Summary
患者BMPC标本和骨转移性前列腺癌异种移植物的三维培养，保持其原始肿瘤的功能异质性，导致囊肿、球形和复杂的肿瘤状有机体。本手稿为异质患者衍生样本的 3D 培养及其使用 IFC 进行分析提供了优化策略和方案。
Abstract
人类患者肿瘤标本的三维（3D）培养和前列腺癌患者衍生异种移植（PDX）模型，称为患者衍生器官（PDO），是研究前列腺癌的肿瘤发生和转移。它们的主要优点是，与不传统的细胞系相比，它们保持了原始组织独特的基因组和功能异质性。此外，PDO的3D培养物可用于预测药物治疗对个别患者的影响，是向个性化医学迈出的一步。尽管有这些优点，但少数组通常使用此方法，部分原因是 PDO 培养条件的广泛优化，这可能需要不同的患者样本。我们之前已经证明，我们的前列腺癌骨转移PDX模型，PCSD1，重述了供体患者的骨转移对抗雄激素治疗的抵抗力。我们使用 PCSD1 3D 有机体进一步描述抗雄激素抵抗机制。在概述当前发布的 PDX 和 PDO 模型研究之后，我们描述了在优化培养条件下使用圆顶或浮动基底膜（例如 Matrigel）球体（例如 Matrigel）的 PDO 3D 培养的分步协议。介绍了本体缝合成像和细胞处理，用于本体。该协议可进一步针对其他应用进行优化，包括西印、共培养等，并可用于探索与耐药性、肿瘤发生、转移和治疗相关的3D培养PDO特性。
Introduction
三维培养的有机物已经引起注意，因为他们有潜力重述其原始组织1，2，3，4，5的体内结构，细胞功能和遗传特征。最重要的是，从患者肿瘤组织或患者衍生异种移植（PDX）模型建立的3D类有机体提供了宝贵的机会，以了解细胞信号机制对肿瘤发生，并确定药物治疗对每个细胞群的影响，每个细胞群6，7，8，9，10，11，12，13。Drost等人为建立人类和小鼠前列腺器官制定了标准规程，在泌尿学领域得到了广泛的应用。此外，已作出重大努力，以进一步表征3D有机体，并了解肿瘤发生和转移4，12，14，15的详细机制。除了以前为 3D 有机体培养建立且被广泛接受的协议之外，我们在这里还介绍了 PDO 的 3D 区域性的分步协议，在优化的培养条件下使用三种不同的点胶方法。
在这份手稿中，3D有机体被确立为骨转移性前列腺癌（BMPC）的体外模型。用于这些培养的细胞来自前列腺癌圣地亚哥（PCSD）系列，直接来自患者前列腺癌骨转移肿瘤组织（PCSD18和PCSD22）或患者衍生异种移植（PDX）肿瘤模型（样本命名为PCSD1、PCSD13和PCSD17）。由于前列腺癌细胞的自发性骨转移在基因工程小鼠模型16中很少见，我们利用直接将人类肿瘤细胞注射到雄性Rag2-/----/-小鼠中建立了骨转移性前列腺癌的PDX模型17。
一旦从异质患者肿瘤细胞或患者衍生的异种移植物中建立3D有机体，确认其作为前列腺肿瘤细胞的身份并确定其在3D器官培养物中的表型至关重要。免疫荧光化学（IFC）允许在每个细胞中原位显示蛋白质表达，通常指示特定细胞群2、4的潜在功能。一般来说，包括组织和细胞在内的绝大多数样品的IFC协议是简单明了的，并且完全优化。然而，细胞密度和器官的数量可以明显低于传统培养物。因此，国际有机物的国际金融委员会协议要求采取额外步骤，以确保样品中所有有机物的正确处理和嵌入石蜡。我们描述了腺苷预嵌入工艺的其他步骤，并介绍了在幻灯片上标记切片有机体的位置的提示，提高了IFC在有机物上的成功率，特别是当有机体样本的细胞密度低于预期时。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究是严格按照《加州大学圣地亚哥分校机构审查委员会指南》中的建议进行的。IRB #090401 批准从 UCSD 机构审查委员会 （IRB） 收集手术标本从患者用于研究目的。