Summary
O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.
Abstract
O comprimento de axônons cholinergic ou outros axônticos neuronais em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com a função específica da região. A estereologia é um método útil para quantificar perfis neuronais de várias estruturas cerebrais. Aqui fornecemos um protocolo de estereorologia baseado em software para estimar o comprimento total das fibras colinérgicas no núcleo basalis de Meynert (NBM) do cérebro do forebrain basal. O método usa uma sonda de bola espacial para estimativas de comprimento. As fibras colinérgicas são visualizadas pelo sistema de detecção de acetiltransferase de colina (ChAT) com o sistema de detecção de peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB). O protocolo de coloração também é válido para estimativa de fibras e números de células em várias regiões cerebrais usando software de estereologia. O protocolo de estereorologia pode ser usado para estimativa de quaisquer perfis lineares, como fibras colececeptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminergicas, fibras sorotonergicas, processos ascicitos ou até mesmo perfis vasculares.
Introduction
Estimativas quantitativas de comprimento e/ou densidade de fibras nervosas no cérebro são parâmetros importantes de estudos neuropatológicos. O comprimento dos axônhonas cholinergicgic, dopaminergice e sorotonergicos em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com as funções específicas da região. Como a distribuição desses axôlos é geralmente heterogênea, a estereorologia baseada em design é usada para evitar viés durante a amostragem. A sonda de bola espacial da estereorologia foi projetada para fornecer medidas eficientes e confiáveis de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em uma região de interesse1. A sonda faz uma esfera virtual que é imposta sistematicamente no tecido para medir intersecções de linha com a superfície da sonda. Por ser impossível colocar sondas de esfera no tecido para análise, o software comercialmente disponível fornece uma esfera virtual tridimensional (3D), que é basicamente uma série de círculos concêntricos de vários diâmetros que representam a superfície da sonda esfera.
A neurodegeneração colinérgica seletiva é uma das características consistentes da doença de Alzheimer (AD)2,3,4. A transmissão colinérgica disfuncional é considerada um fator causal para o declínio cognitivo em AD. A disfunção colinérgica também é evidente em muitos outros transtornos mentais, como Parkinson, vício e esquizofrenia. Diferentes aspectos da neurodegeneração cholinergicsão são estudados em modelos animais (por exemplo, redução na acetilcolina5,proteína ChAT6,neurodegeneração de fibras cholinergicas nas proximidades de placas amiloides6, e diminuição em fibras cholinergic e varicos sinápticos7,8). Acredita-se que a degeneração da fibra ocorra antes da perda neuronal, porque a perda neuronal cholinergica nem sempre é observada em estudos. A maioria dos neurônios colinérgicos estão no cérebro basal e no tronco cerebral, e seus axôlos projetam para várias regiões cerebrais, como os cortices e o hipocampo. O NBM está situado no cérebro basal e descobriu-se ser uma das áreas cerebrais comumente afetadas em D.C.
O método fracionário da estereologia baseia-se na amostragem aleatória sistemática de um tecido em múltiplos níveis. A fração amostral de seção (SSF) é a amostragem sistemática não baseada em computador de seções para o método fracionário de estereology. A fração amostral de área (ASF) é a fracionamento de uma área da região de interesse no trecho. Fração amostral de espessura (TSF) é a fracionamento da espessura de uma seção. A sonda de bola espacial nos permite quantificar perfis de interesse em uma esfera 3D em locais fracionados. Aqui usamos uma sonda de bola espacial para estimar o comprimento total das fibras cholinergic no NBM do cérebro do rato para ilustrar os procedimentos. O protocolo atual fornece detalhes sobre processamento de tecidos, métodos de amostragem para estereology, coloração imunohistoquímica usando o anticorpo ChAT e estereorologia imparcial para estimar o comprimento da fibra cholinergice e a densidade de fibras no NBM do cérebro do rato.
