Summary
Vi presenterer en Flow flowcytometri metode for å identifisere samtidig ulike celletyper Hentet fra mus hjernen eller ryggmargen. Denne metoden kan utnyttes til å isolere eller karakterisere rene celle populasjoner i nevrodegenerative sykdommer eller for å kvantifisere omfanget av celle målretting ved in vivo administrasjon av viral vektorer eller nanopartikler.
Abstract
Nylige fremskritt i viral vektor og nanomaterialebasert vitenskaper har åpnet veien for nye cutting-edge tilnærminger til å undersøke eller manipulere sentralnervesystemet (CNS). Men ytterligere optimalisering av disse teknologiene vil dra nytte av metoder som tillater rask og effektivisere fastsettelse av omfanget av CNS og celle-spesifikk målretting ved administrering av viral vektorer eller nanopartikler i kroppen. Her presenterer vi en protokoll som utnytter den høye gjennomstrømningen og multipleksing evnene til flyt flowcytometri for å tillate en grei kvantifisering av forskjellige celle under typer isolert fra mus hjernen eller ryggmargen, nemlig mikroglia/makrofager, lymfocytter, astrocytter, oligodendrocytes, neurons og endothelial celler. Vi bruker denne tilnærmingen til å fremheve kritiske forskjeller mellom to vev homogenisering metoder i form av celle utbytte, levedyktighet og sammensetning. Dette kan instruere brukeren til å velge den beste metoden avhengig av celletypen (e) av interesse og det bestemte programmet. Denne metoden er ikke egnet for analyse av anatomiske fordelingen, siden vevet er homogenisert til å generere en enkelt celle suspensjon. Men det gjør det mulig å arbeide med levedyktige celler og det kan kombineres med celle-sortering, åpne veien for flere programmer som kan utvide repertoaret av verktøy i hendene på hjerneforsker, alt fra etablering av primær kulturer avledet fra ren celle populasjoner, til gen-uttrykk analyser og biokjemiske eller funksjonelle analyser på veldefinerte celle under typer i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer, ved farmakologisk behandling eller genterapi.
Introduction
Gen-og legemiddel leveranse teknologi (som viral vektorer og nanopartikler) har blitt et kraftig verktøy som kan brukes til å få bedre innsikt i spesifikke molekylære baner som er endret i nevrodegenerative sykdommer og for utvikling av innovative terapeutiske tilnærminger1,2,3. Optimalisering av disse verktøyene er avhengig av kvantifisering av: (1) omfanget av penetrasjon i CNS på ulike administrasjonsveier og (2) målretting av bestemte celle populasjoner. Histologiske analyser brukes vanligvis for å visualisere fluorescerende reporter gener eller fluorescensmerkete nanopartikler i ulike CNS-områder og på tvers av ulike celletyper, identifisert av immunostaining for bestemte celle markører4,5. Selv om denne tilnærmingen gir verdifull informasjon om biodistribusjon av det administrerte genet eller medikament leveringsverktøy, kan teknikken være tidkrevende og arbeidsintensiv, siden den krever: (1) vev fiksering, kryonisk bevaring eller parafin-innebygging og kutting; (2) farging for spesifikke cellulære markører noen ganger krever antigen henting; (3) oppkjøp av fluorescens mikroskopi, som vanligvis tillater analyse av et begrenset antall forskjellige markører i samme eksperiment; (4) bildebehandling for å tillate riktig kvantifisering av signalet av interesse.
Flow flowcytometri har blitt en mye brukt teknikk som utnytter svært spesifikke fluorescerende markører for å tillate ikke bare en rask kvantitativ evaluering av ulike celle fenotyper i celle suspensjoner, basert på uttrykk for overflate eller intracellulære antigener, men også funksjonelle målinger (f. eks, rate av apoptose, spredning, celle syklus analyse, etc.). Fysisk isolering av celler gjennom fluorescerende aktivert celle sortering er også mulig, slik at ytterligere nedstrøms anvendelser (f. eks cellekultur, RNAseq, biokjemiske analyser osv.) 6,7,8.
Tissue homogenisering er et kritisk trinn som er nødvendig for å oppnå en enkelt celle suspensjon for å tillate pålitelig og reproduserbar nedstrøms flyt analytiske evalueringer. Ulike metoder har blitt beskrevet for voksne Brain-tissue homogenisering, hovedsakelig med sikte på å isolere mikroglia celler9,10,11; de kan være samlet klassifisert i to hovedkategorier: (1) mekaniske dissosiasjon, som bruker sliping eller skjærkraft gjennom en Dounce homogenisator (DH) for å rippe hverandre celler fra sine nisjer og danner en relativt homogenisert enkelt celle fjæring, og (2) enzymatisk fordøyelse, som er avhengig av inkubasjons av hakket vev biter på 37 ° c i nærvær av proteolytiske enzymer, slik som Trypsin eller Papain, favoriserer degradering av ekstracellulære matrise for å skape en ganske homogenisert celle suspensjon12.
Uavhengig av hvilken metode som benyttes, er en rensing trinn anbefales etter vev homogenisering å fjerne myelin gjennom sentrifugering på en tetthet gradient eller ved magnetisk valg9,12, før han flyttet til nedstrøms programmer.
