Summary
这里介绍的是一个非侵入性的中伤性干细胞（MSC）传递和跟踪的小鼠模型创伤性脑损伤的协议。超对磁氧化铁纳米颗粒用作磁共振成像（MRI）探头，用于MSC标签和非侵入性体内跟踪，使用实时MRI进行鼻内传递。
Abstract
基于干细胞的脑损伤疗法，如创伤性脑损伤（TBI），是临床试验的一种有前途的方法。然而，侵入性细胞交付和移植效率低的跟踪等技术障碍仍然是转化干细胞治疗的挑战。本文介绍了一种基于用超副磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒标记的中位干细胞（MSCs）以及标记MSCs的鼻内传递的干细胞标记和跟踪的新兴技术。这些纳米粒子是含氟素等子素 （FITC） 嵌入和安全标记 MSC，随后通过内陆途径输送到 TBI 诱导小鼠的大脑。然后，通过实时磁共振成像（MRI）对它们进行非侵入性的体内跟踪。该技术结合了SPIO用于细胞标记和鼻内输送的重要优势，包括：（1）非侵入性、体内MSC跟踪后进行长时间的跟踪，（2）由于非侵入性，可以进行多种给分方案MSC的交付途径，以及（3）由于SPIO的安全性、MRI细胞跟踪方法的非侵入性以及给给的路线，可能应用于人类。
Introduction
中枢神经系统干细胞 （MSC） 是治疗中枢神经系统 （CNS） 疾病和人类损伤的干细胞疗法的诱人候选者。此外，MSC还被用作在损伤部位1、2运送治疗蛋白的工具。近年来，已经开发出有前途的创新技术，为基于干细胞的中枢神经系统疾病疗法建立了细胞传递和2）细胞跟踪的新途径。干细胞进入大脑的内层传递取决于细胞绕过婴儿床板的能力，并通过脑小道3部分进入嗅球。鼻内传递和MSCs与超副磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒的标记相结合，是MSCs在治疗中枢神经系统疾病的临床应用上一个有希望的方法，因为SPIO纳米粒子是磁共振成像（MRI）的安全探针，允许MRI3、4、5在MSC交付后进行非侵入性敏感纵向跟踪。此外，鼻内分娩是一种安全且非侵入性的路线，允许在短时间内进行反复管理。
本文介绍了一种高度敏感和非侵入性的技术，用于在使用SPIO标记细胞和MRI的创伤性脑损伤小鼠模型中跟踪MSC在体内的创伤性脑损伤后分娩。SPIO 标签的一个重要优点是 MRI 对组织中的 SPIO 进行灵敏检测，从而能够高效、非侵入性地跟踪细胞。此处使用的 SPIO 纳米颗粒是市售的，并标有荧光素异物素 （FITC） 荧光磷，允许在组织中检测 SPIO，无需免疫染色或额外处理。此外，还可以执行纵向实时跟踪，并调查交付的 MSCs 的生物分布。
Protocol
本议定书中涉及动物的所有程序均经机构动物护理和使用委员会批准，并经台北医科大学动物使用伦理委员会批准（批准号为1。LAC-2018-0574;15.03.2019).
