Summary
Denne protokollen er for upartisk påvisning av vev-assosiert bakterier i pasient biopsier ved 16S rRNA in situ hybridisering og konfokalmikroskopi mikroskopi.
Abstract
Visualisering av samspillet av bakterier med verten slimhinne overflater og vev kan gi verdifull innsikt i mekanismer for patogenesen. Mens visualisering av bakterielle patogener i dyremodeller av smitte kan stole på bakteriestammer konstruert for å uttrykke fluorescerende proteiner som GFP, visualisering av bakterier i slimhinnen i biopsier eller vev innhentet fra menneskelige pasienter krever en upartisk metode. Her beskriver vi en effektiv metode for påvisning av vev-assosiert bakterier i menneskelige biopsi seksjoner. Denne metoden benytter fluorescerende in situ hybridisering (FISH) med en fluorescensmerkete merket universell oligonukleotid sonde for 16S rRNA å merke vev-tilknyttede bakterier innen blære biopsi seksjoner ervervet fra pasienter som lider av tilbakevendende Urinveisinfeksjon. Gjennom bruk av en universell 16S rRNA sonde, kan bakterier oppdages uten tidligere kjennskap til arter, slekter, eller biokjemiske egenskaper, for eksempel lipopolysakkarid (LPS), som ville være nødvendig for påvisning av immunofluorescence eksperimenter. Vi beskriver en komplett protokoll for 16S rRNA FISH fra biopsi fiksering til avbildning av konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne protokollen kan tilpasses for bruk i nesten alle typer vev og representerer et kraftig verktøy for objektiv visualisering av klinisk relevante bakteriell-Host interaksjoner i pasientens vev. Videre, ved hjelp av arter eller slekter-spesifikke sonder, denne protokollen kan tilpasses for påvisning av bestemte bakterielle patogener i pasientens vev.
Introduction
Urinveiene, bestående av urinrøret, blære, urinlederne og nyrer er stadig eksponert for bakterier som utgjør urin mikrobiomet samt invaderende uropathogens, som uropathogenic E. coli (UPEC), fra mage-tarmkanalen 1,2. Et lag av hydrert mucus bestående av glykosaminoglykaner og en ugjennomtrengelig plakett av glykosylert uroplakin proteiner uttrykt på overflaten av overfladiske celler danner en barriere som rutinemessig beskytter blæren epitel fra invasjon av tilhenger bakterier3,4. Under urinveisinfeksjon (UTI), er disse barrierene forstyrret eller ødelagt, tilrettelegge vedlegg til og invasjon av blæren epitel av uropathogenic bakterier5,6. Arbeid i murine modeller har avdekket at mange uropathogenic bakterier, inkludert UPEC, klebsiella pneumoniae, og Enterococcus faecalis kan danne replicative intracellulære samfunn (IBC) innenfor cytoplasma av overfladiske celler og Quiescent intracellulære reservoarer (QIRs) innen overgangsordning epitelceller7,8,9. Selv om UPEC har blitt identifisert i skur epitelceller fra menneskelige UTI pasienter, samspillet av uropathogens med blæren mucosa hos mennesker hadde ikke vært tidligere visualisere10.
Vi tilpasset en felles teknikk, fluorescens in situ hybridisering (FISH), for å oppdage bakterier innenfor slimhinnen i blæren biopsier innhentet fra postmenopausale pasienter som gjennomgår cystoskopi med electrofulguration av trigonitis (CEFT) for den avanserte forvaltning av antibiotika-ildfaste tilbakevendende UTI11. Ved hjelp av en universell sonde for 16S rRNA, var vi i stand til å objektivt oppdage bakterielle arter knyttet til blæren mucosa av tilbakevendende UTI pasienter og bestemme deres posisjon i blæren veggen12. Den universelle 16S rRNA nukleotid sonden ble tidligere utviklet for å målrette en bevart region av bakteriell 16S rRNA13, som tilsvarer posisjoner 388-355 av E. coli 16S rRNA. Den 16S rRNA og scramble sonde sekvenser har tidligere blitt validert og publisert for bruk i musen mage-tarmkanalen14,15. Sekvensene og egenskapene til sonder er beskrevet i tabell 1. Det er viktig å bruke to sekvensielle seksjoner i denne protokollen, en for 16S rRNA sonde og en for scramble sonde, for å kunne skille mellom sann og bakgrunn signal som blæren epitel, kollagen og elastin utstillingen autofluorescence16 . I denne protokollen, 16S rRNA og scramble sonder ble utformet med fluorescerende Alexa fluor 488 etiketter på både 3 og 5 ' Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester sammenhengene for å øke fluorescerende signal.