Her beskriver vi en vev prosesseringsmetode basert på Papain fordøyelse (PD) etterfulgt av rensing på en tetthet gradient, optimalisert for å få levedyktig heterogen celle suspensjoner fra mus hjernen eller ryggmargen i en tid-følsom måte og egnet for flyt flowcytometri. Videre beskriver vi en 9-farge Flow flowcytometri panel og gating strategien vi vedtatt i laboratoriet for å tillate samtidig diskriminering av forskjellige CNS populasjoner, Live/døde celler eller positivitet for fluorescerende journalister som grønt fluorescerende protein eller rhodamine fargestoff. Ved å anvende denne flyten analytiske analyse, kan vi sammenligne ulike metoder for vevs behandling, dvs., PD versus DH, i form av bevaring av mobilnettet levedyktighet og gir av ulike celletyper.
Detaljene vi gir her kan instruere vedtak om homogenisering protokollen og antistoff kombinasjon til bruk i Flow flowcytometri panel, basert på den spesifikke celletypen (e) av interesse og nedstrøms analyser (f. eks temperaturfølsomme applikasjoner, sporing av spesifikke fluorescerende markører, in vitro-kultur, funksjonelle analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Dana Farber Cancer Institute (Protokollnummer 16-024).
1. utarbeidelse av løsninger som trengs for eksperimentet
- Forbered 1x Hank ' s balansert saltløsning (HBSS) ved å fortynne 10x HBSS med sterilt vann. Pre-chill løsningen på isen. Minst 25 mL oppløsning er nødvendig for hver prøve.
- Forbered isoton Percoll oppløsning (IPS) ved å blande 10x steril HBSS 1:10 med tetthet gradient medium (dvs. Percoll). Pre-chill på isen.
Merk: IPS kan oppbevares i opptil 30 dager ved 4 ° c. - Forbered Flow flowcytometri (FACS) blokkering (BL) løsning (1% storfe serum albumin [BSA], 5% fosterets storfe serum [FBS] i fosfat-bufret saltvann [PBS]). Pre-chill på isen.
2. intrakardielle for dyr ved å disseksjon
Merk: åtte uker gamle C57BL/6J mus, enten sex, ble brukt i eksperimenter. Blod med PBS løsningen er utført for å eliminere forurensning av blodet fra organer, før du fortsetter med vev fordøyelse.
- Bedøve musen ved hjelp av en blanding av ketamin/xylazine (90 − 200 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg xylazine). Plasser musen på ryggen og tape hver lem ned til støtte. Kontroller tilstrekkelig dybde av anestesi ved å sjekke tilbaketrekking refleks.
- Lag en midtlinjen hud snitt på nivået av bryst innløpet å utsette brystbenet. Bruk tang for å gripe tuppen av brystbenet, deretter lage en 1 cm snitt på hver side av ribbeinet buret. Til slutt skjære gjennom membranen og åpne brystbenet vidt nok til å visualisere hjertet.
- Bruk tang for å forsiktig ta tak i hjertet ved høyre ventrikkel og løft den til midtlinjen og litt ut av brystet.
- Sett en 23 G sommerfugl nål inn i spissen av venstre ventrikkel, mot aorta og Hold fast.
- Start med 1x PBS. Pierce gjennom høyre auricle ved hjelp av saks for å tillate perfusate å gå ut av sirkulasjonen. Angi strømningshastigheten til PBS ved 3 mL/min. Perfuse med minst 15 mL 1x PBS for å sikre at vevet er klart.
Merk: blanchering av leveren og chrezbryzheechno blodårer er tegn på god blod. Om nødvendig kan volumet av prefusion økes til væsken som går ut av hjertet, er klar av blod, noe som peker på at flush-linjen kan stoppes. - Etter å ha tatt en hjerne, Sever hjernen fra ryggmargen og fjerne hjernen fra skallen med saks og tang. Fjern pelsen for å øke synligheten og kontrollen under disseksjon og for å unngå å bære over hår forurensninger. Skyll ryggmargen ut av kolonnen ved hjelp av en 3 mL sprøyte fylt med PBS.
- Overfør hvert vev i en brønn av en 6-brønn multi-brønn plate forhåndsutfylt med 2 mL iskald 1x HBSS og holde på isen til fordøyelsen.
- Del hjernen og ryggmargen i to halvdeler, langs langsgående linjen.
Merk: den ene halvdelen av hvert vev er homogenisert (se avsnittene nedenfor) for å tillate flyt analytiske analyser; den andre halvparten kan tildeles ulike behandlingsmåter for alternative analyser (f.eks. dyppet i paraformaldehyde bindemiddel løsning for histologi).
3. enzymatisk fordøyelse av hjerne og ryggmarg
Merk: volumer beskrevet i denne delen er nok for fordøyelsen av en halv hjerne eller ryggmargen.
- Bruk en saks til å hakke vevet inn i 1 − 2 mm tykke biter.
