Summary
Трехмерные культуры пациентов BMPC образцов и ксенотрансплантатов костного метастатического рака предстательной железы поддерживать функциональную неоднородность своих оригинальных опухолей в результате чего кисты, сфероиды и сложные, опухолевидные органоиды. Данная рукопись содержит стратегию оптимизации и протокол для 3D-культуры неоднородных образцов, полученных пациентом, и их анализа с использованием МФк.
Abstract
Трехмерная (3D) культура органоидов из опухолевых образцов пациентов и получаемых пациентом ксенотрансплантата (PDX) моделей рака предстательной железы, именуемых органоидами, полученными от пациента (PDO), являются бесценным ресурсом для изучения механизма опухолевого и метастазов рака предстательной железы. Их главным преимуществом является то, что они поддерживают отличительную геномную и функциональную неоднородность оригинальной ткани по сравнению с обычными клеточными линиями, которые этого не делают. Кроме того, 3D культуры PDO могут быть использованы для прогнозирования воздействия лечения наркотиков на отдельных пациентов и являются шагом к персонализированной медицины. Несмотря на эти преимущества, несколько групп обычно используют этот метод отчасти из-за обширной оптимизации условий культуры PDO, которые могут потребоваться для различных образцов пациентов. Ранее мы продемонстрировали, что наша модель метастаза рака простаты PDX, PCSD1, вновь показала устойчивость метастазировать в кости пациента-донора к антиандрогенной терапии. Мы использовали органоиды PCSD1 3D для дальнейшей характеристики механизмов антиандрогенной резистентности. После обзора опубликованных в настоящее время исследований моделей PDX и PDO мы описываем пошаговой протокол для 3D-культуры PDO с использованием куполообразных или плавающих мембран ывейной (например, Matrigel) сфер в оптимизированных условиях культуры. In vivo стежок изображений и обработки клеток для гистологии также описаны. Этот протокол может быть дополнительно оптимизирован для других приложений, включая западный пятно, совместной культуры и т.д., и может быть использован для изучения характеристик 3D культивируемой PDO, относящихся к лекарственной устойчивости, опухолевому, метастазам и терапии.
Introduction
Трехмерные культивированные органоиды обратили внимание на их потенциал для повторения архитектуры in vivo, клеточной функциональности и генетической подписи их оригинальных тканей1,2,3,4,5. Самое главное, 3D органоиды, установленные из опухолевых тканей пациента или пациента производных ксенотрансплантата (PDX) модели предоставляют бесценные возможности для понимания механизмов клеточной сигнализации при опухолевом и определить влияние медикаментозного лечения на каждую популяцию клеток6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 разработали стандартный протокол для создания органов простаты человека и мыши, который был широко принят в области урологии. Кроме того, значительные усилия были направлены на дальнейшую характеристику 3D-органоидов и понимание детальных механизмов опухолевого и метастазов4,12,14,15. В дополнение к ранее установленному и широко принятому протоколу для культур 3D органоидов, мы описываем здесь пошаговой протокол для 3D-культуры PDO, используя три различных метода доминга в оптимизированных условиях культуры.
В этой рукописи, 3D органоиды были созданы в качестве модели ex vivo кости метастатического рака предстательной железы (BMPC). Клетки, используемые для этих культур пришли из рака предстательной железы Сан-Диего (PCSD) серии и были получены непосредственно из метастатического рака простаты метастатических опухолевых тканей (PCSD18 и PCSD22) или пациента производные ксенотрансплантат (PDX) опухоли модели (образцы под названием PCSD1, PCSD13, и PCSD17). Потому что спонтанные метастазы костной ткани раковых клеток редко в генетически модифицированных моделей мыши16, мы использовали прямую внутри-femoral (IF) инъекции человеческих опухолевых клеток в мужской Rag2-/-КК-/- мышей для создания PDX модели кости метастатического рака предстательной железы17.
