Summary
Dieses Protokoll dient zum unvoreingenommenen Nachweis von gewebeassoziierten Bakterien in Patientenbiopsien durch 16S rRNA in situ Hybridisierung und konfokale Mikroskopie.
Abstract
Die Visualisierung der Wechselwirkung von Bakterien mit Wirtsschleimhautoberflächen und Geweben kann wertvolle Einblicke in Mechanismen der Pathogenese liefern. Während die Visualisierung bakterieller Krankheitserreger in Tiermodellen von Infektionen auf Bakterienstämme nediert werden kann, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Proteine wie GFP auszudrücken, erfordert die Visualisierung von Bakterien innerhalb der Schleimhaut von Biopsien oder Gewebe, das von menschlichen Patienten gewonnen wird. eine unvoreingenommene Methode. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode zum Nachweis von gewebeassoziierten Bakterien in humanen Biopsieabschnitten. Diese Methode nutzt fluoreszierende In-situ-Hybridisierung (FISH) mit einer fluoreszierend gekennzeichneten universellen Oligonukleotidsonde für 16S rRNA, um gewebeassoziierte Bakterien in Blasenbiopsieabschnitten zu kennzeichnen, die von Patienten mit rezidivierendem Harnwegsinfektion. Durch den Einsatz einer universellen 16S rRNA-Sonde können Bakterien ohne Vorherige Kenntnis von Arten, Gattungen oder biochemischen Eigenschaften wie Lipopolysaccharid (LPS) nachgewiesen werden, die für den Nachweis durch Immunfluoreszenzexperimente erforderlich wären. Wir beschreiben ein komplettes Protokoll für 16S rRNA FISH von der Biopsiefixierung bis zur Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in fast jeder Art von Gewebe angepasst werden und stellt ein leistungsfähiges Werkzeug für die unvoreingenommene Visualisierung klinisch relevanter bakterieller-wirt-Wechselwirkungen im Patientengewebe dar. Darüber hinaus kann dieses Protokoll mit Arten oder gattungsspezifischen Sonden für den Nachweis spezifischer bakterieller Krankheitserreger im Patientengewebe angepasst werden.
Introduction
Die Harnwege, bestehend aus Harnröhre, Blase, Harnleiter und Nieren, werden ständig Bakterien ausgesetzt, die das Harnmikrobiom umfassen, sowie eindringenden Uropathogenen, wie uropathogener E. coli (UPEC), aus dem Magen-Darm-Trakt 1,2. Eine Schicht aus hydratisiertem Schleim, bestehend aus Glykosaminoglykinen und einer undurchlässigen Plaque aus glykosylierten Uroplakinproteinen, die auf der Oberfläche der oberflächlichen Zellen exprimiert werden, bilden eine Barriere, die das Blasenepithel routinemäßig vor einer Invasion durch Anhimat schützt. Bakterien3,4. Während der Harnwegsinfektion (UTI) werden diese Barrieren gestört oder zerstört, was die Anhaftung und Invasion des Blasenepithels durch uropathogene Bakterien5,6erleichtert. Die Arbeit in murinen Modellen hat gezeigt, dass viele uropathogene Bakterien wie UPEC, Klebsiella pneumoniaeund Enterococcus faecalis replizierende intrazelluläre Gemeinschaften (IBCs) innerhalb des Zytoplasmas von oberflächlichen Zellen bilden können und quiescent intrazelluläre Reservoirs (QIRs) innerhalb der Übergangsepithelzellen7,8,9. Obwohl UPEC innerhalb von Schuppenepithelzellen von menschlichen UTI-Patienten identifiziert wurde, war die Wechselwirkung von Uropathogenen mit der Blasenschleimhaut beim Menschen zuvor nicht visualisiert worden10.