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Protocol
Todos os procedimentos para o uso desses animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais do Centro de Idosos de Kansas City. Camundongos de 18 meses de idade superexpressam proteína precursora beta-amilóide sueca (APPswe) e seus companheiros de lixo C57/BL6 WT foram usados para os experimentos. Detalhes da reprodução e genotipagem são dados em He et al.8.
1. Perfusão e processamento de tecidos
- Camundongos anestesiados utilizando uma injeção intraperitoneal com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Beliscar os dedos para confirmar a falta de resposta antes de continuar9.
- Transcardially perfundia com ~50 mL de gelo frio 0,1M Dulbecco tampão de soro (DPBS) seguido por 4% de paraformaldeído (PFA) em 0,1M tampão de fosfato (PB)10.
ATENÇÃO: PfA é tóxico. Use equipamentos de proteção individual (EPI) ao trabalhar com PFA. - Remova o cérebro10 e mergulhe em 4% pfa em 0,1 M PB a 4 °C para pós-fixação por 24 h. Lave com DPBS 3x.
- Mudança para solução de sacarose de 0,1 DPBS durante a noite e, em seguida, 30% solução de sacarose em 0,1 M DPBS para mais 48 h a 4 °C.
- Remova o tecido da solução de sacarose e congele em uma câmara de criotome predefinida a uma temperatura de -20 °C. Amostras congeladas podem ser armazenadas em tubos lacrados a -80 °C até a secção.
- Incorpore tecidos em um ótimo meio de incorporação de temperatura de corte (ver Tabela de Materiais)e monte em um disco de espécime. Corte seções de 30 μm de espessura em um plano coronal usando um criotome e colete todas as seções consequentemente em 24 placas de cultura de poço cheias de solução crioprotetora (30% glicerol, 30% glicol de etileno, 40% DPBS; Figura 1A-C). Guarde em um freezer de -20 °C.
NOTA: Seções mais grossas (por exemplo, 50 μm) são preferíveis quando viáveis. Certifique-se de que as seções são mantidas em ordem de corte e todas as seções estão completamente em crioprotetor. Uma placa de 96 poços pode ser usada como alternativa a 24 placas de poço para coletar seções. - Cubra os poços com selador de placas para evitar evaporação e secagem. Guarde placas a -20 °C até o uso. As seções armazenadas a -20 °C estão estáveis por vários meses para imunohistoquímica do ChAT.
2. Seleção sistemática de seção para IHC
NOTA: Um estudo piloto deve ser feito para saber o número total de seções necessárias para alcançar um coeficiente aceitável de erro (CE). O valor CE é uma expressão da quantidade total de erro no procedimento amostral. O menor valor representa o erro mínimo e um valor CE inferior a 0,1 é considerado aceitável pelo software aqui utilizado (ver Tabela de Materiais)11.
- Identifique as primeiras e últimas seções para cada cérebro comparando características morfológicas com um atlas cerebral padrão do rato, como Franklin e Paxinos. NbM começa em bregma -0,0mm e termina em -1,6 mm. Portanto, cerca de 50 seções contêm NBM. O número total de seções é um dos parâmetros necessários durante a estereorologia. A seleção de cada8ª seção (SSF = 1/8) deu um total de 6-7 seções para a análise e rendeu um CE aceitável tanto para estimativa de volume quanto para estimativa de comprimento de fibra em nosso estudo piloto.
- Comece aleatoriamente com uma das oito primeiras seções e, em seguida, amostrar sistematicamente a cada 8ª seção até a última seção posterior contendo NBM(Figura 1C).
3. Imunohistoquímica
- Transfira as seções crioreservadas para temperatura ambiente em crioprotetor e, em seguida, 0,1M tampão de fosfato (PB) em 6 placas de poço.
- Lave 3x na PB.
- Incubar em 0,3% H2O2 em metanol por 15 min.
- Lave 3x em salino tampão tris (TBS).
- Incubar em 0,25% Triton X-100 em TBS por 30 min.
- Bloco com soro bovino 10% normal (NBS) em 0,1% Triton X-100 em TBS por 30 min.