После того, как 3D органоиды устанавливаются из неоднородных опухолевых клеток пациента или пациента, полученных ксенотрансплантатов, важно, чтобы подтвердить их идентичность в качестве клеток опухоли простаты и определить их фенотипы в 3D органоидных культур. Иммунофлуоресценция химии (IFC) позволяет визуализации экспрессии белка на месте в каждой клетке, часто с указанием потенциальных функций для конкретных популяций клеток2,4. В целом протоколы МФЦ для подавляющего большинства образцов, включая ткани и клетки, просты и полностью оптимизированы. Однако плотность клеток и количество органоидов могут быть значительно ниже, чем у обычной культуры. Поэтому протокол МФК для органоидов требует дополнительных шагов для обеспечения надлежащей обработки и встраивания в парафин для всех органоидов в образцах. Мы описываем дополнительные шаги для процесса предварительного встраивания агарозы и советы по обозначения расположения разделенных органоидов на слайде, что увеличивает показатель успеха МФК на органоидов, особенно когда образцы органоидов имеют более низкую плотность клеток, чем хотелось бы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве для Совета по институциональному обзору Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD). IRB #090401 одобрение было получено от UCSD Институциональный обзор совета (IRB) для сбора хирургического образца от пациентов для исследовательских целей. От каждого пациента было получено информированное согласие, и в результате ортопедического ремонта патологического перелома бедренной кости был получен хирургический образец метастазрака рака простаты. Протоколы животных были выполнены в соответствии с Калифорнийским университетом в Сан-Диего (UCSD) защиты животных и институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) утвержденный протокол #S10298. Клетки механически и ферментативно диссоциированной ткани опухоли пациента были внутри-femorally введены в 6 до 8 недель мужчина Rag2-/-; qc-/- мышей, как ранее описано17. Объем опухоли Xenograft был определен с помощью системы визуализации биолюминесценции in vivo и измерений калибра. При росте опухоли до 2,0 см (максимально допустимый размер одобрен IACUC), опухоль была собрана для установки 3D-органоидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс для установления 3D органоидов и протокольный номер для каждого шага экспериментальных процедур.
1. Обработка производных ксенотрансплантата (PDX) опухолевых тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Это первый шаг для органоидного создания опухоли, полученной из модели ксенотрансплантатмыши. Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Drost et al.5, и мы изменили условия сми, включив добавки сыворотки к органоидным носителям.
- Обработайте образец опухоли, как описано ниже.
- Образцы опухоли фарша до 1-3 мм3 размера штук и переварить образцы с 10 мл раствора диссоциации клеток в течение 45 минут при комнатной температуре.
- Чтобы прекратить пищеварение, добавьте 20 мл полного носителя DMEM в образцы.
- Фильтр подвески через 70 мкм ячейки ситечко. Используйте стерильный поршень фланг, чтобы подтолкнуть любые остатки ткани на вершине 70 мкм ячейки ситечко.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Вымойте клеточные гранулы три раза со свежимa adMEM полный носителей. Соподогвайте объем средств для мытья и повторного свистого с объемом носителей, предложенных в таблице 3. Например, для 24 хорошо пластины культуры состояние, объем для стирки должно быть 500 зл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано в таблице 3,протокол применим к различным условиям культуры. - Определить окончательные количество клеток с помощью трипан синий краситель и гемоситометр.
- После получения клеток рассчитывает, повторно приостановить клеточные гранулы в 80 Зл 2 00 FBS в PBS на 2 х 106 опухолевых клеток.
- Добавьте 20 злитровых коктейлей для истощения мышей на 2 x 106 опухолевых клеток. Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 15 мин при 2-8 градусах Цельсия.
- Отрегулируйте громкость до 500 кЛ с 2% FBS в буфере PBS на 2 х 106 опухолевых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: До 1 х 107 опухолевых клеток в 2,5 мл клеточной суспензии могут быть обработаны на одной колонке LS. - Загрузите колонны LS на магнитный сепаратор колонны и поместите коническую трубку 15 мл на стойку под ним, чтобы собрать поток через.
- Промыть каждый столбец с 3 мл 2% FBS в буфере PBS. Откажитесь от конической трубки с промывкой и замените новой, стерильной конической трубкой 15 мл.