获得每位患者的知情同意，并取得手术性骨前列腺癌转移标本，从股骨病理性骨折的矫形修复中获得。动物协议是在加州大学圣地亚哥分校（UCSD）动物福利和机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的协议#S10298下执行的。细胞从机械和酶分离的患者肿瘤组织被注射到6至8周大的雄性Rag2-/-;αc-/-小鼠如前所述17。异种移植肿瘤体积是利用体内生物发光成像系统和卡钳测量确定的。当肿瘤生长达到2.0厘米（IACUC批准的最大允许大小）时，肿瘤被收获为3D器官建立。
注：图1显示了建立3D有机体的工作流程和实验过程每个步骤的协议编号。
1. 治疗患者衍生异种移植（PDX）肿瘤组织
注：这是从异种移植小鼠模型衍生的肿瘤的器官建立的第一步。该协议改编自Drost等人之前发表的5，我们已经修改了培养条件，包括血清补充到有机体培养物。
- 处理肿瘤标本，如下所述。
- 敏丝肿瘤样品至1-3mm3大小片，在室温下用10mL细胞解散溶液消化样品45分钟。
- 要终止消化，向样品中添加 20 mL 的 DMEM 完整介质。
- 通过 70 μm 细胞过滤器过滤悬浮液。使用无菌柱塞法兰将任何剩余组织推至 70 μm 细胞过滤器的顶部。
- 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。
- 用新鲜的adDMEM完整介质清洗细胞颗粒三次。将洗涤和重新悬浮的介质体积与表 3中建议的介质体积相匹配。例如，对于 24 孔板培养条件，洗涤的体积应为 500 μL。
注：如表3所示，该协议适用于不同的区域性条件。 - 使用 Trypan 蓝色染料和血细胞计确定最终细胞计数。
- 获得细胞计数后，在 PBS 中每 2 x 106肿瘤细胞中重新悬浮 80 μL 的 2% FBS 中的细胞颗粒。
- 每2 x 106个肿瘤细胞加入20μL小鼠细胞消耗鸡尾酒。混合良好，在2-8°C下孵育15分钟。
- 每 2 x 106肿瘤细胞在 PBS 缓冲液中调整音量至 500 μL，在 PBS 缓冲液中为 2% FBS。
注：在2.5 mL细胞悬浮液中，可处理多达1 x 107个肿瘤细胞，在一个LS柱上处理。 - 在磁柱分离器上加载 LS 柱，并将一个 15 mL 锥形管放在下面的机架上以收集流。
- 在 PBS 缓冲液中用 3 mL 的 2% FBS 冲洗每列。丢弃带洗涤流管的锥形管，并更换为新的无菌 15 mL 锥形管。
- 将细胞悬浮液（高达 2.5 mL 的 1 x 107肿瘤细胞）添加到柱上。收集流通过，将丰富的人类肿瘤细胞。
- 在 PBS 缓冲区中使用 1 mL 的 2% FBS 洗涤柱两次。
注： 一旦列为空，立即执行洗涤步骤非常重要。此外，尽量避免形成气泡。
- 将适当的电池悬浮量与1.5 mL管进行比，用于建立所需的培养液（表3）。
- 在 300 x g和 4 °C 下离心 1.5 mL 管 5 分钟。
- 小心地取出并丢弃上清液。
2. 患者原发性肿瘤组织的处理
注：这是组织机构建立的第一步。
- 遵循除小鼠细胞耗尽过程之外的所有步骤 1，这是处理患者原发性肿瘤组织所不需要的。
3. 在板上形成一个附加的圆形圆顶
注：本手稿描述了由细胞颗粒和基底膜（例如，Matrigel）混合体制成圆顶的三种方法，如图1和图2所示。在步骤2-4中，细胞和基底膜应保存在冰上，以防止地下室膜凝固。
- 将细胞颗粒重新悬浮在适当体积的基底膜（例如，40 μL）中，用于设置24个孔板（表3）。
- 上下轻轻移液，确保细胞在地下室膜中重新悬浮。
- 将细胞基底膜混合物（和可选的adDMEM完整介质的10μL）的适当体积（表3）移入预加热组织培养板的中心。