1. 使用 SPIO 纳米粒子标记 MSC
- 要用SPIO标记MSC，在含有MSCs的T75瓶中加入6mL的标签介质（Dulbeco的改性鹰介质[DMEM]中25μg/mL的SPIO，不含胎儿牛血清[FBS]））
-
在CO2孵化器（37°C，5%CO2）中用标记介质孵育细胞，无需摇动。24 小时后，使用无菌巴斯德移液器轻轻取下标签介质，并带有塑料尖端连接到真空。用6 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞单层2x，去除任何未内化SPIO的痕迹。
- 要确定细胞是否已成功标记，请在荧光显微镜或共聚焦显微镜下检查标记的细胞，如果 SPIO 被标记有荧光荧光（即，类似于此处使用的那些;图 1B，C.或者，为细胞执行普鲁士蓝色染色（参见染色协议步骤6.2~6.4）。
- 通过3mL胰蛋白酶治疗收获粘附细胞，并在37°C孵育。孵育5分钟后，加入7 mL的预加热DMEM介质，加10%FBS（v/v）以灭活胰蛋白酶。使用移液器将细胞悬浮液收集到 15 mL 锥形管中。
- 将细胞悬浮液在300 x g下离心5分钟。丢弃上清液，在PBS中重新悬浮细胞颗粒。使用锥体蓝色染料和血细胞计计算可存活的细胞。
注：由于铁的负载，标记细胞的细胞颗粒将显示为深色（图1D）。该协议与 MSC 标签和 MRI 成像相关。MSC 标签6的过程以前已经优化，此处仅包含准备标记的 MSC 以跟踪体内的过程，因为体内跟踪是重点。研究者应优化其他细胞类型的培养和标记方案。 - 在 PBS 的 18 μL（或将用于鼻内传递过程的总体积）中，使用 PBS 将细胞浓度调整到 150，000 个细胞（或产生足够 MRI 信号的数字）。
注：人们注意到，高于150，000个细胞/18μL的PBS细胞浓度会导致细胞聚集，这可能会影响鼻内传递的效率。如果鼻内分娩需要较多的细胞，增加细胞悬浮量，增加鼻内给塞的数量，因为鼻内给政是一种非侵入性程序，而且有可能进行多次给分。
2. 受控皮质撞击 （CCI） 伤害
注：在此协议中，雄性C57 BL/6小鼠（7-8周大）保持在12/12小时的光/暗周期中，并可获得食物和水。
- 为使每只小鼠做好CCI损伤的准备，请通过腹内注射（1 mL/kg）施用左子丙平（50毫克/千克）和木兰辛（20毫克/千克）麻醉鸡尾酒。由于缺乏脚趾捏反应，确保麻醉深度足够。或者，将鼠标放入装有 2%-4% 等分胶的腔室中，为 60 s。
- 使用电子理发器在耳朵之间修剪头骨背表面的毛皮。使用浸泡在碘中的无菌棉签清洁剃擦区域几次。使用浸泡在70%乙醇中的棉签来清除碘。
- 将麻醉鼠标置于立体定向框架中，并使用耳条和鼻杆固定鼠标。使用无菌剪刀在被割的皮肤中切开（约2.5厘米），以进入颅骨表面。
- 使用棉垫取出骨骼上的组织，露出头骨。使用浸泡在 3% H2O2中的棉签清洁头骨表面 10 s，然后用干棉垫清洁。
注：头骨缝合线和胸膜和羊肉现在可以很容易地识别。 - 识别颅骨表面为 CCI 损伤选择的坐标，并使用铅笔或正确的标记在坐标周围绘制一个圆（4 mm 直径）。
注：在本协议中，用于CCI感应的坐标（AP）-2.0毫米和平庸（ML）±1.5毫米。 - 使用微钻和圆毛刺（直径 0.5 mm）在标记的圆处薄头骨。避免在钻孔时施加压力，因为钻穿骨头可能会损坏脑气囊。使用干净干燥的棉签清洁骨尘。
- 使用无菌细钳轻轻取出骨瓣，以暴露杜拉母体，同时保持其完好无损。将鼠标从用于受伤前准备的立体定向帧中取出，并将其放入 CCI 设备的立体定向帧中。
- 使用耳杆和鼻杆稳定鼠标头。确保鼠标头在玫瑰色-斜面方向水平，并根据需要调整鼻梁。
- 按照控制盒上的说明将冲击器尖端归零到裸露的皮质表面。使用冲击器底部的 X 和 Y 控制轮，确保冲击器尖端直接对齐到要受影响的皮层坐标上方。
- 使用速度为 5 m/s、驻留时间为 250 ms、伤害深度为 1 mm 的控制箱设置实验参数，以引起小鼠轻度损伤。
- 按下控制箱上的"冲击"按钮，导致受伤。使用无菌棉签发生的任何出血。
- 将鼠标从立体定向框架中取出，并使用丝质手术缝合线关闭切口。请勿使用金属夹关闭手术部位，因为鼠标将受到 MRI 的磁场影响。
