Summary
Neuronal fiber lengde innenfor en tredimensjonal struktur av en hjerneregion er en pålitelig parameter for å kvantifisere spesifikk nevronal strukturell integritet eller degenerasjon. Denne artikkelen beskriver en stereologisk kvantifiseringsmetode for å måle kolinerge fiberlengde innenfor kjernen basalis av Meynert hos mus som et eksempel.
Abstract
Lengden på kolinerge eller andre nevronale aksoner i ulike hjerneregioner er ofte korrelert med den spesifikke funksjonen i regionen. Stereologi er en nyttig metode for å kvantifisere nevronale profiler av ulike hjernestrukturer. Her gir vi en programvarebasert stereologiprotokoll for å estimere den totale lengden på kolinerge fibre i kjernen basalis av Meynert (NBM) av basal forebrain. Metoden bruker en plass ball sonde for lengde estimater. Kolinerge fibre visualiseres av kolin acetyltransferase (ChAT) immunstaining med pepperrot peroksidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) deteksjonssystem. Fargeprotokollen er også gyldig for fiber- og cellenummerestimering i ulike hjerneregioner ved hjelp av stereologiprogramvare. Stereologiprotokollen kan brukes til estimering av lineære profiler som kolinoceptive fibre, dopaminerge/ katekollaminerge fibre, serotonergiske fibre, astrocyttprosesser eller til og med vaskulære profiler.
Introduction
Kvantitative estimater av lengde og/eller tetthet av nervefibre i hjernen er viktige parametere for nevropatologiske studier. Lengden på kolinerge, dopaminerge og serotonerge aksoner i ulike hjerneregioner er ofte korrelert med de spesifikke funksjonene i regionen. Fordi fordelingen av disse aksonene generelt er heterogen, brukes designbasert stereologi for å unngå skjevhet under prøvetaking. Romballsonden til stereologi er designet for å gi effektive og pålitelige tiltak av linjelignende strukturer som nevronale fibre i en region av interesse1. Sonden gjør en virtuell sfære som pålegges systematisk i vevet for å måle linjekryss med overflaten av sonden. Fordi det er umulig å sette sfæresonder i vevet for analyse, gir den kommersielt tilgjengelige programvaren en virtuell tredimensjonal (3D) sfære, som i utgangspunktet er en rekke konsentriske sirkler av ulike diametre som representerer overflaten av sfæresonden.
Selektiv kolinerg neurodegenerasjon er en av de konsekvente egenskapene til Alzheimers sykdom (AD)2,3,4. Dysfunksjonell kolinerg overføring regnes som en årsaksfaktor for kognitiv nedgang i AD. Kolinerg dysfunksjon er også tydelig i mange andre psykiske lidelser som Parkinsons, avhengighet og schizofreni. Ulike aspekter ved kolinerg nevrodegenerasjon studeres i dyremodeller (f.eks. reduksjon i acetylkolin5, ChAT protein6, kolinerge fiberneurodegenerasjon i nærheten av amyloid plakk6,og reduksjon i kolinerge fibre og synaptiske varikositeter7,8). Fiberdegenerasjon antas å finne sted tidligere enn nevronalt tap, fordi kolinerge nevronale tap ikke alltid observeres i studier. De fleste kolinerge nevronene er i basal forhjernen og hjernestammen, og deres aksoner projiserer til ulike hjerneregioner som kortices og hippocampus. NBM ligger i basal forebrain og funnet å være en av de allment berørte hjerneområdene i AD.
Den fraksjonatormetoden for stereologi er basert på systematisk tilfeldig prøvetaking av et vev på flere nivåer. Seksjonsprøvefraksjon (SSF) er den ikke-databaserte systematiske prøvetakingen av seksjoner for brøkmetoden for stereologi. Arealprøvetakingsfraksjon (ASF) er fraksjonering av et område av interesseområdet i delen. Tykkelse prøvetaking fraksjon (TSF) er fraksjoneringen av tykkelsen på en seksjon. Plassballsonden gjør det mulig for oss å kvantifisere profiler av interesse i en 3D-sfære på fraksjonerte steder. Her bruker vi en plass ball sonde for estimering av den totale lengden av kolinerge fibre i NBM av musen hjernen for å illustrere prosedyrene. Den nåværende protokollen gir detaljer om vevsbehandling, prøvetakingsmetoder for stereologi, immunohistokjemisk farging ved hjelp av ChAT-antistoffet, og objektiv stereologi for å estimere kolinerg fiberlengde og fibertetthet i NBM av musehjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for bruk av disse dyrene har blitt godkjent av Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Atten måneder gamle mus overexpressing svensk mutant beta-amyloid forløper protein (APPswe) og deres C57/BL6 WT kullkamerater ble brukt til forsøkene. Detaljer om avl og genotyping er gitt i He et al.8.
