Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור משלוח של תאי גזע mesenchymal לא פולשנית (MSC) ומעקב במודל העכבר של פציעה מוחית טראומטית. ברזל פאראמגנטי תחמוצת הברזל מועסקים כהדמיה תהודה מגנטית (MRI) בדיקה עבור התיוג MSC ו פולשני ב vivo מעקב אחר משלוח intranasal באמצעות MRI בזמן אמת.
Abstract
תאי גזע מבוססי טיפולים לפציעות מוחית, כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), הם גישה מבטיחה ניסויים קליניים. עם זאת, מכשולים טכניים כגון משלוח התא פולשנית ומעקב עם יעילות השתלת נמוכה להישאר אתגרים בטיפול מבוסס גזע translational. מאמר זה מתאר טכניקה המתעוררים לתיוג תא גזע ומעקב על בסיס התיוג של תאי גזע mesenchymal (MSCs) עם תחמוצת ברזל superמגנטית (SPIO) חלקיקים, כמו גם משלוח intranasal של MSCs שכותרתו. חלקיקים אלה הם fluorescocyanate (FITC)-מוטבע ובטוח לתייג את MSCs, אשר מועברים לאחר מכן את המוחות של העכברים המושרה TBI על ידי התוואי intranasal. לאחר מכן הם מסומנים באופן לא פולשני בvivo על ידי דימות תהודה מגנטית בזמן אמת (MRI). יתרונות חשובים של טכניקה זו המשלבת SPIO עבור תיוג תא ומסירה intranasal כוללים (1) לא פולשני, ב vivo מעקב MSC לאחר המסירה לתקופות מעקב ארוך, (2) האפשרות של מינון מרובים בגלל לא פולשני דרך של משלוח MSC, ו (3) יישומים אפשריים לבני אדם, בשל הבטיחות של SPIO, האופי הלא פולשני של שיטת מעקב התא על ידי MRI, ודרך המינהל.
Introduction
תאי גזע של mesenchymal (MSC) הם מועמדים אטרקטיביים עבור טיפולים מבוססי תאי גזע בטיפולים של מערכת העצבים המרכזית (CN) הפרעות ופציעות בבני אדם. יתרה מזאת, MSCs שימשו ככלי לאספקת חלבונים טיפוליים באתרי פציעה1,2. בשנים האחרונות, חידושים מבטיחים פותחו כדי לקבוע 1) מסלולים הרומן של משלוח התא 2) מעקב אחר תאי גזע המבוסס על תאים של הפרעות מערכת העיכול. המסירה intranasal של תאי גזע לתוך המוח תלוי ביכולת של תאים לעקוף את הצלחת cribriform ולהיכנס הנורה הריח באופן חלקי באמצעות כביש בתוך מחסום3. השילוב של משלוח intranasal ואת התיוג של MSCs עם תחמוצת ברזל superמגנטית (spio) חלקיקים מייצג גישה מבטיחה ליישומים קליניים של MSCs בטיפול בהפרעות המוח, מאז חלקיקי spio הם בטוח בדיקה עבור דימות תהודה מגנטית (mri) ולאפשר מעקב לא פולשנית האורך של MSCs post-מסירה על ידי mri3,4,5 יתרה מזאת, משלוח intranasal הוא נתיב בטוח ושאינו פולשני המאפשר ניהול חוזר בתוך פרק זמן קצר.
מאמר זה מתאר טכניקה רגישה מאוד ולא פולשנית עבור מעקב MSCs vivo post-intranasal משלוח במודל העכבר של פציעה מוחית טראומטית (TBI), אשר מעסיקה תאים SPIO התווית ו-MRI. אחד היתרונות החשובים של תיוג SPIO הוא זיהוי רגיש של SPIO ברקמה על ידי MRI, מה שמאפשר לעקוב אחר התאים ביעילות ובאופן בלתי פולשני. חלקיקי SPIO המשמשים כאן הם מסחרית זמין מתויג עם fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescein אשר מאפשר זיהוי של SPIO ברקמה ללא כתמים או עיבוד נוסף. יתר על כן, ניתן לבצע מעקב האורך בזמן אמת ולחקור את ביוהפצה של MSCs נמסר.
