Summary
Nous présentons une méthode de cytométrie de flux pour identifier simultanément différents types de cellules récupérées du cerveau de souris ou de la moelle épinière. Cette méthode pourrait être exploitée pour isoler ou caractériser les populations cellulaires pures dans les maladies neurodégénératives ou pour quantifier l'étendue du ciblage cellulaire sur l'administration in vivo de vecteurs viraux ou de nanoparticules.
Abstract
Les progrès récents des sciences des vecteurs viraux et des nanomatériaux ont ouvert la voie à de nouvelles approches de pointe pour étudier ou manipuler le système nerveux central (SNC). Cependant, une optimisation plus poussée de ces technologies bénéficierait de méthodes permettant une détermination rapide et rationalisée de l'étendue du SNC et du ciblage cellulaire spécifique à l'administration de vecteurs viraux ou de nanoparticules dans l'organisme. Ici, nous présentons un protocole qui tire parti des capacités de haut débit et de multiplexage de la cytométrie du débit pour permettre une simple quantification de différents sous-types cellulaires isolés du cerveau de souris ou de la moelle épinière, à savoir des microglies/macrophages, des lymphocytes, des astrocytes, des oligodendrocytes, des neurones et des cellules endothéliales. Nous appliquons cette approche pour mettre en évidence les différences critiques entre deux méthodes d'homogénéisation des tissus en termes de rendement cellulaire, de viabilité et de composition. Cela pourrait demander à l'utilisateur de choisir la meilleure méthode en fonction du type de cellule (s) d'intérêt et de l'application spécifique. Cette méthode n'est pas adaptée à l'analyse de la distribution anatomique, puisque le tissu est homogénéisé pour générer une suspension unicellulaire. Cependant, il permet de travailler avec des cellules viables et il peut être combiné avec le tri cellulaire, ouvrant la voie à plusieurs applications qui pourraient élargir le répertoire des outils dans les mains du neuroscientifique, allant de l'établissement de cultures primaires dérivées de populations cellulaires pures, à des analyses d'expression génique et des essais biochimiques ou fonctionnels sur des sous-types cellulaires bien définis dans le contexte des maladies neurodégénératives, sur le traitement pharmacologique ou la thérapie génique.
Introduction
Les technologies d'administration de gènes et de médicaments (comme les vecteurs viraux et les nanoparticules) sont devenues un outil puissant qui peut être appliqué pour obtenir de meilleures connaissances sur des voies moléculaires spécifiques modifiées dans les maladies neurodégénératives et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes1,2,3. L'optimisation de ces outils repose sur la quantification de : (1) l'étendue de la pénétration du SNC sur différents axes d'administration et (2) le ciblage de populations cellulaires spécifiques. Les analyses histologiques sont généralement appliquées pour visualiser les gènes des reporters fluorescents ou les nanoparticules étiquetées fluorescentes dans différentes zones du SNC et dans différents types de cellules, identifiées par l'immunostaining pour des marqueurs cellulaires spécifiques4,5. Même si cette approche fournit des informations précieuses sur la biodistribution du gène administré ou des outils de livraison de médicaments, la technique peut être longue et laborieuse, car elle nécessite : (1) fixation des tissus, cryoconservation ou encastrage et découpage de paraffine; (2) la coloration de marqueurs cellulaires spécifiques nécessitant parfois la récupération d'antigènes; (3) acquisition par microscopie fluorescence, qui permet habituellement l'analyse d'un nombre limité de marqueurs différents au sein d'une même expérience; (4) le traitement d'image pour permettre une quantification appropriée du signal d'intérêt.
La cytométrie de flux est devenue une technique largement utilisée qui tire parti de marqueurs fluorescents très spécifiques pour permettre non seulement une évaluation quantitative rapide de différents phénotypes cellulaires dans les suspensions cellulaires, basée sur l'expression d'antigènes de surface ou intracellulaires, mais aussi des mesures fonctionnelles (p. ex., taux d'apoptose, prolifération, analyse du cycle cellulaire, etc.). L'isolement physique des cellules par le tri des cellules activées fluorescentes est également possible, permettant d'autres applications en aval (p. ex., culture cellulaire, RNAseq, analyses biochimiques, etc.) 6,7,8.
L'homogénéisation tissulaire est une étape critique nécessaire pour obtenir une suspension cellulaire unique afin de permettre des évaluations cytométriques fiables et reproductibles en aval. Différentes méthodes ont été décrites pour l'homogénéisation adulte de cerveau-tissu, principalement dans le but d'isoler des cellulesdemicroglie 9,10,11; ils peuvent être classés dans l'ensemble dans deux catégories principales : (1) dissociation mécanique, qui utilise la force de broyage ou de cisaillement à travers un homogénéisateur Dounce (DH) pour déchirer les cellules de leurs niches et former une suspension à cellule unique relativement homogénéisée, et (2) la digestion enzymatique, qui repose sur l'incubation de morceaux de tissu haché à 37 oC en présence d'enzymes protéolytiques, telles que la trypsine ou la papaïne, favorisant la dégradation de la matrice extracellulaire pour créer une suspension cellulaire assez homogène12.
Quelle que soit la méthode utilisée, une étape de purification est recommandée après l'homogénéisation des tissus pour enlever la myéline par centrifugation sur un gradient de densité ou par sélection magnétique9,12, avant de passer aux applications en aval.
