Summary
우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.
Abstract
바이러스 벡터 및 나노 물질 과학의 최근 발전은 중추 신경계를 조사하거나 조작하는 새로운 최첨단 접근법 (CNS)의 길을 열었습니다. 그러나, 이러한 기술의 추가 최적화는 체내에서 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 투여 시 CNS 및 세포 별 표적화의 정도를 신속하고 능률적인 측정을 허용하는 방법의 혜택을 누릴 것입니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌 또는 척수, 즉 microglia/대식세포, 림프세포, 성상세포, 올리고덴드로세포, 올리고덴드로소이트, 내피 세포에서 분리된 상이한 세포 아류형의 간단한 정량화를 허용하기 위해 유세포분석의 높은 처리량 및 다중화 기능을 활용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 세포 수율, 생존력 및 조성의 관점에서 두 조직 균질화 방법 사이의 중요한 차이점을 강조하기 위해이 방법을 적용합니다. 이렇게 하면 사용자가 관심 있는 셀 유형 및 특정 응용 프로그램에 따라 최상의 방법을 선택하도록 지시할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직이 균질화되기 때문에 해부학 적 분포의 분석에 적합하지 않습니다. 그러나, 그것은 가능한 세포로 작동할 수 있고, 순수한 세포 인구에서 파생된 1 차적인 배양의 설치에서, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석학에 구역 수색하는 신경과학자의 손에 있는 공구의 레퍼토리를 확장할 수 있는 몇몇 응용을 위한 방법을 여는 세포 분류와 결합될 수 있습니다.
Introduction
유전자 및 약물 전달 기술(예: 바이러스 벡터 및 나노입자)은 신경 퇴행성 질환에서 변경된 특정 분자 경로에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 혁신적인 치료 접근법의개발을 위해 적용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다1,2,3. 이러한 도구의 최적화는 정량화에 의존합니다: (1) 다른 투여 경로에 대한 CNS의 침투 범위 및 (2) 특정 세포 집단의 표적화. 조직학적 분석은 일반적으로 특정 세포마커4,5에대한 면역 염색에 의해 확인된 다른 CNS 지역 및 상이한 세포 모형에 있는 형광 리포터 유전자 또는 형광 태그나노입자를 구상하기 위하여 적용됩니다. 이 접근법은 투여된 유전자 또는 약물 전달 도구의 생체 분포에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 이 기술은 (1) 조직 고정, 동결 보존 또는 파라핀 삽입 및 슬라이스를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 노동이 강렬할 수 있다; (2) 때로는 항원 검색을 필요로 하는 특정 세포 마커에 대한 염색; (3) 형광 현미경 검사법에 의한 획득, 이는 일반적으로 동일한 실험 내에서 제한된 수의 다른 마커의 분석을 가능하게 한다; (4) 관심 있는 신호를 적절히 정량화할 수 있도록 이미지 처리.
유세포 분석은 표면 또는 세포 내 항원의 발현에 기초하여 세포 현탁액에서 다른 세포 표현형의 신속한 정량적 평가뿐만 아니라 기능적 측정 (예를 들어, 세포 사멸의 속도, 증식, 세포 주기 분석 등)를 허용하기 위해 매우 특이적 형광 마커를 활용하는 널리 사용되는 기술이되었습니다. 형광 활성화 세포 선별을 통한 세포의 물리적 분리도 가능하여 추가다운스트림 응용(예: 세포 배양, RNAeq, 생화학 적 분석 등)을 허용합니다. 6,7,8.
조직 균질화는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 하류 유동 세포 측정 평가를 허용하기 위해 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 중요한 단계입니다. 다른 방법은 성인 뇌 조직 균질화를 위해 설명되었으며, 주로 미세 글리아 세포를 분리하는 것을 목표로9,10,11; 그들은 전반적으로 두 가지 주요 범주로 분류 될 수있다 : (1) Dounce 균질화 (DH)를 통해 연삭 또는 전단력을 사용하여 틈새 에서 세포를 찢어 상대적으로 균질화 된 단일 세포 현탁액을 형성하는 기계적 해리, 및 (2) 효소 소화는 37°C에서 다진 조직 덩어리의 인큐베이션에 의존하며, 트립신 또는 파파인과 같은 단백질 분해 효소의 존재, 상당히 균질화된 세포현탁액(12)을생성하기 위해 세포외 매트릭스의 분해를 선호한다.
어떤 방법을 활용하든, 정화 단계는 조직 균질화 후 밀도 구배 또는 자기 선택9,12에의해 원심분리를 통해 미엘린을 제거하기 위해 하류 응용 프로그램으로 이동하기 전에 권장됩니다.
여기서, 우리는 파파인 소화(PD)에 기초한 조직 처리 방법을 설명하고 밀도 구도에 대한 정제를 거쳐, 시간 민감성 방식으로 마우스 뇌 또는 척수로부터 생존 가능한 이기종 세포 현탁액을 얻기 위해 최적화되고 유세포 분석에 적합하다. 또한, 우리는 녹색 형광 단백질 또는 로다민 염료와 같은 형광 기자를 위한 다른 CNS 인구, 살아있는/죽은 세포 또는 양성의 동시 적인 차별을 허용하기 위하여 실험실에서 채택한 9 색 교류 세포 측정 위원회 및 게이팅 전략을 기술합니다. 이 유동 세포 측정 분석을 적용함으로써, 우리는 조직 처리의 다른 방법을 비교할 수 있습니다, 즉, PD 대 DH, 세포 생존력과 다른 세포 유형의 수율의 보존측면에서.