Protocol
כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים, באישור ועדת האתיקה לשימוש בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית טאיפה (אישור לא. LAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. תיוג של MSCs עם חלקיקים SPIO
- כדי לתייג MSCs עם SPIO, להוסיף 6 מ ל של תיוג מדיה (25 μg/mL של SPIO ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה [DMEM] עם סרום לא עוברי העובר [FBS]) לבקבוקון T75 המכיל MSCs (80% שליטה).
-
דגירה את התאים עם מדיה תיוג בחממה2 (37 ° c, 5% CO2) בלי לרעוד. לאחר 24 שעות, להסיר בעדינות את המדיה תיוג באמצעות הצינורות פסטר סטרילי עם עצה פלסטיק המצורפת ואקום. שטוף את התאים 2x עם 6 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) כדי להסיר את כל העקבות של SPIO הפנפו.
- כדי לקבוע אם התאים סומנו בהצלחה, בדוק את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלורסנט או מיקרוסקופ קונפוקלית אם הספיו מתויגים עם fluorophore (כלומר, כמו אלה המשמשים כאן; איור 1ב', ג). לחילופין, בצעו את הצבע הכחול הפרוסי לתאים (ראו צעדים 6.2 – 6.4 לפרוטוקול הצביעת).
- הקציר תאים מחסיד ידי טיפול עם 3 מ ל טריפסין ו דגירה ב 37 ° c. לאחר 5 דקות של דגירה, להוסיף 7 מ ל של מדיית DMEM מחומם מראש עם 10% FBS (v/v) כדי להשבית את טריפסין. לאסוף את ההשעיה התא באמצעות פיפטה לתוך 15 מ"ל צינור חרוט.
- Centrifugate ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה התא ב-PBS. לספור את התאים הקיימא באמצעות טרי, צבע כחול ו הומוציטומטר.
הערה: הגלולה של התא של התאים שכותרתו יופיע כצבע כהה עקב טעינת ברזל (איור 1D). פרוטוקול זה רלוונטי לתיוג MSC ולדימות MRI. ההליך עבור התיוג MSC6 כבר אופטימיזציה בעבר, ורק את הצעדים כדי להכין תווית MSCs לעקוב vivo כלולים כאן, מאז במעקב vivo הוא המוקד. הפרוטוקול עבור culturing ותיוג של סוגי תאים אחרים צריך להיות ממוטב על ידי החוקר. - כוונן את ריכוז התא באמצעות PBS כדי 150,000 תאים (או מספר שתוצאתו אות MRI מספקת) ב 18 μL של PBS (או את הנפח הכולל שישמש בהליך המסירה intranasal).
הערה: הבחין כי תא ריכוז גבוה יותר מ 150,000 תאים/18 μL של PBS מוביל לצבירת תאים, אשר עשוי להשפיע על היעילות של משלוח intranasal. אם יש צורך במספר גבוה יותר של תאים עבור מסירה intranasal, להגדיל את הנפח הכולל של ההשעיה התא ולהגדיל את מספר מינהל intranasal, כמו intranasal המינהל הוא הליך לא פולשני, ומינון מרובים אפשרי.
2. פציעת השפעה בקליפת הגוף (CCI)
הערה: בפרוטוקול זה, זכר C57 BL/6 עכברים (7 – 8 שבועות) נשמרו באור 12/12 h/כהה מחזור עם גישה מודעת מודעות למזון ולמים.
- כדי להכין כל עכבר עבור הפציעה CCI, לנהל את הזולפם (50 mg/ק"ג) ו xylazine (20 מ"ג/ק"ג) להרדמה קוקטייל באמצעות הזרקת הצפק (כיתה) (1 מ"ל/ק"ג). ודא כי עומק ההרדמה מספיק על ידי חוסר תגובה הבוהן. לחילופין, למקם את העכבר בתא המסופק עם 2% – 4% isofלפני 60 s.
- לגלח את הפרווה של המשטח הפנימי של הגולגולת בין האוזניים באמצעות קוצץ שיער אלקטרוני. לנקות את האזור מגולח מספר פעמים באמצעות ספוגית כותנה סטרילית ספוגה ביוד. השתמש בספוגית כותנה ספוגה 70% אתנול כדי לנקות את יוד.