Ici, nous décrivons une méthode de traitement de tissu basée sur la digestion de papain (PD) suivie de la purification sur un gradient de densité, optimisée pour obtenir des suspensions hétérogènes viables de cellules du cerveau de souris ou de la moelle épinière d'une manière temporelle et appropriée pour la cytométrie d'écoulement. En outre, nous décrivons un panneau de cytométrie de flux de 9 couleurs et la stratégie de gating que nous avons adoptée en laboratoire pour permettre la discrimination simultanée de différentes populations de SNC, cellules vivantes/mortes ou positivité pour les journalistes fluorescents tels que la protéine fluorescente verte ou la teinture de rhodamine. En appliquant cette analyse cytométrique de flux, nous pouvons comparer différentes méthodes de traitement des tissus, c'est-à-dire la DP par rapport à la DH, en termes de préservation de la viabilité cellulaire et des rendements de différents types de cellules.
Les détails que nous fournissons dans les présentes peuvent indiquer la décision sur le protocole d'homogénéisation et la combinaison d'anticorps à utiliser dans le panneau de cytométrie de débit, basé sur le type de cellule spécifique (s) d'intérêt et les analyses en aval (par exemple, la température sensible applications, suivi de marqueurs fluorescents spécifiques, culture in vitro, analyses fonctionnelles).
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Dana Farber Cancer Institute (protocole numéro 16-024).
1. Préparation des solutions nécessaires à l'expérience
- Préparer la solution de sel équilibrée (HBSS) de 1x Hank en diluant 10x HBSS avec de l'eau stérile. Pré-réfrigérer la solution sur glace. Au moins 25 ml de solution sont nécessaires pour chaque échantillon.
- Préparer la solution isotonique Percoll (IPS) en mélangeant 10x HBSS stérile 1:10 avec le milieu de gradient de densité (c.-à-d., Percoll). Pré-froid sur glace.
REMARQUE : L'IPS peut être stocké jusqu'à 30 jours à 4 oC. - Préparer la solution de blocage de la cytométrie du débit (FACS) (BL) (1 % d'albumine de sérum bovin [BSA], 5 % de sérum bovin fœtal [FBS] en saline tamponnée de phosphate [PBS]). Pré-froid sur glace.
2. Euthanasie animale par perfusion intracardiaque et dissection tissulaire
REMARQUE : Des souris C57BL/6J de huit semaines, que ce soit le sexe, ont été utilisées dans les expériences. La perfusion avec la solution de PBS est exécutée pour éliminer la contamination de sang des organes, avant de procéder à la digestion de tissu.
- Anesthésiez la souris à l'aide d'un mélange de kétamine/xylazine (90 à 200 mg/kg de kétamine, 10 mg/kg de xylazine). Placez la souris sur le dos et ruban adhésif chaque membre vers le bas pour le soutien. Vérifier la profondeur adéquate de l'anesthésie en vérifiant le réflexe de sevrage.
- Faire une incision de la peau de la ligne médiane au niveau de l'entrée thoracique pour exposer le sternum. Utilisez des forceps pour saisir la pointe du sternum, puis faites une incision de 1 cm de chaque côté de la cage thoracique. Enfin couper à travers le diaphragme et ouvrir le sternum assez largement pour visualiser le cœur.
- Utilisez des forceps pour saisir doucement le cœur par le ventricule droit et le soulever à la ligne médiane et légèrement hors de la poitrine.
- Insérer une aiguille papillon de 23 G dans la pointe du ventricule gauche, vers l'aorte et tenir fermement.
- Démarrer la perfusion avec 1x PBS. Percer à travers l'oreillette droite à l'aide de ciseaux pour permettre au perfusat e de sortir de la circulation. Régler le débit de PBS à 3 ml/min. Perfuse avec au moins 15 ml de 1x PBS pour s'assurer que les tissus sont clairs.
REMARQUE : Le blanchiment du foie et des vaisseaux sanguins mésentériques sont des signes de bonne perfusion. Si nécessaire, le volume de préfusion peut être augmenté jusqu'à ce que le liquide sortant du cœur est clair de sang, à quel point la ligne de chasse d'eau peut être arrêté. - Après perfusion, couper le cerveau de la moelle épinière et retirer le cerveau du crâne avec des ciseaux et des forceps. Enlever la fourrure pour augmenter la visibilité et le contrôle pendant la dissection et pour éviter de transporter des contaminants capillaires. Rincer la moelle épinière de sa colonne à l'aide d'une seringue de 3 ml remplie de PBS.
- Transférer chaque tissu dans un puits d'une plaque multi-puits de 6 puits préremplie de 2 ml de 1x HBSS glacé et conserver sur la glace jusqu'à la digestion.
- Diviser le cerveau et la moelle épinière en deux moitiés, le long de la ligne longitudinale.
REMARQUE : La moitié de chaque tissu est homogénéisée (voir les sections ci-dessous) pour permettre des analyses cytométriques de débit; l'autre moitié peut être affectée à différents traitements pour des analyses alternatives (p. ex., trempées dans une solution fixative de paraformaldéhyde pour l'histologie).
3. Digestion enzymatique du cerveau et de la moelle épinière
REMARQUE : Les volumes décrits dans cette section sont suffisants pour la digestion d'une moitié du cerveau ou de la moelle épinière.
- Utilisez une paire de ciseaux pour hacher les tissus en morceaux d'une épaisseur de 1 à 2 mm.