본 명세서에서 당사가 제공하는 세부 사항은 관심 있는 특정 세포 유형 및 다운스트림 분석(예를 들어, 온도 민감성)에 기초하여 유세포측정 패널에서 사용하는 균질화 프로토콜 및 항체 조합에 대한 결정을 지시할 수 있다. 특정 형광 마커 추적, 시험관 내 배양, 기능 분석).
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 다나 파버 암 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다(프로토콜 번호 16-024).
1. 실험에 필요한 솔루션 준비
- 멸균수로 10x HBSS를 희석하여 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 1회 준비합니다. 용액을 얼음에 미리 식힙니다. 각 샘플에 대해 최소 25mL의 용액이 필요합니다.
- 10x 멸균 HBSS 1:10을 밀도 그라데이션 매미(즉, Percoll)와 혼합하여 동위 원소 퍼콜 용액(IPS)을 준비합니다. 얼음에 미리 식히세요.
참고: IPS는 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있습니다. - 유세포분석(FACS) 차단(BL) 용액(1% 소 혈청 알부민[BSA], 5% 태아 소 혈청 [FBS]를 인산완충식염수[PBS])에 준비한다. 얼음에 미리 식히세요.
2. 심장 내 관류 및 조직 해부에 의한 동물 안락사
참고: 8주 된 C57BL/6J 마우스, 어느 성별, 실험에 사용 되었다. PBS 용액을 가진 관류는 조직 소화로 진행하기 전에 장기에서 혈액 오염을 제거하기 위해 수행됩니다.
- 케타민 /자일라진 (90-200 mg / kg 케타민, 10 mg / kg 자일라진)의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취. 마우스를 뒷면에 놓고 각 팔다리를 지지대에 테이프로 놓습니다. 철수 반사를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
- 흉골 입구의 수준에서 중간 선 피부 절개를 확인흉을 노출합니다. 집게를 사용하여 흉골의 끝을 잡은 다음 흉곽의 각 측면에 1cm 절개를합니다. 마지막으로 다이어프램을 잘라 심장을 시각화 할 만큼 널리 흉골을 엽니 다.
- 우심실로 심장을 부드럽게 잡고 중간선과 가슴에서 약간 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다.
- 좌심실 의 끝에 23G 나비 바늘을 삽입하고 대동맥쪽으로 단단히 잡습니다.
- 1x PBS로 관류를 시작합니다. 가위를 사용하여 오른쪽 구멍을 관통하여 향수가 순환을 종료 할 수 있도록합니다. PBS의 유량을 3 mL/min. Perfuse에서 1x PBS의 최소 15mL로 설정하여 조직이 명확하도록 합니다.
참고 : 간및 간장의 희게하는 것은 좋은 관류의 징후입니다. 필요한 경우, 심장을 빠져 나가는 유체가 혈액이 제거 될 때까지 프리퓨전의 양을 증가 시킬 수 있으며, 이 시점에서 플러시 라인을 멈출 수 있습니다. - 관류 후 척수에서 뇌를 분리하고 가위와 집게로 두개골에서 뇌를 제거하십시오. 해부 시 가시성과 제어력을 높이고 모발 오염 물질을 운반하는 것을 피하기 위해 모피를 제거하십시오. PBS로 채워진 3 mL 주사기를 사용하여 척수를 기둥에서 내뿜습니다.
- 얼음 차가운 1x HBSS 2 mL로 미리 채워진 6 웰 멀티 웰 플레이트의 우물에서 각 조직을 옮기고 소화 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
- 세로선을 따라 뇌와 척수를 두 개의 반쪽으로 나눕니다.
참고 : 각 조직의 절반은 유세포 분석을 허용하기 위해 균질화 (아래 섹션 참조); 나머지 절반은 대체 분석을 위해 다른 처리에 할당 될 수 있습니다 (예를 들어, 조직학을위한 파라 포름 알데히드 고정 용액에 담근).
3. 뇌와 척수의 효소 소화
참고: 이 섹션에 설명된 부적은 반쪽 뇌 또는 척수의 소화에 충분합니다.
- 가위를 사용하여 조직을 1−2mm 두께의 조각으로 자릅니다.
- 1000 μL 파이펫의 끝을 가위 한 쌍으로 잘라서 조직 조각을 수집 할 수 있도록 충분히 크게 만듭니다. 1x HBSS로 파이펫 팁을 미리 헹구어 보시고 자합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 다진 조직을 함유하는 HBSS 용액의 2 mL을 15 mL 원점 튜브로 이송합니다.
참고: 파이펫 팁의 사전 헹구는 것은 팁 내부의 티슈 조각의 끈적거림을 방지하는 데 중요합니다. - 얼음 차가운 1x HBSS의 추가 2 mL로 잘 세척하고 조직 조각을 포함하는 해당 15 mL 원추형 튜브에 용액을 옮김을 옮김.
- 4 °C에서 250 x g에서 5 분 동안 각 샘플을 원심 분리기.
- 신경 조직 해리 키트의 효소 믹스 1을 준비 (NTDK; 재료 표) 50 μL의 효소 P를 샘플 당 1900 μL의 버퍼 X와 혼합하여. 따뜻한 효소는 수조에서 37 °C에서 1을 혼합합니다. 효소의 완전한 활성화를 허용하기 위해 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 37 °C에서 1을 배양 효소 혼합.