Selv om denne protokollen ble utviklet for bruk på menneske blære biopsi seksjoner, det kan lett bli tilpasset for bruk på parafin-embedded seksjoner fra alle vev der bakterier antas å ligge. I motsetning til immunhistokjemi eksperimenter som mål bestemte antigener (f. eks lipopolysakkarid) på bakteriell overflate, denne metoden krever ingen forkunnskaper i antigener uttrykt av vevet-assosiert bakterier10,17 . Bruk av den universelle 16S rRNA sonden gjør det upartiske påvisning av alle bakterielle arter i utvalget, men tillater ikke fastsettelse av sin identitet. For å bestemme identifisering av oppdagede bakterier, arter eller slekten-spesifikke 16S eller 23S rRNA sonder må brukes. Denne protokollen vil heller ikke oppdage fungal patogener, som Candida albicans, assosiert med verts vev. For påvisning av sopp patogener, må 28S eller 18S rRNA-sonder brukes18.
Protocol
Studien protokollen ble godkjent av og fulgt retningslinjene for institusjonelle biosafety og kjemisk sikkerhet komiteer av UT Dallas og UT Southwestern Medical Center. Bruken av biopsier fra mennesker i denne protokollen ble godkjent av og fulgt retningslinjene for den institusjonelle Review Boards av UT Dallas og UT Southwestern Medical Center. Alle individer involvert med biopsi innsamling og bearbeiding ha aktuelle Human motiv sikringen (HSP) og HIPPA lærer opp.
1. vevs forberedelser for fiksering og para fin innebygging
Merk: Biopsier ble tatt fra samtykkende kvinner gjennomgår cystoskopi med elektro-fulguration av trigonitis for den avanserte forvaltningen av tilbakevendende urinveisinfeksjon (Rüti). Rüti er definert som 3 UVI i en 12-måneders periode. Biopsi samlingen ble utført i operasjonsstuen mens pasienten var under anestesi etter innhente informert pasientens samtykke per UTSW IRB protokollen STU 082010-016. Alle prøvene ble kodet og de-identifisert før eksperimentering.
- Skaff en kald kopp (~ 1 mm3) biopsi fra blæren trigone med Urologiske tang via fleksibel cystoscope og plasser umiddelbart i en steril 2 ml cryovial inneholdende 1,5 ml 4% v/v PARAFORMALDEHYDE (PFA) fremstilt i 1x sterilt fosfat bufret saltvann (PBS).
Merk: 4% PFA i 1x PBS kan gjøres på forhånd og oppbevares ved-20 ° c til det er nødvendig. - Fix biopsi for 6 t ved romtemperatur eller for 16-24 h ved 4 ° c.
Merk: Fiksering varighet bør beregnes basert på størrelsen på vevsprøven og over-fiksering bør unngås. Det er ikke anbefalt å bruke glutaraldehyde som en bindemiddel som det introduserer autofluorescence. - I en sterilisert hette eller biosafety skap, Fjern bindemiddel ved pipettering og Erstatt med 1,5 mL steril 1x PBS. Oppbevar prøvene ved 4 ° c over natten eller Utfør umiddelbart vevs behandling og para fin innebygging19.