- Skjær spissen av en 1000 μL pipette med en saks for å gjøre den tilstrekkelig stor til å tillate innsamling av vevet stykker. Før skylling av pipette-spissen med 1x HBSS. Bruk deretter pipette til å overføre 2 mL HBSS løsning som inneholder hakket vev til en 15 mL konisk rør.
Merk: pre-skylling av pipette spissen er viktig for å hindre klebrige av vevs bitene inne i spissen. - Vask brønnen med ytterligere 2 mL iskald 1x HBSS og Overfør løsningen til tilsvarende 15 mL konisk slange som inneholder vevs bitene.
- Sentrifuger hver prøve i 5 min ved 250 x g ved 4 ° c.
- Forbered enzym blanding 1 av nevrale vev dissosiasjon Kit (NTDK; Tabell med materialer) ved å blande 50 μL av enzym P med 1900 μL av buffer X per prøve. Varm enzym blanding 1 ved 37 ° c i et vannbad. Ruge enzym Mix 1 ved 37 ° c i minst 10 min før bruk for å muliggjøre full aktivering av enzymet.
- Aspirer supernatanten fra det 15 mL koniske røret og tilsett 1,95 mL enzym Mix 1 til hver prøve. Forsiktig Vortex å sørge for at pellet er resuspendert.
- Ruge prøvene på et hjul eller shaker i 15 min ved 37 ° c.
- I mellomtiden forbereder enzymet blande 2 av NTDK ved å blande 10 μL av enzym A med 20 μL av buffer Y per prøve; pre-Warm løsningen ved 37 ° c i et vannbad.
- Ved slutten av inkubasjons med enzym blanding 1, tilsett 30 μL enzym blanding 2 til hver prøve.
- Bland prøvene forsiktig ved å pipettering opp og ned med en 1000 μL pipette-spiss pre-skylles med 1x HBSS.
- Ruge prøven på et hjul eller shaker i 15 min ved 37 ° c.
- Etter inkubasjons, tilsett 10 mL iskald 1x HBSS til hvert rør for å deaktivere enzymet Mix 1 og enzym Mix 2.
- Sentrifuger hver prøve i 10 min ved 320 x g ved 4 ° c.
- Kast supernatanten; Tilsett iskald 1x HBSS til hvert rør opp til et endelig volum på 7 mL og forsiktig resuspend pellet ved virvlingen.
- Fortsett til avsnitt 5 for fjerning av avfall.
4. mekanisk homogenisering av hjernen og ryggmargen
Merk: volumer beskrevet i dette avsnittet er nok for homogenisering av en halv hjerne eller ryggmarg. Protokollen som er beskrevet i denne delen kan brukes som en metode alternativ til den som er beskrevet i avsnitt 3, avhengig av brukerens behov som omtalt nedenfor.
- Pre-chill glasset mørtel av Dounce vev jeksel (tabell av materialer) satt på isen.
- Tilsett 3 mL pre-kjølt 1x HBSS til mørtel.
- Overfør vevet (hjerne eller ryggmarg) fra brønnen av 6-brønn plate inn i glass mørtel gjør at den er dyppet i 1x HBSS og sitter på bunnen av mørtel.
- Knus vevet forsiktig med 10 slag av morter A etterfulgt av 10 slag av morter B. Overfør homogenisert blandingen til et nytt 15 mL konisk rør.
- Fyll røret til et endelig volum på 10 mL ved hjelp av pre-kjølt 1x HBSS og sentrifuge i 10 min ved 320 x g ved 4 ° c.
- Aspirer supernatanten og Legg iskald 1x HBSS til hvert rør opp til et endelig volum på 7 mL og forsiktig resuspend pellet ved virvlingen.
- Fortsett til avsnitt 5 for fjerning av avfall.
5. fjerning av rusk
Merk: fjerning av rusk, består hovedsakelig av ufordøyd vev og myelin hylser, er et kritisk skritt for å tillate effektiv farging av vevet homogenate for påfølgende flyt analytiske analyser.
- Filter hver prøve gjennom en 70 μm celle sil for å fjerne eventuelle ufordøyd vev blings. Dette trinnet er spesielt viktig spesielt når du arbeider med ryggmargen vev siden disse prøvene er mer sannsynlig å inneholde ufordøyd nerve fragmenter eller hjernehinnene som kan påvirke de påfølgende trinnene.
- Kontroller at det endelige volumet er 7 mL i hvert prøverør. Hvis ikke, fyll med iskald 1x HBSS opp til 7 mL.
- Tilsett 3 mL pre-kjølt IPS til hver prøve for å lage et endelig volum på 10 mL av en løsning som inneholder tetthet gradient medium ved 30% avsluttende konsentrasjon. Vortex prøvene forsiktig for å sikre at de er homogenously blandet.
- Sentrifuge prøver for 15 min ved 700 x g ved 18 ° c pass på å sette akselerasjonen av sentrifuge til 7 og bremsen til 0.
Merk: sentrifugering skal ta ca. 30 min. - Fjern forsiktig prøvene fra sentrifuge.
Merk: en hvitaktig disk bestående av rusk og myelin bør være synlig flytende på overflaten av løsningen. En pellet (som inneholder cellene av interesse) skal være synlig på bunnen av røret. - Nøye aspirer alle hvitaktig disk av rusk og deretter resten av supernatanten å sørge for ikke å løsne pellet. La ca 100 μL oppløsning på toppen av celle pellet for å unngå risiko for utilsiktet dislodging det.
