Summary
Die neuronale Faserlänge innerhalb einer dreidimensionalen Struktur einer Hirnregion ist ein zuverlässiger Parameter, um spezifische neuronale strukturelle Integrität oder Degeneration zu quantifizieren. Dieser Artikel beschreibt eine stereologische Quantifizierungsmethode zur Messung der cholinergen Faserlänge innerhalb des Kernbasalis von Meynert bei Mäusen als Beispiel.
Abstract
Die Länge von cholinergen oder anderen neuronalen Axonen in verschiedenen Hirnregionen korreliert oft mit der spezifischen Funktion der Region. Die Stereologie ist eine nützliche Methode, um neuronale Profile verschiedener Gehirnstrukturen zu quantifizieren. Hier stellen wir ein softwarebasiertes Stereologie-Protokoll zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im Kern basalis von Meynert (NBM) des Basalvorhirns zur Verfügung. Die Methode verwendet eine Raumkugelsonde für Längenschätzungen. Die cholinerge Fasern werden durch Cholin-Acetyltransferase (ChAT) Immunfärbung mit dem Meerrettich peroxidase-Diaminobenzidin (HRP-DAB) Detektionssystem visualisiert. Das Färbeprotokoll gilt auch für die Faser- und Zellzahlenschätzung in verschiedenen Hirnregionen mit Stereologie-Software. Das stereologische Protokoll kann zur Abschätzung von linearen Profilen wie chollinoceptiven Fasern, dopaminergen/katecholaminergen Fasern, serotonergen Fasern, Astrozytenprozessen oder sogar Gefäßprofilen verwendet werden.
Introduction
Quantitative Schätzungen der Länge und/oder Dichte von Nervenfasern im Gehirn sind wichtige Parameter neuropathologischer Studien. Die Länge der cholinergen, dopaminergen und serotonergen Axone in verschiedenen Hirnregionen sind oft mit den spezifischen Funktionen der Region korreliert. Da die Verteilung dieser Axone im Allgemeinen heterogen ist, wird die designbasierte Stereologie verwendet, um Verzerrungen während der Probenahme zu vermeiden. Die Raumkugelsonde der Stereologie wurde entwickelt, um effiziente und zuverlässige Messungen von linienähnlichen Strukturen wie neuronalen Fasern in einer Region von Interesse zu bieten1. Die Sonde bildet eine virtuelle Kugel, die systematisch im Gewebe aufgezwungen wird, um Linienschnitte mit der Oberfläche der Sonde zu messen. Da es unmöglich ist, Kugelsonden zur Analyse in das Gewebe zu legen, bietet die kommerziell erhältliche Software eine virtuelle dreidimensionale (3D) Kugel, die im Grunde eine Reihe konzentrischer Kreise mit verschiedenen Durchmessern ist, die die Oberfläche der Kugelsonde darstellen.
Selektive cholinerge Neurodegeneration ist eines der konsistenten Merkmale der Alzheimer-Krankheit (AD)2,3,4. Dysfunktionale cholinerge Übertragung gilt als ein ursächlichen Faktor für kognitive Nk. Cholinerge Dysfunktion ist auch bei vielen anderen psychischen Störungen wie Parkinson, Sucht, und Schizophrenie offensichtlich. Verschiedene Aspekte der cholinergen Neurodegeneration werden in Tiermodellen untersucht (z.B. Reduktion in Acetylcholin5, ChAT-Protein6, cholinerge Faser-Neurodegeneration in der Nähe von Amyloid-Plaques6, und Abnahme der cholinergen Fasern und synaptischen Varikosen7,8). Es wird angenommen, dass die Faserdegeneration früher als der neuronale Verlust stattfindet, da cholinerge neuronaler Verlust nicht immer in Studien beobachtet wird. Die meisten cholinergen Neuronen befinden sich im Basalvorhirn und im Hirnstamm, und ihre Axone projizieren auf verschiedene Hirnregionen wie die Kortizes und den Hippocampus. NBM befindet sich im Basalvorhirn und ist einer der am häufigsten betroffenen Hirnbereiche in AD.