- Bruk en sterilisert mikrotomen til § vev blokker på 5 μm tykkelse og overholde para fin vev seksjoner til ladet glass mikroskop lysbilder. Et minimum av to lysbilder per biopsi vil være nødvendig for 16S rRNA FISH protokollen.
Merk: Den biopsi vev bør krysse sectionally arrangert i forhold til skjæringsplanet for å sikre visualisering av urotelialt lag i alle seksjoner. Det bør også bemerkes at delen tykkelse bør optimaliseres for bakteriell samfunnet deteksjon. Tynnere seksjoner eller prøvetaking av flere serielle seksjoner kan være nødvendig i tilfelle av infeksjoner der vev-Resident bakterier er ekstremt knappe (f. eks < 1 vev-Resident bakterie per 1 000 pattedyrceller).
2. fluorescens in situ hybridisering med Universal 16S rRNA sonder
Merk: Det kreves to lysbilder per biopsi. Ett lysbilde er nødvendig for den universelle 16S rRNA-proben og ett lysbilde for en kontroll sonde med en forvrengt sekvens. Dette er viktig for å skille ekte signal fra bakgrunns signal under mikroskopi siden blæren epitel er Auto-fluorescerende i flere kanaler. I tillegg til den scramble sonde, blokkering med 0,1% Sudan Black B før montering kan redusere bakgrunnen autofluorescence som ligger i vevet20.
- Tilberedning av reagenser og avtrekksvifte
- Rengjør en tom avtrekks hette (eller riktig montert biosafety kabinett) med 70% etanol.
- Klargjør hybridisering buffer består av 0,9 M natriumklorid (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,1% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS) i 10 mL sterilt-filtrert vann.
Merk: Sterilt vann kan fremstilles ved å sende autoklaveres destillert vann gjennom et 0,22 μM-filter. Den hybridisering buffer kan lagres ved romtemperatur, men SDS kan utløse fra løsning. Hvis SDS precipitates, skal oppløsningen varmes opp i et vannbad på 50 ° c før bruk. - Forbered minst 100 mL hver av 95% og 90% etanol i steril-filtrert vann i vasket, autoklaveres flasker.
- Oppløse fluorescensmerkete merket lyofilisert sonder i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) buffer (TE) fremstilt i filter-sterilisert nuklease fritt vann til en endelig konsentrasjon på 100 μM. Klargjør en fortynning av 1 μM i TE-bufferen for bruk i denne protokollen. Oppbevar både 100 μM konsentrert lager og 1 μM lager rekonstituert sonder ved-20 ° c beskyttet mot lys.
Merk: Ikke oppløse fluorescensmerkete merket sonder i vann. Bufring er nødvendig for å hindre hydrolyse av NHS Ester bindingen bøye fluoroforen til nukleotid sonden. - Rengjør fem Coplin krukker med 70% etanol, la tørke, etikett som følger: xylenes I, xylenes II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, og fyll med 100 ml av den aktuelle løsningen. Dette vil bidra til å unngå forvirring i senere trinn.
- Vev de-paraffinization og rehydrering
- I panseret plasserer du to lysbilder per biopsi i en vertikal Slide rack.
- Plasser en vertikal Slide rack i xylenes jeg Coplin jar (som inneholder 100 mL xylenes) i 10 min.
- Fjern lysbilde stativet fra xylenes jeg og blot bunnen på et papir håndkle for å fjerne overflødig xylenes. Plasser i xylenes II Coplin jar for 10 min.
Merk: Arbeid aldri med xylenes utenfor en sertifisert avtrekks hette. - Rehydrate deparaffinized vev seksjoner i påfølgende etanol vasker (95% og 90%) for 10 min hver i henholdsvis merket Coplin krukker.
Merk: I løpet av dette stadiet, varm hybridisering buffer til 50-56 ° c i et vannbad - Fjern lysbilde stativet fra 90% etanol vask, blot bunnen på papirhåndklær for å fjerne overflødig etanol, og plasser i ddH2O Coplin krukke som inneholder 100 ml filter-sterilisert ddH2o i 10 min.