- 在手术部位应用局部抗生素（巴氏杆菌新霉素），以防止感染。将鼠标放在加热垫上，并在恢复阶段密切监视。
- 在手术后3天内每天给酮洛芬（2.5毫克/千克，IP）施用，除非酮托芬给药与研究目标相抵触。
3. 内期交付
- 在CCI诱导后1天，通过i.p.注射施用左子丙平（50毫克/千克）和木拉津（20毫克/千克）麻醉鸡尾酒。确保鼠标因缺乏脚趾夹反应而深度麻醉。
-
通过透明质尿酶治疗，为MSCs的鼻内传递准备小鼠。
- 抓住老鼠的毛骨，在固定头骨的同时，牢牢地打开它的背部。将含有透明质酮酶的移液器尖端置于无菌PBS（4 U/μL）中，以45°角靠近小鼠鼻孔。
- 在每个鼻孔中施用3μL的透明质尿酶悬浮液。保持小鼠不动，在干净的垫子上朝上5分钟。 重复透明质尿酶治疗4次（共100U透明质尿酶悬浮液）。
- 透明质尿酶治疗后，将治疗小鼠放在朝上清洁的垫子上30分钟。
- 要将 MSC 输送到大脑中，请用力握住鼠标，如步骤 3.2.1 中所述。以 3 秒的间隔管理 MSC 悬架的 3 μL/鼻孔。保持鼠标在同一位置 30 s，直到样品滴完全消失。
注：避免在管理过程中形成气泡。 - 以 2 分钟间隔（最多 3 倍）重复管理。
注：要交付的细胞总数为150，000个，因此，每个鼻孔的细胞悬浮液的18μL剂量为3μL，每个3倍。 - 将鼠标返回到笼子并密切监视，直到它完全从麻醉中恢复。
4. 在维沃磁共振成像
注：脑组织组织染色以前曾被用来确认干细胞在鼻内给给术后的成功分娩。但是，此方法只能用作研究的终点，不能纵向使用。使用 MRI 探针标记治疗性干细胞将允许使用 MRI 对细胞进行纵向、非侵入性的体内跟踪。重要的是，该协议有效地减少了所需的动物数量。在此协议中，MRI 扫描在 MSC 交付后第 1 天、第 7 天和第 14 天执行。
- 为了准备用于MRI扫描的小鼠，用异常胶麻醉小鼠（O2的 1 L/min 中为 5% 的极值，用于感应，1.5%~2% 的极值用于维护）。执行脚趾捏，以确保鼠标达到所需的麻醉水平。
- 将鼠标放在成像支架上，并使用水龙头或任何其他正确方法固定其位置。将支架移到 MRI 线圈（7 T/40 厘米磁铁）的中心，然后连接监控连接。
- 要使用自旋回波序列获取 T2+ 加权扫描，将重复时间 （TR） 设置为 1500 ms，将回波时间 （TE） 设置为 2.8 ms。
- 使用 16 mm x 16 mm 视场 （FOV）、128 x 128 采集矩阵 （MTX）和 0.75 x 0.8 mm2的切片厚度，具有四个信号平均值和 90° 翻转角度 （FA）。
- 完成扫描后，从 MRI 线圈中心缩回鼠标支架。将鼠标返回到笼子并密切监视，直到它完全从麻醉中恢复。
-
要跟踪和量化 T2+ 加权图像上标记的 MSC，请使用 ITK-SNAP 软件（版本 3.8.0）7。
- 将 MRI 扫描的原始数据从 MRI 计算机传输到以 DICOM（数字成像和医学通信）格式进行分析的计算机。
- 运行 ITK-SNAP 软件，通过单击"文件"按钮加载 MRI 图像。然后，单击菜单中的"打开主图像"。按下显示窗口中的"打开图像"按钮，然后使用"浏览"按钮查找并打开 MRI 图像。
注：MRI 图像中标记的单元格的可视化将显示为低强度区域。如果需要调整图像对比度，请选择"工具" |图像对比度。 - 通过在分割标签部分中选择活动标签，创建低强度区域、病变或其他大脑部位的分割。对不同的线段使用不同的标签颜色（如果需要多个零件的分割）。
- 使用主工具栏中的多边形工具在表示 SPIO 标记 MSC 的低强度区域周围绘制。选择"接受"，位于 MRI 图像下方。分段区域将显示为分配给该特定线段的活动标签的相同颜色。对所有 MRI 切片重复此分段步骤。
- 通过选择位于 TheITK-SNAP 工具箱底部的"分割标签"部分中的"Scalpel工具"，开发分段区域的 3D 地图，以表示整个大脑中的 MSC 分布。然后，按创建的 3D 地图底部的"接受"。
- 要对表示标记单元格的细分低强度区域执行定量分析（体积和强度平均值），请按顶部面板中的"分割"按钮并选择"体积和统计"。
5. 小鼠大脑的固定和冷冻切片
-