- Добавьте на колонку клеточную суспензию (до 2,5 мл из 1 х 107 опухолевых клеток). Сбор потока через которые будут обогащены человеческими опухолевыми клетками.
- Вымойте столбец дважды с 1 мл 2% FBS в буфере PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнять шаги мытья, как только столбец пуст. Кроме того, старайтесь избегать образования пузырьков воздуха.
- Aliquot соответствующий объем подвески клетки до трубки 1.5 mL для пожеланной установки культуры(таблица 3).
- Центрифуга 1,5 мл трубки на 300 х г и 4 КК в течение 5 мин.
- Тщательно удалите и отбросьте супернатант.
2. Обработка первичных опухолевых тканей пациента
ПРИМЕЧАНИЕ: Это первый шаг для органоидного истеблишмента.
- Следуйте всем шагу 1, за исключением процесса истощения клеток мыши, который не является необходимым для обработки первичных опухолевых тканей пациента.
3. Формирование прилагаемого круглого купола на тарелке
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта рукопись описывает три способа сделать купол из смеси клеточных гранул и мембраны подвала (например, Matrigel), как показано на рисунке 1 и рисунке 2. В шагах 2-4, клетки и мембрана подвала должны быть сдержаны на льду для того чтобы предотвратить затвердевание мембраны подвала.
- Приостановите действие клеточной гранулы в соответствующем объеме мембраны подвала (например, 40 л) для 24 хорошо настроенной пластины(таблица 3).
- Pipette вверх и вниз нежно для того чтобы обеспечить что клетки re-suspended наилучшим образом в мемне подвала.
- Pipette соотвествующее тома (Таблица 3) смеси мембраны клетки-подвала (и факультативного 10 l adDMEM вполне средств) в центр pre-warmed плиты культуры ткани.
- Перевернуть пластину и сразу же поместите пластину вверх дном в инкубатор культуры CO2, установленный на уровне 5% CO2,37 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Это предотвращает клетки от урегулирования и прилипания к нижней пластины, позволяя мембраны подвала затвердеть.
- Pipette соответствующий объем(Таблица 3) предварительно подогретой среды, содержащей 10 МКм Y-27632 дигидрохлорид в каждой скважине.
- Поместите тарелку правой стороной внутри инкубатора культуры CO2 (5% CO2,37 градусов по Цельсию).
- Меняйте носители каждые 3-4 дня. После 5-7 дней, использовать среду культуры без 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид для поддержания культур.
4. Формирование плавающего купола из прилагаемого круглого купола на плите
- После шага 3.7 отсоедините купол с помощью клеточного скребока.
5. Формирование плавающих бусин
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол назван как плавающие бусы, так как смесь мембраны подвала, носителей и органоидов выглядят как бисер.
- Вырезать 2 дюйма х 4 дюйма кусок парафиновой пленки.
- Поместите парафина пленка на верхней части divots пустой наконечник-держащий стойку из 1000 л пластиковых пипетки наконечник поле.
- Аккуратно нажмите на парафина фильм проследить divots с помощью перчаточного указательного пальца, но не пробивая парафина пленки.
- Спрей парафина пленка с 70% этанола и включите УФ лампы в клеточной культуре капот стерилизовать подготовленную пленку парафина, по крайней мере 30 минут.
- Приготовьте смесь клеток и 20 зл и мембраны подвала. Плотность посевов может сосена 50 000 - 250 000 клеток на купол.
- Пипетка смесь клеток, обработанных от шага 1 или 2, и 20 зл и л подвальной мембраны в форму divot формируется в подготовленной парафина пленки.
- Resuspend клетки гранулы в подвале мембраны и пипетки клеточной подвески в подготовленных парафин снимали divots.
- Поместите затвердевные бусы и парафина пленки в 6-колодец пластины. Один колодец в 6-хорошей пластине может поместиться до 5 шариков.