1. Behandling av perfusjon og vev
- Bedøve mus ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon med ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg). Klyp tærne for å bekrefte mangel på respons før du fortsetter9.
- Transkardialt perfuse med ~ 50 ml iskald 0,1 M Dulbeccofosfat bufret saltvann (DPBS) etterfulgt av 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB)10.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Bruk personlig verneutstyr (PPE) når du arbeider med PFA. - Fjern hjernen10 og fordyp i 4 % PFA i 0,1 M PB ved 4 °C for postfiksering i 24 timer. Vask med DPBS 3x.
- Endring til 15% sukroseløsning i 0,1 DPBS over natten og deretter 30% sukroseløsning i 0,1 M DPBS for ytterligere 48 timer ved 4 °C.
- Fjern vevet fra sukroseoppløsningen og frys i et kryotomekammer forhåndsinnstilt til en temperatur på -20 °C. Frosne prøver kan lagres i forseglede rør ved -80 °C til snitting.
- Bygg inn vev i optimal skjæretemperatur innebygging medium (se Tabell av materialer)og monter på en prøveplate. Klipp seriell 30 μm tykke seksjoner i et koronarplan ved hjelp av et kryotome og samle alle seksjonene følgelig i 24 brønnkulturplater fylt med kryoprotectant løsning (30% glyserol, 30% etylenglykol, 40% DPBS; Figur 1A–C). Oppbevares i en -20 °C-fryser.
MERK: Tykkere seksjoner (f.eks. 50 μm) er å foretrekke når det er mulig. Kontroller at seksjonene holdes i skjærerekkefølge og at alle seksjoner er helt i kryoprotectant. En 96 brønnplate kan brukes som et alternativ til 24 brønnplater for å samle seksjoner. - Dekk brønnene med platetetningssett for å forhindre fordampning og tørking. Oppbevar platene ved -20 °C inntil videre. Seksjoner lagret ved -20 °C er stabile i flere måneder for ChAT immunohistochemistry.
2. Systematisk seksjonsvalg for IHC
MERK: En pilotstudie bør gjøres for å vite det totale antallet seksjoner som kreves for å oppnå en akseptabel feilkoeffisient (CE). CE-verdien er et uttrykk for den totale feilmengden i prøvetakingsprosedyren. Den laveste verdien representerer minimal feil og en CE-verdi lavere enn 0,1 anses som akseptabel av programvaren som brukes her (se Materialtabell)11.
- Identifiser de første og siste delene for hver hjerne ved å sammenligne morfologiske funksjoner med et standard musehjerneatlas som Franklin og Paxinos. NBM begynner ved bregma -0,0 mm og slutter på -1,6 mm. Derfor inneholder ca 50 seksjoner NBM. Det totale antallet seksjoner er en av parameterne som kreves under stereologi. Valget av hveråttende del (SSF = 1/8) ga totalt 6–7 seksjoner for analysen og ga en akseptabel CE for både volumestimering og fiberlengdeestimering i pilotstudien vår.
- Begynn tilfeldig med en av de første åtte delene og prøv deretter systemisk hveråttende del til den siste bakre delen som inneholder NBM (Figur 1C).
3. Immunhistokjemi
- Overfør de kryobevarte delene til romtemperatur i kryoprotectant og deretter 0,1 M fosfatbuffer (PB) i 6 brønnplater.
- Vask 3x i PB.
- Inkuber i 0,3% H2O2 i metanol i 15 min.
- Vask 3x i Tris-bufret saltvann (TBS).
- Inkuber i 0,25% Triton X-100 i TBS i 30 min.