- Couper la pointe d'une pipette de 1000 l avec une paire de ciseaux pour la rendre suffisamment grande pour permettre la collecte des morceaux de tissu. Pré-rincez la pointe de pipette avec 1x HBSS. Ensuite, utilisez la pipette pour transférer les 2 ml de solution HBSS contenant le tissu haché à un tube conique de 15 ml.
REMARQUE : Il est important de pré-rincer la pointe de la pipette pour éviter l'adhérence des morceaux de tissu à l'intérieur de la pointe. - Laver le puits avec 2 ml supplémentaires de 1x HBSS glacé et transférer la solution au tube conique correspondant de 15 ml contenant les morceaux de tissu.
- Centrifuger chaque échantillon pendant 5 min à 250 x g à 4 oC.
- Préparer le mélange d'enzymes 1 du kit de dissociation des tissus neuronaux (NTDK; Tableau des matériaux) en mélangeant 50 l'enzyme P avec 1900 l de tampon X par échantillon. Mélange d'enzymes chaudes 1 à 37 oC dans un bain d'eau. Incuber le mélange d'enzymes 1 à 37 oC pendant au moins 10 minutes avant utilisation afin de permettre l'activation complète de l'enzyme.
- Aspirer le supernatant du tube conique de 15 ml et ajouter 1,95 ml de mélange d'enzymes 1 à chaque échantillon. Vortex doucement pour s'assurer que le granule est suspendu.
- Incuber les échantillons sur une roue ou un shaker pendant 15 min à 37 oC.
- Pendant ce temps, préparer le mélange d'enzymes 2 du NTDK en mélangeant 10 l d'enzyme a avec 20 l de tampon Y par échantillon; préchauffer la solution à 37 oC dans un bain d'eau.
- À la fin de l'incubation avec le mélange d'enzymes 1, ajouter 30 l de mélange d'enzymes 2 à chaque échantillon.
- Mélanger délicatement les échantillons en faisant monter et descendre avec une pointe de pipette de 1000 l pré-rincée avec 1x HBSS.
- Incuber l'échantillon sur une roue ou un shaker pendant 15 min à 37 oC.
- Après l'incubation, ajouter 10 ml de 1x HBSS glacé à chaque tube pour inactiver le mélange d'enzymes 1 et le mélange d'enzymes 2.
- Centrifuger chaque échantillon pendant 10 min à 320 x g à 4 oC.
- Jeter le supernatant; ajouter 1x HBSS glacé à chaque tube jusqu'à un volume final de 7 ml et resuspendre doucement la pastille par vortex.
- Continuer à la section 5 pour l'enlèvement des débris.
4. Homogénéisation mécanique du cerveau et de la moelle épinière
REMARQUE : Les volumes décrits dans cette section sont suffisants pour l'homogénéisation d'une demi-cerveau ou de la moelle épinière. Le protocole décrit dans cette section peut être utilisé comme une méthode alternative à celle décrite à la section 3, en fonction des besoins de l'utilisateur comme discuté ci-dessous.
- Pré-réfrigérer le mortier de verre du broyeur de tissu Dounce (Table of Materials) mis sur la glace.
- Ajouter 3 ml de 1x HBSS préréfrigéré au mortier.
- Transférer le tissu (cerveau ou moelle épinière) du puits de la plaque de 6 puits dans le mortier de verre en s'assurant qu'il est trempé dans 1x HBSS et se trouve au fond du mortier.
- Écraser doucement le tissu avec 10 coups de pilon A suivis de 10 coups de pilon B. Transférer le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 15 ml.
- Remplir le tube à un volume final de 10 ml en utilisant 1x HBSS préréfrigéré et centrifugeuse pendant 10 min à 320 x g à 4 oC.
- Aspirer le supernatant et ajouter 1x HBSS glacé à chaque tube jusqu'à un volume final de 7 ml et resuspendre doucement la pastille par vortex.
- Continuer à la section 5 pour l'enlèvement des débris.
5. Enlèvement des débris
REMARQUE : L'enlèvement des débris, composés principalement de tissus non digérés et de gaines de myéline, est une étape critique pour permettre une coloration efficace du tissu homogénéiser pour des analyses cytométriques ultérieures.
- Filtrer chaque échantillon à travers une passoire cellulaire de 70 m pour enlever tout morceau de tissu non digéré. Cette étape est particulièrement importante, surtout lorsque l'on travaille avec les tissus de la moelle épinière puisque ces échantillons sont plus susceptibles de contenir des fragments de nerf non digérés ou des méninges qui pourraient affecter les étapes suivantes.
- Assurez-vous que le volume final est de 7 ml dans chaque tube d'échantillon. Si ce n'est pas le cas, remplissez de 1x HBSS glacé jusqu'à 7 ml.
- Ajouter 3 ml d'IPS préréfrigéré à chaque échantillon pour faire un volume final de 10 ml d'une solution contenant un gradient de densité moyen à 30 % de concentration finale. Vortex doucement les échantillons pour s'assurer qu'ils sont homogènement mélangés.
- Échantillons de centrifugeuse de 15 min à 700 x g à 18 oC pour s'assurer de fixer l'accélération de la centrifugeuse à 7 et le frein à 0.
REMARQUE : La centrifugation devrait prendre environ 30 min. - Retirer délicatement les échantillons de la centrifugeuse.
REMARQUE : Un disque blanchâtre composé de débris et de myéline doit être visible flottant à la surface de la solution. Une pastille (contenant les cellules d'intérêt) doit être visible au bas du tube. - Aspirez soigneusement tout le disque blanchâtre des débris, puis le reste du supernatant en veillant à ne pas déloger le granule. Laissez environ 100 L de solution sur le dessus de la pastille cellulaire pour éviter le risque de le déloger par inadvertance.