- הנח את העכבר הכאוכי במסגרת הסטריאוטקטיקה ואבטח את העכבר באמצעות שורות האוזן ופסי האף. לעשות חתך midsagittal (כ 2.5 ס מ) בעור מגולח באמצעות מספריים סטרילי לגשת אל פני השטח של הגולגולת.
- להסיר את הרקמה על העצם באמצעות משטח כותנה כדי לחשוף את הגולגולת. נקה את משטח הגולגולת באמצעות ספוגית כותנה ספוגה 3% H2O2 עבור 10 s, ואז לנקות אותו עם פד כותנה יבש.
הערה: ניתן לזהות בקלות את התפרים של הגולגולת והן את הברגמה ואת למדא. - לזהות את הקואורדינטות של הבחירה על משטח הגולגולת עבור הפציעה CCI ולצייר מעגל (4 מ"מ קוטר) סביב קואורדינטות באמצעות עיפרון או סמן הנכון.
הערה: בפרוטוקול זה, נקודות הציון ב-anteeroposterior (AP)-2.0 מ"מ ו-mediolateral (ML) + 1.5 מ"מ שימשו האינדוקציה CCI. - השתמש מיקרוקדוח ובבר עגול (קוטר 0.5 מ"מ) כדי להדק את הגולגולת בעיגול המסומן. להימנע מהפעלת לחץ בזמן הקידוח, כמו קידוח דרך העצם עלול לגרום נזק המוח בתוך כימומה. ניקוי אבק העצם באמצעות ספוגית כותנה נקייה ויבשה.
- בעדינות להסיר את הכנף העצם באמצעות מלקחיים משובחים סטרילי לחשוף את מאטר דורא תוך שמירה על שלמות. הסר את העכבר ממסגרת הסטריאוטקטיקה ששימש להכנה לפני פציעה והציבו אותו במסגרת הסטריאוטקטיקה של התקן ה-CCI.
- ייצוב ראש העכבר באמצעות פסי האוזן ומוטות האף. ודא כי ראשו של העכבר הוא ברמה בכיוון rostral-caudal ולהתאים את הסורגים האף, במידת הצורך.
- בצע את ההוראות על תיבת הבקרה כדי לאפס את הקצה המעורר למשטח הקורטימתי החשוף. ודא כי הטיפ impactor שחקן מיושר ישירות מעל קואורדינטות הקליפה הרצויה כדי להיות מושפע באמצעות הגלגלים X ו-Y בבסיס של המדחף.
- הגדר את הפרמטרים הניסוי באמצעות תיבת הבקרה עם מהירות של 5 m/s, לשכון זמן של 250 ms, ועומק הפציעה של 1 מ"מ כדי לגרום לפציעה קלה בעכבר.
- לגרום לפציעה על ידי לחיצה על כפתור ' השפעה ' על תיבת הבקרה. לנגב כל דימום שמתרחש באמצעות ספוגית כותנה סטרילית.
- להסיר את העכבר מהמסגרת סטריאוטקטיקה ולסגור את החתך באמצעות תפרים כירורגי משי. אין להשתמש בקובצי מתכת כדי לסגור את האתר הכירורגי, כיוון שהעכבר יהיה נתון לשדה מגנטי ל-MRI.
- החלת אנטיביוטיקה אקטואלי (bacitracin neomycin) לאתר כירורגי כדי למנוע זיהומים. לשמור על העכבר על כרית החימום ולעקוב אותו היטב במהלך שלב ההחלמה.
- ניהול ketoprofen (2.5 מ"ג/ק"ג, IP) מדי יום עבור 3 ימים לאחר הניתוח, אלא אם כן הממשל ketoprofen סותר את מטרות המחקר.
3. משלוח Intranasal
- ביום 1 האינדוקציה post-CCI, לנהל את הזולפם (50 mg/ק"ג) ו xylazine (20 מ"ג/ק"ג) להרדמה קוקטייל דרך הזרקת כיתה. ודא שהעכבר מורדם עמוקות על-ידי חוסר בתגובה לצביטה בבוהן.
-
הכינו את העכבר למסירה intranasal של MSCs על ידי טיפול hyaluronidase.
- לתפוס את המוח של העכבר ולהדליק את גבו בחוזקה בזמן השתק את הגולגולת. מניחים את הקצה של פיפטה המכיל hyaluronidase ב-PBS סטרילי (4 U/μL) ליד הנחיר של העכבר בזווית 45 °.