Wir haben eine gemeinsame Technik, fluoreszenzinsituierte Hybridisierung (FISH), angepasst, um Bakterien in der Schleimhaut von Blasenbiopsien zu detektieren, die von postmenopausalen Patienten, die sich einer Zystoskopie unterziehen, mit Elektrofulguration von Trigonitis (CEFT) für die fortgeschrittenen Behandlung von antibiotika-refraktärem wiederkehrendem UTI11. Mit einer universellen Sonde für 16S rRNA konnten wir bakterielle Arten, die mit der Blasenschleimhaut von wiederkehrenden UTI-Patienten verbunden sind, objektiv erkennen und ihre Position innerhalb der Blasenwand12bestimmen. Die universelle 16S rRNA Nukleotidsonde wurde zuvor entwickelt, um eine konservierte Region der bakteriellen 16S rRNA13zu zielen, was den Positionen 388-355 der E. coli 16s rRNA entspricht. Die 16S rRNA- und Scramble-Sondensequenzen wurden zuvor validiert und für den Einsatz im Maus-Gastrointestinaltrakt14,15veröffentlicht. Die Sequenzen und Eigenschaften der Prüfpunkte sind in Tabelle 1beschrieben. Es ist wichtig, zwei sequenzielle Abschnitte in diesem Protokoll zu verwenden, einen für die 16S rRNA-Sonde und einen für die Rührsonde, um zwischen wahrem und Hintergrundsignal unterscheiden zu können, da das Blasenepithel, Kollagen und Elastin Autofluoreszenz 16 aufweisen. . In diesem Protokoll wurden die 16S rRNA- und Scramble-Sonden mit fluoreszierenden Alexa Fluor 488-Etiketten auf den 3' und 5' Termini über N-Hydroxysuccinimid (NHS) Ester-Verbindungen entwickelt, um das fluoreszierende Signal zu erhöhen.
Obwohl dieses Protokoll für den Einsatz auf menschlichen Blasenbiopsie-Abschnitten entwickelt wurde, kann es leicht für den Einsatz auf Paraffin-eingebetteten Abschnitten aus jedem Gewebe angepasst werden, in dem Bakterien vermutet werden. Im Gegensatz zu immunhistochemischen Experimenten, die auf spezifische Antigene (z. B. Lipopolysaccharid) auf der bakteriellen Oberfläche abzielen, erfordert diese Methode keine Vorkenntnisse über Antigene, die von den gewebeassoziierten Bakterien10,17 . Die Verwendung der universellen 16S rRNA-Sonde ermöglicht den unvoreingenommenen Nachweis aller Bakterienarten innerhalb der Probe, erlaubt aber keine Bestimmung ihrer Identität. Zur Bestimmung der Identifizierung von nachgewiesenen Bakterien müssen Arten oder Gattungsspezifische 16S- oder 23S-rRNA-Sonden verwendet werden. Dieses Protokoll wird auch keine Pilzpathogene, wie Candida albicans, mit Wirtsgewebe assoziiert. Zum Nachweis von Pilzerregern müssen 28S- oder 18S-rRNA-Sonden verwendet werden18.
Protocol
Das Studienprotokoll wurde von den Institutional Biosafety and Chemical Safety Committees des UT Dallas und des UT Southwestern Medical Center genehmigt und befolgt diese. Die Verwendung von Biopsien von menschlichen Probanden in diesem Protokoll wurde von den Institutional Review Boards der UT Dallas und des UT Southwestern Medical Center genehmigt und befolgt. Alle Personen, die an der Biopsiesammlung und -verarbeitung beteiligt sind, haben aktuellen Schutz für menschliche Personen (HSP) und HIPPA-Schulungen.
1. Gewebevorbereitung zur Fixierung und Paraffineinbettung
HINWEIS: Biopsien wurden von einwilligenden Frauen genommen, die sich einer Zystoskopie mit Elektro-Fulguration von Trigonitis für das fortgeschrittene Management einer wiederkehrenden Harnwegsinfektion (rUTI) unterziehen. rUTI ist definiert als 3 UTIs in einem Zeitraum von 12 Monaten. Die Biopsie-Sammlung wurde im Operationssaal durchgeführt, während der Patient unter Anästhesie war, nachdem er die informierte Patientenzustimmung gemäß UTSW IRB Protokoll STU 082010-016 erhalten hatte. Alle Proben wurden vor dem Experimentieren kodiert und deidentifiziert.