- Пипетка 3-5 мл предварительно подогретой среды, содержащей 10 мкм Y-27632 дигидрохлорид в каждом колодце в то время как мягко щеткой бисер от парафина пленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В минимальном объеме рекомендуется 3 мл. Для максимального количества бусин (N-5) на скважину рекомендуется 5 мл среднего. - Поместите тарелку в инкубатор CO2 (5% CO2,37 градусов по Цельсию).
- Меняйте органоидные носители каждые 3-4 дня. После 5-7 дней, использовать среду культуры без 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид для поддержания культур.
6. In vivo органоидов изображение сшивания с помощью микроскопа8
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые микроскопы не могут достичь внешнего периметра клеточной пластины (краевая стена); Поэтому мы предлагаем использовать скважины, расположенные по периметру клеточной пластины, при сшивке изображения.
- Поместите пластину культуры клеток в восходящем положении в держатель пластины в микроскоп Keyence.
- Поместите объектив в центр ею.
- Настройте процесс автоматического сшивания, выбрав количество кадров. Например, 3 х 3 или 5 х 5 могут быть выбраны для создания 9 изображений или 25 изображений в общей сложности.
- Нажмите кнопку захвата, чтобы инициировать процесс визуализации.
- Откройте программное обеспечение для просмотра изображений и загрузите группу изображений, сделанных шагом 4.
- Нажмите на сшивание изображения, чтобы создать сшитое изображение с высоким разрешением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Захват серийных 9 или 25 изображений может быть выполнен либо вручную, либо автоматически настроить, чтобы фокусировать ячейки.
7. Органоидная обработка гистологии: метод спин-дауна агарозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Vlachogiannis и др.7. Мы добавили шаг с участием агарозы встраивания успешно вставлять все популяции органоидов.
- Удалите существующие носители из скважины. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать подвальные мембранные купола.
- Добавьте равный (равный объем множеству носителей, удаленный со ступени 1) объема раствора восстановления клеток и инкубируйте в течение 60 мин при 4 градусах Цельсия.
- Выбить подвал мембранный купол с помощью пипетки и раздавить подвал мембранный купол с помощью трубчатого наконечника. Соберите разобщенный купол и раствор восстановления клеток в трубке длиной 1,5 мл.
- Центрифуга при 300 х г и 4 кв 5 мин.
- Удалите супернатант (решение восстановления клеток). Сохранить все супернацианты в отдельных трубах до конца, когда присутствие органоидов подтверждается в заключительном шаге гранулирования.
- Добавить желаемый объем (Таблица 3) холодной PBS и мягко пипетка вверх и вниз, чтобы механически беспокоить гранулы.
- Центрифуга при 300 х г и 4 кв 5 мин.
- Удалите супернатант (PBS).
- Исправьте гранулы в соответствующем объеме (например, 500 л для одной гранулы из 24 хорошо пластины культуры состоянии, Таблица 3) 4% ПФА в течение 60 минут при комнатной температуре.
- После фиксации, центрифуга на 300 х г и 4 кв кв в течение 5 мин.
- Удалите супернатант (PFA).
- Вымойте с соответствующим объемом (например, 500 л на одну гранулу из 24 хорошо пластины состояние культуры, Таблица 3) PBS и центрифуги на 300 х г и 4 КК в течение 5 мин.
- Подготовка теплой агарозы (2% агарозы в PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, пеллеты клетки для замороженных разделов можно сразу повторно приостановить в 200 ЗЛ соединения OCT без дальнейших шагов в Протоколе 7. - Повторно приостановить клеточные гранулы в 200 зл агарозы (2% в PBS).
- Сразу же после добавления агарозы, осторожно отсоедините клеточные гранулы от стенки трубки 1,5 мл, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 1 мл. Как показано на рисунке 3, если клетка гранулы физически не отделены от стены 1,5 мл трубки, то есть риск потери всех или части клеточной гранулы во время процесса встраивания агарозы.
- Подождите, пока 2% агарозы в PBS полностью затвердевает.
- Отсоедините затвердеваемый блок агарозы из трубки 1,5 мл, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 1 мл.