- Tilsett 1 mL FACS BL, resuspend pellet ved pipettering opp og ned med en 1000 μL pipette spissen og overføre prøvene til 1,5 mL rør.
- Sentrifuger for 5 min ved 450 x g ved romtemperatur (RT).
- Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend pellet i passende buffer kompatibel med nedstrøms analyser (se pkt. 6 for protokollen som brukes for flyt analytiske evaluering av flere celletyper).
6. farging for Flow analytiske evaluering av flere celletyper
- Resuspend pellet fremstilt i trinn 5,9 med 350 μL av FACS BL. Tilsett FC-blokk i hver prøve ved en endelig konsentrasjon på 5 μg/mL.
Merk: minst 100 μL av prøven skal brukes til en farging, for å sørge for å behandle nok celler til å muliggjøre pålitelige analyser. - Ruge prøven i 10 min ved 4 ° c før du fortsetter med farging.
- Forbered en antistoff blanding i henhold til tabell 1.
- Legg antistoff Mix til hvert rør, Vortex for 5 s og ruge prøvene i 15 min ved 4 ° c i mørket.
- Tilsett 1 mL PBS til hvert rør, Vortex og sentrifuger for 5 min ved 450 x g ved RT.
- I mellomtiden forbereder streptavidin mix i henhold til tabell 1.
- Kast supernatanten og resuspend pellet i streptavidin blandingen fremstilt i trinn 6,6. For hvert utvalg, kan du bruke samme volum som den som brukes for farging i trinn 6,4.
- Vortex for 5 s og ruge prøvene i 10 min ved 4 ° c i mørket.
- Tilsett 1 mL PBS til hvert rør, Vortex og sentrifuger for 5 min ved 450 x g ved RT.
- Kast supernatanten og resuspend pellet i FACS BL. Bruk 300 μL av FACS BL for hver 100 μL av prøve flekker.
- Legg til 7-amino-actinomycin D (7-AAD) løsning på hver prøve. Bruk 5 μL av 7-AAD for hver 300 μL av prøve fremstilt i trinn 6,10.
- Oppbevar prøvene ved 4 ° c i mørket til cytofluorimetric analyse. Utfør analysen innen 16 timer fra prøveklargjøring, for å garantere > 60% celle levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi sammenlignet to forskjellige homogenisering metoder (DH versus PD) brukes til mus hjernen og ryggmargen, for å teste effektiviteten i hente ulike levedyktige celletyper egnet for nedstrøms applikasjoner. For å gjøre dette, utnyttet vi en 9-farge Flow flowcytometri panel designet for å karakterisere, i samme prøve, ulike CNS celletyper inkludert mikroglia, lymfocytter, neurons, astrocytter, oligodendrocytes og endotelet.
Vevet i hjerne-og ryggmargen ble Hentet fra forskjellige mus (n ≥ 6), delt i to halvdeler lengderetningen, veid og behandlet parallelt ved å påføre enten mekaniske forstyrrelser ved hjelp av Dounce-homogenisator (DH-metode) eller finhakket og fordøyd enzymatisk ved hjelp av den kommersielle NTDK basert på Papain (PD-metode) (figur 1A). Etter fjerning av rusk, celler fra hjernen eller ryggmargen ble fortynnet 1/10 eller 1/2 − 1/5, henholdsvis i Trypan blå for å fastslå celle utbytte og levedyktighet med en Neubauer kammer (figur 1B, C). DH-metoden ga generelt en høyere celle kapasitet fra både hjerne og ryggmarg. Men flertallet av cellene Hentet var døde, noe som resulterer i bare 13,8% ± 3,3% av levedyktige celler i hjernen og 10,5% ± 1,5% i ryggmargen (figur 1B). Mange av de døde cellene dannet aggregater (figur 1C); Dette fenomenet kan skyldes tilstedeværelsen av svært sammenkoblede cellenettverk (som endothelial og gliacellene celler lining CNS blodkar) som ikke kunne disaggregated av skjær kraften påføres med DH. Disse aggregater av dødsceller ble sannsynligvis ikke fjernet av tettheten gradient og endte opp i den endelige cellen pellet brukes for cytofluorimetric analyse. Tvert imot, besluttet PD metoden en samlet bedre bevaring av mobilnettet levedyktighet (90,6% ± 0,6% i hjernen og 85,2% ± 2,8% i ryggmargen). Papain er i stand til å fordøye ekstracellulære matrise og celle-til-celle veikryss effektivt, fører til en mer ensartet enkelt celle suspensjon. Noen av cellene som dør under hakking prosessen kan bli ytterligere fordøyd av Papain fører til dannelse av celle rusk som er mer effektivt skilles gjennom tettheten gradient. Samlet sett er dette sannsynligvis bestemt en bedre bevaring av celle levedyktighet med PD-metoden, til tross for en litt lavere celle avkastning sammenlignet med DH metoden.