- 15 mL 원엽 튜브에서 상류를 흡인하고 각 샘플에 1.95 mL의 효소 혼합물 1을 추가합니다. 펠릿이 다시 일시 중단되었는지 확인하기 위해 부드럽게 소용돌이.
- 37 °C에서 15 분 동안 휠 또는 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.
- 한편, NTDK의 효소 믹스 2를 시료당 20 μL의 완충Y와 A 효소 의 10 μL과 혼합하여 준비; 수조에서 37 °C에서 용액을 미리 데우다.
- 효소 믹스 1로 배양이 끝나면 각 샘플에 효소 믹스 2 30 μL을 추가합니다.
- 1x HBSS로 미리 헹구는 1000 μL 파이펫 팁으로 시료를 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
- 37 °C에서 15 분 동안 휠 또는 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.
- 배양 후, 각 튜브에 얼음-차가운 1x HBSS 10 mL을 추가하여 효소 믹스 1과 효소 믹스 2를 비활성화합니다.
- 4°C에서 320 x g에서 10분 동안 각 샘플을 원심분리기.
- 상급자 폐기; 얼음으로 차가운 1x HBSS를 각 튜브에 7 mL의 최종 부피까지 추가하고 소용돌이로 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
- 이물질 제거를 위해 섹션 5를 계속합니다.
4. 뇌와 척수의 기계적 균질화
참고 : 이 섹션에 설명 된 볼륨은 반 뇌 또는 척수의 균질화에 충분합니다. 이 섹션에 설명된 프로토콜은 아래에 설명된 바와 같이 사용자 필요에 따라 섹션 3에 설명된 대안으로 사용될 수 있다.
- 얼음위에 놓인 Dounce 티슈그라인더(재료표)의유리 모르타르를 미리 식힙니다.
- 박격포에 미리 냉각된 1x HBSS 3mL를 추가합니다.
- 6웰 플레이트의 우물에서 유리 모르타르로 조직(뇌 또는 척수)을 옮겨 1x HBSS에 담그고 박격포 바닥에 앉습니다.
- 부드럽게 10 스트로크의 유봉 A로 조직을 분쇄하고 유봉 B. 균질화 된 혼합물을 새로운 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김.
- 4°C에서 320 x g에서 10분 동안 미리 냉각된 1x HBSS 및 원심분리기를 사용하여 튜브를 최종 부피 10 mL로 채웁니다.
- 상월체를 흡인하고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 1x HBSS를 추가하여 최종 부피 인 7 mL까지 가열하여 펠릿을 부드럽게 재돌이합니다.
- 이물질 제거를 위해 섹션 5를 계속합니다.
5. 파편 제거
참고: 주로 소화되지 않은 조직과 미엘린 칼집으로 구성된 이물질을 제거하는 것은 후속 유동 세포 측정 분석을 위해 조직 균질한 조직의 효율적인 염색을 허용하는 중요한 단계입니다.
- 70 μm 세포 스트레이너를 통해 각 샘플을 필터링하여 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거합니다. 이 견본은 후속 단계에 영향을 미칠 수 있는 소화되지 않은 신경 단편 또는 수막을 포함하기 위하여 확률이 높기 때문에 이 단계는 척수 조직으로 일할 때 특히 중요합니다.
- 각 샘플 튜브의 최종 부피가 7mL인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 얼음 차가운 1x HBSS를 최대 7 mL로 채우소서.
- 각 샘플에 미리 냉각된 IPS 3mL를 추가하여 최종 농도30%에서 밀도 그라데이션 매질을 함유하는 용액의 최종 부피를 10mL로 만듭니다. 샘플을 균일하게 혼합할 수 있도록 샘플을 부드럽게 소용돌이시다.
- 원심분리기 샘플은 18°C에서 700 x g에서 15분 동안 시료를 사용하여 원심분리기의 가속을 7로 설정하고 브레이크를 0으로 설정합니다.
참고 : 원심 분리는 약 30 분이 소요됩니다. - 원심분리기에서 샘플을 섬세하게 제거합니다.
참고: 파편과 미엘린으로 구성된 희끄무레한 디스크는 용액 표면에 떠 있는 것을 볼 수 있어야 합니다. 펠릿 (관심있는 세포를 포함하는)은 튜브의 바닥에 표시되어야합니다. - 조심스럽게 파편의 모든 희끄무레한 디스크를 흡인하고 상급의 나머지는 펠릿을 빼내지 않도록합니다. 약 100 μL의 용액을 세포 펠릿 위에 두어 실수로 제거할 위험을 피하십시오.
- FACS BL 1mL를 추가하고, 100μL 파이펫 팁으로 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 일시 중단하고 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.
- 실온 (RT)에서 450 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상판을 부드럽게 흡인하고 다운스트림 분석과 호환되는 적절한 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다(여러 세포 유형의 유동 세포 측정 평가에 사용되는 프로토콜의 섹션 6 참조).
6. 여러 세포 유형의 유세포 측정 평가를위한 염색
- FACS BL의 350 μL로 5.9 단계에서 얻은 펠릿을 다시 중단. 5 μg/mL의 최종 농도에서 각 샘플에 Fc 블록을 추가합니다.
참고: 신뢰할 수 있는 분석을 허용하기에 충분한 세포를 처리하기 위해 시료의 최소 100 μL을 하나의 염색에 사용해야 합니다. - 염색을 진행하기 전에 4°C에서 10분 동안 샘플을 배양하였다.