- Mens du venter på ddH2O vask, fortynne sonder til 10 nM i hybridisering buffer for å skape farging løsning. Klargjør 150 μL av farge oppløsning per lysbilde.
Merk: Beskytt farge løsningen mot lys ved å pakke rørene i aluminiumsfolie og lagre i en skuff. Når du arbeider med fluorescensmerkete merket sonder på stasjonære, bør du vurdere å slå av overhead lys når det er mulig. Sonder fortynnet i hybridisering buffer bør ikke brukes på nytt.
- Hybridisering og mot flekker
- Forbered et fukte kammer for hver sonde ved å plassere gjennomvåt, krøllete Kimwipe og sterilt vann til reservoaret av en P1000 spissen boksen. Plasser spissen holderen kassetten på toppen-det er her lysbildene vil sitte.
Merk: Det er viktig å bruke en fukte kammer for å hindre at biopsi seksjoner tørker ut under hybridisering. Det bør bemerkes at kommersielt tilgjengelige luftfukter kamre er utformet for å opprettholde en stabil, fuktig atmosfære. Men teknikken detaljerte her tilstrekkelig kontrollerer fuktighet til vesentlig mindre kostnader. - Fjern lysbildene fra lysbilde stativet og plasser på et nytt papir håndkle (vev-side opp). Bruk en Kimwipe for å tørke av lysbildet. Vær forsiktig med å bare forsiktig DAB nær (ikke på) biopsi delen for å transportere bort vann. Ved hjelp av en hydrofobe penn, tegne en kant rundt biopsi delen og plasser raset vev-side opp i fukte kammeret.
Merk: Arbeid raskt slik at vevet ikke tørker ut før hybridisering. - Plasser fukte kammeret i en inkubator satt til 50 ° c. Pipetter 50-150 μL av farge løsningen direkte på toppen av vevet slik at rektangelet laget av hydrofobe kant rundt vevet er fylt. Vær forsiktig med å ikke legge for mye løsning som å overflow hydrofobe grensen. Lukk boksen forsiktig.
- Ruge over natten (~ 16 h) ved 50 ° c i mørket. Hvis inkubator har et vindu, dekk det med aluminiumsfolie for å skape et mørkt miljø.
Merk: En hybridisering temperatur under Smeltetemperaturen til FISH-proben er nødvendig for pålitelig signal. 50 ° c er den optimale temperaturen for den universelle 16S rRNA-proben, men er kanskje ikke optimal for andre sonder. - Neste morgen, Forbered minst 500 mL vask buffer består av 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) i ddH2O og filter-sterilisere inn i en steril flaske med et vakuum flaske topp filter. Varm til 50-56 ° c i et vannbad.
- Fjern lysbildene fra fukte kamre og forsiktig isolere bort eventuelle gjenværende hybridisering løsning med en Kimwipe. Plasser lysbildene i et loddrett farge stativ.
- Plasser farge stativet i en ugjennomsiktig Coplin krukke som inneholder 100 mL pre-varmet vaskebuffer i 10 min. Hvis Coplin-glassene ikke er ugjennomsiktige (f.eks. glass), plasserer du dem i mørket under inkubasjons trinn – kanskje under en eske eller i en skuff.
- Gjenta vaske trinnet to ganger med ny Wash-buffer i nye Coplin-krukker.
- Under vaske trinnene, klargjør du mot flekken ved å fortynne en 100 μg/mL lagerløsning av Hoechst 33342 1:1000 i vaskebuffer. Til samme tube, Legg til Alexa-555 hvete bakterie agglutinin (WGA) til en endelig konsentrasjon av 5μg/mL og Alexa-555 Phalloidin til en endelig konsentrasjon på 33 nM. Oppbevares i mørket til de er klare til bruk.
