Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

Vi beskriver protokoll för strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO genom röntgenkristallografi. Metoderna omfattar proteinuttryck, rening och karakterisering samt strategier för framgångsrik kristall optimering och strukturbestämning av proteinet i dess obundna form.

Abstract

NEMO är ett byggnads ställnings protein som spelar en viktig roll i NF-κB-vägen genom att montera IKK-komplexet med kinaser IKKα och IKKβ. Vid aktivering, IKK komplexa fosforylerar de iκb molekyler som leder till NF-κb nukleära flyttning och aktivering av målgener. Hämning av den NEMO/IKK interaktion är en attraktiv terapeutisk paradigm för modulering av NF-κB Pathway aktivitet, gör NEMO ett mål för inhibitorer design och upptäckt. För att underlätta processen för upptäckt och optimering av NEMO-hämmare, konstruerade vi en förbättrad konstruktion av IKK-bindande domän av NEMO som skulle möjliggöra strukturbestämning av proteinet i APO-form och samtidigt bunden till småmolekylära vikt hämmare. Här presenterar vi den strategi som används för design, uttryck och strukturell karakterisering av IKK-bindande domän av NEMO. Proteinet uttrycks i E. coli -celler, solubiliseras under denaturerande förhållanden och renas genom tre kromatografiska steg. Vi diskuterar protokollen för att få kristaller för strukturbestämning och beskriver datainsamlings-och analysstrategier. Protokollen kommer att finna stor tillämplighet på strukturen bestämning av komplex av NEMO och små molekyler hämmare.

Introduction

NF-κB-vägen aktiveras som svar på en mängd olika stimuli, inklusive cytokiner, mikrobiella produkter och stress, för att reglera uttrycket av målgener som svarar för inflammatoriska och immunrespons, celldöd eller överlevnad och proliferation1. Patologier inklusive inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar och cancer2,3,4,5 har korrelerats till hyperaktivering av vägen, som har gjort modulering av NF-κb aktivitet ett främsta mål för utvecklingen av nya terapier6,7.

Den kanoniska NF-κB-vägen skiljer sig i synnerhet från den icke-kanoniska vägen, som ansvarar för lymphorganogenes och B-cells aktivering, av det förstnämnda beroendet av byggnads ställnings proteinet NEMO (NF-κB Essential modulator8) för monteringen av IKK-komplexet med kinaser IKKα och ikkβ. IKK-komplexet ansvarar för fosforyleringen av IκBα (inhibitor för κB) som riktar den mot nedbrytning, vilket frigör NF-κB-dimererna att translokalisera till kärnan för gentranskription1 och är därför ett attraktivt mål för utvecklingen av inhibitorer för att MODULERA NF-κb-aktiviteten.

Vår forskning fokuserar på karakterisering av protein-protein interaktion mellan NEMO och IKKβ, inriktning NEMO för utveckling av små molekyler hämmare av IKK komplex formation. Den minimala bindnings domänen för NEMO, som krävs för att binda IKKβ, omfattar resthalter 44-111, och dess struktur har fastställts i komplex med en peptid motsvarande IKKβ-sekvens 701-7459. Nemo och ikkβ bildar en Four-Helix bunt där Nemo dimer rymmer de två alfahelixar av ikkβ (701-745) i ett långsträckt öppet spår med en utökad interaktion gränssnitt. IKKβ (734-742), även känd som NEMO-bindande domän (NBD), definierar den viktigaste hot-spot för bindning, där de två viktiga tryptophans (739 741) begrava djupt i NEMO fickan. Detaljerna i den komplexa strukturen kan stöd i struktur-baserad design och optimering av småmolekylära hämmare riktar sig till NEMO. Samtidigt är det svårt att bindningen av en liten molekyl eller peptid skulle återskapa i NEMO den fullständiga överensstämande förändringen (dvs. omfattande öppnande av NEMO coiled-Coil dimer) orsakad av bindning av den långa IKKβ (701-745), som observerats i kristallen, och strukturen av obunden NEMO eller NEMO bunden till en liten molekyl hämmare kan representera ett bättre mål för strukturbaserad läkemedelsdesign och inhibitor optimering.

Full längd NEMO och mindre trunkering konstruktioner som omfattar IKK-bindande domän har visat sig vara svårbevisad för strukturbestämning i obunden form via röntgen kristallografi och kärnmagnetisk resonans (NMR) metoder10, som föranledde oss att utforma en förbättrad version av IKK-bindande domän Nemo. Indeed, Nemo (44-111) i obunden form är bara delvis viks och genomgår konforma utbyte och vi därför att stabilisera sin dimeriskt struktur, lindade-spole vika och stabilitet, samtidigt som bindning affinitet för ikkβ. Genom att lägga till tre heptads av ideal dimeriskt lindade-Coil sekvenser11 vid N-och C-Termini av proteinet, och en serie av fyra punktmutationer, genererade vi Nemo-eeaa, en konstruktion helt dimeriskt och viks i en lindad spole, som räddade IKK-bindande affinitet till nanomolar sortiment som observerats för full längd Nemo12. Som en ytterligare fördel, vi hoppades att lindade-Coil adaptrar (baserat på GCN4 sekvens) skulle underlätta kristallisation och så småningom stöd i röntgen strukturbestämning via molekylär ersättning. Lindade-Coil adaptrar har på samma sätt utnyttjas för att både öka stabiliteten, förbättra lösningen beteende och underlätta kristallisering för trimeric lindade spolar och antikroppar fragment13,14. Nemo-eeaa är lätt att uttryckas och renas från Escherichia. coli -celler med en klyvbar histidin-tagg, är löslig, vikas i en stabil dimeriskt lindad spole och är lätt kristalliserad, med diffraktion till 1,9 Å. Närvaron av de beställda lindade-Coil regioner i GCN4 kan dessutom stöd i fasa data från kristaller av NEMO-EEAA genom molekylär ersättning med hjälp av den kända strukturen i GCN415.