- 표 1에따라 항체 혼합을 준비한다.
- 각 튜브에 항체 혼합물을 추가하고, 5 s의 소용돌이를 넣고 어둠 속에서 4 °C에서 15 분 동안 샘플을 배양합니다.
- 각 튜브, 소용돌이 및 원심분리기에 1 mL의 PBS를 추가하여 RT에서 450 x g에서 5 분 동안 추가하십시오.
- 한편 표 1에따라 스트렙타비딘 믹스를 준비한다.
- 상급체를 버리고 6.6단계에서 제조된 스트렙타비딘 혼합물에 펠릿을 다시 놓습니다. 각 샘플에 대해 6.4단계에서 염색에 사용되는 것과 동일한 부피를 사용하십시오.
- 소용돌이 5 s를 위해 4°C에서 10분 동안 샘플을 암흑에서 배양하였다.
- 각 튜브, 소용돌이 및 원심분리기에 1 mL의 PBS를 추가하여 RT에서 450 x g에서 5 분 동안 추가하십시오.
- 상급체를 버리고 FACS BL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 각 샘플에 7-아미노 액티노마이신 D(7-AAD) 용액을 첨가합니다. 6.10단계에서 제조된 시료 300μL마다 7-AAD 5 μL을 사용하십시오.
- 세포 불소화 분석까지 어두운 4 °C에서 샘플을 저장합니다. 시료 전형에서 16시간 이내에 분석을 수행하여 >60% 세포 생존가능성을 보장합니다.
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Representative Results
우리는 마우스 뇌와 척수에 적용된 두 가지 균질화 방법(DH 대 PD)을 비교하여 다운스트림 애플리케이션에 적합한 다양한 생존 세포 유형을 검색하는 효율성을 테스트했습니다. 이를 위해, 우리는 마이크로글리아, 림프구, 뉴런, 성상 세포, 올리고덴드로시테 및 내피를 포함한 다른 CNS 세포 유형을 특성화하도록 설계된 9 색 유동 세포 분석 패널을 이용했습니다.
뇌 및 척수 조직은 상이한 마우스로부터 회수되었고(n ≥ 6), 세로로 두 개의 반으로 분할, 계량 및 Dounce 균질화(DH 방법)를 사용하여 기계적 중단을 적용하여 병렬로 처리되거나, 파파인(PD 방법)에 기초한 상용 NTDK를 사용하여 효소적으로 부드럽게 다듬고 소화하였다(그림1A). 파편 제거 후, 뇌 또는 척수로부터의 세포를 각각 1/10 또는 1/2-1/5로 희석하여, 트리판 블루에서 Neubauer 챔버로 세포 수율 및 생존가능성을 결정하였다(그림1B,C). DH 방법은 전반적으로 뇌와 척수 모두에서 더 높은 세포 수율을 생성했습니다. 그러나, 검색된 세포의 대다수는 죽은, 단지 13.8% ± 3.3% 두뇌에 있는 실행 가능한 세포의 결과로 및 척수에 있는 10.5% ± 1.5%(그림1B). 많은 죽은 세포가 골재를 형성하였다(도1C); 이 현상은 DH를 적용한 전단력에 의해 분해될 수 없었던 고도로 상호 연결된 세포 네트워크(CNS 혈관을 일렬로 세우는 내피 및 신경교 세포와 같은)의 존재 때문일 수 있습니다. 이러한 사멸 세포의 응집체는 밀도 구배에 의해 제거되지 않았고 세포불용형 분석에 사용되는 최종 세포 펠릿에서 끝났을 가능성이 있다. 반대로, PD 방법은 세포 생존의 전반적인 더 나은 보존을 결정 (90.6% ± 0.6% 뇌에서 와 85.2% ± 2.8% 척수에서). 파파인은 세포외 매트릭스와 세포 간 접합을 효율적으로 소화할 수 있게 되어 보다 균일한 단일 세포 현탁액을 이끌어 냅니다. 다듬는 과정 도중 정지하는 세포의 몇몇은 조밀도 구배를 통해서 더 효율적으로 분리되는 세포 파편의 대형으로 이끌어 내는 papain에 의해 더 소화될 수 있었습니다. 전반적으로, 이것은 DH 방법과 비교하여 약간 낮은 세포 수율에도 불구하고 PD 방법을 사용하여 세포 생존율의 더 나은 보존을 결정했을 가능성이 높습니다.
뇌 및 척수 세포 현탁액으로부터 100 μL의 aliquot를 항체 혼합물로 염색하였다(표1)하고9색 패널로 유세포측정에 의해 분석하였다. 그림 2A는 뇌 및 척수 세포 현탁액으로부터 상이한 세포 유형을 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략을 나타낸다. 간략하게, 제1 게이트는 작은 세포 파편을 제외한 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)에 따라 일반 인구를 식별한다. 그런 다음 라이브(7-AAD-) 세포가 식별됩니다. 총 라이브 셀 집단 내에서 CD45+ 및 CD45-셀이 강조 표시됩니다. CD45+ 게이트 내에서 CD45+CD11b+ 마이크로글리아/대식세포 및 CD45+CD11b-림프구가 식별됩니다. CD45-게이트 내에서, 세포는 ACSA2 (성상 세포) 또는 O4 (oligodendrocytes)에 대한 양성에 따라 구별된다. CD45-ACS2-O4-세포는 Thy1(뉴런) 또는 CD31(내피)에 대한 양성에 따라 더욱 세분화된다. 나머지 Thy1-CD31-세포는 우리의 항체 혼합에 의해 고려되지 않는 "다른 세포 유형"으로 분류된다.