- Ajouter 1 mL de FACS BL, resuspendre le granule en faisant monter et descendre avec une pointe de pipette de 1000 l et transférer des échantillons dans des tubes de 1,5 mL.
- Centrifugeuse de 5 min à 450 x g à température ambiante (RT).
- Aspirez doucement le supernatant et suspendez le granule dans un tampon approprié compatible avec les analyses en aval (voir la section 6 du protocole utilisé pour l'évaluation cytométrique du débit de plusieurs types de cellules).
6. Coloration pour l'évaluation cytométrique de flux de plusieurs types de cellules
- Resuspendre la pastille obtenue à l'étape 5.9 avec 350 L de FACS BL. Ajouter le bloc Fc à chaque échantillon à une concentration finale de 5 g/mL.
REMARQUE : Au moins 100 L de l'échantillon doivent être utilisés pour une coloration, afin de s'assurer de traiter suffisamment de cellules pour permettre des analyses fiables. - Incuber l'échantillon pendant 10 min à 4 oC avant de procéder à la coloration.
- Préparer un mélange d'anticorps selon le tableau 1.
- Ajouter le mélange d'anticorps à chaque tube, le vortex pendant 5 s et incuber les échantillons pendant 15 min à 4 oC dans l'obscurité.
- Ajouter 1 ml de PBS à chaque tube, vortex et centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g à RT.
- Pendant ce temps préparer le mélange de streptavidin selon le tableau 1.
- Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le mélange de streptavidin préparé à l'étape 6.6. Pour chaque échantillon, utilisez le même volume que celui utilisé pour la coloration à l'étape 6.4.
- Vortex pour 5 s et incuber les échantillons pendant 10 min à 4 oC dans l'obscurité.
- Ajouter 1 ml de PBS à chaque tube, vortex et centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g à RT.
- Jetez le supernatant et suspendez à nouveau la pastille dans FACS BL. Utilisez 300 L de FACS BL pour chaque 100 L d'échantillon taché.
- Ajouter la solution 7-amino-actinomycine D (7-AAD) à chaque échantillon. Utilisez 5 ll de 7-AAD pour chaque 300 l d'échantillon préparé à l'étape 6.10.
- Conserver les échantillons à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à l'analyse cytofluorimétrique. Effectuer l'analyse dans les 16 h à partir de la préparation de l'échantillon, afin de garantir la viabilité de la cellule à 60 %.
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Representative Results
Nous avons comparé deux méthodes différentes d'homogénéisation (DH contre PD) appliquées au cerveau de souris et à la moelle épinière, pour tester l'efficacité dans la récupération de différents types de cellules viables adaptées aux applications en aval. Pour ce faire, nous avons exploité un panneau de cytométrie de flux de 9 couleurs conçu pour caractériser, dans le même échantillon, différents types de cellules du SNC, y compris les microglies, les lymphocytes, les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et l'endothélium.
Les tissus du cerveau et de la moelle épinière ont été prélevés sur différentes souris (n - 6), divisés en deux moitiés longitudinalement, pesés et traités en parallèle en appliquant soit des perturbations mécaniques à l'aide de l'homogénéisateur Dounce (méthode DH) ou doucement hachés et digérés enzymatiquement à l'aide de la NTDK commerciale basée sur la papaïne (méthode PD) (Figure 1A). Après l'enlèvement des débris, les cellules du cerveau ou de la moelle épinière ont été diluées 1/10 ou 1/2-1/5, respectivement, en bleu Trypan pour déterminer le rendement cellulaire et la viabilité avec une chambre Neubauer (figure 1B,C). La méthode de DH a globalement produit un rendement cellulaire plus élevé du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, la majorité des cellules récupérées étaient mortes, ce qui n'a donné lieu qu'à 13,8 % et 3,3 % de cellules viables dans le cerveau et 10,5 % à 1,5 % dans la moelle épinière(figure 1B). Bon nombre des cellules mortes ont formé des agrégats (figure 1C); ce phénomène pourrait être dû à la présence de réseaux cellulaires fortement interconnectés (comme les cellules endothéliales et gliales qui tapissent la vascularisation du SNC) qui ne pouvaient pas être désagrégés par la force de cisaillement appliquée avec la DH. Ces agrégats de cellules de mort n'ont probablement pas été enlevés par le gradient de densité et se sont retrouvés dans le granule de cellules finale utilisé pour l'analyse cytofluorimétrique. Au contraire, la méthode de la DP a permis de mieux préserver la viabilité cellulaire (90,6 % à 0,6 % dans le cerveau et 85,2 % à 2,8 % dans la moelle épinière). Papain est capable de digérer efficacement la matrice extracellulaire et les jonctions cellule-cellule, menant à une suspension de cellule simple plus uniforme. Certaines des cellules qui meurent pendant le processus de mincing pourraient être digérées davantage par la papaine menant à la formation des débris cellulaires qui sont plus efficacement séparés par le gradient de densité. Dans l'ensemble, cela a probablement déterminé une meilleure préservation de la viabilité cellulaire avec la méthode, en dépit d'un rendement cellulaire légèrement inférieur par rapport à la méthode DH.