Med tanke på de resultat som erhållits med APO-NEMO-EEAA, tror vi att de protokoll som beskrivs här kan också tillämpas på kristallisering av NEMO-EEAA i närvaro av små peptider (som NBD peptid) eller små molekyler hämmare, med målet att förstå kraven för NEMO hämning och strukturbaserad optimering av initiala bly-hämmare till hög affinitet. Med tanke på plasticitet och dynamiska karaktären hos många lindade-Coil domäner16, användning av lindade-Coil adaptrar kunde hitta mer allmän tillämplighet i medhjälp strukturell beslutsamhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion av konstruktion för kristallografi

  1. Klona sekvensen av NEMO-EEAA som i föregående publikation12 i en vektor för uttryck i E. coli med T7 promotorn, inklusive en N-Terminal hexa-Histidine tagg och en proteas klyvning webbplats.
    ANMÄRKNINGAR: i detta protokoll använde vi en vektor modifierad för att inkludera en N-Terminal hexa-Histidine tagg och en tobak etch virus (TEV) klyvning plats10. Denna vektor underlättar klyvning av hans tagg för protein kristallisation och lämnar bara den korta förlängningen av GSW rester före början av den önskade proteinsekvensen. Vektorn varifrån detta härleddes, och alternativa vektorer listas i tabellen av material. I detta protokoll, senare ändringar av den ursprungliga NEMO (44-111) sekvens infördes stegvis, som beskrivs tidigare10, med hjälp av sida riktad mutages. Vi försökte initialt att stabilisera NEMO coiled-Coil dimer lägga till idealiska lindade-Coil adaptrar (i en längd av minst tre heptads) till N-terminalen eller C-terminalen slutet eller till båda. Den dubbla lindade spolen var den mest lovande från tidigare kristalliserings försök och det ändrades därefter införa mutationer för att förbättra kristallisation som beskrivs tidigare12.

2. stor skala uttryck för hans6 Tagged Nemo-eeaa

  1. Omvandla konstruera till BL21 (DE3) kompetenta celler. Förvara vid-80 ° c som en cell glycerol lager.
  2. Dag 1 – Förbered en cell starter kultur. I en 125 mL Erlenmeyer kolv, tillsätt 20 mL fantastisk buljong lösning och 20 μL av en 100 mg/mL lager av ampicillin. Tillsätt några mikroliter cell glycerol lager (från-80 ° c lagring av BL21 (DE3) kompetenta celler omvandlas med vektor).
  3. Skaka 10 mL starter kulturen över natten vid 37 ° c, 220 rpm (ca 15 h).
  4. Dag 2 – från startmotorn, späd till en OD600 = 0,1 i 250 ml av fantastisk buljong. Tillsätt ampicillin till en slutlig koncentration på 100 μg/mL. Växa till en OD600 = 0,8-1,0.
    1. Tillsätt isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till 500 μM, och växa för 4 h vid 37 ° c.
    2. Mät OD600 av inducerad kultur efter 4 h. kulturen bör nå en OD600 = 6-10.

3. rening av hans6 Tagged Nemo-eeaa

  1. Spin cellkultur ner på 3 800 x g för 20 min vid 4 ° c.
  2. Spara cellpelleten och kassera mediet.
    Obs: cellpelleten kan sparas och lagras vid-20 ° c vid denna punkt, för rening vid ett senare tillfälle.
  3. Omsuspendera cellerna i 40 mL lyseringsbuffert som innehåller 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 2 mM MgCl2, 0,5 mm fenylmetylsulfonylfluorid, 2 mm Ditiothreitol (dTT) och 3 μl Benzonase-nukleas.
    Anmärkning: nickel immobiliserade metall Ion affinitetskromatografi (iMac) kolumn utnyttjas är kompatibel med 2 mm DTT. Alternativt kan 0,2 mM tris (2-karboxyethyl) fosfin (TCEP) utnyttjas.
  4. Dela upp återsuspenderade celler i två 20-25 mL-aliquoter.
  5. Lyse cellerna med hjälp av fransk press (ungefärligt tryck 25 000 PSI), upprepa 2-3 gånger för varje alikvot (i kallt rum).
    ANMÄRKNINGAR: Alternativt kan celler lyseras av ultraljudsbehandling (inte testat i detta protokoll).
  6. Tillsätt urea till cellen lysate till en slutlig koncentration av 8 M, låt Inkubera på en gungande plattform för minst 2 h eller upp till natten. Detta och alla följande reningssteg, med undantag för dialys, kan utföras vid rumstemperatur.
  7. Dag 3 – överföra lysate till första rör och balansvikt, säkerställa lysate fyller rören till minst 3/4 full. Snurra lysatet på 125 000 x g för 45 min vid 25 ° c. Dekanera supernatanten i en 100 mL bägare för lastning på kolonnen.
    Obs: centrifugering vid 4 ° c kommer att orsaka urea att krascha ut.
  8. På ett snabbt Vätskekromatografisystem, ta bort etanol från iMac 5 ml-kolonn med 25 ml ultrarent H2O vid 5 ml/min, följt av 25 ml elueringbuffert som innehåller 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm Imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, sedan 25 ml bindningsbuffert som innehåller 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm Imidazol, 2 mm DTT, 8 M urea, pH 8,0.
  9. Ladda urea inkuberas supernatanten på 3 mL/min på IMAC kolumn, samla in flödet genom. Tvätta kolonnen för 10 kolumn volymer med bindningsbuffert på 3 mL/min.
  10. Refold Nemo-eeaa konstruera på kolumn genom att tvätta kolonnen med vika buffert för 20 kolumn volymer på 3 ml/min, innehållande 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm Imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0.
  11. Utför gradienteluering av NEMO-EEAA, från 10 till 500 mM Imidazol över en 12-kolonn volymgradient, samla alla eluat i fraktion uppsamlings platta (1 mL fraktioner).
  12. Fortsätt att eluera vid 500 mM Imidazol för två kolumn volymer, fortsätter att samla in.
  13. Kör natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgelelektrofores (sida) av fraktioner för att avgöra NEMO-EEAA förekomst i elutionsfraktioner.
    Anmärkning: vi använde 10% akrylamid, MES buffert.
  14. Poolfraktioner som innehåller rent målprotein.
  15. Mät protein koncentrationen av Bradford assay17.
    Obs: Detta är nödvändigt för att uppskatta mängden proteas för taggklyvning.