要修复小鼠大脑，在上次MRI扫描后用4%的甲醛（PFA）进行心脏灌注，如前所述8。
- 斩首头部，提取大脑8。在 4°C 下用 4% PFA 修复大脑至少 48 小时。
- 将大脑浸入4°C的30%蔗糖溶液中，直到大脑沉入溶液底部，使大脑脱水。
- 将大脑嵌入最佳切割温度 （OCT） 溶液中，并在 -20°C 冷冻。将大脑用低温微托成片，厚度为14微米，并安装到幻灯片上。将部分幻灯片存储在 -20 °C，直到进一步使用。
6. 普鲁士蓝染色
注：普鲁士蓝色染色通常用于检测 SPIO 标记细胞中的铁含量。在这里，普鲁士蓝色染色用于确认 MRI 图像中的低强度信号对应于标有 SPIO 的 MSC 而不是伪影。普鲁士蓝色染色是检测组织中铁的最敏感的组织化学方法之一，甚至可用于识别细胞中的单个铁颗粒。
- 用蒸馏水清洗大脑部分的幻灯片5分钟。
- 将幻灯片浸入含盐酸等份（10%）的染色溶液中30分钟，执行普鲁士蓝色染色和氰化钾（10%）在使用前准备。
- 用蒸馏水洗3次，每次5分钟。用核快红将部分反光5分钟。用蒸馏水冲洗幻灯片2倍。
- 通过将幻灯片浸入 95% 和 100% 酒精中，使各部分逐渐脱水 2 分钟。使用树脂安装介质添加盖玻片。
- 使用光学显微镜检测大脑部分的染色细胞。
注：标记单元格中的铁将显示为蓝色沉积物。
Representative Results
在鼻内分娩后24小时，在T2+加权图像（图2B）上检测到带有SPIO标记的MSCs为强低强度区域，与皮质损伤有关（图2B），表明SPIO向损伤部位的定向迁移。这种迁移在传递后14天内仍然可见，因为在这个时间段，低强度信号是可见的，没有显著减少（图2B）。用PBS治疗的受伤动物没有显示低强度区域，表明观察到的低强度区域对应于标有MSCs的SPIO，并且没有发出信号（图2A），使用3D重建（图2C，D）在体内观察到的带MRI的标记MSCs的生物分布被可视化。MSC 向受伤皮层的迁移通过普鲁士蓝色染色和 FITC 通道检测在标记 MSC 中标记的 SPIO（图 3A，B） 在组织学上得到确认。
图1：协议原理流程图和MSCs对SPIO吸收的体外确认. （A） MSCs用SPIO孵育24小时进行标记。然后，标记的 MSC 通过内陆 （IN） 路由传递到 TBI 鼠标模型中。在不同时间点进行MRI以跟踪标有MSCs的MRI。由于SPIO纳米粒子被贴有FITC标记，因此（B）荧光显微镜和（C）共聚焦显微镜通过（B）荧光显微镜和（C）共聚焦显微镜实现了对MSCs的充分标记。（D） 由于铁的装载，标记的 MSC 的细胞颗粒呈深色。FITC = 氟辛等子素;SPIO = 氧化铁的超副磁性颗粒;MSCs = 中位干细胞;MRI = 磁共振成像;IN = 内向;TBI = 创伤性脑损伤。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：实时MRI能够检测和跟踪SPIO标记的MSC向TBI诱导小鼠大脑中损伤部位的迁移。（A） 小鼠接受TBI治疗，然后使用带有PBS或SPIO标签的MSCs进行治疗，在受伤后24小时通过鼻内途径进行治疗。T2+加权图像的冠状部分显示，在分娩后1天、7天和14天，标记的MSCs在损伤部位边缘（箭头）处为低强度区域（箭头）。PBS处理的小鼠没有低强度区域。（B） 基于日冕 T2+-MRI 图像的损伤部位区域（绿色）和标记 MSC（红色）的分割过程。（C） 基于T2+加权图像的小鼠大脑治疗的3D重建，说明在分娩后14天在大脑中SPIO标记MSCs的生物分布。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：组织学分析证实，在接受治疗的动物的大脑中存在SPIO标记MSCs。用PBS（对照）和（C）小鼠治疗用SPIO标记MSC治疗的小鼠大脑部分的蓝色染色。在MSC处理的小鼠（盒细胞，蓝色）中检测到SPIO阳性细胞，而对照小鼠在分娩后14天在皮层损伤部位未显示阳性细胞，证实了MRI的观察。使用PBS和（D）小鼠使用SPIO标记MSC治疗的a（B）对照小鼠皮层的荧光显微镜分析在分娩后14天进行。分析显示，在MSC治疗的小鼠受伤的皮层上存在FITC标记的SPIO阳性细胞（盒装细胞，绿色），但在PBS处理小鼠的皮层中未观察到FITC信号。刻度条 = 50 μm，除非另有说明。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