- Incubar com uma diluição de 1:1.000 de anticorpos primários anti-humanos chat de cabra (ver Tabela de Materiais) em TBS com 0,1% Triton X-100 e 1% NBS para 48 h a 4 °C.
- Lave 3x em TBS à temperatura ambiente. Realize mais incubação e lavagem à temperatura ambiente.
- Incubacom anticorpo secundário biotinylated bovino (ver Tabela de Materiais) por 1h.
- Lave 3x em TBS.
- Incubar com o complexo avidin-biotina-peroxidase (ver Tabela de Materiais).
- Lave 3x em TBS.
- Desenvolva-se usando uma solução avançada de substrato peroxidase DAB (ver Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações do fabricante.
ATENÇÃO: DAB é um suspeito de carcinógeno. É tóxico por contato e inalação. Use EPI ao trabalhar com DAB. - Lave o trecho algumas vezes com água destilada e mantenha em Tris pH = 7,6.
- Monte as seções nos slides gelatinizados. Todas as seções de um tecido podem ser colocadas no mesmo slide. O ar seca as seções, desidrata2x por 5 min cada com 70%, 90%, 95%, e 100% de etanol, e depois limpar as seções com duas lava-matas de 10 min xylene. Deslize as seções usando meio de montagem (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O tempo de processamento da desidratação e da limpeza afeta a espessura das seções. Portanto, as mesmas condições devem ser utilizadas para todas as seções. No presente estudo, o valor médio para a espessura final foi de 21,11 ± 0,45 μm. - Mantenha as seções no capô da fumaça para secar. As seções secas estão prontas para estereology.
4. Estereology
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para o microscópio e o software utilizados. Um objetivo de imersão com abertura numérica (NA) > 1.2 será útil e deve ser utilizado se necessário. Os slides devem ser agrupados de acordo com o genótipo ou grupo de tratamento e codificados. A estereorologia completa para um estudo deve ser realizada pela mesma pessoa e a pessoa que realiza a estereologia deve ser cega à identidade dos slides individuais ou grupo examinado1,12,13.
- Abra um novo estudo no software. (File > New Study). Uma caixa de diálogo 'Inicializaçãode Estudo ' será aberta. Preencha as informações do estudo, utilizando Multi-level (Fraction Based) (Figura 2A).
- Clique duas vezes em 'Volume' Parâmetros, que abrirá a caixa de diálogo Volume. Nomeie o recurso de interesse e selecione a sonda'Contagemde Pontos da Região '. Clique em seguir.
- Clique duas vezes no próximo parâmetro,'Comprimento'.
- Forneça um nome do recurso (porexemplo, 'L') Selecione 'Sphere' sonda e clique em Next.
- Em seguida, clique na caixa de diálogo 'Inicializaçãodo Estudo ', que abrirá a caixa 'Case Initialization' caixa . Preencha as informações do caso. Os grupos devem ser codificados antes de iniciar o estudo. O número total de seções é o número de seções a partir da primeira seção contendo a área de interesse até a última seção contendo área de interesse (ver etapa 2.1). O intervalo amostral da seção é de oito, pois cada8seção foi selecionada para a coloração do IHC.
- Clicando Em seguida abre a caixa de diálogo 'Inicialização de Sonda', que definirá automaticamente a menor ampliação para a seleção e estimativa de volume da região. Confirme as configurações e verifique se a região de interesse pode ser identificada na ampliação mais baixa selecionada. Clique duas vezes em'Volume' e preencha 50.000 μm3 por ponto para a fração de volume da região. Clique em Feito.
- a Ampliação do Objeto (Alto),coloque o comprimento em 63x ou 100x. Clique duas vezes em 'Comprimento' para abrir a caixa de diálogo Long-Sphere e definir o diâmetro da esfera para 10 μm. Clique feito.
NOTA: A zona de guarda deve ser determinada com base na espessura real das seções. O operador deve verificar a espessura das seções em vários locais para evitar qualquer dano. Se necessário, ajuste a espessura da zona de guarda com base na espessura da seção. - Defina valores apropriados para área de quadros, altura do quadro, zona de guarda e espaçamento de quadros.