- Über flexibles Zystoskop eine Kaltbecher-Biopsie (ca. 1 mm3) aus der Blase Trigon mit urologischer Zange erhalten und sofort in ein steriles 2 ml Kryovial mit 1,5 ml 4% v/v Paraformaldehyd (PFA) in 1x steriler Phosphatgepufferte Kochstofflösung aufstellen (PBS).
HINWEIS: 4% PFA in 1x PBS können im Voraus hergestellt und bei -20 °C gelagert werden, bis es benötigt wird. - Biopsie für 6 h bei Raumtemperatur oder für 16-24 h bei 4 °C fixieren.
HINWEIS: Die Fixierungsdauer sollte auf der Grundlage der Größe der Gewebeprobe berechnet und eine Überfixierung vermieden werden. Es wird nicht empfohlen, Glutaraldehyd als Fixierung zu verwenden, da es Autofluoreszenz einführt. - In einem sterilisierten Kapuzen- oder Biosicherheitsschrank fixieren Sie fixativ durch Pipettieren und ersetzen Sie sie durch 1,5 ml steriles 1x PBS. Halten Sie die Proben über Nacht bei 4 °C oder führen Sie sofort Gewebeverarbeitung und Paraffineinbettung19durch.
- Verwenden Sie ein sterilisiertes Mikrotome, um Gewebeblöcke mit einer Dicke von 5 m zu schneiden und Paraffingewebeabschnitte an geladenen Glasmikroskop-Dias zu kleben. Für das 16S rRNA FISH-Protokoll sind mindestens zwei Dias pro Biopsie erforderlich.
HINWEIS: Das Biopsiegewebe sollte relativ zur Schnittebene querschnittsweise angeordnet sein, um die Visualisierung von Urothelschichten in allen Abschnitten zu gewährleisten. Es sollte auch beachtet werden, dass die Schnittdicke für den Nachweis der bakteriellen Gemeinschaft optimiert werden sollte. Bei Infektionen, bei denen geweberesidente Bakterien extrem knapp sind (z. B. <1 geweberesidentes Bakterium pro 1.000 Säugetierzellen), können dünnere Abschnitte oder Probenahmen mehrerer serieller Abschnitte erforderlich sein.
2. Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung mit Universal 16S rRNA-Sonden
HINWEIS: Pro Biopsie sind zwei Dias erforderlich. Für die universelle 16S rRNA-Sonde wird ein Dia und für eine Steuersonde mit einer Rührsequenz ein Schlitten benötigt. Dies ist wichtig, um das wahre Signal während der Mikroskopie vom Hintergrundsignal zu unterscheiden, da das Blasenepithel in mehreren Kanälen autofluoreszierend ist. Zusätzlich zur Scramble-Sonde kann die Blockierung mit 0,1% Sudan Black B vor der Montage die Hintergrundautofluoreszenz reduzieren, die dem Gewebe inhärent ist20.
- Herstellung von Reagenzien und Dunstabzugshaube
- Reinigen Sie eine leere Dunstabzugshaube (oder einen entsprechend ausgestatteten Biosicherheitsschrank) mit 70 % Ethanol.
- Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer bestehend aus 0,9 M Natriumchlorid (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in 10 ml sterilgefiltertem Wasser vor.
HINWEIS: Sterilgefiltertes Wasser kann durch das Übergeben von autoklaviertem destilliertem Wasser durch einen 0,22 M-Filter hergestellt werden. Der Hybridisierungspuffer kann bei Raumtemperatur gespeichert werden, aber das SDS kann aus der Lösung ausfallen. Wenn SDS ausscheidt, erwärmen Sie die Lösung vor der Anwendung in einem 50 °C-Wasserbad. - Bereiten Sie mindestens 100 ml mit je 95 % und 90 % Ethanol in sterilgefiltertem Wasser in gewaschenen, autoklavierten Flaschen vor.
- Fluoreszenz markierte lyophilisierte Sonden in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer (TE) in filtersterilisiertem Nuklease-freiem Wasser aufeine Endkonzentration von 100 m auflösen. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1 M im TE-Puffer für die Verwendung in diesem Protokoll vor. Lagern Sie sowohl 100 M konzentrierte Sonden als auch rekonstituierte Sonden mit 1 m M bei -20 °C, die vor Licht geschützt sind.