Die Fraktionatormethode der Stereologie basiert auf einer systematischen Stichprobenerhebung eines Gewebes auf mehreren Ebenen. Section Sampling Fraction (SSF) ist die nicht computergestützte systematische Probenahme von Abschnitten für die Fraktionatormethode der Stereologie. Flächenstichprobenfraktion (ASF) ist die Fraktionierung eines Bereichs der Interessenregion in diesem Abschnitt. Die Dickeentnahmefraktion (TSF) ist die Fraktionierung der Dicke eines Abschnitts. Die Raumkugelsonde ermöglicht es uns, Profile von Interesse in einer 3D-Kugel an fraktionierten Stellen zu quantifizieren. Hier verwenden wir eine Raumkugelsonde zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im NBM des Maushirns, um die Abläufe zu veranschaulichen. Das aktuelle Protokoll enthält Details zur Gewebeverarbeitung, Probenahmemethoden für die Stereologie, immunhistochemische Färbung mit dem ChAT-Antikörper und unvoreingenommene Stereologie zur Schätzung der cholinergen Faserlänge und Faserdichte im NBM des Maushirns.
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Protocol
Alle Verfahren zur Verwendung dieser Tiere wurden vom Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für die Experimente wurden 18 Monate alte Mäuse verwendet, die das schwedische Mutamyloid-Vorläuferprotein (APPswe) und ihre C57/BL6-WT-Wurfmate überexpressionierten. Einzelheiten zur Zucht und Genotypisierung finden Sie in He et al.8.
1. Perfusion und Gewebeverarbeitung
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Pinch Zehen, um einen Mangel an Antwort zu bestätigen, bevor Sie9fortsetzen.
- Transkardinal perfuse mit 50 ml eiskalt0,1M DulbeccoPhosphat gepufferte Saline (DPBS) gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1M Phosphatpuffer (PB)10.
VORSICHT: PFA ist giftig. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) bei der Arbeit mit PFA. - Gehirne10 entfernen und in 4% PFA in 0,1 M PB bei 4 °C für die Postfixierung für 24 h eintauchen. Mit DPBS 3x waschen.
- Wechseln Sie zu 15% Saccharoselösung in 0,1 DPBS über Nacht und dann 30% Saccharoselösung in 0,1 M DPBS für weitere 48 h bei 4 °C.
- Entfernen Sie das Gewebe aus der Saccharoselösung und frieren Sie in einer Kryotomkammer ein, die auf eine Temperatur von -20 °C voreingestellt ist. Gefrorene Proben können bis zum Schnitt in versiegelten Rohren bei -80 °C gelagert werden.
- Gewebe in optimales Schnitttemperatur-Einbettmedium einbetten (siehe Materialtabelle)einbetten und auf einer Probenscheibe montieren. Schneiden Sie die 30 m dicken Abschnitte in einer koronalen Ebene mit einem Kryotom und sammeln Sie alle Abschnitte folglich in 24 Brunnenkulturplatten, die mit Kryoprotektorlösung gefüllt sind (30% Glycerin, 30% Ethylenglykol, 40% DPBS; Abbildung 1A–C). In einem Gefrierschrank von -20 °C aufbewahren.
HINWEIS: Dickere Abschnitte (z. B. 50 m) sind vorzuziehen, wenn dies möglich ist. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte in Schnittreihenfolge gehalten werden und alle Abschnitte vollständig kryoprotektoris sind. Eine 96-Wellplatte kann als Alternative zu 24 Brunnenplatten verwendet werden, um Abschnitte zu sammeln. - Bedecken Sie die Brunnen mit Plattenversiegelung, um Verdunstung und Trocknung zu verhindern. Platten bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung lagern. Bei -20 °C gelagerte Abschnitte sind für die ChAT-Immunhistochemie für mehrere Monate stabil.
2. Systematische Schnittauswahl für IHC
ANMERKUNG: Es sollte eine Pilotstudie durchgeführt werden, um die Gesamtzahl der Abschnitte zu kennen, die erforderlich sind, um einen akzeptablen Fehlerkoeffizienten (CE) zu erreichen. Der CE-Wert ist ein Ausdruck der Gesamtfehlermenge im Samplingverfahren. Der niedrigste Wert stellt den minimalen Fehler dar, und ein CE-Wert unter 0,1 wird von der hier verwendeten Software als akzeptabel angesehen (siehe Tabelle der Materialien)11.