도 2B에도시된 바와 같이, DH 방법을 사용하여 뇌로부터 회수된 생존 세포의 약 38%와 척수로부터 회수된 생존 세포의 약 32%가 조혈 기원(CD45+)이었다. 한편, PD 방법은 비 조혈 CD45-세포로 표현되는 매우 큰 분획(뇌에서 약 82%, 척수에서 92%)으로 매우 큰 분획을 가진 두 조직에서 생존 가능한 세포의 상당히 높은 수율을 검색할 수 있었다. 놀랍게도, CD45+CD11b+ 마이크로글리아/대식세포는 DH 방법(도 2C)으로가장 풍부한 생존 가능한 세포 분획을 나타냈다. 그러나, PD 방법은 ACSA+ 성상 세포, O4+ 올리고덴드로시트, CD31+ 내피 세포 및 Thy1+ 뉴런을 포함하는 세포 유형의 보다 이질적인 표현을 생성하였다(그림2C). 흥미롭게도, 실행 가능한 뉴런 및 내피 세포는 DH 방법으로 거의 검출되지 않았다.
상기 DH 방법은 Dounce 균질화기의 유리 유봉과 모르타르 사이의 조직의 기계적 분쇄에 의존하여 조직 균질화를 얻는다. 이것은 신경혈관의 신경세포 와 같은 크거나 아주 과민한 세포의 가능성 손상 그리고 영향을 미칠 몇몇 전단 응력을 일으키는 원인이 될 수 있었습니다. 항체 패널을 통해 확인된 각 세포 소집단 내의 세포 생존율(7-AAD-세포의 백분율)을 평가하였다(그림3). 조혈 세포(CD45+)는 마이크로글리아/대식세포(CD45+CD11b+) 및 기타 비골수성 세포(CD45+Cd11b-)를 포함하여 뇌 및 척수로부터 분리되었으며, 사용된 균질화 방법과는 독립적으로 매우 높은 생존력을나타냈다(도 3A). 반대로, DH 방법은 CD45-모집단의 생존율의 현저한 감소를 결정하였다(도3B)반면PD 방법은 상이한 CNS 세포 유형의 광범위한 보존을 결정했다. 구체적으로, 뉴런 및 내피 세포는 DH에 의해 가장 크게 영향을 받고 PD 방법에 의해 보존된 하위 집단이었다.
적절한 시료 준비 및 효율적인 이물질 제거에 필요한 중요한 단계의 개략적 프레젠테이션은 그림 4에요약되어 있습니다.
그림 1: 뇌와 척수에서 회수된 세포의 수율은 균질화 방법에 의해 영향을 받습니다.
(A)실험 개요. 마우스는 마취되고 혈관 내 순환 혈액 세포를 제거하기 위해 PBS와 함께 심근 내 관영을 하였다. 뇌와 척수는 조심스럽게 해부되고 세로 방향으로 두 부분으로 분할되었습니다. 조직은 주문헌에 상세히 설명된 바와 같이 Dounce 균질화제(DH) 또는 파파인 소화(PD)를 사용하여 균질화되었다. 미엘린 및 조직 파편은 30% 밀도 구배 배지 용액에서 원심분리에 의해 제거된 후 유세포 측정에 의해 분석될 수 있는 상이한 세포 유형을 포함하는 이기종 세포 현탁액을 초래하였다. (B)DH 또는 PD 방법으로 조직 균질화 시 뇌 또는 척수로부터 회수된 세포의 수율을 나타내는 히스토그램. 조건당 적어도 6마리의 동물의 평균 ±SEM이 표현된다. (C) Representative brightfield microscope photomicrographs of Trypan blue positive (dead) and negative (live) cells retrieved from brain or spinal cord by the two methods. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: CNS로부터 회수된 상이한 세포 유형의 상대적 비율은 조직 균질화 방법에 의해 영향을 받습니다.
(a)대표적인 유동 세포 분석 플롯은 뇌 또는 척수로부터 수득된 세포 제제 내에서 상이한 세포 소집단을 식별하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 플롯: 세포 집단은 FSC 및 SSC 물리적 파라미터에 문이 정이고, 그 다음에 7-AAD-살아있는 세포에 대한 선택; 세포는 CD45 마커에 대한 양성에 따라 구별된다; microglia/대식세포는 CD45+ 분획 내의 CD11b+ 세포로 확인되는 반면 림프구는 CD11b-입니다. 성상 세포, 올리고덴드로시테, 내피 및 뉴런 세포는 각각 CD45-내 ACSA2+, O4+, CD31+ 또는 Thy1+ 세포로 확인된다. (B)DH 또는 PD 방법으로 균질화 시 뇌 또는 척수에서 총 라이브 또는 죽은 세포 집단 내에서 CD45+ 및 CD45-세포의 백분율을 보여주는 히스토그램. 그래프에 나타난 결과의 통계 분석은 표 2에보고되어 있다. (C)총 세포 집단 내에서, DH 또는 PD 방법으로 균질화 시 뇌 또는 척수에서 상이한 생존 세포 아류형의 백분율을 나타내는 원형 차트. 총 죽은 세포의 비율도 보고 됩니다. N ≥ 6. CD45+CD11b+ = 마이크로글리아/대식세포; CD45+CD11b- = 림프구/비골수성 세포; CD45-ACSA2+ = 성상 세포; CD45-O4+ = 올리고엔드로시트; CD45-Thy1+ = 뉴런; CD45-CD31+ = 내피 세포; 기타 = 위에서 언급 한 모든 마커에 대한 음의 셀. 그래프에 나타난 결과의 통계 분석은 표 2에보고되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 상이한 CNS 세포 유형의 세포 생존성은 적용된 균질화 방법에 의해 영향을 받습니다.