En alikvot på 100 μL fra hjerne og ryggmarg celle suspensjoner ble beiset med antistoff mix (tabell 1) og analysert av Flow flowcytometri med en 9-fargepanel. Figur 2A viser gating strategien brukes til å identifisere de ulike celletyper fra hjernen og ryggmargen celle suspensjoner. Kort sagt identifiserer den første porten befolkningen generelt i henhold til "Forward scatter" (FSC) og side scatter (SSC), unntatt små celle rusk. Deretter Live (7-AAD-) celler er identifisert. Innenfor total bo cellen befolkning, CD45 + og CD45-celler er fremhevet. Innenfor CD45 + gate, CD45 + CD11b + mikroglia/makrofager og CD45 + CD11b-lymfocytter er identifisert. Innenfor CD45-porten blir celler diskriminert i henhold til positivitet for ACSA2 (astrocytter) eller O4 (oligodendrocytes). CD45-ACS2-O4-celler er videre inndelt i henhold til positivitet for Thy1 (neurons) eller CD31 (endotelet). Resterende Thy1-CD31-celler er klassifisert som "andre celletyper", ikke beregnet av vår antistoff mix.
Som vist i figur 2B, med DH metode ca 38% av levedyktige celler Hentet fra hjernen og ca 32% av levedyktige celler Hentet fra ryggmargen var av blodkreft opprinnelse (CD45 +). På den annen side, PD metoden lov til å hente en betydelig høy avkastning av levedyktige celler i begge vev, med en svært stor brøkdel representert ved ikke-blodkreft CD45-celler (ca 82% i hjernen og 92% i ryggmargen). Bemerkelsesverdig, CD45 + CD11b + mikroglia/makrofager representerte den mest tallrike levedyktige celle fraksjonen med DH-metoden (figur 2C). PD-metoden produserte imidlertid en mer heterogen representasjon av celletyper, inkludert ACSA + astrocytter, O4 + oligodendrocytes, CD31 + endothelial celler og Thy1 + neurons (figur 2C). Interessant, levedyktige neurons og endothelial celler var neppe oppdages med DH metoden.
DH-metoden er avhengig av mekanisk sliping av vevet mellom glass morter og mørtel av Dounce homogenisator for å oppnå vev homogenisering. Dette kan føre til noen skjær stress som vil trolig skade og påvirke levedyktigheten til store eller svært følsomme celler som neurons eller celler i neurovasculature. Vi evaluerte mobilnettet levedyktighet (prosentandel av 7-AAD-celler) i hver celle pasientpopulasjonen identifisert gjennom antistoff panelet (Figur 3). Blodkreft celler (CD45 +) isolert fra hjernen og ryggmargen, inkludert mikroglia/makrofager (CD45 + CD11b +) og andre ikke-myelogen celler (CD45 + Cd11b-), vises svært høy levedyktighet uavhengig av homogenisering metoden som ble brukt (Figur 3A). I motsetning til dette bestemte DH-metoden en signifikant reduksjon av levedyktigheten til CD45-populasjoner (Figur 3B) mens PD-metoden fastslo en omfattende bevaring av ulike celletyper i CNS. I detalj, nevroner og endothelial celler var subpopulasjoner mest signifikant påvirket av DH og bevart av PD-metoden.
En skjematisk fremstilling av de kritiske trinnene som kreves for forsvarlig prøveforberedelse og effektiv fjerning av avfall er oppsummert i Figur 4.
Figur 1: utbytte av celler Hentet fra hjernen og ryggmargen er påvirket av homogenisering metoden.
(A) eksperimentell disposisjon. Mus var anesthetized og intracardiacally perfusert med PBS å fjerne intra-vaskulær sirkulerende blodlegemer. Hjernen og ryggmargen ble nøye dissekert og splittet i to halvdeler lengderetningen. Vev ble homogenisert ved hjelp av enten Dounce homogenisator (DH) eller Papain fordøyelse (PD) som beskrevet i den viktigste teksten. Myelin og vev rusk ble deretter fjernet av sentrifugering i en 30% tetthet gradient medium løsning som resulterer i en heterogen celle suspensjon inneholder ulike celletyper som kan analyseres ved flyt flowcytometri. (B) histogrammer som viser avkastningen av celler Hentet fra hjernen eller ryggmargen på vev HOMOGENISERING med DH eller PD-metoden. Gjennomsnittlig ± SEM av minst 6 dyr per tilstand er representert. (C) representant brightfield mikroskop fargefotomikrografier av Trypan blå positive (død) og negative (live) celler Hentet fra hjernen eller ryggmargen ved de to metodene. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: relative proporsjoner av ulike celletyper Hentet fra CNS påvirkes av vev homogenisering metoden.