- Blokk med 10 % normalt storfeserum (NBS) i 0,1 % Triton X-100 i TBS i 30 min.
- Inkuber med en 1:1000 fortynning av geit anti-humant ChAT primære antistoffer (se Materialtabell)i TBS med 0,1% Triton X-100 og 1% NBS for 48 timer ved 4 °C.
- Vask 3x i TBS ved romtemperatur. Utfør all ytterligere inkubasjon og vask ved romtemperatur.
- Inkuber med biotinylated storfe anti-geit sekundærantistoff (se Tabell av materialer)i 1 t.
- Vask 3x i TBS.
- Inkuber med avidin-biotin-peroksidasekomplekset (se Materialtabell).
- Vask 3x i TBS.
- Utvikle ved hjelp av en forbedret DAB peroxidase substratløsning (se Materialtabell)i henhold til produsentens anbefalinger.
FORSIKTIG: DAB er et mistenkt kreftfremkallende. Det er giftig ved kontakt og innånding. Bruk PPE når du arbeider med DAB. - Vask seksjonen et par ganger med destillert vann og hold i Tris pH = 7,6.
- Monter seksjonene på de gelatiniserte lysbildene. Alle seksjoner fra ett vev kan settes på samme lysbilde. Lufttørk seksjonene, dehydrere 2x i 5 min hver med 70%, 90%, 95%, og 100% etanol, og deretter tømme seksjonene med to 10 min xylen vasker. Dekkslip seksjonene ved hjelp av monteringsmedium (se Materialtabell).
MERK: Behandlingstiden for dehydrering og rydding påvirker tykkelsen på seksjonene. Derfor bør de samme forholdene brukes for alle seksjoner. I den nåværende studien var gjennomsnittsverdien for den endelige tykkelsen 21,11 ± 0,45 μm. - Hold delene i røykhetten for å tørke. De tørre delene er klare for stereologi.
4. Stereologi
MERK: Se Materialbordet for mikroskopet og programvaren som brukes. En nedsenking mål med en numerisk blenderåpning (NA) > 1.2 vil være nyttig og bør brukes hvis nødvendig. Lysbilder skal grupperes i henhold til genotype eller behandlingsgruppe og kodet. Den komplette stereologien for en studie bør utføres av samme person, og personen som utfører stereologien, bør være blind for identiteten til de enkelte lysbildene eller gruppen som undersøkes1,12,13.
- Åpne en ny studie i programvaren. (Fil > Ny studie). Dialogboksen'Studieinitialisering' åpnes. Fyll ut studieinformasjonen ved hjelp av multinivå (brøkbasert) (figur 2A).
- Dobbeltklikk på 'Volum' under Parametere, som vil åpne dialogboksen Volum. Gi deg navn til funksjonen for interesse, og velg'Områdepunkttelling' probe. Klikk Neste.
- Dobbeltklikk på neste parameter,'Lengde'.
- Oppgi et navn på funksjonen (f.eks.'L') Velg 'Sfære' probe og klikk neste.
- Deretter klikker du på dialogboksen 'Studie initialisering' som vil åpne boksen 'Case Initialization' . Fyll inn saksinformasjonen. Grupper må kodes før du starter studien. Totalt antall seksjoner er antall seksjoner fra første del som inneholder interesseområdet til den siste delen som inneholder interesseområde (se trinn 2.1). Seksjonsprøveintervallet er åtte, fordi hveråttende del ble valgt for IHC-farging.
- Når du klikker Neste, åpnes dialogboksen'Probe Initialization', som automatisk angir den laveste forstørrelsen for områdevalget og volumestimering. Bekreft innstillingene, og kontroller om interesseområdet kan identifiseres ved den valgte nedre forstørrelsen. Dobbeltklikk på'Volum' og fyll 50.000 μm3 per punkt for regionvolumfraksjonen. Klikk ferdig.
- Angi Lengde på 63x eller 100x under Objektforstørrelse. Dobbeltklikk på 'Lengde' for å åpne dialogboksen Lengde-sfære og sette diameteren på sfæren til 10 μm. Klikk ferdig.