HINWEIS: Lösen Sie fluoreszierend markierte Sonden nicht in Wasser auf. Eine Pufferung ist erforderlich, um eine Hydrolyse der NHS-Esterbindung zu verhindern, die das Fluorophor mit der Nukleotidsonde konjugiert. - Fünf Coplin-Gläser mit 70 % Ethanol reinigen, trocknen lassen, wie folgt etikettieren: Xylole I, Xylole II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, und mit 100 ml der entsprechenden Lösung füllen. Dies wird dazu beitragen, Verwechslungen in späteren Schritten zu vermeiden.
- Gewebedeparaffinierung und Rehydratation
- Legen Sie in die Kapuze zwei Dias pro Biopsie in ein vertikales Schiebeträger.
- Legen Sie ein vertikales Schiebegestell 10 min in das Xyloli I Coplin Glas (mit 100 ml Xylol) ein.
- Entfernen Sie das Schielenvon von xyloles I und bersten Sie den Boden auf ein Papiertuch, um überschüssige Xylole zu entfernen. 10 min in das Xylolii Coplin Glas geben.
HINWEIS: Arbeiten Sie niemals mit Xylolen außerhalb einer zertifizierten Dunstabzugshaube. - Rehydratierung deparaffinierter Gewebeabschnitte in aufeinanderfolgenden Ethanol-Washes (95% und 90%) jeweils 10 min in den jeweils beschrifteten Coplin-Gläsern.
HINWEIS: In dieser Phase wird der warme Hybridisierungspuffer auf 50-56 °C in einem - Entfernen Sie das Schielengestell von der 90% Ethanolwäsche, bloten Sie den Boden auf Papiertücher, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und legen Sie es in das ddH2O Coplin Glas mit 100 ml filtersterilisiertem ddH2O für 10 min.
- Während Des Wartens auf die ddH2O-Wäsche die Sonden im Hybridisierungspuffer auf 10 nM verdünnen, um die Färbelösung zu erstellen. Bereiten Sie 150 l Färbungslösung pro Schlitten vor.
HINWEIS: Schützen Sie die Färbelösung vor Licht, indem Sie die Rohre in Aluminiumfolie wickeln und in einer Schublade lagern. Wenn Sie mit fluoreszierend beschrifteten Sonden auf der Tischplatte arbeiten, sollten Sie die Oberlichter ausschalten, wenn sie in der Lage sind. Im Hybridisierungspuffer verdünnte Sonden sollten nicht wiederverwendet werden.
- Hybridisierung und Gegenfärbung
- Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer für jede Sonde vor, indem Sie getränktes, zerknittertes Kimwipe und steriles Wasser in das Reservoir einer P1000-Spitzenbox legen. Platzieren Sie die Spitzenhalterpatrone oben - hier sitzen die Dias.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine Befeuchtungskammer zu verwenden, um zu verhindern, dass die Biopsieabschnitte während der Hybridisierung austrocknen. Es sei darauf hingewiesen, dass handelsübliche Luftbefeuchterkammern so konzipiert sind, dass sie eine stabile, feuchte Atmosphäre erhalten. Die hier beschriebene Technik steuert jedoch die Luftfeuchtigkeit ausreichend zu wesentlich geringeren Kosten. - Entfernen Sie die Dias aus dem Schiebeträger und legen Sie sie auf ein frisches Papiertuch (Gewebeseite nach oben). Verwenden Sie einen Kimwipe, um die Folie zu trocknen. Achten Sie darauf, nur sanft in der Nähe (nicht auf) der Biopsie Abschnitt zu taufen, um Wasser abzuleiten. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rahmen um den Biopsiebereich und legen Sie das Diagewebe in die Befeuchtungskammer.
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, damit das Gewebe vor der Hybridisierung nicht austrocknet. - Legen Sie die Befeuchtungskammer in einen Brutkasten, der auf 50 °C eingestellt ist. Pipette 50-150 l der Färbelösung direkt auf dem Gewebe, so dass das Rechteck, das durch die hydrophobe Grenze um das Gewebe gemacht wird, gefüllt wird. Achten Sie darauf, nicht zu viel Lösung hinzuzufügen, um die hydrophobe Grenze zu überlaufen. Schließen Sie den Kasten vorsichtig.