(A)CD45+ 조혈 집단 내의 7-AAD-살아있는 세포의 백분율을 보여주는 히스토그램은 CD11b+ 마이크로글리아/대식세포 및 CD11b-비골수성 세포를 포함한다. (B)성상세포, 올리고덴드로소이트, 뉴런, 내피 및 기타 세포 유형을 포함하는 CD45-비조혈성 집단 내의 7-AAD-살아있는 세포의 백분율을 나타내는 히스토그램. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, DH와 PD 사이의 Mann-Whitney. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 적절한 조직 처리에 필요한 중요한 단계의 개략적 표현.
적절한 조직 처리 및 효율적인 파편 제거에 필요한 가장 중요한 단계 목록이 표시됩니다. 30% 밀도 구이도에서 시료의 원심분리 후 형성된 이물질 디스크(검은 색 화살표)와 세포 펠릿(파란색 화살표)을 적절히 식별하는 것이 중요하다. 파편 디스크, 상류의 나머지와 함께, 조심스럽게 샘플 손실을 방지하기 위해 세포 펠릿을 해제하지 않고 흡인에 의해 제거해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체 혼합 | 초기 농도(μg/mL) | 최종 농도(μg/mL) | 희석 계수 |
| 안티 CD45 / BV510 | 200 | 2 | 100 |
| 안티 CD11b / APC.780 | 200 | 2 | 100 |
| 안티 CD31/ BV421 | 200 | 2 | 100 |
| 안티 ACSA2 / APC | 150 | 0.75 | 200 |
| 안티 O4 / 비오틴 | Na | Na | 40 |
| 안티 CD90.2 / PE. Cy7 | 200 | 2 | 100 |
| 스트렙타비딘 믹스 | 초기 농도(μg/mL) | 최종 농도(μg/mL) | 희석 계수 |
| 스트렙타비딘/알렉사 680 | 1000 | 1 | 1000 |
표 1: 유세포 분석 염색을 위한 혼합물의 제조법. 표는 여러 세포 유형의 유동 세포 측정 분석을 허용하는 데 사용되는 항체 및 스트렙타비딘의 최적 농도를 설명합니다. 표에 언급된 각 시약의 카탈로그 번호에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
| 그림 2B에 대한 통계 | ||||||||||
| 뇌 (% 세포) | ||||||||||
| CD45+ | CD45- | |||||||||
| 라이브 | 죽은 | 라이브 | 죽은 | |||||||
| 메서드 | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | ||
| Dh | 15.20 | @ 2.32 | 1.90 | ± 0.30 | 24.78 | ± 4.045 | 51.58 | @ 6.033 | ||
| Pd | 15.20 | ± 2.65 | 2.33 | ± 1.10 | 68.53 | @ 3.618 | 13.93 | ± 2.180 | ||
| 만 휘트니 | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p 값 | 0.9989 | 0.738 | 0.0006 | 0.0015 | ||||||
| 척수 (% 세포) | ||||||||||
| CD45+ | CD45- | |||||||||
| 라이브 | 죽은 | 라이브 | 죽은 | |||||||
| 메서드 | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | ||
| Dh | 15.00 | ± 8.21 | 1.41 | ± 0.11 | 31.64 | ± 8.21 | 51.95 | @ 16.52 | ||
| Pd | 7.49 | @ 4.99 | 1.15 | ± 0.68 | 84.27 | @ 9.39 | 7.09 | @ 3.75 | ||
| 만 휘트니 | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p 값 | 0.5548 | 0.7236 | 0.0438 | 0.1144 | ||||||
| 그림 2C에 대한 통계 | |||||||||||||||||
| 뇌 (% 세포) | |||||||||||||||||
| CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b+ | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | 다른 | 죽은 | ||||||||||
| 메서드 | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | |
| Dh | 19.32 | @ 3.88 | 1.17 | ± 0.27 | 9.52 | @ 2.68 | 3.41 | ± 1.01 | 1.39 | ± 0.77 | 0.48 | ± 0.29 | 10.52 | @ 4.49 | 53.83 | @ 5.79 | |
| Pd | 10.88 | ± 2.03 | 1.65 | ± 0.48 | 8.17 | @ 2.66 | 6.54 | ± 0.76 | 6.37 | @ 1.76 | 8.27 | ± 1.25 | 33.28 | @ 6.34 | 23.72 | @ 5.31 | |
| 만 휘트니 | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p 값 | 0.1206 | 0.4819 | 0.5894 | 0.0264 | 0.0093 | 0.0003 | 0.0084 | 0.0022 | |||||||||
| 척수 (% 세포) | |||||||||||||||||
| CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b+ | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | 다른 | 죽은 | ||||||||||
| 메서드 | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | 의미 | ± SEM | |
| Dh | 21.23 | @ 6.25 | 2.51 | ± 0.57 | 4.26 | @ 2.34 | 9.40 | @ 1.89 | 2.82 | ± 1.51 | 0.97 | ± 0.50 | 22.74 | ± 9.04 | 35.28 | @ 1.89 | |
| Pd | 9.63 | @ 1.67 | 2.77 | ± 0.48 | 4.23 | @ 1.59 | 28.62 | @ 3.57 | 1.26 | ± 0.49 | 6.94 | @ 2.14 | 26.39 | @ 8.17 | 19.09 | @ 4.76 | |
| 만 휘트니 | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p 값 | 0.1905 | >0.9999 | 0.7302 | 0.0159 | 0.7302 | 0.0317 | 0.7302 | 0.1111 | |||||||||
표 2: DH 또는 PD 방법을 적용하여 검색된 상이한 모집단의 통계 분석. 이 표는 그림 2B 및 그림 2C에표시된 그래프에 대한 통계를 설명합니다. 적어도 6개의 독립적인 샘플의 평균 및 SEM이 표현된다. 각 비교에 적용된 통계 테스트에 대한 p 값 및 세부 정보도 보고됩니다.