- 反转板并立即将板倒置在 CO2细胞培养培养箱中，设定为 5% CO2，37°C 15 分钟。这可以防止细胞沉淀和粘附在板底，同时允许基底膜凝固。
- 将含有10μM Y-27632二盐酸的预热介质的适当体积（表3）移入每个井中。
- 将板右侧放在 CO2细胞培养箱内（5% CO2，37 °C）。
- 每 3-4 天更换一次介质。5-7天后，使用不含10μM Y-27632二盐的培养基来维持培养物。
4. 从板上的附着圆形圆顶形成浮动圆顶
- 步骤 3.7 后，使用细胞刮刀拆下圆顶。
5. 形成浮珠
注：此协议被命名为浮珠，因为基底膜、介质和有机物的混合物看起来像珠子。
- 切割 2 英寸 x 4 英寸石蜡薄膜。
- 将石蜡薄膜放在 1000 μL 塑料移液器吸头盒的空吸头架顶部。
- 轻轻按下石蜡薄膜，用戴手套的食指追踪石蜡膜，但不突破石蜡膜。
- 用 70% 乙醇喷洒石蜡薄膜，并在细胞培养罩中打开 UV 灯，对制备的石蜡薄膜进行至少 30 分钟的消毒。
- 制备细胞和20μL基底膜的混合物。播种密度可以是每个圆顶50，000 -250，000个细胞。
- 将从步骤1或2和20μL的基底膜加工的细胞混合物移入制备的石蜡膜中形成的divot的模具中。
- 在基底膜中重新悬浮细胞颗粒，在制备的石蜡薄膜中移液细胞悬浮液。
- 将凝固的珠子和石蜡薄膜放入 6 孔板中。6 孔板中的一口孔可容纳多达 5 个珠子。
- 含有10μM Y-27632二氯化物的预加热介质3-5 mL，同时轻轻刷掉石蜡薄膜上的珠子。
注：作为最小音量，建议使用 3 mL。对于每口井的最大珠数 （N=5），建议使用 5 mL 的介质。 - 将板放在CO2培养箱内（5% CO2，37 °C）。
- 每3-4天更换一次有机体介质。5-7天后，使用不含10μM Y-27632二盐的培养基来维持培养物。
6. 使用显微镜8进行体内器官图像拼接
注：某些显微镜无法到达细胞板的外周（边缘壁）;因此，我们建议在图像拼接时使用靠近细胞板周长的孔。
- 将细胞培养板置于键显显微镜中的板支架中。
- 将镜头放在目标圆顶的中心。
- 通过选择帧数来设置自动拼接过程。例如，可以选择 3 x 3 或 5 x 5 生成 9 个图像或总共 25 个图像。
- 按捕获按钮启动成像过程。
- 打开图像查看器软件并加载步骤 4 拍摄的一组图像。
- 单击"图像拼接"以创建高分辨率拼接图像。
注： 可通过手动或自动设置来对焦单元执行串行 9 或 25 图像的捕获。
7. 组织学的有机体处理：腺糖自旋方法
注：此协议改编自弗拉乔吉安尼斯等人以前的出版物。我们增加了一个步骤，涉及甘蔗糖嵌入成功嵌入所有群体的有机体。
- 从井中取出现有介质。小心不要吸气地下室膜圆顶。
- 添加相等（等于从步骤 1 中删除的介质体积）的细胞恢复溶液，并在 4°C 下孵育 60 分钟。
- 使用移液器拆除地下室膜圆顶，并使用移液头粉碎地下室膜圆顶。在 1.5 mL 管中收集分离的圆顶和细胞恢复溶液。
- 在300 x g和4°C下离心5分钟。
- 取出上清液（细胞恢复溶液）。将所有上生物保存在单独的管中，直到最终颗粒步骤中确认有机物的存在时结束。
- 添加所需的冷PBS体积（表3），并轻轻上下移液以机械干扰颗粒。
- 在300 x g和4°C下离心5分钟。
- 拆下上清液 （PBS）。
- 将颗粒固定在匹配体积中（例如，24 孔板培养条件下的一粒颗粒为 500 μL，表 3）为 4% PFA，在室温下 60 分钟。
- 固定后，在300 x g和4°C下离心5分钟。
- 拆下上清液 （PFA）。
- 用匹配的体积（例如，从24孔板培养条件中一粒颗粒（例如，500 μL）清洗，表3）的PBS和离心机在300 x g和4°C下5分钟。