4. hans6 tag klyvning och rening

  1. Lägg TEV i en 1:10 viktförhållandet TEV: NEMO-EEAA protein för att klyva hans6 tag. TEV proteashämmare renades i huset.
    Obs: optimera mängden TEV, tid och temperatur som krävs för fullständig klyvning separat.
    1. Express TeV protease, S219V Mutant18 i BL21 (de3)-RIL celler och rena som beskrivs tidigare19. Kort växa cellerna som beskrivs i steg 2, lyse av franska tryck och rena med hjälp av en IMAC-kolumn. Förvara proteinet i 25 mM natriumfosfatbuffert, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glycerol.
  2. Dialysera provet över natten (ca 15 h) i 4 L 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, för att möjliggöra klyvning och för att avlägsna överskott av Imidazol från provet för efterföljande rening.
  3. Dag 4 – ta bort provet från dialys. Kör en sida med SDS-PAGE gel av provet från TEV klyvning för att säkerställa klyvning är avslutad.
  4. På ett snabbt Vätskekromatografisystem, ta bort etanol från en iMac 5 ml-kolonn med 25 ml ultrarent H2O vid 5 ml/min, följt av 25 ml elueringbuffert som innehåller 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm Imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, sedan bindningsbuffert innehållande 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm Imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0.
  5. Fyll på kolonnen med 1 mL/min med TEV-cleaved NEMO-EEAA. Cleaved NEMO-EEAA kommer att eluera i genomflödet: samla in en 96 väl fraktion uppsamlings platta (1 mL fraktioner). Tvätta kolonnen för fem kolumn volymer på 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol vid 1 mL/min, och fortsätter att samlas i fraktionsplattan.
  6. Elute TEV och uncleaved hans6-Nemo-eeaa med tre kolumn volymer 20 mm Tris, 150 mm nacl, 500 mm Imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, samla eluering i en 50 ml kolv.
  7. Kör SDS-PAGE gel av genomflödesfraktioner för att bestämma närvaron av klyvt NEMO-EEAA.
  8. Pool Flow-Through fraktioner som innehåller klyvt NEMO-EEAA konstruera, och koncentrera sig med en omrörare-cell koncentrator till 5 mL. Membran molekylvikt cut-off (MWCO) = 3 kDa.
  9. Med hjälp av en 3 kDa MWCO membran, dialyze koncentrerat prov i 2 L 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 för 2 h. ändra dialys bufferten till 2 L färsk dialys buffert för övernattning dialys (ca 15 h), vid 4 ° c.
  10. Dag 5 – Fyll på 5 mL av det dialyserade provet på en kromatografi med ett storleks undantag (SEC) 16 mm x 60 cm kolonn (34 μm genomsnittlig partikelstorlek) vid 1 mL/min i 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Upprepa med ytterligare kolumner beroende på provvolym.
  11. Pool fraktioner som motsvarar dimeriskt Nemo-eeaa.
    Obs: Nemo-eeaa eluerar mellan 60-65 ml, vilket motsvarar en större molekylvikt protein, på grund av den långsträckta karaktären av dimeriskt lindade spole.
  12. Koncentrat med en omrörnings cells koncentrator och ett MWCO = 3 kDa-membran till en slutlig koncentration på 113 μM (1,65 mg/mL).
  13. Aliquot proteinet och förvara vid 4 ° c (stabilt i över 1 månad).

5. kontroll av glesa matriser

Obs: protokollet utför kristalliserings försök med kommersiellt tillgängliga skärmar och ställa in sittande Drop experiment med en kristalliserings robot. Kristall bilder samlas in automatiskt av en Imager.