NOTA: Esses valores dependem da heterogeneidade dos perfis de objetos (fibras) na região de estudo. Uma área de quadros de 400 μm2, altura do quadro de 10 μm, zona de guarda de 2 μm e espaçamento de quadros de 300 μm dá valores ce aceitáveis para estimativa de comprimento de fibra em NBM. Um estudo piloto deve ser realizado com esses valores antes de ir para o próximo caso. - Siga as instruções fornecidas pelo software após cada etapa. As instruções aparecem como uma caixa de diálogo e/ou na parte inferior da tela.
- Insira a Seção 1.
- Em baixa ampliação (5x), defina a região de interesse fazendo um limite arbitrário em torno do NBM. Clique no botão Next no canto esquerdo da janela de vídeo. Siga as instruções e confirme que todos os pontos verdes estão no NBM. Os pontos podem ser incluídos ou excluídos clicando nos pontos.
NOTA: Não há limite definido e definido em torno do NBM. A seleção é definida principalmente por investigadores. Os neurônios cholinergic chat+ do NBM podem ser observados na cápsula interna (ic) e globus pallidus (GP). Neste protocolo, o ic com neurônios cholinergic ChAT+ e suas projeções (fibras) e GP inteiro está incluído no NBM (Figura 1D). - Siga as instruções e mude para 63x para medições de fibra na fração atual. A caixa de diálogo 'Section Thickness' aparece na tela. Defina a superfície superior e inferior da seção para medir a espessura real da seção. O movimento manual do eixo Z deve ser usado. Clique em Done.
NOTA: Se não houver fibra na área, o passo pode ser ignorado para ir para o próximo local de fração. - Mova o eixo Z lentamente de cima para baixo na altura do quadro da seção e marque todas as fibras interseccionais na superfície da sonda esfera virtual(Figura 3). Quando feito, clique em Next para ir para o próximo local.
- Depois de completar todas as frações, o software pedirá para inserir a próxima seção. Repita os passos 4.9-4.12 para todas as seis ou sete seções do tecido.
- No final, o software gerará um resultado para o caso mostrando os valores ce (Figura 4). Se o CE for aceitável, prossiga para o próximo caso. Arquivo > Novo Caso. Se o CE não for aceitável (Figura 4A),o software fornece recomendações para alterar alguns dos parâmetros. Em muitos casos, a diminuição do espaçamento do quadro diminui os valores da CE para uma faixa aceitável (Figura 4B).
- Após a conclusão de todos os casos, gere resultados para cada caso e grupo (Arquivo > Resultados).
5. Análise e estatística
- O software fornece dados para cada amostra e cada grupo. O próprio software calcula frações como SSF, ASF e TSF, e fornece o volume total de referência (VREF)e o comprimento total (L) das fibras na região de referência (neste caso, NBM) (Figura 4B). Exporte os dados e salve ou copie para o software estatístico de escolha para entre a análise do grupo. A Tabela 1 mostra dados típicos de resultados para análise estatística. Analise a densidade de fibras (Lv) dividindo o comprimento total da fibra com o volume de referência.
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Representative Results
Os resultados representativos são mostrados na Tabela 1 e Figura 5. O Grupo C, que foi decodificado como APPswe Group (APP), teve comprimento de fibra significativamente menor (Figura 5B) e densidade de comprimento de fibra(Figura 5C) em comparação com seus companheiros de lixo tipo selvagem (WILD). Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM entre os dois grupos analisados (Figura 5A).