Un aliquot de 100 L provenant des suspensions du cerveau et de la moelle épinière a été taché avec le mélange d'anticorps (tableau 1) et analysé par cytométrie de flux avec un panneau de 9 couleurs. La figure 2A montre la stratégie de gating utilisée pour identifier les différents types de cellules à partir des suspensions du cerveau et de la moelle épinière. En bref, la première porte identifie la population générale en fonction de la diffusion vers l'avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), à l'exclusion des petits débris cellulaires. Ensuite, des cellules vivantes (7-AAD-) sont identifiées. Dans la population totale de cellules vivantes, les cellules CD45 et CD45 sont mises en évidence. À l'intérieur de la porte CD45MD, les lymphocytes CD45-CD11bMD microglia/macrophages et les lymphocytes CD45-CD11b sont identifiés. Dans CD45- porte, les cellules sont discriminées selon la positivité pour ACSA2 (astrocytes) ou O4 (oligodendrocytes). CD45-ACS2-O4- les cellules sont subdivisées en fonction de la positivité pour Thy1 (neurones) ou CD31 (endothélium). Restant Thy1-CD31- les cellules sont classées comme « d'autres types de cellules », non expliquées par notre mélange d'anticorps.
Comme le montre la figure 2B, avec la méthode DH environ 38% des cellules viables extraites du cerveau et environ 32% des cellules viables extraites de la moelle épinière étaient d'origine hématopoïétique (CD45). D'autre part, la méthode de a permis de récupérer un rendement sensiblement élevé des cellules viables dans les deux tissus, avec une très grande fraction représentée par les CD45-cellules non hématopoïétiques (environ 82% dans le cerveau et 92% dans la moelle épinière). Fait remarquable, les microglies/macrophages CD45-CD11bMD représentaient la fraction de cellules viables la plus abondante avec la méthode DH (Figure 2C). Cependant, la méthode de la DP a produit une représentation plus hétérogène des types de cellules, y compris les astrocytes ACSAMD, les oligodendrocytes O4MD, les cellules endothéliales CD31MD et les neurones Thy1MD(figure 2C). Intéressant, les neurones viables et les cellules endothéliales étaient à peine détectables avec la méthode de DH.
La méthode DH repose sur le broyage mécanique du tissu entre le pilon de verre et le mortier de l'homogénéisateur Dounce pour obtenir l'homogénéisation des tissus. Cela pourrait causer un certain stress de cisaillement qui endommagera probablement et affectera la viabilité des cellules grandes ou très sensibles telles que des neurones ou des cellules de la neurovasculature. Nous avons évalué la viabilité cellulaire (pourcentage de cellules 7-AAD) dans chaque sous-population cellulaire identifiée par le panneau d'anticorps (figure 3). Les cellules hématopoïétiques (CD45MD) isolées du cerveau et de la moelle épinière, y compris les microglies/macrophages (CD45-CD11bMD) et d'autres cellules non myéloïdes (CD45-Cd11b-), présentaient une viabilité très élevée indépendamment de la méthode d'homogénéisation utilisée (Figure 3A). Au contraire, la méthode DH a déterminé une réduction significative de la viabilité des populations cD45 (figure 3B) alors que la méthode a déterminé une conservation étendue de différents types de cellules du SNC. Dans le détail, les neurones et les cellules endothéliales étaient les sous-populations les plus significativement affectées par la DH et préservées par la méthode DeP.
Une présentation schématique des étapes critiques requises pour une préparation adéquate de l'échantillon et l'enlèvement efficace des débris est résumée à la figure 4.
Figure 1 : Le rendement des cellules extraites du cerveau et de la moelle épinière est affecté par la méthode d'homogénéisation.
(A) Aperçu expérimental. Des souris ont été anesthésiés et percrutées intracardiaquement avec PBS pour enlever les cellules sanguines circulantes intra-vasculaires. Le cerveau et la moelle épinière ont été soigneusement disséqués et divisés en deux moitiés longitudinalement. Les tissus ont été homogénéisés à l'aide de l'homogénéisateur Dounce (DH) ou de la digestion papaïne (PD) comme détaillé dans le texte principal. La myéline et les débris tissulaires ont ensuite été enlevés par centrifugation dans une solution moyenne de gradient de densité de 30 %, ce qui a entraîné une suspension hétérogène des cellules contenant différents types de cellules qui pourraient être analysées par cytométrie du débit. (B) Histogrammes montrant le rendement des cellules extraites du cerveau ou de la moelle épinière lors de l'homogénéisation des tissus avec la méthode DH ou. La moyenne - SEM d'au moins 6 animaux par condition est représentée. (C) Photomicrographes de microscope lumineux représentatifs des cellules positives bleues (mortes) et négatives (mortes) de Trypan récupérées du cerveau ou de la moelle épinière par les deux méthodes. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les proportions relatives des différents types de cellules extraites du SNC sont affectées par la méthode d'homogénéisation des tissus.