- Über Nacht bei 50 °C im Dunkeln inkubieren. Wenn der Inkubator ein Fenster hat, bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie, um eine dunkle Umgebung zu schaffen.
HINWEIS: Für ein zuverlässiges Signal ist eine Hybridisierungstemperatur unterhalb der Schmelztemperatur der FISH-Sonde erforderlich. 50 °C ist die optimale Temperatur für die universelle 16S rRNA Sonde, ist aber möglicherweise nicht optimal für andere Sonden. - Am nächsten Morgen mindestens 500 ml Waschpuffer aus 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) in ddH2O zubereiten und mit einem Vakuumflaschen-Top-Filter in eine sterile Flasche filtern. Im Wasserbad auf 50-56 °C erwärmen.
- Entfernen Sie die Dias aus den Befeuchtungskammern und leiten Sie alle verbleibenden Hybridisierungslösungen mit einem Kimwipe vorsichtig ab. Legen Sie die Dias in ein vertikales Färbegestell.
- Legen Sie das Färbegestell in ein undurchsichtiges Coplin-Glas, das 100 ml vorgewärmter Waschpuffer enthält. Wenn die Coplin-Gläser nicht undurchsichtig sind (z.B. Glas), legen Sie sie während der Inkubationsschritte ins Dunkel – vielleicht unter einer Schachtel oder in einer Schublade.
- Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal mit frischem Waschpuffer in neuen Coplin-Gläsern.
- Bereiten Sie während der Waschschritte den Gegenfleck vor, indem Sie eine 100 g/ml-Lagerlösung von Hoechst 33342 1:1.000 im Waschpuffer verdünnen. Fügen Sie Alexa-555 Weizenkeim agglutinin (WGA) in eine Endkonzentration von 5 g/ml und Alexa-555 Phalloidin zu einer Endkonzentration von 33 nM hinzu. Im Dunkeln lagern, bis es einsatzbereit ist.
HINWEIS: Hoechst, Alexa-555 WGA und Alexa-555 Phalloidin Label DNA, Mucin/Uroplakins bzw. Actin, bzw. können langfristig im Dunkeln gemäß den Anweisungen des Herstellers gespeichert werden. Fluoreszierende Etiketten, die für Sonden und Gegenflecken verwendet werden, können für die Filtersätze angepasst werden, die für das zu verwendende Mikroskop zur Verfügung stehen. - Entfernen Sie die Dias von der letzten Wäsche und leiten Sie überschüssigen Waschpuffer vorsichtig mit einem Kimwipe ab. Legen Sie die Dias Gewebeseite auf ein Papiertuch und fügen Sie 50-150 L Gegenfleck direkt auf das Gewebe, so dass die hydrophobe Grenze gefüllt wird, aber nicht überlaufen. Bis zu vier Dias mit einem Kryobox-Top bedecken und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Seiten wieder in den Färbegestell und waschen Sie zweimal mehr in Coplin Gläser mit frischem Waschpuffer, für jeweils 10 min.
- Trocknen Sie die Dias nach dem letzten Waschen gründlich und legen Sie das Gewebe auf ein Papiertuch unter einem Kryobox-Top. Drücken Sie einen Tropfen Montagemedien direkt auf das Gewebe. Legen Sie vorsichtig einen entsprechend großen Deckel (hängt von der Biopsiegröße ab) oben drauf. Drücken Sie vorsichtig alle Blasen heraus, da sie die Bildgebung stören und die verdeckten Dias über Nacht im Dunkeln aushärten lassen.
- Versiegeln Sie am nächsten Tag die Ränder des Deckels mit einem leichten Mantel aus klarem Nagellack an der Rutsche. 10 min im Dunkeln trocknen lassen und dann im Dunkeln bei 4 °C für die konfokale Mikroskopie aufbewahren.
- Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer für jede Sonde vor, indem Sie getränktes, zerknittertes Kimwipe und steriles Wasser in das Reservoir einer P1000-Spitzenbox legen. Platzieren Sie die Spitzenhalterpatrone oben - hier sitzen die Dias.