- מנהל 3 μL של השעיה hyaluronidase בכל נחיר. לשמור על העכבר מוחלטת ופונה כלפי מעלה על משטח נקי עבור 5 דקות. חזור hyaluronidase טיפול 4x (סך של 100 U hyaluronidase השעיה).
- לאחר הטיפול hyaluronidase, לשמור על העכבר המטופל על משטח נקי פונה למעלה עבור 30 דקות.
- כדי להעביר את MSCs למוח, החזק את העכבר בחוזקה, כפי שמתואר בשלב 3.2.1. מנהל 3 μL/נחיר של MSC ההשעיה עם מרווח של 3 s. להמשיך להחזיק את העכבר באותו מיקום עבור 30 s עד טיפות המדגם נעלמו לחלוטין.
הערה: להימנע מיצירת בועות אוויר במהלך המינהל. - חזור על הניהול עם מרווח של 2 דקות עד 3x.
הערה: המספר הכולל של תאים להישלח הוא 150,000, כגון 18 μL של השעיית התא ניתן להעביר במינון 3 μL עבור כל נחיר, 3x כל אחד. - החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר אותו היטב עד שהוא מתאושש באופן מלא מן ההרדמה.
4. ב Vivo תהודה מגנטית הדמיה
הערה: כתמים היסטולוגית של רקמת המוח השתמשו בעבר כדי לאשר את המסירה מוצלחת של תאי גזע לאחר intranasal המינהל. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטה זו רק כנקודת קצה של מחקר, לא longitudinally. שימוש בבדיקות MRI כדי לתייג תאי גזע טיפולית יאפשר האורך, לא פולשני, במעקב vivo של התאים באמצעות MRI. וחשוב מכך, פרוטוקול זה מפחית ביעילות את מספר בעלי החיים הנדרשים. בפרוטוקול זה, סריקת MRI בוצעה בימים 1, 7, ו -14 לאחר המסירה של MSCs.
- כדי להכין את העכבר לסריקת MRI, מורדם העכבר עם isofלוריאן (5% isofלפני ב 1 L/מינימום של O2 עבור אינדוקציה, 1.5% – 2% isofלאנה עבור תחזוקה). לבצע קמצוץ הבוהן כדי להבטיח כי העכבר מגיע לרמת ההרדמה הנדרשת.
- הנח את העכבר על מחזיק ההדמיה ואבטח את מיקומו באמצעות הברזים או כל שיטה נכונה אחרת. להעביר את המחזיק למרכז סליל MRI (7 T/40 ס מ מגנט) ולחבר את החיבור ניטור.
- לרכישת סריקות *-משוקלל T2 באמצעות רצף הספין-הד, להגדיר את זמן החזרה (TR) כדי 1500 ms וזמן הד (TE) כדי 2.8 ms.
- שימוש 16 מ"מ x 16 מ"מ שדה של תצוגה (FOV), 128 x 128 מטריצה הרכישה (MTX), ואת עובי הפרוסה של 0.75 x 0.8 mm2 עם ארבעה ממוצעים אות ו זווית היפוך של 90 (FA).
- למשוך את מחזיק העכבר ממרכז סליל MRI לאחר השלמת סריקות. החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר אותו היטב עד שהוא מתאושש לחלוטין מן ההרדמה.
-
כדי לעקוב ולכמת את MSCs שכותרתו בתמונות *-משוקלל T2, השתמש בתוכנת ITK-SNAP (גירסה 3.8.0)7.
- העבר את הנתונים הגולמיים של סריקות ה-MRI מהמחשב של מחשב ה-MRI למחשב המשמש לניתוח בתבנית DICOM (הדמיה דיגיטלית ותקשורת ברפואה).
- הפעל את תוכנת ה-ITK-SNAP וטען את תמונות ה-MRI על-ידי לחיצה על לחצן הקובץ . לאחר מכן, לחצו על ' פתח תמונה ראשית ' בתפריט. לחצו על הלחצן ' פתח תמונה ' בחלון התצוגה ולאחר מכן אתרו ופתחו את תמונות ה-MRI בעזרת לחצן ' עיון '.