(A) Parcelles de cytométrie représentatives montrant la stratégie de gating pour identifier différentes sous-population scelliques dans les préparations cellulaires obtenues à partir du cerveau ou de la moelle épinière : la population cellulaire est fermée sur les paramètres physiques fSC et SSC, suivie de la sélection des cellules vivantes 7-AAD; puis les cellules sont discriminées selon la positivité pour le marqueur CD45 ; les microglies/macrophages sont identifiés comme des cellules CD11bMD dans la fraction CD45MD alors que les lymphocytes sont CD11b-. Les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules endothéliales et neuronales sont identifiés comme cellules ACSA2, O4MD, CD31 ou Thy1MD dans les cellules CD45-, respectivement. (B) Histogrammes montrant le pourcentage de cellules CD45 et CD45- dans les populations totales de cellules vivantes ou mortes, dans le cerveau ou la moelle épinière lors de l'homogénéisation avec la méthode DH ou. L'analyse statistique des résultats indiqués dans les graphiques est rapportée dans le tableau 2. (C) Graphiques à secteurs montrant le pourcentage de différents sous-types cellulaires viables au sein de la population cellulaire totale, dans le cerveau ou la moelle épinière lors de l'homogénéisation avec la méthode DH ou. Le pourcentage de cellules mortes totales est également rapporté. N 6. CD45-CD11bMD - microglies/macrophages; CD45-CD11b- lymphocytes/cellules non myéloïdes; CD45-ACSA2MD - astrocytes; Les oligodendrocytes CD45-O4MD; CD45-Thy1MD - neurones; CD45-CD31MD - cellules endothéliales; Autres cellules négatives pour tous les marqueurs mentionnés ci-dessus. L'analyse statistique des résultats indiqués dans les graphiques est rapportée dans le tableau 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La viabilité cellulaire de différents types de cellules du SNC est affectée par la méthode d'homogénéisation appliquée.
(A) Histogrammes montrant le pourcentage de cellules vivantes de 7-AAD- dans les populations hématopoïétiques CD45, y compris les microglies/macrophages CD11b et les cellules non myéloïdes CD11b. (B) Histogrammes montrant le pourcentage de cellules vivantes 7-AAD- dans les populations Non hématopoïétiques CD45- y compris les astrocytes, les oligodendrocytes, les neurones, les endothéliales et d'autres types de cellules. - p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.01, Mann-Whitney entre DH et. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Représentation schématique des étapes critiques requises pour un traitement approprié des tissus.
Une liste des étapes les plus critiques requises pour un traitement approprié des tissus et l'enlèvement efficace des débris est présentée. Il est important d'identifier correctement le disque de débris (flèche noire) et la pastille cellulaire (flèche bleue) formée après centrifugation des échantillons sur le gradient de densité de 30%. Le disque de débris, avec le reste du supernatant, doit être soigneusement enlevé par aspiration sans déloger le granule de cellules pour éviter la perte d'échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Mélange d'anticorps | Concentration initiale (g/mL) | Concentration finale (g/mL) | Facteur de dilution |
| anti CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD11b/APC.780 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| anti ACSA2/APC | 150 | 0.75 | 200 |
| anti O4/biotine | Na | Na | 40 |
| anti CD90.2/PE. Cy7 (Cy7) | 200 | 2 | 100 |
| Mélange Streptavidin | Concentration initiale (g/mL) | Concentration finale (g/mL) | Facteur de dilution |
| Streptavidin/Alexa 680 | 1000 | 1 | 1000 |
Tableau 1 : Recette pour la préparation des mélanges pour la coloration cytométrie de flux. Le tableau décrit les concentrations optimales d'anticorps et de streptavidin utilisé pour permettre des analyses cytométriques de débit de plusieurs types de cellules. Veuillez consulter le Tableau des matériaux pour plus de détails sur les numéros de catalogue de chaque réactif mentionné dans le tableau.
| Statistiques de la figure 2B | ||||||||||
| BRAIN (% de cellules) | ||||||||||
| CD45 | CD45- | |||||||||
| Vivre | Mort | Vivre | Mort | |||||||
| Méthode | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | ||
| Dh | 15.20 | 2,32 euros | 1.90 | 0,30 euros | 24.78 | 4,045 euros | 51.58 | 6.033 | ||
| (en) | 15.20 | 2,65 euros | 2.33 | 1,10 euros | 68.53 | 3.618 euros | 13.93 | 2,180 euros | ||
| Mann-Whitney (en) | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p-valeur | 0.9989 | 0.738 | 0.0006 | 0.0015 | ||||||
| SPINAL CORD (% de cellules) | ||||||||||
| CD45 | CD45- | |||||||||
| Vivre | Mort | Vivre | Mort | |||||||
| Méthode | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | ||
| Dh | 15.00 | 8,21 euros | 1.41 | 0,11 | 31.64 | 8,21 euros | 51.95 | à 16,52 | ||
| (en) | 7.49 | 4,99 euros | 1.15 | 0,68 euros | 84.27 | à 9,39 euros | 7.09 | 3,75 euros | ||
| Mann-Whitney (en) | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p-valeur | 0.5548 | 0.7236 | 0.0438 | 0.1144 | ||||||
| Statistiques de la figure 2C | |||||||||||||||||
| BRAIN (% de cellules) | |||||||||||||||||
| CD45 | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b | CD11b- | ACSA2 (en) | O4 (en) | Thy1 (en) | CD31 (en) | Autres | Mort | ||||||||||
| Méthode | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | |
| Dh | 19.32 | 3,88 euros | 1.17 | 0,27 | 9.52 | 2,68 euros | 3.41 | 1,01 | 1.39 | 0,77 euros | 0.48 | 0,29 euros | 10.52 | 4,49 euros | 53.83 | 5,79 euros | |
| (en) | 10.88 | 2,03 euros | 1.65 | 0,48 | 8.17 | 2,66 euros | 6.54 | 0,76 | 6.37 | 1,76 euros | 8.27 | 1,25 | 33.28 | à 6,34 | 23.72 | 5,31 euros | |
| Mann-Whitney (en) | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p-valeur | 0.1206 | 0.4819 | 0.5894 | 0.0264 | 0.0093 | 0.0003 | 0.0084 | 0.0022 | |||||||||
| SPINAL CORD (% de cellules) | |||||||||||||||||
| CD45 | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b | CD11b- | ACSA2 (en) | O4 (en) | Thy1 (en) | CD31 (en) | Autres | Mort | ||||||||||
| Méthode | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | Veux dire | SEM (EN) | |
| Dh | 21.23 | à 6,25 | 2.51 | 0,57 euros | 4.26 | 2,34 euros | 9.40 | 1,89 euros | 2.82 | 1,51 | 0.97 | 0,50 euros | 22.74 | 9,04 euros | 35.28 | 1,89 euros | |
| (en) | 9.63 | 1,67 | 2.77 | 0,48 | 4.23 | 1,59 euros | 28.62 | 3,57 euros | 1.26 | 0,49 euros | 6.94 | 2,14 euros | 26.39 | à 8,17 euros | 19.09 | 4,76 euros | |
| Mann-Whitney (en) | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p-valeur | 0.1905 | 0,9999 | 0.7302 | 0.0159 | 0.7302 | 0.0317 | 0.7302 | 0.1111 | |||||||||
Tableau 2 : Analyse statistique des différentes populations récupérées en appliquant la méthode DH ou PD. Le tableau décrit les statistiques des graphiques présentés à la figure 2B et à la figure 2C. La moyenne et le SEM d'au moins six échantillons indépendants sont représentés. La valeur p et les détails du test statistique appliqué pour chaque comparaison sont également rapportés.