  1. Med hjälp av kommersiellt tillgängliga gles matris skärmar (se tabell över material), pipettera 60 μl av gles matris lösning i var och en av de 96 brunnar i en 2 Drop-kammare kristalliserings platta för sittande droppe ånga diffusion (reservoarlösning).
  2. Använda en robotstyrd droppe setter, avstå 100 nL av proteinlösning på 1,65 mg/mL i en 1:1 förhållande med reservoarlösning i Drop 1 för en slutlig volym av 200 nL; sedan 66 nL av proteinlösning med 134 nL av reservoarlösning för en slutlig volym av 200 nL i droppe 2 (1:2 ratio).
  3. Täta plattan med 3-tums-Wide tätnings tejp omedelbart efter dispensering.
    Obs: droppar kommer att torka ut om den lämnas utsatt för atmosfär för längre än 2-3 min.
  4. Förvara facken i kristalliserings kameran, vid 20 ° c, och kontrollera de bilder som samlas in automatiskt för Crystal Presence, med början efter två dagar.
    Anmärkning: kristalliserings screening fortskred parallellt med Bygg optimering. Inledande kristaller bildas i följande villkor (kommersiella skärmar som anges i tabellen av material): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30% v/v POLYETYLENGLYKOL (PEG) Mme 550, 5% Poly-γ-glutaminsyra, 200-400 kDa låg molekylvikt polymer (pga-LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Glesa matris skärmen kristaller kommer att ha dålig gitter enhetlighet; Därför kommer de att se fattiga med hjälp av Cross-polariserad avbildning. Använd UV-avbildning för att säkerställa att kristallerna innehåller protein. Följande utsäde lager generation steg är nödvändigt för att erhålla den slutliga diffraktion kvalitet kristaller.

6. generering av utsädesråvara

Notera: vi får reproducerbart kristaller för fröproduktion 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20K. Men kristaller kommer att Visa hög mosaicitet och är olämpliga för datainsamling i detta skede.

  1. Med hjälp av ett kit för utsäde generation, förbereda utsäde lager genom Pipettera ut hela droppe med kristall närvarande, och placera i 50 μL kristalliserings tillstånd lösning i den medföljande injektionsflaskan.
  2. Vortex fröbeståndet för 3 min, pulserande 20 s på och 10 s av.
  3. Seriellt utspädd frö buljong i 1:10 steg ner till 1:10000. Förvara alla spädningar vid 4 ° c, för vidare användning.

7. fina skärmar

  1. Designa fina skärmar som varierar förutsättningarna för Tris, PGA-LM, och PEG. Variera PEG längd för enskilda brickor.
    Anmärkning: den fina skärmen som producerade Crystal utnyttjas för strukturbestämning av NEMO-EEAA anställda följande villkor: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM varierade från 8 till 0% i kolumnerna 1-12. Rader A-H avskärmade olika pinnar, med koncentrationer varierande i kolumnerna 1-12 enligt följande. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10K (0-20% w/v); H: PEG 20K (0-20% w/v). Kristallen dök upp i väl H4 (5,45% w/v PEG 20K, 5,8% w/v PGA-LM). I detta protokoll, en proteinkristallografi Screen Builder flytande hanterare användes för att bygga skärmarna.
  2. Utsäde ett protein lager i en 1:25 volymförhållandet 1:1000 frö utspädning.
    Obs: koncentrationen av NEMO-EEAA kommer att sjunka något, men kristaller kommer fortfarande bildas.
  3. Upprepa steg 2 med 1:10000 frö utspädning, samma 1:25 volym förhållande.
  4. Använd drop setter, fördela 100 nL proteinlösning på 1,65 mg/mL, med 1:1000 utspädning av utsäde lager i en 1:1 förhållande med reservoarlösning i Drop 1 för en slutlig volym av 200 nL. Upprepa för Drop 2, men med 1:10000 utspädning av utsäde lager närvarande.
  5. Täta plattan med 3-tums-Wide tätnings tejp omedelbart efter dispensering.
    Obs: droppar kommer att torka ut om den lämnas utsatt för atmosfär för längre än 2-3 min.
  6. Förvara facken i kameran vid 20 ° c och kontrollera bilder som samlats in efter två dagar för kristall närvaro.
  7. Kontrollera kristallerna med Cross-polarisator Imager för gitter enhetlighet, att välja för enskilda villkor för att ställa in följande brickor.

8. generering av kristaller för datainsamling

  1. Design enda skick skärmar runt Tris, PGA-LM, och PEG skick som producerade enhetliga kristaller som analyseras av tvärpolariserade bilder, och de största kristallerna möjligt.
    Obs: kristaller från dessa villkor är oregelbundna i form, mestadels rektangulära tunna ark. Det är nyckeln till att välja ett tillstånd där kanterna på kristallen är väl definierade och har störst tjocklek möjligt.
  2. Gör 20 mL kristalliserings tillstånd för hand.
  3. Använd en multikanalpipettor och fördela 60 μL per brunn i en 2 Drop-kammare, 96 väl kristalliserings platta för sittande droppe ångdiffusion.
  4. Förbered utsädesbeståndet enligt beskrivningen i steg 6,2.
  5. Dispensera proteinet enligt beskrivningen i steg 6,3.
  6. Täta plattan med 3-tums-Wide tätnings tejp omedelbart efter dispensering.
    Obs: droppar kommer att torka ut om den lämnas utsatt för atmosfär för längre än 2-3 min.
  7. Förvara magasinen i kameran vid 20 ° c och kontrollera bilderna för kristall närvaro varje dag.
  8. Kontrollera Cross-polariserade bilder av kristallerna för gitter enhetlighet, för att välja kristaller för datainsamling.