3. Visualisierung von 16S rRNA FISH durch Konfokalmikroskopie
HINWEIS: Für dieses Protokoll werden beste Ergebnisse mit einem laserscannenden Konfokalmikroskop mit 63x und 100x Objektiven erzielt. Für die Visualisierung von Hoechst, Alexa-488 und Alexa-555 fluoreszenz sind geeignete Filtersätze erforderlich. Eine Standard-Fluoreszenzmikroskopie kann jedoch verwendet werden, wenn ein konfokales Mikroskop nicht verfügbar ist. Dieses Protokoll ist für ein laserscannendes konfokales Mikroskop.
- Schalten Sie das konfokale Mikroskop und die Computersoftware ein, die dem Mikroskop gemäß herstellerspezifischen Anweisungen zugeordnet ist.
- Laden Sie die Folie und visualisieren Sie mit dem 10x Objektiv im blauen (DAPI/Hoechst) Kanal. Konzentrieren Sie sich sorgfältig, bis Kerne sichtbar sind.
- Sobald konzentriert, ändern Sie das Ziel auf hohe Vergrößerung (63x oder 100x). Öl auf den Deckelbeleg geben. Konzentrieren Sie sich mit dem neuen Ziel neu, um sicherzustellen, dass die Objektivlinse in Kontakt mit Öl kommt, während Sie sich fokussieren.
HINWEIS: Verwenden Sie nur feine Fokussierung bei hoher Vergrößerung (63x oder 100x). Öl sollte nur für ein Ölziel verwendet werden. - Bewerten Sie schnell jede Folie durch das Auge im grünen (eGFP/Alexa-488) Kanal, um zu bestimmen, welche Dias FISH-positiv und welche FISH-negativ sind.
HINWEIS: Es ist am besten, wenn diese erste Bewertung/Bewertung von einer separaten Person geblendet durchgeführt wird, um experimentelle Voreingenommenheit zu reduzieren. - Um die gebeizten Biopsien abzubilden, beginnen Sie mit einem FISH-Positivschlitten und wechseln Sie in den Computervisualisierungsmodus. Wählen Sie die Kanäle 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Stellen Sie das Loch mit dem längsten Wellenlängenkanal ein, in diesem Fall 555. Finden Sie die richtige Fokalebene für die Visualisierung von markierten Bakterien im 488-Kanal. Ohne die Fokusebene zu ändern, stellen Sie die Verstärkung, Laserleistung und den Offset für jeden Kanal so ein, dass das Signal nicht gesättigt ist und der Hintergrund nicht überkorrigiert wird. Erfassen Sie das Bild in allen drei Kanälen.
HINWEIS: Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für den 488-Kanal, um jede Folie in einem Experiment abzubilden. Die Laserleistung kann in den Kanälen 405 und 555 angepasst werden müssen, wenn sich die optimale Brennebene für die bakterielle Visualisierung zwischen den Feldern ändert. - Wiederholen Sie dies auf zusätzlichen Feldern, bis Bilder der gesamten Epitheloberfläche erhalten werden.
HINWEIS: Möglicherweise müssen Sie die Brennebene leicht ändern, um markierte Bakterien in verschiedenen Feldern zu visualisieren, aber niemals die Verstärkung, Laserleistung oder den Offset für den 488-Kanal zwischen feldern ändern. Wenn Sie an einem konfokalen Mikroskop arbeiten, kann es informativ sein, einen Z-Stack zu erfassen, so dass die dreidimensionale Lokalisation der Bakterien im Gewebe analysiert werden kann. - Verarbeiten Sie Bilder und quantifizieren Sie markierte Bakterien innerhalb oder mit dem Gewebe mit ImageJ oder ähnlicher Software verbunden. Es wird eine minimale Verarbeitung der Bilder empfohlen (z.B. Aufteilen/Zusammenführen von Kanälen und Konvertieren in Bilddateien), wobei bei Bedarf eine Hintergrundkorrektur durchgeführt werden kann. Alle Korrekturen oder andere Änderungen sollten zwischen den Bildern konsistent bleiben.