- Identifizieren Sie den ersten und letzten Abschnitt für jedes Gehirn, indem Sie morphologische Merkmale mit einem Standard-Maus-Gehirnatlas wie Franklin und Paxinos vergleichen. NBM beginnt bei Bregma -0,0 mm und endet bei -1,6 mm. Daher enthalten etwa 50 Abschnitte NBM. Die Gesamtzahl der Abschnitte ist einer der Parameter, die während der Stereologie erforderlich sind. Die Auswahl jedes8. Abschnitts (SSF = 1/8) ergab insgesamt 6–7 Abschnitte für die Analyse und ergab in unserer Pilotstudie ein akzeptables CE sowohl für die Volumenschätzung als auch für die Faserlängenschätzung.
- Beginnen Sie zufällig mit einem der ersten acht Abschnitte und proben Sie dann jeden8. Abschnitt systemisch bis zum letzten hinteren Abschnitt, der NBM enthält (Abbildung 1C).
3. Immunhistochemie
- Übertragen Sie die kryokonservierten Abschnitte auf Raumtemperatur in Kryoprotektor und dann 0,1M Phosphatpuffer (PB) in 6 Brunnenplatten.
- Waschen Sie 3x in PB.
- Inkubieren Sie in 0,3%H2O2 in Methanol für 15 min.
- Waschen Sie 3x in Tris-gepufferter Salin (TBS).
- Inkubieren Sie in 0,25% Triton X-100 in TBS für 30 min.
- Block mit 10% normalem Rinderserum (NBS) in 0,1% Triton X-100 in TBS für 30 min.
- Inkubieren Sie mit einer Verdünnung von humanen ChAT-Primärantikörpern von Ziegen (siehe Materialtabelle)in TBS mit 0,1% Triton X-100 und 1% NBS für 48 h bei 4 °C.
- Waschen Sie 3x in TBS bei Raumtemperatur. Führen Sie alle weiteren Inkubation und Waschen bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie mit biotinylatierten Rindern Anti-Ziegen-Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) für 1 h.
- Waschen Sie 3x in TBS.
- Inkubieren Sie mit dem Komplex avidin-biotin-peroxidase (siehe Materialtabelle).
- Waschen Sie 3x in TBS.
- Entwickeln Sie mit einer verbesserten DAB-Peroxidase-Substratlösung (siehe Materialtabelle)gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
VORSICHT: DAB ist ein vermutetes Karzinogen. Es ist giftig durch Kontakt und Inhalation. Verwenden Sie PSA, wenn Sie mit DAB arbeiten. - Waschen Sie den Abschnitt ein paar Mal mit destilliertem Wasser und halten Sie in Tris pH = 7.6.
- Montieren Sie die Abschnitte auf den gelatinierten Dias. Alle Abschnitte aus einem Gewebe können auf die gleiche Folie gelegt werden. Die Abschnitte trocknen, 2x für je 5 min mit 70%, 90%, 95% und 100% Ethanol trocknen und dann die Abschnitte mit zwei 10 min Xylolwäschen löschen. Abdeckung der Abschnitte mit Montagemedium (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Verarbeitungszeit der Austrocknung und Rodung wirkt sich auf die Dicke der Abschnitte aus. Daher sollten die gleichen Bedingungen für alle Abschnitte verwendet werden. In der aktuellen Studie lag der Mittelwert für die Enddicke bei 21,11 bis 0,45 m. - Halten Sie die Abschnitte in der Dunstabzugshaube zum Trocknen. Die trockenen Abschnitte sind bereit für die Stereologie.
4. Stereologie
HINWEIS: Siehe Materialtabelle für das verwendete Mikroskop und die verwendete Software. Ein Tauchziel mit einer numerischen Blende (NA) > 1.2 ist nützlich und sollte bei Bedarf verwendet werden. Die Dias sollten nach Genotyp oder Behandlungsgruppe gruppiert und kodiert werden. Die vollständige Stereologie für eine Studie sollte von derselben Person durchgeführt werden, und die Person, die die Stereologie durchführt, sollte blind für die Identität der einzelnen Dias oder der untersuchten Gruppe1,12,13sein.
- Öffnen Sie eine neue Studie in der Software. (Datei > Neue Studie). Ein Dialogfeld"Studieninitialisierung"wird geöffnet. Füllen Sie die Studieninformationen mit Multi-Level (Fraction Based) aus (Abbildung 2A).