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Discussion
본 명세서에서 우리는 마우스 뇌 및 척수로부터 가장 관련성이 높은 CNS 세포의 일부의 동시 정제 및 동시 유동 세포측정 분석을 위한 프로토콜을 기술한다. 전통적으로, 조직학 분석은 CNS5,13에서바이러스 벡터의 나노입자 또는 트랜스덕션 효율의 분포를 설명하거나, 병리학 또는 약리학적 치료 시 특정 세포 유형에서 발생하는 형태학적 및 분자 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 적용되었다14. 그러나 조직학은 처리성이 결여되어 있으며 동시에 분석할 수 있는 마커의 수가 제한되어 있기 때문에 동일한 조직학적 샘플에서 여러 특징을 포괄적으로 검사할 수 없습니다. 우리의 접근 방식은 전통적인 장기학적 분석에 보완될 수 있으며, 개별 샘플에서 얻을 수 있는 정보의 컴파일을 확장하기 위해 여러 다운스트림 애플리케이션(분류, 1차 문화, 생화학 적 또는 차세대 시퀀싱 분석)과 결합될 수 있습니다. 그러나 아래에 나열된 몇 가지 주요 요소는 이 접근 방식의 성공에 심각한 영향을 줄 수 있기 때문에 고려해야 합니다.
- 시작 조직의 양. 우리는 세포 분리를 최적화하여 척수 절반 또는 뇌 의 절반으로 시작했습니다. 우리의 경험에서, PD 방법을 가진 성인 8 주 오래된 마우스에서 반 두뇌 또는 반 척수를 처리하는 것은 뇌에서 1-6 x10 6 가능한 세포와 밀도 구배 단계 후 척수에서 약 0.1-0.5 x10 6 가능한 세포를 산출합니다. 우리는 8 주 미만의 신생아 또는 마우스에서 조직에 PD 방법을 적용 한 후 세포 수율을 측정하지 않았습니다. 그러나, 우리의 손에, 결과는 시작 조직의 무게에 비례합니다. 따라서, 어린 동물 (예를 들어, 10 일 된 새끼)의 경우 전체 뇌 또는 척수를 처리하여 신뢰할 수있는 하류 분석을위한 좋은 세포 수율을 보장해야합니다. 필요한 경우, 여러 동물에서 조직을 풀링 하는 데 도움이 세포 수율을 증가 도움이 될 것입니다. 우리의 경험에서, 이 프로토콜은 또한 시작 조직의 무게 당 사용된 시약의 비율이 존중되는 한, 쥐의 두뇌 또는 척수에서 세포를 격리하기 위하여 수정 없이 적용될 수 있습니다. 250 mg 이상의 무게의 조직에 대해 여러 샘플에서 조직을 확장하거나 분할하는 것이 좋습니다 (각 가중치 및 lt;250 mg).
- 밀도 구배 전에 수막 / 잔류 조직 덩어리를 제거. 우리의 경험에서, 이에 기술된 PD 방법은 척수에서 나오는 신경 및 신경 뿌리와 같은 능동적인 수막 또는 매우 높게 골수성 조직을 소화할 수 없습니다. 이 조직이 존재할 때, 몇몇 소화되지 않은 끈적끈적한 조각은 파편 제거의 앞에 효소 소화 단계 후에 회수된 세포 현탁액에서 남아 있을 수 있습니다. 70 μm 세포 스트레이너(단계 5.1에서 제안된 대로)를 통해 용액을 필터링하여 이러한 청크를 제거하는 것은 성공적인 세포 제제에 매우 중요합니다. 사실, 제거하지 않을 경우, 수막 또는 조직 조각은 가난한 세포 수율의 결과로 효율적인 밀도 구배 분리를 방해합니다.