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Discussion
Ici nous décrivons un protocole pour la co-purification et l'analyse cytométrique simultanée de flux de quelques-unes des cellules les plus pertinentes de CNS du cerveau de souris et de la moelle épinière. Traditionnellement, des analyses histologiques ont été appliquées pour décrire la distribution des nanoparticules ou l'efficacité de la transduction des vecteurs viraux dans le SNC5,13, ou pour fournir des informations sur les changements morphologiques et moléculaires se produisant dans des types de cellules spécifiques au cours d'une pathologie ou sur le traitement pharmacologique14. Cependant, l'histologie manque de processivité et elle ne permet pas l'examen complet de multiples caractéristiques dans les mêmes échantillons histologiques, en raison du nombre limité de marqueurs qui peuvent être analysés simultanément. Notre approche peut être complémentaire aux analyses histologiques traditionnelles et elle peut être couplée à plusieurs applications en aval (tri, culture primaire, biochimie ou analyses de séquençage de nouvelle génération) pour élargir la compilation d'informations pouvant être obtenues à partir d'échantillons individuels. Toutefois, certains facteurs clés énumérés ci-dessous doivent être pris en considération car ils peuvent avoir un impact critique sur le succès de cette approche :
- Quantité de tissu de départ. Nous avons optimisé la séparation cellulaire pour commencer avec aussi peu que la moitié de la moelle épinière ou la moitié du cerveau. D'après notre expérience, le traitement de la moitié du cerveau ou de la moitié de la moelle épinière d'une souris adulte de 8 semaines avec la méthode De la donne 1 à 6 x 106 cellules viables du cerveau et environ 0,1 x 0,5 x 106 cellules viables de la moelle épinière après l'étape du gradient de densité. Nous n'avons pas mesuré le rendement des cellules après l'application de la méthode de la DP sur les tissus de nouveau-nés ou de souris de moins de 8 semaines. Cependant, dans nos mains, le résultat est proportionnel au poids du tissu de départ. Ainsi, pour les animaux plus jeunes (p. ex., les chiots de 10 jours), tout le cerveau ou la moelle épinière devrait être traité pour garantir un bon rendement cellulaire pour des analyses fiables en aval. Si nécessaire, la mise en commun des tissus provenant de plusieurs animaux aiderait à augmenter les rendements cellulaires. Dans notre expérience, ce protocole peut également être appliqué sans modifications pour isoler les cellules du cerveau ou de la moelle épinière des rats, dans la mesure où la proportion de réactifs utilisés par poids du tissu de départ est respectée. Pour les tissus de plus de 250 mg de poids, la mise à l'échelle des réactifs ou la division du tissu dans plusieurs échantillons (chaque pondération de 250 mg) est suggérée.
- Enlever les méninges/morceaux de tissu résiduels avant le gradient de densité. Dans notre expérience, la méthode de décrite par la présente n'est pas capable de digérer efficacement les méninges ou les tissus très fortement myélinisés tels que les nerfs et les racines nerveuses émergeant de la moelle épinière. Lorsque ces tissus sont présents, certains morceaux collants non digérés peuvent rester dans la suspension cellulaire récupérée après les étapes de digestion enzymatique, avant l'enlèvement des débris. L'élimination de ces morceaux en filtrant la solution à l'intermédiaire d'une passoire cellulaire de 70 m (comme suggéré à l'étape 5.1) est essentielle pour une préparation cellulaire réussie. En fait, s'ils ne sont pas enlevés, les méninges ou les morceaux de tissu entraveront la séparation efficace du gradient de densité, ce qui entraînera de faibles rendements cellulaires.