MERK: Vernesonen bør bestemmes basert på den faktiske tykkelsen på seksjonene. Operatøren må kontrollere tykkelsen på seksjonene på flere steder for å unngå skade. Juster om nødvendig vaktsonetykkelsen basert på snitttykkelsen. - Angi passende verdier for rammeområde, rammehøyde, vernesone og rammeavstand.
MERK: Disse verdiene avhenger av heterogeniteten til objektprofilene (fibrene) i studieområdet. Et rammeområde på 400 μm2, rammehøyde på 10 μm, vernesone på 2 μm og rammeavstand på 300 μm gir akseptable CE-verdier for fiberlengdeestimering i NBM. En pilotstudie må utføres med disse verdiene før du går til neste sak. - Følg instruksjonene fra programvaren etter hvert trinn. Instruksjonene vises enten som en dialogboks og/eller nederst på skjermen.
- Sett inn avsnitt 1.
- Ved lav forstørrelse (5x) definerer du interesseområdet ved å gjøre en vilkårlig grense rundt NBM. Klikk på Neste-knappen i venstre hjørne av videovinduet. Følg instruksjonene og bekreft at alle grønne punkter er i NBM. Poengene kan inkluderes eller utelates ved å klikke på punktene.
MERK: Det er ingen klar, satt grensen rundt NBM. Utvalget er for det meste utprøverdefinert. ChAT+ kolinerge nevroner i NBM kan observeres i den interne kapselen (ic) og globuspallidus (GP). I denne protokollen er ic med ChAT + kolinerge nevroner og deres projeksjoner (fibre) og hele GP inkludert i NBM (Figur 1D). - Følg instruksjonene og bytt til 63x for fibermålinger med strømbrøkeringen. Dialogboksen 'Inndelingtykkelse' vises på skjermen. Angi den øverste og nederste overflaten av delen for å måle den faktiske tykkelsen på inndelingen. Den manuelle Z-aksebevegelsen skal brukes. Klikk på Ferdig.
MERK: Hvis det ikke er fiber i området, kan trinnet hoppes over for å gå til neste brøkplassering. - Flytt Z-aksen langsomt fra topp til bunn i rammen høyden på seksjonen og merk alle kryssende fibre på overflaten av den virtuelle sfæresonden (Figur 3). Når du er ferdig, klikker du Neste for å gå til neste sted.
- Etter å ha fullført alle brøker, vil programvaren be om å sette inn neste del. Gjenta trinn 4.9–4.12 for alle seks eller syv deler av vevet.
- På slutten vil programvaren generere et resultat for saken som viser CE-verdiene (Figur 4). Hvis CE er akseptabelt, går du videre til neste sak. Fil > Ny sak. Hvis CE ikke er akseptabelt (Figur 4A),gir programvaren anbefalinger for å endre noen av parameterne. I mange tilfeller reduserer reduksjon av rammeavstanden CE-verdiene til et akseptabelt område (figur 4B).
- Når du har fullført alle tilfellene, genererer du resultater for hvert tilfelle og gruppe (Fil > Resultater).
5. Analyse og statistikk
- Programvaren inneholder data for hver prøve og hver gruppe. Programvaren i seg selv beregner fraksjoner som SSF, ASF og TSF, og gir det totale referansevolumet (VREF)og total lengde (L) av fibrene i referanseområdet (i dette tilfellet NBM) (Figur 4B). Eksporter dataene og lagre eller kopier til den statistiske programvaren som er valgfor mellom gruppeanalyse. Tabell 1 viser typiske resultatdata for statistisk analyse. Analyser fibertetthet (Lv) ved å dele den totale fiberlengden med referansevolumet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater vises i tabell 1 og figur 5. Gruppe C, som ble dekodet som APPswe group (APP), hadde betydelig lavere fiberlengde (figur 5B) og fiberlengdetetthet (figur 5C) sammenlignet med deres ville type (WILD) kullkamerater. Resultatene viste at det ikke var noen signifikant forskjell i volumet av NBM mellom de to gruppene som ble analysert (figur 5A).
