומרים הפנימיים של המטאווליט והתקן הפנימי הם בעלי היעילות האינון מאז שהם שותפים, ויחס האינטנסיביות שלהם יכול לשמש לכמת את הריכוז במדגם הניסיוני.

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול לזהות ולכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה מבוססת על הגישה GSIST, שבו השתמשנו 12ג-אנילין ו -13ג-אנילין לתייג, לזהות, ולכמת מטבוליטים באמצעות היפוך-שלב LC/MS. הטווח הליניארי של כל התרכובות המקיפות 2-3 הזמנות של סדר גודל עם מקדם מתאם ממוצע של 0.988. לכן, השיטה היא גישה איתנה ומדויקת לחקור חילוף חומרים ללא תא, ואולי תמציות תאים שלמים.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים לתיוג אנילין הכינו תמיסה של 6 מטרים ב-pH 4.5. עבודה בשכונה, לשלב 550 μL של אנילין עם 337.5 μL של מים LCMS כיתה ו 112.5 μL של 12 M חומצה הידרוכלורית (HCl) בשפופרת צנטריפוגה. הבאר מערבולת ולחנות ב 4 ° c.הערה: אנילין יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c במשך חודשיים.התראה: אנילין הוא רעיל מאוד ויש לעבוד…

Representative Results

כהוכחה-of-קונספט, השתמשנו בפרוטוקול כדי לכמת מטבוליטים ב -E. coli מבוסס cfps מערכת המבטא חלבון פלורסנט ירוק (gfp).  התגובה CFPS (14 μL) היה מוכן ומלא עם אתנול. דגימת CFPS הייתה מתויגת עם 12ג-אנילין, ואילו התקנים תויגו עם 13ג-אנילין. המדגם והתקנים המתויגים שולבו והוזריקו לתוך ה-LC/MS (<strong class="xfig"…

Discussion

מערכות ללא תא יש קיר תא, ולכן יש גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא צורך הכנה לדוגמה מורכבת. עם זאת, מעט מאוד עבודה נעשתה כדי לפתח פרוטוקולים יסודיים וחזקים כדי כימות לחקור מערכות התגובה של התא ללא. במחקר זה, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי לכמת מטבוליטים בתערובות התגובה של התא חינם, פו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה שתוארה נתמכת על ידי המרכז על הפיסיקה של מטבוליזם הסרטן באמצעות הפרס מספר 1U54CA210184-01 מהמכון הלאומי לסרטן (https://www.cancer.gov/). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Play Video

Cite This Article
Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

View Video