- 타이밍, 온도 및 불임. 제안된 대로 적절한 온도 설정 및 인큐베이션을 사용하여 모든 단계를 적시에 수행하는 것이 매우 중요합니다. 이는 샘플의 높은 세포 생존율과 무결성을 보장하는 데 중요합니다. 다운스트림 적용에 따라 멸균 후드 하에서 멸균 시약으로 모든 단계를 수행해야 할 수 있습니다(예: 1차 세포 배양 확립). 제안된 시간(섹션 3)을 초과하여 효소 소화 용액에서 의 연장된 배양은 세포 생존력의 하락을 초래할 수 있다. 몇몇 표면 항원의 epitopes는 유세포측정에서 신호의 손실의 결과로 파파인에 과민할 수 있었습니다. 이 문서에 설명된 것 이외의 추가 마커를 요구하는 특정 어플리케이션의 경우, 실험을 시작하기 전에 상이한 항체 클론의 성능을 테스트하는 것이 좋습니다. 그것은 밀도 그라데이션 매체 면역 세포의 활성화를 일으킬 수 있는 endotoxins의 일부 흔적을 포함 될 수 있다 보고 되었습니다 (microglia/대 식 세포). 적절한 내부 제어는 항상 이러한 인구를 분석 할 때마다 실험에 추가해야, 절차에 의해 유도 가능한 효과를 제외. 제안된 온도를 고수하고 이물질 제거 단계 직후에 남은 밀도 구배를 세척하는 것은 일반적으로 면역 세포 활성화를 피하기에 충분합니다. 그러나 다운스트림 애플리케이션(예: RNAseq 또는 기능 분석)이 이 단계의 영향을 받는 경우, 사용자는 저내독소 밀도 그라데이션 배지 제제(재료 표에서제안됨)로 전환해야 한다.
- FACS 항체 및 기계. 이에 제시된 유동 세포분석 염색 프로토콜은 실험실 경험과 우리 연구소에서 사용할 수 있는 FACS 기계에서 회수된 세포 수율과 가장 잘 작동하는 항체 농도 및 색상 활용을 활용합니다. 사용자는 새로운 실험을 시작하기 전에 손에 있는 항체를 적시해야 합니다, 농도는 약간 조정될 필요가 있기 때문에. 게다가, 우리는 모든 항체와 FACS 기계의 보상 설정이 적절하게 작동하는지 확인하기 위해 각 실험에서 항상 단일 색상 염색 컨트롤을 사용하는 것이 좋습니다. 뉴런 검출에 사용되는 CD90(Thy) 항원이 마우스 균주에 따라 CD90.2 또는 CD90.1과 같은 두 개의 서로 다른 동인형에 존재한다는 것을 알아차릴 수 있습니다: C57BL6/J 익스프레스 CD90.2와 같은 가장 일반적으로 사용되는 마우스 균주; AKR/J, PL 및 FVB/N 익스프레스 CD90.1과 같은 마우스 균주. 따라서, 사용자는 신중하게 마우스 변형을 확인하고 실험을 시작하기 전에 적절한 항 CD90 항체 (재료 표에서제안 됨)를 선택해야합니다.
요약하자면, 여기에 제시된 프로토콜은 마우스 뇌와 척수로부터 상이한 세포 유형의 효율적인 동시 유동 세포 측정 평가를 허용하는 9색 염색에 이어 부드러운 효소 소화를 활용한다. 프로토콜은 CNS15에서투여된 나노입자 또는 바이러스 벡터에 의한 세포 표적화의 효율을 능률적이고 포괄적인 방식으로 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 더욱이, 프로토콜은 세포 선별, 생체 배양, 단세포 RNAeq와 같은 매우 섬세한 다운스트림 응용을 위해 쉽게 채택될 수 있으며, 이는 치료제에 의한 세포 표적화의 전임상 평가뿐만 아니라 신경 퇴행성 질환의 병리학 적 과정의 심층적 특성화에도 매우 중요합니다.
전체 CNS 세포 집단의 일부가 이 프로토콜에 의해 구별되지 않는다(그림 2의"기타" 세포 유형 참조); 이것은 CNS에서 존재하지만 우리가 사용하는 항체에 의해 포착되지 않는 그밖 세포 특수형의 존재에 의해 설명될 수 있습니다. 우리의 예비 분석에서, "다른 세포" 분획의 약 14%는 CD73에 대해 양성이며, 중간엽 세포 마커는 신경혈관에서 풍부하게 농축되고 여러 신경염증성 과정에관여한다 16,17. 더욱이, 우리는 "그밖 세포" 분획이 또한 둥지+ 신경 줄기 세포, nestin+ vimentin+ 방사형 신경교 전구체, doublecortin+ 신경 전구체, NG2+ oligodendrocyte 전구체 세포와 같은 성숙의 다른 단계에서 전구체 같이 보다 적게 분화한 세포를 포함할 수 있었다는 것을 가설합니다. 이 세포 부형은 우리의 유세포 분석 프로토콜을 적용해서 쉽게 조사될 수 있었습니다, 우리는 불소 이소티옥시아네이트 (FITC) 또는 phycoerythrin (PE) 불소와 결합된 2개의 추가 세포 마커를 수용할 수 있는 형광 염료의 구성을 선택했기 때문에.
전반적으로, 우리의 접근 방식은 정성적 및 높은 처리량 정량적 평가를 모두 허용하는 잘 통합된 기술을 활용하는 CNS (건강 및 질병)의 맥락에서 보다 포괄적인 조사를 위한 새로운 도구를 제공할 수 있었습니다. 유세포분석과 같은
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 A.B., ALSA 교부금 nr에 보스턴 아동 병원 창업 기금에 의해 투자되었습니다. 17-IIP-343에서 M.P.에, 그리고 상 번호에 따라 근위축성 측삭 경화증 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실. W81XWH-17-1-0036 ~ M.P. 우리는 기술 지원을 위해 DFCI 흐름 세포 측정 코어를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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