Figur 1: Illustrasjon av vevsbehandling og prøvetaking som brukes i den foreliggende studien. Prøveforberedelse og prøvetaking. (A) Lillehjernen og olfaktorisk pære fjernes før montering på prøveskiven. (B) Retning av hjernen på prøveskiven for seksjonsskjæring. Et grunt langsgående snitt (merket med en linje) på den ene halvkule bidrar til å identifisere siden av hjernen i seksjonene. (C) Skjematisk diagram av en 24 brønnplate som viser systematisk utvalg av hveråttende del fra 24 brønnplaten (merket som 'X'). (D) Skjematisk diagram over koronale seksjoner som begrenser grensen til NBM i de systematisk utvalgte seks delene. - Jeg har ikke noe åsi. Representative bilder av koronale seksjoner immunisert for ChAT og plassering av NBM (skissert). (H) Et høyt forstørrelsesbilde som viser NBM-grensene. LV = lateral ventrikkel; VL = ventrolateral thalamus kjerne; ic = intern kapsel; GP = globus pallidus; CPu = caudate putamen (striatum); NBM = kjernebasalis av Meynert (representert som 'B' i Franklin og Paxinos mus atlas). Skala bar = 1 mm (E-G), 200 μm (H). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjermbildebilder. (A)Studie initialisering' (B)Case Initialization', og (C) 'Probe Initialization' dialogbokser. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sfæresonde ved hjelp av en optisk dissector. Representative skjermbildebilder som viser de fire flyene i en sfære og merking av kryssende fibre. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative resultater. (A) viser en uakseptabel CE og (B) viser en akseptabel CE for lengdeestimering. ASF, SSF og TSF for hvert tilfelle presenteres også i resultatene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representative data og analyse. Grafisk representasjon av volum (A), lengde (B) og lengdetetthet (C) i NBM av to grupper. Dataene ble analysert i to forskjellige grupper ved hjelp av Student t-testen. *p < 0,05. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Gruppe | Tilfelle # | Volum (μm^3) | Lengde (μm) | Lv (μm/μm^3) |
| B | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| B | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| B | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| C | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| C | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| C | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| Statistikk | ||||
| Gjennomsnittlig gruppe B | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| SD gruppe B | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| Gjennomsnittlig gruppe C | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| SD gruppe C | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B vs C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
Tabell 1: Representative data og analyse. Volum- og lengdeverdier ble direkte kopiert fra resultatene som tilbys av stereologiprogramvaren. Lengdetetthet (Lv) ble beregnet ved å dele lengdeverdiene med volumverdiene for hvert tilfelle. p-verdier ble beregnet ved hjelp av Studentens t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en metode for å estimere tettheten av kolinerge fibre i NBM ved hjelp av en romkule (sfære) sonde. Denne sonden anslår den totale fiberlengden i området av interesse. Den totale lengden kan deles på volumet av regionen for å få fibertettheten. For å estimere volumet av regionen, ble Cavalieri point count-metoden brukt. Cavalieri point count-metoden er en objektiv og effektiv estimator av et 3D-referansevolum for alle regioner. Metoden beregner et estimat av området på en kuttoverflate av en seksjon ved å telle punkter (som representerer arealfraksjoner) og deretter multiplisere med avstanden mellom to seksjoner analysert11. Metoden krever ikke arbeidsintensiv, nøyaktig sporing av omkretsen av området av interesse. Den brukes sammen med optiske brøkerforå anslå tettheten av celler og fibre.
Stereologisk analyse krever en presis prøvetakingsmetode. Hjerneområdet av interesse bør defineres riktig med farging. NBM sitter mellom AP bregma -0,0 mm til -1,6 mm per Franklin og Paxinos museatlas. For immunhistokjemi bør seksjoner systematisk, tilfeldig valgt, noe som betyr at den første delen bør velges tilfeldig og deretter andre seksjoner bør velges systematisk. For en voksen mus hjerne, NBM består av ca 1600 μm (anestesi-bakre), noe som betyr ca 53 koronale seksjoner 30 μm tykk. Deretter, hvis hveråttende del er valgt, vil det være 6-7 seksjoner som kreves for å flekkfor stereologisk analyse. I vår vanlige prosedyre er 6-7 seksjoner nok til å estimere det totale antallet kolinerge fibre i NBM. Analyse av CE er foreslått for verifisering i begynnelsen av metodisk optimalisering12.