Representative Results
Das Protokoll wurde für den unvoreingenommenen Nachweis von Bakterien im Zusammenhang mit der Blasenschleimhaut in paraffin-eingebetteten Blasenbiopsieabschnitten optimiert. Abbildung 1 zeigt repräsentative konfokale Mikrographen aus einem Experiment mit diesem Protokoll an Abschnitten von Blasenbiopsien, die von Frauen mit wiederkehrenden Harnwegsinfektionen erhalten wurden. Zwei serielle Abschnitte wurden entweder mit den universellen 16S rRNA (obere Panels) oder Scramble (untere Panels) Sonden hybridisiert. Bilder aus der gleichen Region des Gewebes wurden aufgenommen und Bakterien (grün) sind im gewebe hybridisiert mit den 16S rRNA-Sonden und nicht mit der Rührsonde deutlich sichtbar. Abbildung 2 stellt ein falsch positives Ergebnis dar. Signal, das autofluoreszierendem Kollagen oder Elastin entspricht, wird in den 405- und 488-Kanälen sowohl in den 16S-rRNA- als auch in den scramble-sonts-hybridisierten Biopsieabschnitten nachgewiesen, was die Bedeutung einer immer mit einer Scramble-Sondensteuerung gemessenen.
| sonde | folge | Tm | Fluorophor | Bindung |
| Universal 16S rRNA | 5'-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3' |
54.9 | Alexa-488 (5' und 3') | NHS Ester |
| Durcheinander | 5'-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3' |
Na | Alexa-488 (5' und 3') | NHS Ester |
Tabelle 1: FISH-Sondensequenzen und -merkmale. Tm gibt Schmelztemperatur an und NHS ist eine Abkürzung für N-Hydroxysuccinimid.
Abbildung 1: Repräsentative konfokale Mikrographien von FISH von universeller 16S rRNA und Rührsonde in einer menschlichen Blasenbiopsie. Actin und Mucin sind rot, Zellkerne sind blau und Bakterien grün gekennzeichnet. Gewebeassoziierte Bakterien werden nur mit der 16SrRNA-Sonde und nicht mit dem Rührei nachgewiesen. Bilder mit 63-facher Vergrößerung. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative konfokale Mikrographien falsch-positiver grüner Autofluoreszenz in einer menschlichen Blasenbiopsie. Actin und Mucin sind rot gekennzeichnet, zelluläre Kerne sind blau gekennzeichnet und Bakterien und autofluoreszierende Komponenten der extrazellulären Matrix (z. B. Kollagen und Elastin) sind grün. Grüne Fluoreszenz wird sowohl mit den 16S rRNA- als auch mit den Scramble-Sonden beobachtet, die auf ein falsch-positives Ergebnis hinweisen. Die Bilder werden mit 63-facher Vergrößerung aufgenommen. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis von gewebeassoziierten Bakterien in humanen Blasenbiopsien durch 16S rRNA FlSH. Dieses Protokoll kann leicht für Biopsien aus anderen Geweben, wie dem Magen-Darm-Trakt oder der Haut, angepasst werden und kann auf Gewebe ausgedehnt werden, die von einer Vielzahl von Säugetiermodellorganismen geerntet werden. Das hier beschriebene Protokoll kann auch für die Verwendung von Mehrfachfixierung (z. B. Formalin, Ethanol, Methacarn) und Gewebevorbereitungstechniken (z. B. Paraffin oder Harz eingebettet und kryokonserviertes Gewebe) angepasst werden. Die doppelmarkierte universelle 16S rRNA-Sonde ermöglicht den unvoreingenommenen Nachweis aller bakterienarten im Gewebe und kann wertvolle Einblicke in die räumliche Interaktion von Krankheitserregern und Mikrobiota mit Schleimhautoberflächen bei Krankheiten und gesunden Staaten. Mit Ressourcen wie probeBase, PhylOPDb oder dem PROBE_DESIGN-Tool des ARB-Softwarepakets zur Auswahl oder Gestaltung von Arten oder generaspezifischen 16S- oder 23S-rRNA-Sonden kann dieses Protokoll für den Nachweis bestimmter Bakterienarten oder Gattungen angepasst werden. gewebe15,21,22. Eine wichtige zukünftige Richtung für diese Methode ist das Multiplexen mit arten- oder gattungsspezifischen Sonden, die mit unterschiedlichen, diskreten Fluorophoren gekennzeichnet sind, um die mikrobielle Vielfalt innerhalb der Blasenschleimhaut zu bewerten.