(A) representant flyt flowcytometri tomter viser gating strategi for å identifisere ulike celle pasientpopulasjonen innen celle preparater innhentet fra hjernen eller ryggmargen: cellen befolkningen er GATED på FSC og SSC fysiske parametre, etterfulgt av valg for 7-AAD-levende celler; da cellene er diskriminert i henhold til positivitet for CD45 markør; mikroglia/makrofager er identifisert som CD11b + celler i CD45 + brøk mens lymfocytter er CD11b-. Astrocytter, oligodendrocytes, endothelial og neuronal celler er identifisert som ACSA2 +, O4 +, CD31 + eller Thy1 + celler innen CD45-, henholdsvis. (B) histogrammer som viser prosentandelen av CD45 + og CD45-celler innenfor total levende eller døde celle populasjoner, i hjernen eller ryggmargen ved HOMOGENISERING med DH-eller PD-metoden. Den statistiske analysen av resultatene som vises i diagrammene er rapportert i tabell 2. (C) sektordiagrammer som viser prosentandelen av ulike levedyktige celle under typer innenfor total celle befolkning, i hjernen eller ryggmargen ved HOMOGENISERING med DH-eller PD-metoden. Prosentandelen av totalt døde celler rapporteres også. N ≥ 6. CD45 + CD11b + = mikroglia/makrofager; CD45 + CD11b-= lymfocytter/ikke-myelogen celler; CD45-ACSA2 + = astrocytter; CD45-O4 + = oligodendrocytes; CD45-Thy1 + = neurons; CD45-CD31 + = endothelial celler; Andre = celler negative for alle nevnte markører. Den statistiske analysen av resultatene som vises i diagrammene er rapportert i tabell 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cellular levedyktighet av ulike CNS celletyper påvirkes av homogenisering metoden brukes.
(A) histogrammer som viser prosentandelen av 7-AAD-levende celler innen CD45 + blodkreft populasjoner inkludert CD11b + mikroglia/makrofager og CD11b-ikke-myelogen celler. (B) histogrammer som viser prosenten av 7-AAD-bo celler innenfor CD45-ikke-blodkreft populasjoner inkludert astrocytter, oligodendrocytes, neurons, endothelial og andre celletyper. * = p < 0,05, * * = p < 0,01, mann-Whitney mellom DH og PD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk fremstilling av de kritiske trinnene som kreves for riktig vevs behandling.
En liste over de mest kritiske trinnene som kreves for riktig vevs behandling og effektiv fjerning av rusk vises. Det er viktig å identifisere riktig rusk disken (svart pil) og cellen pellet (blå pil) dannet etter sentrifugering av prøvene på 30% tetthet gradient. Avfallet disken, sammen med resten av supernatanten, må fjernes omhyggelig ved aspirasjon uten å dislodging celle pellet for å unngå prøve tap. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antistoff blanding | Opprinnelig konsentrasjon (μg/mL) | Endelig konsentrasjon (μg/mL) | Fortynnings faktor |
| anti CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD11b/APC. 780 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| anti ACSA2/APC | 150 | 0,75 | 200 |
| anti O4/biotin | Na | Na | 40 |
| anti CD 90.2/PE. Cy7 | 200 | 2 | 100 |
| Streptavidin Mix | Opprinnelig konsentrasjon (μg/mL) | Endelig konsentrasjon (μg/mL) | Fortynnings faktor |
| Streptavidin/Alexa 680 | 1000 | 1 | 1000 |
Tabell 1: oppskrift for utarbeidelse av mikser for flyt flowcytometri farging. Tabellen beskriver optimale konsentrasjoner av antistoffer og streptavidin som brukes til å tillate flyt analytiske analyser av flere celletyper. Se materialfortegnelsen for detaljer om katalognumrene til hver reagens som er nevnt i tabellen.
| Statistikk for figur 2B | ||||||||||
| BRAIN (% celler) | ||||||||||
| CD45 + | CD45 | |||||||||
| Live | Døde | Live | Døde | |||||||
| Metoden | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | ||
| Dh | 15,20 | ± 2,32 | 1,90 | ± 0,30 | 24,78 | ± 4,045 | 51,58 | ± 6,033 | ||
| Pd | 15,20 | ± 2,65 | 2,33 | ± 1,10 | 68,53 | ± 3,618 | 13,93 | ± 2,180 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p-verdi | 0,9989 | 0,738 | 0,0006 | 0,0015 | ||||||
| RYGGMARG (% celler) | ||||||||||
| CD45 + | CD45 | |||||||||
| Live | Døde | Live | Døde | |||||||
| Metoden | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | ||
| Dh | 15,00 | ± 8,21 | 1,41 | ± 0,11 | 31,64 | ± 8,21 | 51,95 | ± 16,52 | ||
| Pd | 7,49 | ± 4,99 | 1,15 | ± 0,68 | 84,27 | ± 9,39 | 7,09 | ± 3,75 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p-verdi | 0,5548 | 0,7236 | 0,0438 | 0,1144 | ||||||
| Statistikk for figur 2C | |||||||||||||||||
| BRAIN (% celler) | |||||||||||||||||
| CD45 + | CD45 | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andre | Døde | ||||||||||