הערה: ההדמיה של תאים המסומנים בתמונות MRI יופיעו כאזורים מתוחים. אם יש לכוונן את הניגודיות של התמונה, בחר כלים | ' ניגוד תמונה'. - צור segmentations של אזורים היניקוד ונגע או חלקי מוח אחרים על ידי בחירת התווית הפעילה במקטע תוויות פילוח. השתמש בצבעי תוויות שונים עבור מקטעים שונים (אם יש צורך בפילוח של יותר מחלק אחד).
- השתמש בכלי מצולע בסרגל הכלים הראשי כדי לצייר סביב האזורים היפוינלים המייצגים את MSCs. בחר לקבל, הממוקם מתחת לתמונת ה-MRI. האזורים המקוטחים יופיעו כאותו צבע של התווית הפעילה שהוקצתה למקטע מסוים זה. חזור על שלב זה עבור כל פרוסות ה-MRI.
- לפתח מפת תלת-ממד של אזורים מקוטע כדי לייצג את התפלגות MSC במוח כולו על ידי בחירת כלי אזמל בתחתית סרגל הכלים תלת-ממד, הממוקם במקטע התוויות פילוח בחלק התחתון של theitk-הצמד ארגז הכלים. לאחר מכן, הקש על קבל בתחתית המפה התלת-ממדית שנוצרה.
- כדי לבצע ניתוח כמותי (ממוצע אמצעי האחסון והעוצמה) של האזורים האלה מקוטע המייצגים תאים, לחץ על לחצן פילוח בלוח העליון ובחר עוצמה וסטטיסטיקה.
5. קיבוע של מוח העכבר והקריוסידון
-
כדי לתקן את המוח העכבר, לבצע את הפרזיה עם 4% פאראפורמלדהיד (בלוח ההוא) בעקבות סריקת MRI האחרונה, כפי שתוארה בעבר8.
- לערוף את ראשו של הראש. ולחלץ את המוח ה-8 לתקן את המוח עם 4% בכיוון הג לפחות 48 h ב -4 ° c.
- מייבשים את המוח באמצעות המשך הפתרון לתוך 30% בתמיסה עד שהמוח שוקע בתחתית התמיסה.
- הטמע את המוח בתמיסה של טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) והקפא ב-20 ° c. מדור את המוח עם מיקרוסטטיסטיקה מיקרוטום לפרוסות עם עובי של 14 יקרומטר ולטעון אותם על שקופיות. אחסן את המקטעים בשקופיות ב- -20 ° c עד לשימוש נוסף.
6. פרוסי כחול מכתים
הערה: כתמים פרוסי משמש בדרך כלל כדי לזהות את תוכן הברזל בתאים המסומנים ב-SPIO. כאן, מכתים הכחול הפרוסי משמש כדי לאשר את האותות ההיפומיים בתמונות ה-MRI התואמים ל-SPIO שכותרתו MSCs ולא לחפצים. הכתמים הפרוסי כחול הוא אחד האמצעים הרגישים ביותר היסטכימיים המשמשים לזיהוי ברזל ברקמות ניתן להשתמש כדי לזהות אפילו גרגר אחד של ברזל בתאים.
- רוחצים את השקופיות של חתכי מוח במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- לבצע מכתים הכחול הפרוסי על ידי לאשר את השקופיות עבור 30 דקות בפתרון הצביעת, אשר מכיל חלקים שווים חומצה הידרוכלורית (10%) ואשלגן מגנטי (10%) וכן מיד לפני השימוש.
- לשטוף את 3x עם מים מזוקקים, עבור 5 דקות כל אחד. מנוגד את הסעיפים עם אדום במהירות גרעינית עבור 5 דקות. לשטוף את השקופיות 2x עם מים מזוקקים.
- הדהים את הסעיפים בהדרגה על-ידי הגבלת השקופיות ב 95% ו 100% אלכוהול עבור 2 דקות כל אחד. הוסף שמיכות עם מדיום הרכבה שרף.
- השתמש במיקרוסקופ אור כדי לזהות את התאים המוכתמים במקטעי המוח.
הערה: הברזל בתאים המסומנים בתווית יופיע כהפקדות בצבע כחול.