- Doppelklicken Sie unter Parameterauf 'Volume', wodurch das Dialogfeld Lautstärke geöffnet wird. Benennen Sie das Voninteresse enthaltene Feature, und wählen Sie den Prüfpunkt RegionPoint Countingaus. Klicken Sie auf Weiter.
- Doppelklicken Sie auf den nächsten Parameter 'Länge'.
- Geben Sie einen Namen des Features an(z. B. 'L') Wählen Sie 'Kugel' Und klicken Sie auf Weiter.
- Klicken Sie als Nächstes auf das Dialogfeld "Studieninitialisierung",in dem das Feld "Fallinitialisierung"geöffnet wird. Geben Sie die Anfrageinformationen ein. Gruppen müssen vor Beginn der Studie codiert werden. Die Gesamtzahl der Abschnitte ist die Anzahl der Abschnitte, beginnend mit dem ersten Abschnitt, der den Interessenbereich enthält, bis zum letzten Abschnitt, der den Bereich von Interesse enthält (siehe Schritt 2.1). Das Abschnittsabtastintervall beträgt acht, da jeder8. Abschnitt für die IHC-Färbung ausgewählt wurde.
- Wenn Sie auf Weiter klicken, wird das Dialogfeld "Probeinitialisierung"geöffnet, in dem automatisch die niedrigste Vergrößerung für die Regionsauswahl und die Volumenschätzung festgelegt wird. Bestätigen Sie die Einstellungen, und überprüfen Sie, ob der Interessenbereich bei der ausgewählten unteren Vergrößerung identifiziert werden kann. Doppelklicken Sie auf'Volumen' und füllen Sie 50.000 m3 pro Punkt für den Regionsvolumenanteil aus. Klicken Sie auf Fertig.
- Setzen Sie unter Objekt (Hohe) Vergrößerung die Länge auf 63x oder 100x. Doppelklicken Sie auf 'Länge', um das Dialogfeld Länge-Sphäre zu öffnen und den Durchmesser der Kugel auf 10 m festzulegen. Klicken Sie auf Fertig.
HINWEIS: Die Schutzzone sollte anhand der tatsächlichen Dicke der Abschnitte bestimmt werden. Der Bediener muss die Dicke der Abschnitte an mehreren Standorten überprüfen, um Schäden zu vermeiden. Passen Sie bei Bedarf die Dicke der Schutzzone basierend auf der Schnittdicke an. - Legen Sie geeignete Werte für Rahmenbereich, Rahmenhöhe, Schutzzone und Rahmenabstand fest.
HINWEIS: Diese Werte hängen von der Heterogenität der Objektprofile (Fasern) im Studienbereich ab. Eine Rahmenfläche von 400'm2, Rahmenhöhe von 10 'm, Schutzzone von 2 'm und Rahmenabstand von 300 'm ergibt akzeptable CE-Werte für die Faserlängenschätzung in NBM. Eine Pilotstudie muss mit diesen Werten durchgeführt werden, bevor Sie zum nächsten Fall gehen. - Folgen Sie den Anweisungen der Software nach jedem Schritt. Die Anweisungen werden entweder als Dialogfeld und/oder am unteren Rand des Bildschirms angezeigt.
- Fügen Sie Abschnitt 1 ein.
- Definieren Sie bei niedriger Vergrößerung (5x) den Interessenbereich, indem Sie eine willkürliche Grenze um die NBM festlegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter in der linken Ecke des Videofensters. Folgen Sie den Anweisungen und bestätigen Sie, dass sich alle grünen Punkte im NBM befinden. Die Punkte können durch Anklicken der Punkte eingeschlossen oder ausgeschlossen werden.
HINWEIS: Es gibt keine definitive, festgelegte Grenze um die NBM. Die Auswahl ist meist vom Ermittler definiert. Die ChAT+ cholinergen Neuronen der NBM können in der inneren Kapsel (ic) und dem Globus pallidus (GP) beobachtet werden. In diesem Protokoll ist das ic mit ChAT+ cholinergen Neuronen und ihren Projektionen (Fasern) und ganzen GP im NBM enthalten (Abbildung 1D). - Befolgen Sie die Anweisungen und wechseln Sie zu 63x für Fasermessungen bei der aktuellen Fraktion. Das Dialogfeld 'Schnittdicke' wird auf dem Bildschirm angezeigt. Legen Sie die obere und untere Oberfläche des Abschnitts fest, um die tatsächliche Dicke des Abschnitts zu messen. Die manuelle Z-Achsenbewegung sollte verwendet werden. Klicken Sie auf Fertig.