Merk: Hoechst, Alexa-555 WGA, og Alexa-555 Phalloidin Label DNA, mucin/uroplakins, og utgangen, henholdsvis og kan lagres på lang sikt i mørket i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescerende etiketter som brukes til sonder og counterstains, kan tilpasses for de tilgjengelige filter settene for mikroskopet som skal brukes. - Fjern lysbildene fra siste vask og forsiktig isolere bort overflødig vaskebuffer med en Kimwipe. Plasser lysbilder vev-side opp på et papir håndkle og tilsett 50-150 μL av mot flekker direkte på toppen av vevet slik at hydrofobe grensen er fylt, men ikke overfylte. Dekk til fire sklier med en cryobox og ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
- Plasser sidene tilbake i farge stativet og vask to ganger mer i Coplin krukker med fersk vask buffer, for 10 min hver.
- Tørk av lysbildene etter siste vask og plasser vevs IDen opp på et papir håndkle under en cryobox-Top. Klem en dråpe montering Media direkte på toppen av vevet. Forsiktig plassere en passende størrelse dekkglass (vil avhenge av biopsi størrelse) på toppen. Trykk forsiktig ut noen bobler som de vil forstyrre bildebehandling og la dekselet-gled lysbilder å kurere over natten i mørket.
- Neste dag, forsegle kantene av dekkglass til lysbildet med et lett lag med klar neglelakk. La den tørke i 10 minutter i mørket og oppbevar den i mørket ved 4 ° c for konfokalmikroskopi mikroskopi.
- Forbered et fukte kammer for hver sonde ved å plassere gjennomvåt, krøllete Kimwipe og sterilt vann til reservoaret av en P1000 spissen boksen. Plasser spissen holderen kassetten på toppen-det er her lysbildene vil sitte.
3. visualisering av 16S rRNA FISH av Konfokalmikroskopi mikroskopi
Merk: For denne protokollen oppnås de beste resultatene med et laser-skanning konfokalmikroskopi mikroskop med 63x og 100-mål. Riktig filter sett for visualisering av Hoechst, Alexa-488, og Alexa-555 fluorescens er nødvendig. Standard fluorescerende mikroskopi kan imidlertid brukes hvis et konfokalmikroskopi mikroskop ikke er tilgjengelig. Denne protokollen er for en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop.
- Slå på det konfokalmikroskopi mikroskopet og datamaskinprogramvaren som er knyttet til mikroskopet, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Legg i lysbildet og Visualiser med 10x mål i den blå (DAPI/Hoechst) kanal. Fokuser nøye til kjerner er synlige.
- Når du har fokusert, endrer du målsettingen til høy forstørrelse (63x eller 100 ganger). Legg olje på toppen av dekselet slip. Fokuser på nytt med det nye målet, og sørg for at objektivlinsen kommer i kontakt med olje mens du fokuserer.
Merk: Bruk bare fin fokusering ved høy forstørrelse (63x eller 100 a). Oljen skal kun brukes til olje mål. - Raskt vurdere hvert lysbilde gjennom øyet-brikke i den grønne (eGFP/Alexa-488) kanal for å bestemme hvilke lysbilder er fisk positive og som er fisk negative.
Merk: Det er best om denne første vurderingen/scoring gjøres blindet av en egen person for å redusere eksperimentell bias. - Å avbilde det flekkete biopsier, starte med en FISKEN positiv skyve og skru av å computeren visualisering måte. Velg kanaler for 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Still inn pinhole ved hjelp av den lengste bølgelengde kanalen, i dette tilfellet 555. Finn riktig fokalplanet for visualisering av merket bakterier i 488 kanalen. Uten å endre fokalplanet, sette gevinsten, laser kraft, og offset for hver kanal slik at signalet ikke er mettet, og bakgrunnen er ikke over-korrigert. Skaff deg bildet i alle tre kanalene.