Representative Results
עשרים וארבע שעות לאחר המסירה intranasal, MSCs המסומנים SPIO זוהו כאזורים חזקים היפוינמטר המדיאלי לפגיעה בקליפת הגוף ב-T2 תמונות משוקלל (איור 2B), המציין את הגירה ממוקדת של spio לאתר הפציעה. הגירה זו נשארה גלויה עד 14 ימים לאחר המסירה, כמו אותות מתוח הפוינטיים נמצאו להיות גלויים ללא הפחתה משמעותית עבור תקופה זו (איור 2B). בעלי החיים הפצועים שטופלו PBS לא הראו אזורים היפרפוינמתוח, המציין כי האזורים הנצפים שנצפו הסביבה מתאימים SPIO המסומן MSCs ולא כדי לאותת ממצאים (איור 2A) ההתפלגות של MSCs המסומנים שנצפו בvivo עם MRI היה דמיינו באמצעות שחזור תלת-ממד (איור 2ג, ד). הגירה של MSCs לקליפת הפצע אושרה באופן היסטולוגית על ידי כתמים כחולים פרוסי ו-FITC איתור ערוץ הזיהוי של FITC-tagged SPIO ב MSCs התווית (איור 3A, B).
איור 1: תרשים זרימה סכימטי של הפרוטוקול ובאישור מחוץ למבחנה של ספיגת SPIO על ידי MSCs. (A) MSCS היו מודבטים עם spio עבור 24 שעות עבור תיוג. לאחר מכן, MSCs המסומנים בתווית הועברו למודל עכבר TBI באמצעות נתיב intranasal (IN). MRI בנקודות זמן שונות בוצע כדי לעקוב אחר MSCs בתווית. אישור של תיוג מספיק של MSCs על ידי spio הושגה על ידי (ב) מיקרוסקופ פלואורסצנטית ו (ג) מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות ערוץ fitc, מאז חלקיקי spio היו מתויגים עם fitc. (ד) הגלולה הסלולרית של הMSCs המסומנת בתווית הופיעה כהה בצבע עקב טעינת ברזל. כיצד לעשות זאת; SPIO = חלקיקים מגנטיים של תחמוצת ברזל; MSCs = תאי גזע מסנמצ'אל; MRI = דימות תהודה מגנטית; ב = intranasal; TBI = פציעה מוחית טראומטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ה-MRI בזמן אמת מאפשר איתור ומעקב אחר הגירה של העברת מע באמצעות SPIO לעבר אתרי פציעה במוחם של עכברים המושרה על ידי. (א) עכברים היו חשופים tbi, ואחריו טיפול עם PBS או spio-מתויג MSCs, מנוהל באמצעות intranasal מסלול 24 שעות לאחר הפציעה. קטעים coronal של התמונות משוקלל *-משוקללים הראו את MSCs מתויג כאזור היפוינמתוח (ראש חץ) בקצה של אתר הפציעה (אזור המתואר) ב 1, 7, ו 14 ימים שלאחר המסירה. העכברים שטופלו ב-PBS. לא מראים אזור מתוח (ב) פילוח תהליך של אזור אתר הפציעה (ירוק) ומתויג MSCs (אדום) על בסיס תמונות מבוססות-MRI של ילתית T2. (ג) שחזור תלת מימד של הטיפול במוח העכבר על בסיס תמונות משוקללים של T2 הממחישות את ההתפלגות של ה-spio המסומנת ב-MSCs במוח 14 ימים לאחר המסירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח היסטולוגית מאשר את הנוכחות של SPIO מתויג MSCs במוחם של בעלי חיים שטופלו. כתמים פרוסי כחול של קטעים המוח של (a) עכבר שטופלו ב-PBS (שליטה) ו (ג) עכבר שטופלו עם התווית Spio-חיוביים MSCs. spio-חיובית זוהו בעכבר מטופל MSC (תאים, כחול), בעוד עכבר הבקרה מראה לא תאים חיוביים באתר הפציעה בקליפת המוח 14 ימים לאחר המסירה ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של קליפת (ב) העכבר השליטה שטופלו עם PBS ו (ד) עכבר שטופלו Spio מתויג MSCs נערך 14 ימים לאחר המסירה. הניתוח חשף את הנוכחות של FITC מתויג תאים SPIO-חיוביים (מסגרת תאים, ירוק) בקליפת הפצע בעכבר מטופלים MSC, אבל אותות FITC לא נצפו בקליפת העכבר מטופלים PBS. קנה מידה של סרגלים = 50 μm, אלא אם צוין אחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מייצג הליכים כלליים עבור תיוג SPIO של מעקב MSCs ו-MRI של מסירת משלוח MSCs post-intranasal מתויג של SPIO. הפרוטוקול מאפשר הזדמנות ללמוד את הגירה ואת biodistribution של MSCs post-משלוח ב vivo במוח, באמצעות שיטה לא פולשנית.