HINWEIS: Wenn sich keine Faser im Bereich befindet, kann der Schritt übersprungen werden, um zum nächsten Bruchplatz zu wechseln. - Verschieben Sie die Z-Achse langsam von oben nach unten in der Rahmenhöhe des Schnitts, und markieren Sie alle sich schneidenden Fasern auf der Oberfläche der virtuellen Kugelsonde (Abbildung 3). Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Speicherort zu wechseln.
- Nach Abschluss aller Brüche wird die Software aufgefordert, den nächsten Abschnitt einzufügen. Wiederholen Sie die Schritte 4.9–4.12 für alle sechs oder sieben Abschnitte des Gewebes.
- Am Ende generiert die Software ein Ergebnis für den Fall, der die CE-Werte anzeigt (Abbildung 4). Wenn die CE akzeptabel ist, fahren Sie mit dem nächsten Fall fort. Datei > Neuer Fall. Wenn das CE nicht akzeptabel ist (Abbildung 4A), bietet die Software Empfehlungen, um einige der Parameter zu ändern. In vielen Fällen verringert die Verringerung des Rahmenabstands die CE-Werte auf einen akzeptablen Bereich(Abbildung 4B).
- Nachdem Sie alle Anfragen abgeschlossen haben, generieren Sie Ergebnisse für jeden Fall und jede Gruppe (Datei > Ergebnisse).
5. Analyse und Statistik
- Die Software stellt Daten für jedes Beispiel und jede Gruppe bereit. Die Software selbst berechnet Brüche wie SSF, ASF und TSF und stellt das gesamte Referenzvolumen (VREF) und die Gesamtlänge (L) der Fasern im Referenzbereich (in diesem Fall NBM)(Abbildung 4B) bereit. Exportieren Sie die Daten und speichern oder kopieren Sie in die statistische Software ihrer Wahl für die Gruppenanalyse. Tabelle 1 zeigt typische Ergebnisdaten für die statistische Analyse. Analysieren Sie die Faserdichte (Lv), indem Sie die gesamte Faserlänge mit dem Referenzvolumen dividieren.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Abbildung 5dargestellt. Gruppe C, die als APPswe-Gruppe (APP) decodiert wurde, hatte eine deutlich geringere Faserlänge (Abbildung 5B) und eine Faserlängendichte (Abbildung 5C) im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfmatten (WILD). Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied im Volumen der NBM zwischen den beiden analysierten Gruppen gab (Abbildung 5A).
Abbildung 1: Abbildung der in dieser Studie verwendeten Gewebeverarbeitung und -probenahme. Probenvorbereitung und Probenahme. (A) Das Kleinhirn und die Riechbirne werden vor der Montage auf der Probenscheibe entfernt. (B) Ausrichtung des Gehirns auf der Probenscheibe zum Schnittschneiden. Ein flacher Längsschnitt (markiert mit einer Linie) auf der einen Hemisphäre hilft, die Seite des Gehirns in den Abschnitten zu identifizieren. (C) Schematische Darstellung einer 24-Well-Platte, die die systematische Auswahl jedes8. Abschnitts aus der 24-Well-Platte (gekennzeichnet als "X") zeigt. (D) Schematische Sätzige der koronalen Abschnitte, die die Grenzen von NBM in den systematisch ausgewählten sechs Abschnitten abgrenzen. (E-G) Repräsentative Bilder von koronalen Abschnitten immunostainiert für ChAT und Standort von NBM (umrissen). (H) Ein Bild mit hoher Vergrößerung, das die NBM-Grenzen zeigt. LV = seitlicher Ventrikel; VL = ventrolateraler thalamischer Kern; ic = interne Kapsel; GP = globus pallidus; CPu = Caudate Putamen (Striatum); NBM = nucleus basalis von Meynert (dargestellt als 'B' in Franklin und Paxinos Mausatlas). Skalenstange = 1 mm (E-G), 200 m (H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Screenshot-Bilder. (A) 'Study Initialization' (B) 'Case Initialization'und (C) 'Probe Initialization' Dialogfelder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kugelsonde mit einem optischen Dissektor. Repräsentative Screenshot-Bilder, die die vier Ebenen einer Kugel und die Markierung von sich schneidenden Fasern zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. (A) zeigt ein inakzeptables CE und (B) ein akzeptables CE für die Längenschätzung. Die ASF, SSF und TSF für jeden Fall werden ebenfalls in den Ergebnissen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Daten und Analysen. Grafische Darstellung von Volumen (A), Länge (B) und Längendichte (C) im NBM zweier Gruppen. Die Daten wurden mit dem Student t-Test in zwei verschiedenen Gruppen analysiert. *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gruppe | Fall # | Volumen (Nr. 3) | Länge (m) | Lv ('m/'m'3) |