- Перенесите отсоединенный блок агарозы, содержащий клеточные гранулы, в новую трубку 1,5 мл.
- Заполните трубку с 70% EtOH и продолжить работу с использованием обычного протокола для обезвоживания тканей и встраивания парафина.
8. Гистология и иммунофлооресцентная цитохимия (МФК) органоидов
- Выберите слайд (ы) для гистологии или МФК.
- Прежде чем начать процесс окрашивания, выяснить, где клетки расположены на слайде и нарисовать круг вокруг клеток на слайде с помощью маркера.
- Нарисуйте периметр вокруг края или бордера слайда и где круги расположены на слайде в лабораторном блокноте, чтобы записать их местоположение.
- Выполните желаемое окрашивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса, отмеченные круги исчезают, так как регулярный производитель не устойчив к химическим веществам. Даже некоторые гистологии постоянные маркеры могут быть стерты во время процесса окрашивания. - После процесса окрашивания поместите слайд над рисунком в лабораторном блокноте, чтобы найти расположение клеток на слайде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D органоиды были успешно созданы из пациента производных ксенотрансплантат (PDX) модель метастатического рака предстательной железы (BMPC), а также непосредственно из метастатического рака предстательной железы пациента(рисунок 4). Короче говоря, наши модели PDX BMPC были созданы путем внутри-бедренной (IF) инъекции опухолевых клеток в мужской Rag2-/- c-/- мышей, а затем PDX опухоли были собраны и обработаны, как описано в этой рукописи. Как показано на рисунке 4, PDX опухолевых тканей из серии PCSD привело к 3D органоидов с дифференциальными фенотипами, которые проявляются как кисты, сфероиды и более высокой сложности органоидов, которые образуются с помощью этого протокола.
Сшитое изображение с 25 изображений с высоким разрешением 10x увеличение показало весь купол мембраны подвала и органоидов(рисунок 5). Используя программное обеспечение для анализа изображений, можно сортировать ячейки или клеточные кластеры, которые больше определенного размера или вручную выбрать сфероиды или кисты.
Шаги для агарозы встраивания органоидных культур и советы по обозначения расположения разделенных органоидов на слайде увеличивают успех выполнения МФЦ на органоидах, особенно когда образцы органоидов имеют более низкую плотность клеток, чем хотелось бы. На рисунке 6 показан пример МФК на секции парафина толщиной 5 мкм органоидов, нацеленных на цитокератин 5 (CK5, базальный эпителиальный маркер), цитокератин 8 (CK8, светящийся эпителиальный маркер) и DAPI.
Рисунок 1: Создание и характеристика для 3D культурных органоидов, полученных либо из тканей опухоли пациента или пациента производного ксенотрансплантата (PDX) опухолевых тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Методологии для формирования смеси клеточных гранул и мембраны подвала. Прилагаемый купол(a),плавающий купол(b)и плавающие бусы(c). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Ключевой шаг для успешного встраивания агарозы. Процесс отсоединения клеточной гранулы от стенки трубки 1,5 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Дифференциальные фенотипы органоидов из серии опухолей PCSD PDX, которая включает в себя одиночные клетки, кисты, сфероиды и органоиды более высокой сложности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Пример сырого сшитого изображения из общего числа 25 изображений с высоким разрешением и его применение для последующего анализа для подсчета количества ячеек или измерения площади клеток/клеточных кластеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Изображение, показывающее CK5 и CK8 IFC окрашенных органов PCSD1 (5 мкм толщиной парафиновой секции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Компонент запаса | Окончательная концентрация | Vol (мЛ) необходим для раствора 500 мл |
| 1000 мМ HEPES | 10 мМ | 5 |
| 200 мМ Глутамакс | 2 мМ | 5 |
| 100x Пен-Стреп | 1x | 5 |
| adMM/F12 | 485 |
Таблица 1: AdMEM/F12 //- Подготовка. Эта таблица была ранее опубликована Drost et al.5.