En skikkelig fargemetodikk er det grunnleggende kravet til en studie. ChAT farging for kolinerge fibre kan være utfordrende, og mange antistoffer flekker noen av de cellulære delene, men ikke de fjerne axodendritic prosesser. Se vår tidligere beskrevne protokoll for relevante detaljer om ChAT farging8.
Metoden krever i hovedsak tykke seksjoner fordi histologisk behandling forårsaker krymping i vevet. Ideelt sett er det nødvendig med deler av mer enn 20 μm etterbehandling, endelig tykkelse (ofte tynnere enn den første vevsseksjontykkelsen) for plassballsonder. Derfor anbefales en seksjonstykkelse på 50 μm. Krympingen er generelt ujevn, og det kan påvirke volumetriske forvrengninger i vevet og derfor endres i Lv-verdien. For eksempel ble det observert en flerfoldet forskjell i kapillær lengdetetthet da den ble analysert in vivo ved hjelp av multiphoton imaging14,15. Tatt i betraktning dette problemet, er det mer effektivt å rapportere lengde per region i stedet for lengde per volum.
Selv om de gitte verdiene i protokollen fungerte perfekt, anbefales det alltid en pilotstudie for en individuell studie. Etter å ha fullført et enkelt vevprøvetilfelle, gir programvaren en CE-verdi for den valgte prøvetakingsdesignen. CE-verdien brukes til å estimere presisjonen til estimatet og kan beregnes av flere formler. Programvaren som brukes her bruker Gundersons formel fra 1999 til å analysere CE og anser det akseptabelt hvis verdiene er mindre enn 0,11,16. Prøvetakingsdesignordningen bør justeres til CE-verdien blir akseptabel før protokollen tilpasses andre prøver. Generelt reduserer et økt antall prøvetaking (ved å redusere rammeintervallet) CE-verdien. Praktisk talt ingen struktur i det biologiske systemet er en ideell linjeprofil, men bånd eller sylindere. Derfor varierer det å bestemme den nøyaktige kryssende funksjonen på et fokuspunkt fra person til person. Dermed bør stereologien til alle prøver av en bestemt studie utføres av samme person. For å unngå mulige skjevheter bør stereologioperatøren være blind for eksempelidentifikatoren.
Reproduserbarhet er en stor bekymring i denne metoden. En faktor er vevkrymping og deformiteter under prøvebehandling som kan overvinnes til en viss grad ved hjelp av in vivo confocal mikroskopi13,14,15. Romballen krever høy kontrastfarging og god bildeoppløsning for å visualisere strukturer. Siden fibre vanligvis ikke er i lineær form, forblir fastsettelsen av avskjæringer for det meste operatørens beslutning. Automatisert segmentering av histologiske funksjoner har blitt foreslått for å overvinne dette problemet. Dette er imidlertid ikke tilgjengelig ennå13.
Fordelen med å bruke stereologi er at det gir en objektiv ordning for å analysere strukturer i et 3D-vev. Romballsonden gir isotropiske fraksjoner i vevsprøver og tilbyr derfor en objektiv tilnærming til å kvantifisere fiberlengde. En alternativ metode for å analysere fibertetthet måler den optiske tettheten til en histokjemisk farging. De flekkeintensitetsbaserte metodene gir semikvantitativ estimering av fargetettheten og kan eller ikke være følsom nok til å skille endringene av kolinerge nevroner og fibre i NBM. Stereologiske metoder ved hjelp av romball (sfære) sonde bruker bestemmelse av fibre basert på deres visuelle egenskaper og gir estimering av den virkelige lengden på fibrene. Protokollen kan også brukes til å analysere andre lineære profiler i hjernen, som kolinoceptive fibre (ved hjelp av acetylkolinesterase histochemistry), dopaminergisk eller katekollaminergfibre (tyrosinhydroksylase immunfarging), serotonergic fibre (serotonin immunstaining), vaskulære strukturer (CD31 immunostaining), eller astrocyttprosesser (glial fibrillærtsyreprotein, GFAP, immunbeisering)17,18,19,20,21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressurser fra Midtvesten Biomedical Forskningsstiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. Unbiased Stereology-A Concise Guide. , Johns Hopkins University Press. (2011).
- West, M. J.
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