| Metoden | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | |
| Dh | 19,32 | ± 3,88 | 1,17 | ± 0,27 | 9,52 | ± 2,68 | 3,41 | ± 1,01 | 1,39 | ± 0,77 | 0,48 | ± 0,29 | 10,52 | ± 4,49 | 53,83 | ± 5,79 | |
| Pd | 10,88 | ± 2,03 | 1,65 | ± 0,48 | 8,17 | ± 2,66 | 6,54 | ± 0,76 | 6,37 | ± 1,76 | 8,27 | ± 1,25 | 33,28 | ± 6,34 | 23,72 | ± 5,31 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p-verdi | 0,1206 | 0,4819 | 0,5894 | 0,0264 | 0,0093 | 0,0003 | 0,0084 | 0,0022 | |||||||||
| RYGGMARG (% celler) | |||||||||||||||||
| CD45 + | CD45 | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andre | Døde | ||||||||||
| Metoden | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | Mener | ± SEM | |
| Dh | 21,23 | ± 6,25 | 2,51 | ± 0,57 | 4,26 | ± 2,34 | 9,40 | ± 1,89 | 2,82 | ± 1,51 | 0,97 | ± 0,50 | 22,74 | ± 9,04 | 35,28 | ± 1,89 | |
| Pd | 9,63 | ± 1,67 | 2,77 | ± 0,48 | 4,23 | ± 1,59 | 28,62 | ± 3,57 | 1,26 | ± 0,49 | 6,94 | ± 2,14 | 26,39 | ± 8,17 | 19,09 | ± 4,76 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p-verdi | 0,1905 | > 0.9999 | 0,7302 | 0,0159 | 0,7302 | 0,0317 | 0,7302 | 0,1111 | |||||||||
Tabell 2: statistisk analyse av ulike populasjoner som hentes ved å bruke DH-eller PD-metoden. Tabellen beskriver statistikken for diagrammene vist i figur 2B og figur 2C. Gjennomsnittet og SEM av minst seks uavhengige prøver er representert. P-verdien og detaljer om statistisk test brukt for hver sammenligning rapporteres også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskriver vi en protokoll for co-rensing og samtidig flyt analytiske analyse av noen av de mest relevante CNS celler fra mus hjernen og ryggmargen. Tradisjonelt har histologiske analyser blitt brukt for å beskrive fordelingen av nanopartikler eller den Transduction effektiviteten til virale vektorer i CNS5,13, eller for å gi innsikt om morfologiske og molekylære endringer som forekommer i bestemte celletyper under en patologi eller ved farmakologisk behandling14. Imidlertid, histologi mangler processivity og den tillater ikke allsidig eksamen av mangfoldig vise egenskaper inne det likt histologiske eksemplar, på grunn av det begrenset antallet av markører det kan samtidig analysert. Vår tilnærming kan være utfyllende til tradisjonelle histologic analyser og det kan kombineres med flere nedstrøms applikasjoner (sortering, primær kultur, biokjemiske eller neste generasjons-sekvensering analyser) for å utvide sammenstillingen av informasjon som kan fås fra individuelle prøver. Men noen viktige faktorer nedenfor må betraktes som de kan kritisk påvirke suksessen til denne tilnærmingen:
- Mengden av starter vev. Vi har optimalisert celle separasjon å starte med så lite som halvparten ryggmargen eller halve hjernen. I vår erfaring, behandler halv hjerne eller halv ryggmargen fra en voksen 8-ukers-gammel mus med PD metoden gir 1 − 6 x 106 levedyktige celler fra hjernen og om lag 0,1-0,5 x 106 levedyktige celler fra ryggmargen etter tettheten gradient trinn. Vi har ikke målt celler yield etter påføring av PD-metoden på vev fra nyfødte eller mus yngre enn 8 uker. Men i våre hender, er utfallet proporsjonal med vekten av Start vevet. Således, for yngre dyrene (e.g., 10-dag-gamle pups) det hel hjerne eller rotere ledningen burde være bearbeidet å garanti en fint cellen utbytte for pålitelig nedstrøms analyser. Om nødvendig, pooling vev fra flere dyr ville hjelpe økende celle gir. I vår erfaring, kan denne protokollen også brukes uten modifikasjoner for å isolere celler fra hjernen eller ryggmargen av rotter, så langt som andelen reagenser som brukes per vekt av Start vevet blir respektert. For vev mer enn 250 mg vekt, skalering reagenser opp eller splitte vevet i flere prøver (hver vekting < 250 mg) foreslås.
- Fjerne hjernehinnene/gjenværende vev biter før tettheten gradient. I vår erfaring, PD metoden herved beskrevet er ikke i stand til å fordøye effektivt hjernehinnene eller svært høyt myelinated vev som nerver og nerverøtter dukker opp fra ryggmargen. Når disse vev er til stede, noen ufordøyd klebrig stykker kan forbli i cellen suspensjonen hentes etter enzymatisk fordøyelsen trinnene, før rusk fjerning. Fjerne disse bitene ved å filtrere løsningen gjennom en 70 μm celle sil (som foreslått i trinn 5,1) er avgjørende for en vellykket celle forberedelse. Faktisk, hvis ikke fjernes, hjernehinnene eller vev brikker vil hindre effektiv tetthet gradient separasjon resulterer i dårlig celle gir.