- 准备温暖的甘蔗（PBS中2%的甘蔗）。
注：此处，冷冻部分的细胞颗粒可在OCT化合物的200μL中直接重新悬浮，无需在协议7中采取进一步步骤。 - 在200 μL的甘蔗素（PBS中为2%）中重新悬浮细胞颗粒。
- 加入甘草后，使用连接到 1 mL 注射器的 25 G 针头，从 1.5 mL 管壁轻轻分离细胞颗粒。如图3所示，如果细胞颗粒没有物理上与1.5 mL管壁分离，那么在甘蔗素嵌入过程中有失去全部或部分细胞颗粒的风险。
- 等待，直到PBS中的2%甘蔗完全凝固。
- 使用连接到 1 mL 注射器的 25 G 针头从 1.5 mL 管中分离凝固的甘草块。
- 将含有细胞颗粒的分离的甘蔗组转移到新的1.5 mL管中。
- 用70%EtOH填充管，并使用传统的组织脱水和石蜡嵌入方案进行进一步。
8. 有机体的组织学和免疫荧光细胞化学（IFC）
- 选择组织学或国际金融公司的幻灯片。
- 在开始染色过程之前，找出细胞在幻灯片上的位置，并使用标记在幻灯片上的单元格周围画一个圆圈。
- 在幻灯片的边缘或板周围绘制周长，以及位于实验室笔记本中幻灯片上的圆圈的位置，以记录其位置。
- 执行所需的染色。
注：在此过程中，标记的圆圈消失，因为常规制造商对化学品没有抵抗力。甚至一些信息学永久标记也可能在染色过程中被抹去。 - 染色过程结束后，将幻灯片放在实验室笔记本上的绘图上，以查找幻灯片上细胞的位置。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D有机体成功地建立了从患者衍生异种移植（PDX）模型骨转移前列腺癌（BMPC）以及直接从患者骨转移前列腺癌组织（图4）。简单地说，我们的BMPCPDX模型是通过将肿瘤细胞注射到雄性Rag2-/----c-/-小鼠中建立的，然后PDX肿瘤被采集和处理，如本手稿所述。如图4所示，PCSD系列的PDX肿瘤组织产生了具有差异表型的3D类有机体，这些表型表现为囊肿、球形和更高的复杂度有机体，使用该协议形成。
从25个高分辨率10倍放大图像缝合的图像显示了整个圆顶的地下室膜和有机物（图5）。使用图像分析软件，可以选择整理大于特定大小的细胞或细胞簇，或手动选择球形或囊肿。
将胶体培养物嵌入的胶合物和提示的步骤，在幻灯片上标记被切片的有机体的位置，可提高在有机体上执行IFC的成功，特别是当有机体样本的细胞密度低于预期时。图6显示了IFC在5μm厚的石蜡部分的有机物，靶向细胞角蛋白5（CK5，基底上皮细胞标记），细胞角蛋白8（CK8，亮度上皮细胞标记）和DAPI。
图1：从患者肿瘤组织或患者衍生异种移植（PDX）肿瘤组织衍生的3D培养器官的建立和表征。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：形成细胞颗粒和基底膜混合物的方法。附加圆顶 （a）， 浮动圆顶 （b） 和浮动珠子 （c）请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：成功嵌入甘蔗的关键步骤。从 1.5 mL 管壁分离细胞颗粒的过程。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：一系列PCSD PDX肿瘤的有机物差异表型，包括单细胞、囊肿、球体和高复杂度有机体。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：来自总共 25 个高分辨率图像的原始拼接图像示例及其应用，用于后续分析以计数细胞数或测量细胞/细胞簇的区域。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：图：显示CK5和CK8IFC染色PCSD1有机物（石蜡部分厚度为5微米）的图像。请点击此处查看此图的较大版本。