9. bestämning av Cryo-Protectant

  1. För att testa Cryo-Protectants, skapa lagerlösningar som motsvarar kristalliserings förhållanden men som innehåller 30%, 20%, 10%, och 5% högre koncentration av varje komponent. Tillsatsen av Cryo-Protectant-volymen kommer att resultera i en slutlig koncentration av komponenter som är desamma som kristalliserings förhållandena.
    Anmärkning: för provning av en Cryo-Protectant vid en koncentration av 30% för en 0,1 M Tris kristalliserings tillstånd, börja med en stamlösning på 0,143 M Tris, innan du lägger till Cryo-Protectant.
  2. Från en Cryo-reagens kit, skapa 10 μL prov för Cryo-Protectant test genom att blanda 30% av volymen av Cryo skick i 70% av kristallisation skick stamlösning, för en slutlig koncentration av 30% Cryo-Protectant i ursprungliga kristalliserings förhållanden. Blanda noga.
    1. Använd en 10 μL pipett och ta 5 μL av den Cryo-skyddade lösningen och doppa Pipettera-spetsen i flytande kväve. Om isen observeras, kassera.
    2. Testa alla Cryo-protectants på 30%. För de framgångsrika lösningarna, upprepa processen vid 20%, sedan 10% och 5% av Cryo-Protectant.
    3. Använda den framgångsrika Cryo-Protectant lösning med den minsta andelen Cryo-Protectant, tillsätt 0,5 μL lösning i en test droppe med kristaller närvarande. Observera under Mikroskop, timing hur länge kristall varar i tillståndet, om inte obestämd.
      Obs: dessa kristaller är endast för test och kommer att kasseras. För NEMO-EEAA är 12% 1, 2-Propanediol den optimala Cryo-Protectant-lösningen. 12% står för utspädning den Cryo-Protectant lösningen kommer att uppleva när de tillsätts till kristall droppe ca 100 nL, för en ungefärlig slutkoncentration av 1,2-propandiol av 10%.

10. Crystal looping

  1. Loop kristaller 1-2 dagar före leverans till Synchrotron.
    Obs: kristaller kommer att vara ungefär 60-100 μm i diameter: 0,05-0,10 mm slingor är idealiska för looping.
  2. Klipp tejpen från toppen av brunnen.
  3. Tillsätt 0,5 μL kristalliserings lösning innehållande 12% 1, 2-propandiol Cryo-Protectant direkt till brunnen.
    Anmärkning: slutkoncentration av 1,2-propandiol är nu på cirka 10%, på grund av utspädning av 100 nL av droppe lösning (ungefärlig droppe volym minskning från initial 200 nL, på grund av ång diffusion).
  4. Loop kristallen från brunnen.
    Obs: kristaller växer ofta på botten av brunnen men kommer att få bort med en mild knuffa från slingan. När den har avlämnats, loop.
  5. Förvara kristall som innehåller Cryo-loopar i puckar nedsänkt i vätska N2.
  6. Förvara dessa puckar i flytande N2 i Dewar kolv tills de är klara för transport för röntgendiffraktion vid Synchrotron.

11. insamling av uppgifter

  1. Samla in röntgen diffraktions data. I detta protokoll, Använd AMX fd (ID: 17-ID-1), nationella Synchrotron ljuskälla II.
    Obs: data samlades in på plats men kan samlas in på distans. Samla in data i regionen av kristallen som visade gitter enhetlighet i Cross-polariserade bilder. Placera kristallerna i slingan så att datainsamlingen inte involverar "fattiga" regioner i kristallen medan kristallen roterar i goniometern. Data som gav den bästa upplösningen kom från insamling på kanten av en utvidgning av en kristall ca 5 x 5 μm i storlek. Använd rastering för att identifiera de bästa områdena på kristallen för att samla20.

12. behandling av röntgen data

  1. Bearbeta datamängd till högsta upplösning som samlats in (1,8 Å) med XDS IDXREF program för att bestämma utrymme grupp, enhet cell och lösningsmedelsinnehåll.
  2. Integrera data med XDS INTEGRATE-programmet.
  3. Bearbeta skalade intensiteter från XDS XSCALE-programmet med hjälp av STARANISO Server, med I/σI cutoff medelvärde av 1,2 för diffraktion-Limit yta för data.
    Obs: data kommer inte att klippas i sann ellipsoid. Behåll alla data över i/σI av 1,2 cutoff. Statistiken över de uppgifter som beräknats för sfärisk fullständighet kommer att vara dålig, på grund av den icke-sfäriska trunkering. Elliptisk fullständigheten var 88% med högsta upplösning på: 1,88 å, 2,10 å och 2,55 å längs a *, b * respektive c-axeln.

13. struktur lösning

  1. Utnyttja X-ray struktur GCN4 (PDB: 4DMD)15 som en Sök modell för molekylär ersättning med hjälp av mrage21 i Phoenix22. Den 4DMD struktur definierades i MRage som en "Ensemble", och MRage lösning framgångsrikt byggt strukturen del som motsvarar N-terminalen lindad-coil adapter NEMO-EEAA, homolog till Sök modellen, för båda kedjorna i dimer.
    Obs: Stäng av anisotropi korrigering i Phaser, eller data kommer att ytterligare skalas tillbaka.
  2. Utnyttja på varandra följande rundor av Autobuild23 i Phoenix och manuell byggnad (med 2Fo-fc och fo-fc kartor, i coot24) för att bygga resten av strukturen.
  3. Manuellt bygga rester fortfarande saknas i den modell som bygger på 2Fo-fc och fo-fc kartor, med hjälp av coot24.
    Anmärkning: det sista steget innebar att bygga 4 N-terminalen rester och 4 C-Terminal rester för varje monomer. Sido kedjans placering justerades också manuellt efter behov.
  4. Beräkna en sammansatt utelämna karta med PHENIX och en 10% utelämnande av strukturen.