| Компонент запаса | Окончательная концентрация | Vol (КЛ), необходимый для раствора 50 мл | Vol (КЛ), необходимый для раствора 25 мл |
| 50x B27 | 50x Разбавленный | 1000 | 500 |
| 500 мМ N-ацетилцистеин | 1,25 мМ | 125 | 62.5 |
| 0,5 мг/мл EGF | 5 нг/мл | 0.5 | 0.3 |
| 100 мкг/мл Ноггин | 100 нг/мл | 50 | 25 |
| Р-Спондин 1 | 10% кондиционированная среда | 5000 | 2500 |
| 5 мМ A83-01 | 500 нм | 5 | 2.5 |
| 0,1 мг/мл FGF10 | 10 нг/мл | 5 | 2.5 |
| 50 мкг/мл FGF2 | 5 нг/мл | 5 | 2.5 |
| 10 мМ Простагландин E2 | 1 км | 5 | 2.5 |
| 1M Никотинамид | 10 мМ | 500 | 250 |
| 30 мМ SB202190 | 10 км | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 ММ ДХТ | 1 нм | 50 | 25 |
| adMM/F12 | Принесите до 50 мл | Принесите до 25 мл | |
| 100 мМ Y-27632 Дигидрохлорид | 10 км | 5 | 2.5 |
Таблица 2: Компоненты для C/S Human Media - 10% FBS. Эта таблица была ранее опубликована Drost et al.5.
| Культурная плита | Плотность посева (клетки) | Объем мембраны в подвале (КЛ) | Средний (КЛ) |
| 48 хорошо | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 хорошо | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 хорошо | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Таблица 3: Плотность посева, объем мембраны в подвале и средний объем, необходимый для одного купола. Эта таблица изменена из предыдущей публикации Drost et al.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D органоиды, полученные из метастазов костей пациента раковых клеток предстательной железы по-прежнему относительно редки. Здесь мы описываем стратегии и дальнейший оптимизированный протокол для успешно говорутого серийного 3D-пациента, полученных из органов (PDF) BMPC. Кроме того, описаны протоколы для обеспечения органоидов в образцах с более низкой плотностью клеток для анализа МФк и IHC. Дифференциальные фенотипы в виде кисты, сфероидов и более сложных органоидов указывают на то, что этот протокол обеспечивает культурные условия, позволяющие гетерогонозным популяциям опухолевых клеток у пациентов сохранять свой клеточный фенотип и структуру. Таким образом, описанные здесь культурные условия, которые были адаптированы из Drost et al.5, измененных с помощью добавок сыворотки FBS, оказались оптимальными для культур клеток, полученных bmPC, таким образом, что они сохраняют свою внутрисубъектную и межсубъектную неоднородность (рукопись в процессе подготовки).
Наш оптимизированный протокол является практичным для экспериментальной настройки с несколькими конечными точками из ограниченного исходного материала из первичных или PDX опухолевых тканей для создания 3D культур органоидов. В целом, создание 3D-органоидов из первичных опухолевых тканей пациента менее успешно, чем создание 3D органоидов из опухолевых тканей PDX. Поэтому рекомендуется иметь более высокую плотность посева (до четырех раз выше) клеток для создания 3D-органоидов из первичных опухолевых тканей пациента, чем от опухолей PDX). Один из методов для увеличения урожайности клеток во время обработки опухолевой ткани заключается в том, чтобы восстановить любые опухолевые ткани остатки на вершине 70 мкм ячейки ситечко, проходя фильтрованную подвеску клеток через ситечко снова.