Merk: Bruk de samme innstillingene for 488-kanalen til å avbilde hvert lysbilde i et eksperiment. Laser strømmen kan kreve justering i 405-og 555-kanalene hvis det optimale fokalplanet for bakterie visualisering endres mellom felt. - Gjenta på flere felt til du har tatt bilder av hele epitel overflaten.
Merk: Du må kanskje endre fokalplanet litt for å visualisere merkede bakterier i forskjellige felt, men aldri endre forsterkningen, laser strømmen eller forskyvningen for 488-kanalen mellom felt. Hvis du arbeider på et konfokalmikroskopi mikroskop, kan det være informativ å fange en Z-stabel slik at den tredimensjonale lokalisering av bakterier i vevet kan analyseres. - Behandle bilder og kvantifisere merkede bakterier innenfor eller forbundet med vevet ved hjelp av ImageJ eller lignende programvare. Minimal bearbeiding av avbildningene er anbefalt (e.g., splitting/sammenslåing kanalene og omdanner i image fil-størrelse), til tross for miljøet rettelsen kanskje være utført dersom det er nødvendig. Alle rettelser eller andre endringer bør være konsekvente mellom bildene.
Representative Results
Protokollen er optimalisert for upartisk påvisning av bakterier knyttet til blæren mucosa i parafin-embedded blære biopsi seksjoner. Figur 1 skildrer representative konfokalmikroskopi micrographs fra et eksperiment som bruker denne protokollen på deler av blæren biopsier innhentet fra kvinner med tilbakevendende urinveisinfeksjon. To serielle seksjoner ble hybridisert med enten den universelle 16S rRNA (øvre paneler) eller scramble (nedre paneler) sonder. Bilder fra samme region av vevet ble tatt og bakterier (grønn) er godt synlig i vevet hybridisert med 16S rRNA sonder og ikke med scramble sonde. Figur 2 representerer et falskt positivt resultat. Signal tilsvarende autofluorescent kollagen eller elastin oppdages i 405 og 488 kanaler i både 16S rRNA og scramble sonde-hybridisert biopsi seksjoner fremhever viktigheten av alltid å bruke en scramble sonde kontroll.
| Sonde | Sekvens | Tm | Fluoroforen | Kobling |
| Universell 16S rRNA | 5 '-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3 ' |
54,9 | Alexa-488 (5 ' og 3 ') | NHS Ester |
| Scramble | 5 '-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3 ' |
Na | Alexa-488 (5 ' og 3 ') | NHS Ester |
Tabell 1: fiske sonde sekvenser og egenskaper. TM indikerer Smeltetemperatur og NHS er en forkortelse for N-hydroxysuccinimide.
Figur 1: representant konfokalmikroskopi micrographs av fisk av universell 16S rRNA og scramble sonde i en menneskelig blære biopsi. Utgangen og mucin er merket i rødt, cellulære kjerner er merket i blått, og bakterier i grønt. Vev-tilknyttede bakterier er bare oppdages med 16SrRNA sonden og ikke scramble. Bilder tatt på 63x forstørrelse. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative konfokalmikroskopi micrographs av falske positive grønne autofluorescence i en menneskelig blære biopsi. Utgangen og mucin er merket i rødt, cellulære kjerner er merket i blått, og bakterier og autofluorescent komponenter av ekstracellulære matrise (f. eks kollagen og elastin) er grønne. Grønn fluorescens er observert med både 16S rRNA og scramble sonder som indikerer et falskt positivt resultat. Bildene er tatt på 63x forstørrelse. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for påvisning av vev-assosiert bakterier i menneskelig blære biopsier av 16S rRNA FlSH. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for biopsier tatt fra andre vev, slik som mage-tarmkanalen eller hud, og kan utvides til vev høstes fra en rekke pattedyr modell organismer. Protokollen beskrevet her kan også tilpasses for bruk av flere fiksering (f. eks, formalin, etanol, methacarn) og vev forberedelse teknikker (f. eks, parafin eller harpiks innebygd, og embryo vev). Den doble-merket universell 16S rRNA sonde gjør det mulig for upartisk påvisning av alle bakterielle arter til stede innenfor vev og kan gi verdifull innsikt i hvordan patogener og bakterieflora romlig samhandle med slimhinne flater i sykdom og sunn Stater. Ved hjelp av ressurser som probeBase, PhylOPDb eller PROBE_DESIGN-verktøyet i ARB programvarepakke for valg eller design av arter eller slekter-spesifikke 16S-eller 23S rRNA-sonder, kan denne protokollen tilpasses for påvisning av bestemte bakterielle arter eller slekter innenfor vev15,21,22. En viktig fremtidig retning for denne metoden er multipleksing ved hjelp av arter-eller slekter-spesifikke sonder merket med ulike, diskrete fluorophores for evaluering av mikrobiell mangfold i blæren mucosa.