| 库存组件 | 最终浓度 | 500 ml 溶液所需的 Vol （mL） |
| 1000 mM HEPES | 10 mM | 5 |
| 200 mM 谷氨酸 | 2 mM | 5 |
| 100x 笔链 | 1x | 5 |
| adDMEM/F12 [/]/* | 485 |
表1：adDMEM/F12 [/]/* 准备。这张表以前曾由德罗斯特等人发表。
| 库存组件 | 最终浓度 | 50 mL 溶液所需的伏 （μL） | 25 mL 溶液所需的伏 （μL） |
| 50 x B27 | 50x 稀释 | 1000 | 500 |
| 500 mM N-乙酰半胱氨酸 | 1.25 mM | 125 | 62.5 |
| 0.5毫克/毫克EGF | 5 纳克/升 | 0.5 | 0.3 |
| 100微克/千米诺金 | 100 纳克/升 | 50 | 25 |
| R-斯蓬丁 1 | 10% 条件介质 | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0.1毫克/毫克 FGF10 | 10 纳克/千米 | 5 | 2.5 |
| 50 μg/mL FGF2 | 5 纳克/升 | 5 | 2.5 |
| 10 mM 普罗斯塔兰丁 E2 | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M 尼古丁酰胺 | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| FBS | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 [/]/* | 最多 50 毫升 | 高达 25 mL | |
| 100 mM Y-27632 二盐 | 10 μM | 5 | 2.5 |
表 2：C/S 人体介质组件 = 10 % FBS。这张表以前曾由德罗斯特等人发表。
| 文化板 | 播种密度（细胞） | 地下室膜体积 （μL） | 中等 （μL） |
| 48 井 | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 井 | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 井 | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
表3：一个圆顶所需的播种密度、基底膜体积和中等体积。此表是从 Drost 等人5. 以前的出版物中修改的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从患者骨转移性前列腺癌细胞中提取的3D器官仍然相对少见。在这里，我们描述了成功建立BMPC串行3D患者衍生器官（PDO）的策略和进一步优化的协议。此外，还描述了用于保护具有较低细胞密度的样品中的有机物的协议，用于IFC和IHC分析。囊肿、球形和更复杂的有机体形式的差分表型表明，该协议提供了培养条件，允许患者的异体肿瘤细胞群保持其细胞表型和结构。因此，本文描述的培养条件，改编自Drost等人5与FBS血清补充修改，已被证明是最适合患者BMPC衍生细胞的培养，以便它们保持其主体内和学科间异质性（手稿在准备）。