Figura 1: Ilustração do processamento e amostragem de tecidos utilizados no presente estudo. Preparo e amostragem de amostras. (A)A lâmpada cerebelo e olfativa são removidas antes de serem montadas no disco da amostra. (B)Orientação do cérebro no disco do espécime para corte de seção. Uma incisão longitudinal rasa (marcada com uma linha) em um hemisfério ajuda a identificar o lado do cérebro nas seções. (C) Diagrama esquemática de uma placa de 24 poços mostrando a seleção sistemática de cada8ª seção da placa de 24 poços (marcada como 'X'). (D) Diagrama esquemática de seções coronais delimitando as fronteiras do NBM nas seis seções sistematicamente selecionadas. (E-G) Imagens representativas de seções coronais imunosmanchadas para ChAT e localização de NBM (delineada). (H)Uma imagem de alta ampliação mostrando os limites do NBM. LV = ventrículo lateral; VL = núcleo talâmico ventrolateral; ic = cápsula interna; GP = globus pallidus; CPu = putamen caudate (estriato); NBM = núcleo basalis de Meynert (representado como 'B' no atlas do rato Franklin e Paxinos). Barra de escala = 1 mm(E-G),200 μm(H). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Imagens de captura de tela. (A)Iniciação de Estudo' (B) Iniciação de Casos ' e (C) 'Inicializaçãodesonda' caixas de diálogo . Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Sonda sphere usando um dessetor óptico. Imagens representativas de captura de tela mostrando os quatro planos de uma esfera e a marcação de fibras interseccionais. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Resultados representativos. (A) mostra um CE inaceitável e(B)mostra um CE aceitável para estimativa de comprimento. O ASF, ssf e TSF para cada caso também são apresentados nos resultados. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Dados representativos e análise. Representação gráfica do volume (A),comprimento(B)e densidade de comprimento(C) no NBM de dois grupos. Os dados foram analisados dentro de dois grupos diferentes utilizando o teste t do Estudante. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Grupo | Caso # | Volume (μm^3) | Comprimento (μm) | Lv (μm/μm^3) |
| B | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| B | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| B | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| C | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| C | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| C | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| Estatísticas | ||||
| Grupo Médio B | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| Grupo B da SD | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| Grupo C médio | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| Grupo C da SD | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B vs C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
Tabela 1: Dados representativos e análise. Os valores de volume e comprimento foram copiados diretamente dos resultados fornecidos pelo software de estereologia. A densidade de comprimento (Lv) foi calculada dividindo os valores de comprimento pelos valores de volume de cada caso. p os valores foram calculados usando o teste t do Aluno.
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Discussion
Aqui demonstramos um método para estimar a densidade de fibras cholinergic no NBM usando uma sonda de esfera espacial (esfera). Esta sonda estima o comprimento total da fibra na região de interesse. O comprimento total pode ser dividido pelo volume da região para obter a densidade da fibra. Para estimar o volume da região, utilizou-se o método de contagem de pontos Cavalieri. O método de contagem de pontos Cavalieri é um estimador imparcial e eficiente de um volume de referência 3D para qualquer região. O método calcula uma estimativa da área em uma superfície cortada de uma seção contando pontos (representando frações de área) e, em seguida, multiplicando-se pela distância entre duas seções analisadas11. O método não requer rastreamento intensivo e preciso do perímetro da região de interesse. É usado em conjunto com fracionadores ópticos para estimar a densidade de células e fibras.
A análise estereológica requer um método preciso de amostragem. A região de interesse cerebral deve ser devidamente definida com a coloração. O NBM fica entre o ap bregma -0,0 mm a -1,6 mm pelo atlas do mouse Franklin e Paxinos. Para imunohistoquímica, as seções devem ser sistematicamente escolhidas aleatoriamente, o que significa que a primeira seção deve ser selecionada aleatoriamente e, em seguida, outras seções devem ser escolhidas sistematicamente. Para um cérebro de camundongo adulto, o NBM consiste em cerca de 1.600 μm (anterior-posterior), o que significa cerca de 53 seções coronais de 30 μm de espessura. Em seguida, se cadaseção 8 for selecionada, haverá 6-7 seções necessárias para manchar para análise estereológica. Em nosso procedimento habitual, 6-7 seções são suficientes para estimar o número total de fibras cholinergic no NBM. A análise do CE é sugerida para verificação no início da otimização metodológica12.
Uma metodologia adequada de coloração é a exigência básica para um estudo. A coloração de chAT para fibras cholinergic pode ser desafiadora, e muitos anticorpos mancham algumas das partes celulares, mas não os processos axondrióticos distantes. Consulte nosso protocolo previamente descrito para os detalhes relevantes sobre a coloração do ChAT8.