Den primære begrensningen av denne metoden for bruk på menneskelige eksemplarer er tilgjengeligheten av biopsied vev. Institusjonelle gjennomgang Board godkjenning og informert pasientens samtykke er pålagt å innhente biopsier og direkte samarbeid med legen utføre prosedyren er nødvendig for optimal prøvetaking samling og tilgang til pasientens metadata. Den CEFT prosedyren selv ødelegger blæren epitel så vi var i stand til å rettferdiggjøre biopsi av disse områdene før inngrepet. En avtrekksvifte eller passende montert biosafety kabinett er nødvendig for denne protokollen på grunn av bruk av giftige xylenes i deparaffinization trinn og behovet for å opprettholde et sterilt miljø gjennom hele prosedyren. Et fluorescerende mikroskop, fortrinnsvis konfokalmikroskopi, med en 63x eller en 100-målsetting og passende filter sett for visualisering av Hoechst, Alexa-555, og Alexa-488 er nødvendig for denne protokollen. Representative resultater avbildet i figur 1 ble avbildet ved hjelp av en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop. Lignende laserskanning mikroskop bør produsere sammenlignbare bilder. Denne protokollen er begrenset av dens evne til å bare oppdage vev-tilknyttede bakterier og ikke, for eksempel, sopp. Sonder spesifikke sopp 18S eller 28S rRNA må brukes til å identifisere fungal patogener innen vev18.
Kritiske skritt til denne protokollen inkluderer opprettholde et sterilt miljø gjennom hele prosedyren og sikre at vevet ikke tørker ut mellom hybridisering og flekker trinn. Hvis vevet tørker ut under prosedyren, kan signalet være fuktet eller vevet kan falle ut av raset under en vask trinn. Det er også viktig å alltid bruke to serielle seksjoner for denne protokollen-en for 16S rRNA sonde og en for scramble sonde. Uten denne kontrollen, kan det være svært vanskelig å skille falske positiver og data innhentet kan ikke være nyttig eller informativ. Hvis denne protokollen blir tilpasset for bruk med en annen sonde enn den universelle 16S rRNA-proben, må det utvises forsiktighet for å velge en passende hybridisering temperatur, ca. 5 ° c lavere enn den antatte Smeltetemperaturen til proben. For å opprettholde signal intensiteten må ikke vevet utsettes for lys over lengre tid etter at proben er tilsatt og må ikke overeksponert under mikroskopi. Til slutt, under mikroskopi de samme innstillingene for kanalen tilsvarer fluoroforen bøyd til FISH sonden må holdes konsistent mellom den eksperimentelle (16S rRNA sonde) og kontroll (scramble probe) lysbilder. Visualisere romlige forholdet mellom bakterier innenfor slimhinne overflater av pasient-avledet vev er avgjørende for å forstå og bygge klinisk relevante hypoteser om verten-patogen interaksjoner underliggende smittsomme sykdommer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Kim orth og Marcela de Souza Santos for protokollen råd og Amanda Arute for teknisk støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Cecil H. og Ida Green Chair i Systems Biology Science holdt av K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