我们的优化方案适用于从初级或 PDX 肿瘤组织到设置 3D 有机体培养的有限起始材料的多个端点的实验设置。一般来说，从患者原发性肿瘤组织建立3D器官比从PDX肿瘤组织建立3D器官要少。因此，建议从患者原发性肿瘤组织中建立3D有机体，其细胞的播种密度（高达四倍）高于PDX肿瘤。在肿瘤组织处理过程中提高细胞产量的一种方法是，通过过滤细胞悬浮液再次通过滤网，恢复70μm细胞过滤器顶部的任何肿瘤组织剩余。
可以使用三种不同的方法来形成 3D 有机体培养物 （图 2）， 可根据后续端点分析轻松调整。例如，如果一个人想要在建立3D有机体后有缝合的图像，强烈建议使用附加圆顶，因为图像拼接过程需要微观目标的连续运动才能获得所需的图像数量（9 或 25）。这个过程导致细胞培养板支架的细微振动。两种类型的浮动圆顶在获得图像时，由于振动而自由移动。此外，这两种类型的浮动圆顶可以很容易地从一个井转移到另一个，使它们适合在单独的井中建立3D有机体培养和附着细胞后与粘附细胞共同培养。从连接中释放的附着圆顶和浮动圆顶已被证明可以保留有机物长达10周。有趣的是，浮珠方法的浮圆顶已被证明可以保留有机物长达4个月。在我们的协议中引入的用于生产基底膜球的浮珠法涉及更多的步骤和技能，但可以考虑长期培养。同时，尽管它们用于建立不同肿瘤和转移的3D有机体，但模因法和基底膜形状对器官形成的作用尚未最终确定。从这个意义上说，当其他两种方法不成功时，可以考虑使用石蜡薄膜方法。
对于所有三种不同的方法，该协议建议在重新悬浮过程中使用较低的介质体积和较高的基底膜，因为圆顶在培养过程中会持续更长时间。圆顶由1：4的介质和基底膜组成。值得注意的是，这种方法增加了气泡的形成，同时移液细胞悬浮液上下移，因为增加的介质体积不会绕过基底膜的粘度。因此，建议设置 1.5 mL 管，以便每个圆顶有一个细胞颗粒，而不是在一个 1.5 mL 管中有一个用于多个圆顶的细胞颗粒。这样，一个圆顶管中的气泡形成不会连续影响其他圆顶。如果培养条件的持续时间以前经过优化，并且已知较短（长达一个月），则可以进一步稀释基底膜，以规避基底膜的粘度问题。可在一个管中制备多个孔的细胞颗粒重悬浮液，利用较高的介质体积达到基底膜的所需体积，以尽量减少细胞损失和可变性。
为了尽量减少移液过程中气泡的形成，移液器的体积比实际体积的细胞、介质和基底膜混合物要低。例如，对于 24 孔板内的圆顶，40 μL 的基底膜和高达 10 μL 的 adDMEM 完整介质与细胞颗粒混合。在这种情况下，可以设置移液器处理40μL的体积，而不是50μL，同时上下移液，以尽量减少气泡的形成。对于第二种方法，可在一个管中制备多个孔的细胞颗粒重悬浮液，以尽量减少细胞损失和变异性。市售地下室膜的液体状态通常可变。因此，需要测试新的批次的基底膜进行点膜处理。如果基底膜比平常更粘稠，则可以添加多达 10 μL 的 adDMEM 完整介质（步骤 1 中详述的详细信息），以稀释细胞颗粒和基底膜的混合物。
在这里，我们提出了一个协议，以建立，图像和处理培养的3D有机体与详细的提示，以成功完成所需的程序。我们的手稿中介绍的 3D 有机物培养培养物是专门用于前列腺衍生细胞的。然而，我们的协议中描述的其他细节适用于不同类型的肿瘤组织和转移位点。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
李桑吉和克里斯蒂娜·杰米森是JoVE方法集的客座编辑。
Acknowledgments
这项研究得到了利奥和安妮·阿尔伯特慈善基金会和JM基金会的支持。我们感谢加州大学圣地亚哥摩尔斯癌症中心的成员，杨静博士和杨凯博士允许我们使用他们的微体和兰德尔法语，外科系的技术专长。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al.
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