14. förfining av struktur

  1. Förfina strukturerna med PHENIX förfina. Kör de initiala förfiningar mot bulk-lösningsmedel och stereokemi vikter, avslappnande RMSbond och RMSangle begränsningar till 0,01 och 1,0, respektive. Fortsätt förfining på enskilda B-faktorer, TLS-parametrar och occupancies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning, uttryck och rening av den IKK-bindande domänen för NEMO.
Protokollet följde i denna studie för att få den slutliga sekvensen av NEMO-EEAA (figur 1A), som producerade diffraktion kvalitet kristaller, involverade uttrycket och karakterisering av alla mellanliggande konstruktioner, inklusive tillägg av lindade-Coil adaptrar på N-och eller C-terminus, mutationer C76A, C95S och mutationer E56A, E57A. Figur 1B visar en gel av SDS-Page som samlats in under renings förfarandet enligt schemat i figur 1C. Proteinet är överuttryckt i E. coli och visas som ett band ungefär vid 14 kDa MW vikt markör på SDS-Page gel (Lane 3, celler som samlats vid skörd och lyseras i Laemmli prov buffert kompletterad med 8 M urea). Proteinet visas ren efter den första IMAC-kolumnen och visar en monomer och ett dimer band på nivån för 14 och 28 kDa MW markörer på SDS-PAGE gel (Lane 9). TEV klyvning är praktiskt taget komplett efter protokollet och proteinet eluera med flödet genom under den andra IMAC kolumnen nästan helt som en dimer, vid den förväntade MW (band under 28 kDa). Kromatografi med storleks uteslutning visar en enda topp som eluera mellan 60-65 mL och som motsvarar vår erfarenhet av dimer (figur 1D). Den dimeriskt lindade spole alltid eluerar tidigare än väntat på SEC på grund av den långsträckta formen av lindade spolen och därmed stora hydrodynamiska radie10. NEMO-EEAA i bråk från SEC Peak fortfarande visas som en monomer och en dimer på SDS-Page gel (körfält 14-15). Att använda en omrörare-cell koncentrator är viktigt att förhindra prov möjlig aggregering och nederbörd vid koncentration.

Kristallisation av Nemo-EEAA
Initiala kristaller erhölls från en kommersiell skärm med PGA (se tabell över material), som utnyttjar 1,65 μg/ml Nemo-eeaa i 2 mm Tris, 100 mm NaCl, 2 mm DTT, pH 8,0. Fin screening producerade kristaller i 0,1 M Tris pH 8,9, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20K (figur 2A), som användes för att tillverka ett frö bestånd. Slutliga kristaller erhölls med sådd i 0,1 M Tris pH 8,0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20K (figur 2B).

Bestämning av data insamling och struktur
NEMO-EEAA kristaller lider av mosaicitet och anisotropi. Kristaller bildas i P 1 21 1 rymd grupp, med data upplösning varierande i a *, b * och c * axel (1,88 å, 2,10 å och 2,55 Å). Exempel på diffraktions profiler finns i figur 3. Data förvärvades på AMX (17-ID-1) fd av nsls II, med en balk storlek på 7 x 5 μm2. Den lilla strålen storlek var viktigt att fokusera på den önskade delen av kristallen (figur 2B) och säkerställa datakvalitet.

Den lyckade protokoll för strukturbestämning kräver anisotropisk trunkering av data med hjälp av staraniso27 Server (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi), följt av gradvis genom molekylär ersättning med hjälp av mrage21 inom Phoenix22 och strukturen i dimeriskt GCN4 (PDB: 4dmd)15 som en Sök modell. I lösningen av denna struktur fasa var ursprungligen försökt genom att märka den infödda metionin med SeMet. Den anomala signalen var för svag, förmodligen på grund av lösningsmedlet exponerade karaktären av Met95 i obunden form av NEMO (SeMet95 framgångsrikt använts för att fasa av NEMO/IKKβ struktur9).

Inledande dataanalys gjordes med sfärisk trunkering av data till 2,3 Å. Denna datauppsättning kunde inte framgångsrikt fasas genom molekylär ersättning men en lösning erhölls med hjälp av MR-ROSETTA25 och strukturen av Nemo (44-111) i komplex med IKKβ (701-745) som en Sök modell (PDB: 3BRV)9. Den här ursprungliga modellen kunde inte förfinas korrekt. Vi utnyttjade diffraktion anisotropi server på UCLA26 att elliptiskt trunkera data och ta bort anisotropi av anisotropisk skalning. Den nyligen bearbetade datauppsättningen kan fasas ut genom molekylär ersättning. För att ytterligare förbättra uppgifterna använde vi STARANISO27 Server för anisotropisk trunkering av data och amplituder korrigerades med en anisotropisk korrigering faktor med Bayesian uppskattning28. Dessa data, vilket resulterade i en ökning av antalet unika reflektioner till 19 560, användes för struktur förfining. Composite utelämna kartor där beräknat med PHENIX, exklusive 10% av atomerna i taget, och jämfört med den slutliga struktur modellen, för att bekräfta att strukturen inte var partisk av Atommodellen. Den kristallografiska modellera är färdig bortsett från de första och sist restsubstanserna i kedja A av Nemo-eeaa, som ingen Elektrontäthet observerades för.