O método requer essencialmente seções grossas porque o processamento histológico causa encolhimento no tecido. Idealmente, seções de mais de 20 μm pós-processamento, espessura final (muitas vezes mais fina do que a espessura da seção de tecido inicial) são necessárias para sondas de bola espacial. Portanto, recomenda-se uma espessura de seção de 50 μm. O encolhimento é geralmente desigual, podendo afetar distorções volumétricas dentro do tecido e, portanto, mudar no valor de Lv. Por exemplo, observou-se uma diferença multivezes em densidade capilar de comprimento quando foi analisada in vivo utilizando imagens multifotonas14,15. Considerando essa questão, é mais eficaz informar o comprimento por região em vez de comprimento por volume.
Embora os valores dados no protocolo tenham funcionado perfeitamente, um estudo piloto para um estudo individual é sempre aconselhável. Após completar uma única caixa amostrade de tecido, o software fornece um valor CE para o projeto de amostragem escolhido. O valor CE é usado para estimar a precisão da estimativa e pode ser calculado por várias fórmulas. O software aqui usado usa a fórmula de Gunderson de 1999 para analisar o CE e considera aceitável se os valores forem inferiores a 0,11,16. O esquema de desenho amostral deve ser ajustado até que o valor ce se torne aceitável antes que o protocolo seja adaptado para outras amostras. Em geral, um aumento do número de amostragem (reduzindo o intervalo do quadro) reduz o valor ce. Praticamente nenhuma estrutura no sistema biológico é um perfil de linha ideal, mas fitas ou cilindros. Portanto, decidir o recurso exato de cruzamento em um ponto de focalização varia de pessoa para pessoa. Assim, a estereorologia de todas as amostras de um determinado estudo deve ser realizada pela mesma pessoa. Para evitar possíveis viés, o operador de estereology deve ficar cego para o identificador de amostras.
A reprodutibilidade é uma grande preocupação neste método. Um fator é o encolhimento do tecido e deformidades durante o processamento da amostra que pode ser superado até certo ponto usando na microscopia confocal vivo13,14,15. A bola espacial requer coloração de alto contraste e boa resolução de imagem para visualizar estruturas. Como as fibras geralmente não estão em forma linear, a determinação das interceptações permanece principalmente a decisão do operador. A segmentação automatizada de recursos histológicos foi proposta para superar esse problema. No entanto, isso ainda não está disponívelem 13.
A vantagem de usar estereology é que ele fornece um esquema imparcial para analisar estruturas em um tecido 3D. A sonda de bola espacial fornece frações isotrópicas dentro de amostras de tecido e, portanto, oferece uma abordagem imparcial para quantificar o comprimento da fibra. Um método alternativo para analisar a densidade de fibras está medindo a densidade óptica de uma coloração histoquímica. Os métodos à base de intensidade de coloração fornecem estimativa semiquantitativa da densidade de coloração e podem ou não ser sensíveis o suficiente para diferenciar as alterações de neurônios e fibras colinérgicas no NBM. Métodos estereológicos usando a sonda space ball (esfera) utilizam a determinação de fibras com base em suas características visuais e fornecem estimativa do comprimento real das fibras. O protocolo também pode ser usado para analisar outros perfis lineares no cérebro, como fibras coleenceríticas (utilizando histoquímica esterase acetila), fibras dopaminergicas ou catecolaminergicas (imunocoloração hidrólise de tyrosina), fibras sorotonergicas (imunostaining de serotonina), estruturas vasculares (imunocoloração CD31) ou processos de astrócito (fibrilacia glial GFAP, imunocoloração)17,18,19,20,21 .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios à W.Z.S. do Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, Departamento de Assuntos de Veteranos (Revisão de Mérito 1I01 BX001067-01A2), associação de Alzheimer (NPSPAD-11-202149) e recursos do Midwest Biomedical Fundação de Pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
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