| B | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| B | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| B | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| C | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| C | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| C | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| Statistiken | ||||
| Mittlere Gruppe B | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| SD Gruppe B | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| Mittlere Gruppe C | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| SD-Gruppe C | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B gegen C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
Tabelle 1: Repräsentative Daten und Analysen. Volumen- und Längenwerte wurden direkt aus den Ergebnissen der Stereologiesoftware kopiert. Die Längendichte (Lv) wurde berechnet, indem die Längenwerte durch die Volumenwerte jedes Falles dividiert wurden. p-Werte wurden mit dem t-Test von Student berechnet.
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Discussion
Hier zeigen wir eine Methode zur Abschätzung der Dichte cholinerger Fasern in der NBM mit einer Raumkugelsonde ( Kugel). Diese Sonde schätzt die gesamte Faserlänge in der Region von Interesse. Die Gesamtlänge kann durch das Volumen der Region geteilt werden, um die Faserdichte zu erhalten. Um das Volumen der Region zu schätzen, wurde die Cavalieri-Punktzählungsmethode verwendet. Die Cavalieri-Punktzählungsmethode ist ein unvoreingenommener und effizienter Schätzer eines 3D-Referenzvolumens für jede Region. Die Methode berechnet eine Schätzung der Fläche auf einer Schnittfläche eines Abschnitts durch Zählen von Punkten (die Flächenfraktionen darstellen) und multipliziert sich dann mit dem Abstand zwischen zwei analysierten Abschnitten11. Die Methode erfordert keine arbeitsintensive, genaue Rückverfolgung des Umfangs der Interessenregion. Es wird in Verbindung mit optischen Fraktionatoren verwendet, um die Dichte von Zellen und Fasern zu schätzen.
Die stereologische Analyse erfordert eine präzise Stichprobenmethode. Die Hirnregion von Interesse sollte richtig mit Färbung definiert werden. Die NBM liegt zwischen dem AP Bregma -0,0 mm bis -1,6 mm pro Franklin und Paxinos Mausatlas. Für die Immunhistochemie sollten Abschnitte systematisch und zufällig ausgewählt werden, was bedeutet, dass der erste Abschnitt nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und dann andere Abschnitte systematisch ausgewählt werden sollten. Für ein erwachsenes Maushirn besteht die NBM aus ca. 1.600 m (vorderes Poster), was etwa 53 koronalen Abschnitten von 30 m Dicke bedeutet. Wenn dann jeder8. Abschnitt ausgewählt ist, werden 6 bis 7 Abschnitte benötigt, um für die stereologische Analyse zu färben. In unserem üblichen Verfahren reichen 6-7 Abschnitte aus, um die Gesamtzahl der cholinergen Fasern in der NBM zu schätzen. Die Analyse des CE wird zu Beginn der methodischen Optimierung zur Überprüfung vorgeschlagen12.
Eine richtige Färbemethodik ist die Grundvoraussetzung für eine Studie. ChAT Färbung für cholinerge Fasern kann eine Herausforderung sein, und viele Antikörper färben einige der Zellteile, aber nicht die entfernten axodendritischen Prozesse. Die entsprechenden Details zur ChAT-Färbung8finden Sie in unserem zuvor beschriebenen Protokoll.