此处描述的协议代表了 MSC 的 SPIO 标签和 SPIO 标记 MSC 的 MRI 跟踪的一般程序。该协议允许有机会使用非侵入性方法研究MSC在体内分娩后在大脑中的迁移和生物分布。
MSC是干细胞疗法的有吸引力的候选，治疗中枢神经系统疾病和损伤，因为它们能够分泌营养因子，1）触发神经恢复过程，2）提供神经保护，因为它们在损伤区域9，10，11，12的抗炎作用。虽然长期MRI跟踪和检测SPIO标记MSCs可能由于细胞间SPIO与细胞分裂稀释可能受到限制，标记细胞可以在移植后长达数周的动物模型13的大脑中检测到。
这里还描述了MSC的标签协议，带有SPIO纳米颗粒，涂有无转染剂的dextran。其他协议已在文献中使用了14，15，16。然而，在所有情况下，这些协议应根据细胞类型、SPIO大小、孵育时间和SPIO浓度进行调整。MSCs已被证明有受损的软骨分化潜力，但不是在SPIO标签17的腺体分化。因此，强烈建议在干细胞交付之前进行分化测定，以评估SPIO对干细胞分化效力的影响。在以前的研究中，证明MSC标签与相同的SPIO类型和浓度在这里使用不影响MSCs6的成骨或异化抗性抗性效力。
治疗性干细胞治疗性脑疾和损伤的内向途径是干细胞临床应用的一条有希望的途径。然而，决定鼻腔干细胞行为的内在和分子机制仍不清楚。虽然对小分子的传递被广泛探索，但治疗干的大小和生物分布行为与小分子不同。当前协议表明，MSC 倾向于在鼻内分娩后迁移到损伤部位。
此处，T2+ 加权图像用于跟踪标有 SPIO 的 MSC。其他报告使用了梯度回波成像。然而，由于细胞间SPIO，在梯度回波成像中经常观察到易感伪影。在当前协议中，表示T2+加权图像上标有SPIO的MSCs的低强度区域的位置与组织学检查检测到的脑部分SPIO的位置相同（图3）。这表明T2+加权旋转回波成像对大脑中标有SPIO标记的MSC跟踪有足够的灵敏度。
总之，所述方案有利于脑损伤和紊乱的体内干细胞跟踪研究。对体内干细胞的纵向跟踪传统上是通过在多个时间点牺牲动物来进行的。目前的协议为MSCs的交付和跟踪提供了一种非侵入性和有效的方法，它代表了基于干细胞治疗脑损伤和临床疾病的潜在程序。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了科学和技术部赠款的支持， 台湾（MOST 104-2923-B-038-004 -MY2，MOST 107-2314-B-038-063，以及 MOST 107-2314-B-038-042）和台北医科大学（TMU 105-AE1-B03，TMU 106-5400-004-400，TMU106-5310-001-400、DP2-107-21121-01-N-05 和 DP2-108-21121-01-N-05-01）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
| Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
| Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
| Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
| Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
| ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
| Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
| TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |
References
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