NEMO-EEAA är en homo-dimeric, oregelbunden, parallell lindade spole av ~ 175 Å i längd. Den ordinarie lindade-Coil regionen omfattar den idealiska lindade-coil adapter sekvens vid N-Terminus (rester 20-50) och de första två heptads av NEMO korrekt sekvens (rester 51-65). En regelbunden lindad spole är också närvarande vid C-terminus, med början vid NEMO rester 97 och omfattar C-terminalen idealisk spole-coil adapter (figur 4A). Den centrala delen, som omfattar NEMO rester 66-98 visar större interspirala avstånd (interspirala avstånd går från ett genomsnittligt värde av 7,6 Å i den ordinarie lindade-spole struktur till högst 11,5 Å i den oregelbundna regionen) och diskontinuerliga hydrofoba gränssnitt jämfört med en idealisk lindad spole. Denna region av NEMO representerar också gränssnittet för bindande IKKβ och genomgår en konformationsändring på ligand bindning. Den IKKβ-bundna strukturen visar en mer öppen lindad-spole konformation att rymma ligand med större interspirala avstånd med 1,0 till 2,2 Å i denna region (figur 4B)12. I APO struktur rester Leu93, Met94, Lys96, Phe97 och Arg101 skiftas mot mitten av lindade spolen att invadera ligand bindnings ficka (Cα-Cα avstånd för Phe97 är hårdare med 2,9 Å), med den totala effekten av att stänga den stora hydrofoba klyven som är värd för ligand i IKKβ-bunden struktur.

Figure 1
Figur 1: rening av Nemo-EEAA. A sekvensjustering av Nemo från homo sapiens, mus Musculus och Bos bovis och den konstruerade Nemo-eeaa. Sekvensen med lindade spole är understruken och mutationerna är markerade i orange. B) gel med SDS-Page av fraktioner som samlats in under uttrycket och reningen (som märkts och refereras i flödesschema 1c). 10% akrylamid, MES-buffert. C ett flödesschema för rening av Nemo-eeaa. D) storleks uteslutnings profil som indikerar dimeren av Nemo-eeaa (blå). I grönt indikeras molekylvikt markörer (kDa). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: morfologi och storlek på Nemo-EEAA kristaller. (A) en kristall av Nemo-eeaa från den ursprungliga sparse matris skärmen, unseeded. Denna typ av kristall användes för sådd för efterföljande kristalliserings försök (0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20K; med en proteinlösning i 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, pH 8,0). (B) kristall som används för datainsamling (0,1 M tris pH 8,0, 5,8% pga-LM, 5,45% PEG 20K, med en proteinlösning i 2 mm tris, 100 mm NaCl 2 mm DTT, pH 8,0). Det ungefärliga området som används för datainsamling är inringat i rött. Skalstapeln för 100 μm längd definieras i figuren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kristallografiska data som erhålls från Nemo-kristaller. (A) röntgen diffraktions profil av tidig Nemo kristall: långsträckt streck indikerar mosaicitet i kristallen. B) röntgen diffraktions profil av en optimerad Nemo-eeaa kristall. Resolutions ringen ritas med en rumslig upplösning på 2,5 Å. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: obunden Nemo-struktur. (A) Nemo-eeaa dimer visas som ett band, ljusblå = lindade-Coil adaptrar, blå = Nemo (51-112). B) överplacering av APO Nemo-eeaa struktur (blå, PDB: 6MI3) och Nemo (44-111) från ikkβ-bunden struktur (grå, PDB: 3BRV, ikkβ visas inte), visas som band; strukturerar arrangera i rak linje på kedja A, region 44-111 endast. Denna siffra har modifierats från tidigare publikation12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kristalliserings försök av NEMO i obunden form misslyckades, inklusive försök att använda full längd protein och flera trunkering konstruktioner som omfattar IKK-bindande domän. Vår biofysiska karakterisering av IKK-bindande domän av Nemo (rester 44-111) av cirkulär dichroism, NMR spektroskopi och fluorescens anisotropi uppgav att konstruktionen, om än kunna binda ikkβ, existerade i ett tillstånd av överensstämande utbyte, inte lämpar sig för kristallisation9,10. Vårt förhållningssätt involverade Engineering en konstruktion av IKK-bindande domän NEMO som antog en mer stabil, vikta och infödda-liknande konformation, vilket eliminerar den flexibilitet som förhindrade kristallisering. Perfekt lindade-Coil domän adaptrar smält till N-och C-Termini i Nemo (44-111) sekvens erbjuda fördelen av att stabilisera dimeriskt lindade-spole gånger av den infödda Nemo och underlättande kristallisation14. Beteendet hos en serie av proteinkonstruktioner övervakades vid varje steg genom SDS-Page, storlek uteslutning kromatografi, cirkulär dichroism, fluorescens anisotropi och NMR spektroskopi, som beskrivs tidigare10,12. Illviljan den progressiva förbättringen i alla önskade parametrar ingen konstruktion gav diffraktion kvalitets-kristaller till mutationar E56A, E57A introducerades. Mutationerna var de högsta effekterna mutationer som föreslagits av ytan entropi minskning Server SERp29 som inte innebar rester inblandade i Hot-Spots av bindning för IKKβ, som i Nemo/ikkβ komplex struktur. Även om andra konstruktioner som stabiliserar den beställda strukturen av IKK-bindande domän av NEMO genom cystein disulfid länkage och bindning IKKβ med hög affinitet har beskrivits30, det protokoll som beskrivs här representerar den första framgångsrika metoden att strukturera bestämning av IKK-bindande domän av Nemo i obunden form.

Protein produktion och-rening följde standardprocedurer i vårt laboratorium. Vid celllys är en avsevärd del av proteinet närvarande i den olösliga fraktionen, även när cellerna växer efter induktion vid 18 ° c, därför var proteinet solubilized i 8 M urea efter cell lysis och före rening, och revikta samtidigt bunden till IMAC-kolumn. Omfattande tvättning av kolonnbundet protein både under denatureringen villkorar och efter vika är kritisk för en ren produkt efter den första reningssteg. Den rena NEMO-EEAA har en högre tendens att fällning än de tidigare konstruktioner men är fortfarande tillräckligt löslig under kristalliserings förhållanden.