Три различных метода для формирования 3D органоидной культуры(Рисунок 2) могут быть использованы и легко адаптированы в зависимости от последующей до анализа конечных точек. Например, если кто-то хотел иметь сшитые изображения после создания 3D органоидов, прилагаемый купол настоятельно рекомендуется, поскольку процесс сшивания изображения требует последовательного движения микроскопической цели для получения желаемого количества изображений (или 9 или 25). Этот процесс приводит к тонкой вибрации к держателю плиты культуры клетки. Оба типа плавающего купола будут свободно перемещаться из-за вибрации при получении изображения. Кроме того, оба типа плавающих куполов могут быть легко перенесены из одного колодца в другой, что делает их пригодными для совместной культуры с клетками адептов после создания 3D органоидных культур и клеток адептов в отдельных колодцах. Прикрепленный купол и плавающий купол, освобожденный от прикрепления, сохраняют органоиды на срок до 10 недель. Интересно, что плавучий купол из метода плавающей бисера, как было показано, сохраняет органоиды на срок до 4 месяцев. Плавучий метод бусин для производства подвальных мембранных сфер, введенных в наш протокол, включает в себя больше шагов и навыков, но может быть рассмотрен для долгосрочной культуры. Параллельно, несмотря на их использование для создания 3D-органоидов из различных опухолей и метастазов, роль метода доминга и форма мембраны подвала на образование органоидов не были глубоко определены. В этом смысле метод парафина пленки может быть рассмотрен для использования, когда два других метода были неудачными.
Для всех трех различных методов, этот протокол рекомендует использовать меньший объем носителей и больший объем подвала мембраны для процесса повторного действия, потому что купола будет длиться дольше в культуре. Купол образуется с соотношением 1:4 носителей и мембраны подвала. Следует отметить, что этот метод увеличивает образование пузырьков при пипетке клеточной подвески вверх и вниз, так как добавленный объем носителей не обходит вязкость мембраны подвала. Поэтому рекомендуется установить трубки мощностью 1,5 мл таким образом, чтобы на каждый купол была одна клеточная гранулы вместо одной клеточной гранулы на несколько куполов в одной трубке 1,5 мл. При этом образование пузырьков в одной трубке для одного купола не будет последовательно влиять на другие купола. Если продолжительность состояния культуры была ранее оптимизирована и, как известно, коротка (до месяца), мембрану подвала можно разбавить больше, чтобы обойти вопрос вязкости мембраны подвала. Ревнеситель клеточных гранул для нескольких скважин может быть подготовлен в одной трубе, используя больший объем носителей для желаемого объема мембраны подвала, чтобы свести к минимуму потерю и изменчивость клеток.
Чтобы свести к минимуму образование пузырьков во время процесса трубации, пипетка меньше гостем, чем фактический объем клеток, носителей и мембранной смеси подвала. Например, для купола в пределах 24 скважинных пластин, 40 зл и мембраны подвала и до 10 зл adMEM полных носителей смешиваются с клеточными гранулами. В этом случае, пипетка может быть установлена для обработки объема 40 зл, а не 50 qL в то время как пайпеттинг вверх и вниз, с тем чтобы свести к минимуму образование пузырьков. Для этого второго метода, повторение клеточных гранул для нескольких скважин может быть подготовлено в одной трубке, чтобы свести к минимуму потерю и изменчивость клеток. Статус жидкого фундамента часто изменяется. Поэтому новые партии мембраны подвала должны быть испытаны для процесса doming. Если мембрана подвала более вязкая, чем обычно, то до дополнительных 10 ЗЛ AdMEM полных носителей (детали, написанные в шаге 1) могут быть добавлены, чтобы разбавить смесь клеточных гранул и мембраны подвала.
Здесь мы представляем протокол по установлению, изображению и обработке культивированных 3D органоидов с подробными советами для успешного завершения желаемых процедур. Культурные носители для 3D-органоидов, представленные в нашей рукописи, специально для клеток, полученных от простаты. Однако другие детали, описанные в нашем протоколе, применимы к различным типам опухолевых тканей и метастатическим участкам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Санги Ли и Кристина А.М. Джеймисон являются приглашенными редакторами коллекции Методов JoVE.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Благотворительным фондом Лео и Анны Альберт и Фондом JM. Мы благодарим Калифорнийского университета в Сан-Диего Мурс онкологический центр членов, д-р Цзин Ян и д-р Кей Т. Енг за предоставленную нам возможность использовать их микротомы и Рэндалл французский, Департамент хирургии для технических знаний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al.
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