- Timing, température et stérilité. Il est très important d'effectuer toutes les étapes en temps opportun en utilisant les bons réglages de température et les incubations comme suggéré. Ceci est essentiel pour assurer une viabilité cellulaire élevée et l'intégrité de l'échantillon. Selon l'application en aval, il peut être nécessaire d'effectuer toutes les étapes sous une hotte stérile et avec des réactifs stériles (p. ex., établir des cultures cellulaires primaires). Une incubation prolongée dans la solution digestive enzymatique au-delà du temps suggéré (section 3) pourrait entraîner une baisse de la viabilité cellulaire. Les épitopes de certains antigènes de surface pourraient être sensibles à la papaïne entraînant une perte de signal à la cytométrie d'écoulement. Pour des applications spécifiques nécessitant des marqueurs supplémentaires autres que ceux décrits dans cet article, il est recommandé de tester les performances de différents clones d'anticorps avant de commencer l'expérience. Il a été rapporté que le milieu de gradient de densité pourrait contenir quelques traces d'endotoxines qui peuvent déclencher l'activation des cellules immunitaires (microglies/macrophages). Des contrôles internes appropriés doivent toujours être ajoutés dans les expériences chaque fois que ces populations sont analysées, afin d'exclure les effets possibles induits par la procédure. S'en tenir aux températures suggérées et laver les restes de gradient de densité moyenne immédiatement après l'étape d'enlèvement des débris est généralement suffisant pour éviter l'activation manifeste des cellules immunitaires. Toutefois, dans le cas où les applications en aval (p. ex., RNAseq ou analyses fonctionnelles) sont affectées par cette étape, l'utilisateur devrait passer à une préparation moyenne de gradient de densité d'endotoxine faible (suggérée dans tableau des matériaux).
- Anticorps et machine FACS. Le protocole de coloration de cytométrie de flux présenté par la présente fait usage des concentrations d'anticorps et des conjugaisons de couleur qui ont fonctionné le mieux avec des rendements de cellules récupérés dans notre expérience de laboratoire et avec des machines DESA disponibles dans notre institut. L'utilisateur doit mettre les anticorps dans ses mains avant de commencer une nouvelle expérience, car la concentration pourrait avoir besoin d'être légèrement ajustée. En outre, nous encourageons à utiliser toujours des contrôles de coloration d'une seule couleur dans chaque expérience pour vérifier que tous les anticorps et la configuration de compensation de la machine FACS fonctionne correctement. Il faut noter que l'antigène CD90 (Thy) utilisé pour détecter les neurones existe dans deux isotypes différents, à savoir CD90.2 ou CD90.1 selon la souche de souris: les souches de souris les plus couramment utilisés, telles que C57BL6/J express CD90.2; souris telles que AKR/J, PL et FVB/N express CD90.1. Ainsi, l'utilisateur doit vérifier soigneusement la souche de la souris et choisir l'anticorps anti-CD90 approprié (comme suggéré dans Tableau des matériaux) avant de commencer les expériences.
En résumé, le protocole présenté ici tire parti d'une digestion enzymatique douce suivie d'une coloration de 9 couleurs permettant une évaluation cytométrique de flux simultané efficace de différents types de cellules du cerveau de souris et de la moelle épinière. Le protocole pourrait être exploité pour surveiller de manière rationalisée et complète l'efficacité du ciblage cellulaire par les nanoparticules ou les vecteurs viraux administrés dans le SNC15. En outre, le protocole pourrait être facilement adopté pour des applications très délicates en aval, telles que le tri cellulaire, la sous-culture ex vivo, RNAseq à cellule unique, résultant de la plus haute importance non seulement pour l'évaluation préclinique du ciblage cellulaire par la thérapeutique, mais aussi pour la caractérisation en profondeur des processus pathologiques dans les maladies neurodégénératives.
Une fraction de l'ensemble de la population cellulaire du SNC n'est pas discriminée par ce protocole (voir « autres » types de cellules à la figure 2); cela peut s'expliquer par la présence d'autres sous-types cellulaires qui sont présents dans le SNC, mais qui ne sont pas capturés par les anticorps que nous avons utilisés. Dans nos analyses préliminaires, environ 14% de la fraction "autres cellules" est positive pour CD73, un marqueur cellulaire mésenchymal enrichi dans la neurovasculature et impliqué dans plusieurs processus neuroinflammatoires16,17. De plus, nous émettons l'hypothèse que la fraction « autres cellules » pourrait également comprendre des cellules moins différenciées, comme les progéniteurs à différents stades de maturation, comme les cellules souches neurales de nestin, les progéniteurs de gliale radiale nestinMD vimentinMD, les progéniteurs neuronaux doublecortinMD, les cellules précurseurs de l'oligodendrocyte NG2MD, entre autres. Ces sous-types cellulaires pourraient être facilement étudiés en appliquant notre protocole de cytométrie de flux, puisque nous avons choisi une configuration de colorants fluorescents qui permet d'accueillir jusqu'à deux marqueurs cellulaires supplémentaires conjugués soit avec l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la phycoérythrine (PE) fluorophores.
Dans l'ensemble, notre approche pourrait fournir un nouvel outil pour des enquêtes plus complètes dans le contexte du SNC (en santé et maladies) tirant parti d'une technologie bien consolidée permettant des évaluations quantitatives qualitatives et à haut débit. comme la cytométrie du débit.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par les fonds de démarrage de l'Hôpital pour enfants de Boston à A.B., ALSA subvention nr. 17-IIP-343 à M.P., et le Bureau du Sous-Secrétaire à la Défense pour les affaires de santé par le biais du programme de recherche sur la sclérose latérale amyotrophique dans le cadre du Prix No. W81XWH-17-1-0036 à M.P. Nous reconnaissons DFCI Flow Cytometry Core pour son support technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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