Die Methode erfordert im Wesentlichen dicke Abschnitte, da die histologische Verarbeitung Schrumpfung im Gewebe verursacht. Im Idealfall sind Für Raumkugelsonden Abschnitte von mehr als 20 m Nachbearbeitung erforderlich (oft dünner als die anfängliche Gewebeschnittdicke). Daher wird eine Schnittdicke von 50 m empfohlen. Die Schrumpfung ist in der Regel ungleichmäßig, und es kann volumetrische Verzerrungen innerhalb des Gewebes beeinflussen und somit den Lv-Wert ändern. Beispielsweise wurde ein mehrfacher Unterschied in der Kapillarlängendichte beobachtet, als er in vivo mit Multiphotonen-Bildgebung14,15analysiert wurde. In Anbetracht dieses Problems ist es effektiver, die Länge pro Region anstelle der Länge pro Volumen zu melden.
Obwohl die im Protokoll genannten Werte perfekt funktionierten, wird immer eine Pilotstudie für eine einzelindividuelle Studie empfohlen. Nach Abschluss eines einzelnen Gewebeprobenfalls liefert die Software einen CE-Wert für das gewählte Probenahmedesign. Der CE-Wert wird zur Schätzung der Genauigkeit der Schätzung verwendet und kann mit mehreren Formeln berechnet werden. Die hier verwendete Software verwendet Gundersons Formel von 1999, um das CE zu analysieren und hält es für akzeptabel, wenn die Werte kleiner als 0,11,16sind. Das Stichprobendesign sollte so lange angepasst werden, bis der CE-Wert akzeptabel wird, bevor das Protokoll für andere Stichproben angepasst wird. Im Allgemeinen reduziert eine erhöhte Anzahl von Stichproben (durch Verringerung des Rahmenintervalls) den CE-Wert. Praktisch keine Struktur im biologischen System ist ein ideales Linienprofil, sondern Bänder oder Zylinder. Daher variiert die Entscheidung über das genaue Schneiden der Funktion an einem Fokuspunkt von Person zu Person. Daher sollte die Stereologie aller Proben einer bestimmten Studie von derselben Person durchgeführt werden. Um eine mögliche Verzerrung zu vermeiden, sollte der Stereologie-Operator blind gegenüber dem Beispielbezeichner sein.
Reproduzierbarkeit ist ein großes Anliegen bei dieser Methode. Ein Faktor sind die Gewebeschrumpfung und Missbildungen während der Probenverarbeitung, die durch die Verwendung der konfokalen In-vivo-Mikroskopie13,14,15bis zu einem gewissen Grad überwunden werden können. Der Raumball erfordert eine kontrastreiche Färbung und eine gute Bildauflösung, um Strukturen zu visualisieren. Da Fasern in der Regel nicht linear sind, bleibt die Bestimmung von Intercepts meist die Entscheidung des Bedieners. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine automatisierte Segmentierung histologischer Merkmale vorgeschlagen. Dies ist jedoch noch nicht verfügbar13.
Der Vorteil der Verwendung der Stereologie besteht darin, dass sie ein unvoreingenommenes Schema zur Analyse von Strukturen in einem 3D-Gewebe bietet. Die Raumkugelsonde liefert isotrope Brüche in Gewebeproben und bietet daher einen unvoreingenommenen Ansatz zur Quantifizierung der Faserlänge. Eine alternative Methode zur Analyse der Faserdichte ist die Messung der optischen Dichte einer histochemischen Färbung. Die auf Färbeintensitäten basierenden Methoden liefern eine semiquantitative Abschätzung der Färbedichte und können empfindlich genug sein, um die Veränderungen von cholinergen Neuronen und Fasern in der NBM zu unterscheiden. Stereologische Methoden mit der Raumkugelsonde (Kugel) verwendet die Bestimmung von Fasern auf der Grundlage ihrer visuellen Eigenschaften und liefert eine Schätzung der realen Länge der Fasern. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um andere lineare Profile im Gehirn zu analysieren, wie cholinzeptive Fasern (mit Acetylcholinesterase Histochemie), dopaminerge oder katecholaminergische Fasern (Tyrosinhydroxylase-Immunostaining), serotonerge Fasern (Serotonin-Immunostaining), Gefäßstrukturen (CD31-Immunostaining) oder Astrozytenprozesse (glial fibrilläres saures Protein, GFAP, Immunfärbung)17,18,19,20 ,21, .
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an W.Z.S. vom Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), die Alzheimer es Association (NPSPAD-11-202149) und Ressourcen aus dem Midwest Biomedical unterstützt. Forschungsstiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
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