- Timing, temperatur og sterilitet. Det er svært viktig å utføre alle trinnene i tide å bruke de riktige temperaturinnstillingene og incubations som foreslått. Dette er avgjørende for å sikre høy celle levedyktighet og integritet av prøven. Avhengig av nedstrøms søknad, utføre alle trinnene under en steril hette og med sterile reagenser kan være nødvendig (for eksempel etablere primær cellekulturer). Utvidet inkubasjons i enzymatisk fordøyelses løsning utover den foreslåtte tiden (del 3) kan føre til en dråpe celle levedyktighet. Epitopes av noen overflate antigener kan være følsomme for Papain som resulterer i tap av signal ved flyt flowcytometri. For bestemte programmer som krever andre markører enn de som er beskrevet i denne artikkelen, anbefales det at du tester ytelsen til ulike antistoff-kloner før du starter eksperimentet. Det har blitt rapportert at tettheten gradient medium kan inneholde noen spor av endotoksiner som kan utløse aktivering av immunceller (mikroglia/makrofager). Passende interne kontroller bør alltid legges i eksperimentene når disse bestandene er analysert, for å utelukke mulige effekter indusert av prosedyren. Stikkende med den foreslåtte temperaturer og vaske tetthet gradient medium restene umiddelbart etter at rusk-fjerning trinn er vanligvis nok til å unngå åpenbare uimottakelig celler aktivisering. Men i tilfelle nedstrøms søknader (f. eks, RNAseq eller funksjonell analyse) påvirkes av dette trinnet, bør brukeren bytte til en lav-endotoksin tetthet gradient medium forberedelse (foreslått i tabell over materialer).
- FACS antistoffer og maskin. Flyt flowcytometri fargeprotokoll presenteres herved gjør bruk av antistoff konsentrasjoner og farge conjugations som fungerte best med celle gir hentet i vår laboratorie opplevelse og med FACS maskiner tilgjengelig i vårt Institutt. Brukeren bør titer Antistoffene i hans/hennes hender før du starter et nytt eksperiment, da konsentrasjonen kanskje må justeres litt. For resten, vi oppmuntre å bruk alltid enkelt-fargen flekk Kontroller inne hver eksperiment å bekrefte det alle Antistoffene og erstatningen sette-opp av det FACS apparat arbeider adekvat. Det må bli lagt merke til at CD90 (Thy) antigen brukes for å oppdage neurons eksisterer i to forskjellige isotypes, nemlig CD 90.2 eller CD 90.1 avhengig av musen belastning: den mest brukte musen stammer, for eksempel C57BL6/J Express CD 90.2; mus stammer som AKR/J, PL, og FVB/N Express CD 90.1. Dermed bør brukeren nøye verifisere musen belastningen og velge riktig anti-CD90 antistoff (som foreslått i tabell av materialer) før du starter eksperimentene.
Oppsummert protokollen her presenterte tar fordel av en mild enzymatisk fordøyelsen etterfulgt av en 9-farge flekker tillater effektiv samtidig flyt analytiske evaluering av ulike celletyper fra mus hjernen og ryggmargen. Protokollen kan utnyttes til å overvåke i en strømlinjeformet og helhetlig måte effektiviteten av celle målretting med nanopartikler eller viral vektorer administreres i CNS15. Videre kan protokollen lett bli vedtatt for svært delikate nedstrøms anvendelser, slik som celle sortering, ex vivo under kultur, enkelt celle RNAseq, som er et resultat av største viktighet, ikke bare for prekliniske vurdering av celle målretting etter legemiddel, men også for inngående karakterisering av patologiske prosesser i nevrodegenerative sykdommer.
En brøkdel av hele CNS celle populasjonen er ikke diskriminert av denne protokollen (se "andre" celletyper i figur 2); Dette kan forklares ved tilstedeværelsen av andre celle under typer som er til stede i CNS, men ikke fanges opp av antistoffer vi brukte. I våre Foreløpige analyser er ca 14% av brøkdelen av "andre celler" positiv for CD73, en mesenchymal celle markør beriket i neurovasculature og involvert i flere neuroinflammatory prosesser16,17. Videre hypothesize vi at "andre celler" brøk kan også omfatte mindre differensiert celler, som forfedre på ulike stadier av modning, som nestin + nevrale stamceller, nestin + vimentin + radial glia forfedre, doublecortin + neural forfedre, NG2 + oligodendrocyte forløper celler, blant andre. Disse celle sub-typer kan lett undersøkes ved å anvende vår Flow flowcytometri protokoll, siden vi valgte en konfigurasjon av fluorescerende fargestoffer som gjør det mulig å huse opptil to ekstra celle markører bøyd med enten fluorescein isothiocyanate (FITC) eller fykoerytrin (PE) fluorophores.
Samlet, vår tilnærming kunne gi et nytt verktøy for mer omfattende undersøkelser i sammenheng med CNS (i helse og sykdom) utnytter en godt konsolidert teknologi slik at både kvalitativ og høy gjennomstrømming kvantitative vurderinger som Flow flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av Boston Children ' s Hospital oppstart midler til A.B., ALSA Grant nr. 17-via-343 til M.P., og kontoret til assisterende forsvarsminister for helsedirektoratet gjennom amyotrofisk lateral sklerose Research program under Award nr. W81XWH-17-1-0036 til M.P. Vi erkjenner DFCI Flow flowcytometri Core for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