Die primäre Einschränkung dieser Methode für den Einsatz bei menschlichen Proben ist die Verfügbarkeit von biopsied Gewebe. Die Zustimmung des Institutional Review Board und die Zustimmung der informierten Patienten sind erforderlich, um Biopsien zu erhalten, und eine direkte Zusammenarbeit mit dem Arzt, der das Verfahren durchführt, ist für eine optimale Probenentnahme und den Zugriff auf Patientenmetadaten erforderlich. Das CEFT-Verfahren selbst zerstört das Blasenepithel, so dass wir die Biopsie dieser Bereiche vor dem Eingriff rechtfertigen konnten. Für dieses Protokoll ist aufgrund der Verwendung von toxischen Xylolen im Deparaffinisierungsschritt und der Notwendigkeit, während des gesamten Verfahrens eine sterile Umgebung zu erhalten, eine Rauchhaube oder ein entsprechend ausgestatteter Biosicherheitsschrank erforderlich. Für dieses Protokoll ist ein fluoreszierendes Mikroskop, vorzugsweise konfokale, mit einem 63-fachen oder 100-fachen Objektiv und geeigneten Filtersätzen zur Visualisierung von Hoechst, Alexa-555 und Alexa-488 erforderlich. Die in Abbildung 1 dargestellten repräsentativen Ergebnisse wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop abgebildet. Ähnliche Laserscanmikroskope sollten vergleichbare Bilder erzeugen. Dieses Protokoll ist durch seine Fähigkeit eingeschränkt, nur gewebeassoziierte Bakterien und nicht beispielsweise Pilze zu erkennen. Sonden spezifisch die Pilz 18S oder 28S rRNA muss verwendet werden, um Pilzpathogene in Gewebe18zu identifizieren.
Zu den kritischen Schritten zu diesem Protokoll gehören die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung während des gesamten Verfahrens und die Sicherstellung, dass das Gewebe nicht zwischen Hybridisierungs- und Färbeschritten austrocknet. Wenn das Gewebe während des Eingriffs austrocknet, kann das Signal gedämpft werden oder das Gewebe kann während eines Waschschritts vom Schlitten fallen. Es ist auch wichtig, immer zwei serielle Abschnitte für dieses Protokoll zu verwenden – einen für die 16S rRNA-Sonde und einen für die Scramble-Sonde. Ohne diese Kontrolle kann es sehr schwierig sein, falsch positive Ergebnisse zu unterscheiden, und die erhaltenen Daten können nicht nützlich oder informativ sein. Wenn dieses Protokoll für die Verwendung mit einer anderen Sonde als der universellen 16S rRNA-Sonde angepasst wird, ist darauf zu achten, dass eine geeignete Hybridisierungstemperatur ausgewählt wird, die etwa 5 °C unter der vorhergesagten Schmelztemperatur der Sonde liegt. Um die Signalintensität aufrechtzuerhalten, darf das Gewebe nach dem Zubau der Sonde nicht über einen längeren Zeitraum dem Licht ausgesetzt und während der Mikroskopie nicht überbelichtet werden. Schließlich müssen während der Mikroskopie die gleichen Einstellungen für den Kanal, der dem fluorophorkonjugierten Fluorophor entspricht, der der FISH-Sonde konjugiert ist, zwischen den experimentellen (16S rRNA-Sonde) und den Kontroll-Dias (Scramble-Sonde) konsistent gehalten werden. Die Visualisierung der räumlichen Beziehung von Bakterien innerhalb von Schleimhautoberflächen von Patientengeweben ist entscheidend für das Verständnis und den Aufbau klinisch relevanter Hypothesen über die wirt-pathogenen Wechselwirkungen, die einer Infektionskrankheit zugrunde liegen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Kim Orth und Marcela de Souza Santos für die Protokollberatung und Amanda Arute für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise vom Cecil H. und Ida Green Chair in Systems Biology Science von K.P. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
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