MSCs הם מועמדים אטרקטיביים עבור מבוססי תאי גזע טיפולים עבור הפרעות המוח ופציעות בשל יכולתם להפריש הזנה גורמים 1) ההדק neurorestorative תהליכים ו 2) לספק הגנה עצבית, בשל השפעות אנטי דלקתיות שלהם בתוך אזור הפציעה9,10,11,12. למרות מעקב לטווח ארוך MRI ואיתור של SPIO התווית MSCs עשוי להיות מוגבל עקב הדילול של SPIO הסלולר עם חלוקת התא, התאים המסומנים ניתן להבחין עד מספר שבועות לאחר ההשתלה במוחות של מודלים בעלי חיים13.
מתואר גם כאן הוא פרוטוקול תיוג של MSCs עם חלקיקי SPIO מצופה באמצעות דקטרן ללא סוכני החצייה. פרוטוקולים אחרים שימשו בספרות14,15,16. עם זאת, בכל המקרים, פרוטוקולים אלה יש להתאים עבור סוג תא, גודל SPIO, זמן דגירה, ו SPIO ריכוז. MSCs הוכחו כונדרוגניים בידול פוטנציאל אבל לא הבחנה אדיפוגניים על תיוג SPIO17. לכן, מומלץ מאוד כי בידול להתבצע לפני המסירה תא גזע להעריך את ההשפעה של SPIO על העוצמה בידול של תאי גזע. במחקר הקודם, זה היה הוכיח כי התיוג MSC עם אותו סוג SPIO ו הריכוז בשימוש כאן לא השפיע על הMSCs האוסטגניים או adipogenic של שימוש6.
המסלול הintranasal של משלוח של תאי גזע טיפולית להפרעות במוח ופציעות הוא גישה מבטיחה ליישום הקליני של תאי גזע. עם זאת, המנגנונים הפנימיים והמולקולריים המכתיבים את התנהגותם של תאי גזע בחלל האף נותרים ברורים. למרות התוואי הintranasal הוא חקר נרחב לאספקת מולקולות קטנות, את הגודל ואת התנהגות biodistribution של הגזע הטיפולי שונים ממולקולות קטנות. הפרוטוקול הנוכחי ממחיש כי MSCs נוטים להגר לעבר אתר הפציעה לאחר intranasal מסירה.
כאן, תמונות משוקללים של T2 שימשו למעקב אחר הMSCs המסומנות ב-SPIO. דוחות אחרים השתמשו בהדמיית ההד של מעבר צבע. עם זאת, חפצי רגישות הם נצפו לעתים קרובות הדמיה הד הדרגתי בשל spio התרבות. בפרוטוקול הנוכחי, את המיקום של אזורים hypointense המייצגים את MSCs מתויג SPIO על התמונות T2 *-משוקלל היה זהה למיקום של SPIO בסעיפים המוח כפי שזוהו על ידי בדיקה היסטולוגית (איור 3). הדבר מציין את הרגישות הנאותה של הדמיה משוקללת הספין משוקלל של T2 עבור מעקב שכותרתו MSC במוח.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר מועיל עבור במחקרים vivo תאי גזע מעקב אחר פציעות והפרעות במוח. מעקב האורך של תאי גזע בvivo באופן מסורתי בוצעה על ידי הקרבת בעלי חיים בנקודות זמן מרובות. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה לא פולשנית ויעילה עבור משלוח MSCs ומעקב, אשר מייצג הליך פוטנציאלי עבור טיפול בתאי גזע עבור פציעות מוחי והפרעות בהגדרות הקליניות.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי משרד המדע והטכנולוגיה מענקים, טייוואן (רוב 104-2923-B-038-004-MY2, רוב 107-2314-B-038-063, ואת רוב 107-2314-B-038-042) ו האוניברסיטה הרפואית טייפה (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 ו DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
| Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
| Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
| Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
| Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
| ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
| Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
| TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |
References
- Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
- Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
- Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
- Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
- Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
- Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
- Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
- Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
- Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).
- Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
- Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).