Ett kritiskt steg i struktur bestämningen var användningen av seedning. I ett tillvägagångssätt som liknar microseed Matrix screening31, frön från kristall som erhållits under glesa matris screening användes i en ytterligare screening av villkor, följt av en fin screening runda, för att bestämma de slutliga kristalliserings förhållanden. De flesta av de kristaller som odlas i de slutliga villkoren visar hög mosaicitet och är inte lämpliga för datainsamling. Kristaller screenades över flera besök på fd och bästa datakvalitet uppnåddes genom att samla datamängder vid kanten av kristallen, där den senaste tillväxten hade inträffat. Eftersom den region som visade gitter enhetlighet i Cross-polariserade bilder var liten, var det avgörande att ha tillgång till AMX fd på nsls II, på grund av den lilla strålen storlek.

Vi har framgångsrikt fastställt strukturen för Nemo-eeaa genom molekylär ersättning använder som en Sök modellstrukturen på dimeriskt lindade-spole av GCN415, som mappas till den idealiska lindade-Coil adaptrar smält vid N-och C-Termini i Nemo sekvens. Den molekylära ersättningen var framgångsrik eftersom GCN4 adaptorer behålla sin ursprungliga struktur när smält till NEMO. Samtidigt kunde vi kontrollera att NEMO bibehåller sin inhemska struktur genom att jämföra de delar som inte är involverade i IKK-bindning med motsvarande struktur region i den komplexa NEMO/IKKβ-strukturen. Som ett alternativ, kan det vara möjligt att använda strukturen av NEMO i NEMO/IKKβ Complex (PDB: 3BRV)9 som en molekylär ersättning Sök modell, med fokus på monomer B, som motsvarar den kedja som genomgår den minsta överensstämmelses förändring på ligand bindning. Denna strategi visade några inledande framgångar med MR-ROSETTA modul av PHENIX.

Slutligen var det viktigt för en lyckad struktur beslutsamhet att utnyttja alla tillgängliga data i datauppsättningen, genom att tillgripa en anisotropisk cut-off av sammanslagna intensitet data, som tillhandahålls av STARANISO27 Server eller diffraktion Anisotropy server på UCLA26.

Den viktiga roll som spelas av NEMO/IKK-komplexet i NF-kB-vägen gör det till ett önskvärt mål för modulering av vägen för terapeutisk intervention. Protein-proteininteraktioner, särskilt när man involverar ett stort bindnings gränssnitt, är utmanande att hämma med små peptider eller små molekyler, och strukturbaserad inhibitor design kan erbjuda en betydande fördel. De konstruktioner av IKK-bindande domän NEMO som vi utvecklat övervinna gränserna för den flexibla NEMO (44-111) för att underlätta kristallisation och strukturbestämning. Som konstruktionen lätt kristalliserar i obunden form, vi föreställa sig att samma protokoll kan framgångsrikt tillämpas i kristallisation av komplexet NEMO med små molekyler hämmare, att fastställa en struktur som skulle ge information om bindande lägen och möjliggöra ytterligare ligand förbättringar.

En analys av kristall packning i kristalliserings förhållanden uppnås i detta arbete visar att ligand Co-kristallisation kan vara att föredra att ligand blötläggning i APO-proteinkristaller. Medan Crystal Packing ger lite utrymme runt kedja B av dimer (6 till 10 Å till närmaste kedja) och på ena sidan av ligand bindningsstället (ca 13 Å i hot-spot regionen mellan Phe82-Phe87), är den symmetriska bindnings fickan helt ockluderad av närliggande kedjor, vilket förhindrar ligand bindning.

Lindade spolar är närvarande i en betydande del i proteomen och är viktiga i sin funktion som molekylära distansar, ställningar och i att kommunicera kon Formations förändringar16. Trots deras överflöd och relevanta roller, det finns relativt få strukturer av fullängds lindade-Coil proteiner. Användningen av lindade-spole adaptrar kan stöd i stabilisering av strukturella domäner av lindade-Coil proteiner samtidigt bevara deras ursprungliga struktur och stöd i strukturell beslutsamhet och klargörande av deras funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar prof. D. Madden, för många hjälpsamma diskussioner i hela detta projekt. Vi tackar prof. D. Bolon för gåvan av plasmiden som innehåller den optimerade GCN4 lindade spolen. Vi tackar Dr. B. Guo för NEMO plasmider. Vi tackar Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili och Amy E. Kennedy för att demonstrera förfarandet. Vi tackar BioMT kristallografi Core facility och avdelningarna för kemi och biokemi & cell bio logi vid Dartmouth för användning av kristallografi utrustning och BioMT personal för deras stöd. Denna forskning används AMX fd av den nationella Synchrotron ljuskälla II, en US Department of Energy (DOE) Office of Science användaranläggning drivs för DOE Office of Science av Brookhaven National Laboratory under kontrakt nr. DE-SC0012704. Vi tackar Personalen på NSLS II för deras stöd. Detta arbete finansierades av NIH bidrag R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 och P20GM113132, och en Munck-Pfefferkorn roman och interaktiva bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Tags

Biokemi NF-κb Nemo iκb Kinas (IKK) Nemo bindande domän (NBD) lindad Coil röntgenkristallografi proteinteknik strukturbestämning strukturbaserad drog design
Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J.,… More

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter