Summary
Cardiomyocyte proliferatie na letsel is een dynamisch proces dat een symfonie van extracellulaire signalen van niet-myocyte celpopulaties vereist. Met behulp van afstamming strekken, passieve helderheid, en drie-dimensionale whole-mount confocale microscopie technieken, kunnen we analyseren de invloed van een verscheidenheid van celtypes op cardiale reparatie en regeneratie.
Abstract
Hart- en vaatziekten overtreft alle andere doodsoorzaken en is verantwoordelijk voor maar liefst 31% van de sterfgevallen wereldwijd. Deze ziekte manifesteert zich bij hartletsel, voornamelijk in de vorm van een acuut hartinfarct. Met weinig veerkracht na letsel, zal het eens gezonde hartweefsel worden vervangen door vezelig, niet-contractiele littekenweefsel en vaak een prelude op hartfalen. Om nieuwe behandelingsopties in regeneratieve geneeskunde te identificeren, heeft het onderzoek zich gericht op gewervelde dieren met aangeboren regeneratieve mogelijkheden. Een dergelijk model organisme is de neonatale muis, die reageert op hartletsel met robuuste myocardiale regeneratie. Om een verwonding bij de neonatale muis te veroorzaken die klinisch relevant is, hebben we een operatie ontwikkeld om de linker voorste dalende slagader (LAD) te oconeren, waarbij een hartinfarct wordt weerspiegeld dat wordt veroorzaakt door atherosclerose in het menselijk hart. Wanneer gekoppeld aan de technologie om veranderingen bij te houden, zowel binnen cardiomyocyten als niet-myocytenpopulaties, biedt dit model ons een platform om de mechanismen te identificeren die hartregeneratie begeleiden. Het verkrijgen van inzicht in veranderingen in hartcelpopulaties na letsel eenkeer zwaar vertrouwd op methoden zoals weefselsectie en histologisch onderzoek, die beperkt zijn tot tweedimensionale analyse en vaak schade aan het weefsel in het proces. Bovendien missen deze methoden de mogelijkheid om veranderingen in cellijnen te traceren, in plaats daarvan bieden ze slechts een momentopname van de blessurerespons. Hier beschrijven we hoe technologisch geavanceerde methoden in lineage tracing modellen, hele orgaan clearing, en drie-dimensionale (3D) whole-mount microscopie kan worden gebruikt om mechanismen van cardiale reparatie op te helderen. Met ons protocol voor neonatale muis myocardiale infarct chirurgie, weefsel clearing, en 3D hele orgaan beeldvorming, de complexe trajecten die cardiomyocyte proliferatie induceren kan worden ontrafeld, onthullen nieuwe therapeutische doelen voor hartregeneratie.
Introduction
Het hart is al lang beschouwd als een post-mitotisch orgaan, maar recent bewijs toont aan dat cardiomyocyte vernieuwing optreedt in het volwassen menselijk hart op ongeveer 1% per jaar1. Echter, deze lage tarieven van cardiomyocyte omzet zijn onvoldoende om het enorme verlies van weefsel dat optreedt na letsel aan te vullen. Een hart dat heeft geleden een hartinfarct zal verliezen ongeveer een miljard cardiomyocyten, vaak dienen als een prelude op hartfalen en plotselinge hartdood2,3. Met meer dan 26 miljoen mensen getroffen door hartfalen wereldwijd, is er een onvervulde behoefte aan therapieën die de schade toegebracht door hart-en vaatziekten kan keren4.
Om deze kloof in de therapieën te overbruggen, zijn wetenschappers begonnen met het onderzoeken van evolutionair geconserveerde mechanismen die ten grondslag liggen aan endogene regeneratie na letsel. Een model voor het bestuderen van zoogdier hartregeneratie is de neonatale muis. Binnen de week na de geboorte hebben neonatale muizen een robuuste regeneratieve respons na hartschade5. We hebben eerder aangetoond dat neonatale muizen hun hart kunnen regenereren via cardiomyocyte proliferatie na een apicale resectie5. Hoewel deze techniek hartregeneratie in de neonaten kan oproepen, mist de operatie klinische relevantie voor menselijke hartletsels. Om een menselijk letsel in het neonatale muismodel na te bootsen, hebben we een techniek ontwikkeld om een hartinfarct te veroorzaken door middel van een coronaire slagader occlusie6. Deze techniek vereist chirurgische ligatie van de linker voorste dalende slagader (LAD), die verantwoordelijk is voor het leveren van 40%-50% van het bloed aan de linker ventriculaire myocardium6,7. Zo resulteert de operatie in een infarct dat een aanzienlijk deel van de linker ventriculaire wand beïnvloedt. Deze schade aan het myocardium zal cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie bij neonaten stimuleren5.
De coronaire oclusie chirurgie biedt een zeer reproduceerbare en direct translationele methode om de innerlijke werking van hartregeneratie te ontdekken. De neonatale chirurgie parallellen coronaire slagader atherosclerose in het menselijk hart, waar accumulatie van plaque binnen de binnenwanden van de slagaders kan leiden tot een occlusie en de daaropvolgende hartinfarct8. Als gevolg van een leegte in therapeutische behandelingen voor patiënten met hartfalen, een occlusie in de LAD wordt geassocieerd met sterftecijfers tot 26% binnen een jaar na letsel9, en bijgevolg is genoemd de "weduwe maker." Vooruitgang in de therapieën vereist een model dat nauwkeurig de complexe fysiologische en pathologische effecten van cardiale letsel weerspiegelt. Ons chirurgisch protocol voor neonatale muis hartletsel biedt een platform waarmee onderzoekers de moleculaire en cellulaire signalen die zoogdier hartregeneratie signaal na letsel te onderzoeken.
Recent onderzoek benadrukt de dynamische relatie tussen de extracellulaire omgeving en het verspreiden van cardiomyocyten. Bijvoorbeeld, de postnatale regeneratieve venster kan worden uitgebreid door het verminderen van de stijfheid van de extracellulaire matrix rond het hart10. Biomaterialen uit de neonatale extracellulaire matrix kunnen ook hartregeneratie bevorderen bij volwassen zoogdierharten na hartletsel11. Ook de begeleidende cardiomyocyteproliferatie is een angiogene respons12,13; bijkomende slagadervorming die uniek is voor het regenererende hart van de neonatale muis bleek essentieel te zijn voor het stimuleren van hartregeneratie12. Bovendien heeft ons lab aangetoond dat zenuwsignalering cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie reproduceert via modulatie van groeifactorniveaus, evenals de ontstekingsreactie na letsel14. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om niet-myocyte celpopulaties te traceren in reactie op hartletsel. Om dit doel te bereiken, hebben we gebruik gemaakt van de Cre-lox recombination systeem in transgene muizen lijnen te nemen constitutieve of voorwaardelijke expressie van fluorescerende reporter eiwitten voor lineage tracing. Bovendien kunnen we geavanceerde methoden gebruiken om de kloonexpansiepatronen te bepalen met de Rainbow muislijn, die is gebaseerd op de stochastische expressie van de Cre-afhankelijke, multi-color fluorescerende verslaggevers om de kloonexpansie van gerichte celpopulaties te bepalen15. Gebruik te maken van afstamming traceren met de neonatale kransslagader occlusie chirurgie is een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de ingewikkelde cellulaire mechanismen van hartregeneratie.
Het bijhouden van de afstamming van fluorescerende gelabelde cellen met driedimensionale (3D) hele orgaanbeeldvorming is moeilijk te bereiken met behulp van traditionele sectioning en reconstructie techniek - vooral wanneer celpopulaties kwetsbaar zijn, zoals zenuwvezels of bloedvaten. Terwijl directe geheel-mount beeldvorming van het orgaan door optische sectioning oppervlakkige celpopulaties kan vangen, structuren die diep in het weefsel verblijven ontoegankelijk blijven. Om deze barrières te omzeilen, zijn weefselclearingtechnieken ontwikkeld om de ondoorzichtigheid van hele orgaanweefsels te verminderen. Onlangs zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt op clear lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-gebaseerde methoden, die vast weefsel wissen via lipide extractie16. Er worden ook stappen ondernomen om de brekingsindex te homogeniseren en vervolgens de lichtverstrooiing te verminderen terwijl imaging17. Een dergelijke methode is actieve helderheid, die lipideafbraak versnelt met behulp van elektroforese om het wasmiddel door het hele weefsel te penetreren18. Hoewel effectief, deze weefsel clearing methode vereist dure apparatuur en kan weefselschade veroorzaken, waardoor de aanpak onverenigbaar met fragiele celpopulaties zoals de hartzenuwen19. Zo maken we gebruik van de passieve CLARITY-benadering, die afhankelijk is van warmte om de penetratie van detergentia voorzichtig te vergemakkelijken, waardoor we helpen bij het behoud van ingewikkelde celstructuren20,21.
Passieve HELDERHEID wordt meestal beschouwd als minder efficiënt dan actieve HELDERHEID18,omdat de techniek vaak gepaard gaat met twee belangrijke obstakels: het onvermogen om de gehele orgaandiepte te wissen en de uitgebreide hoeveelheid tijd die nodig is om volwassen weefsels te wissen. Onze passieve CLARITY-aanpak overwint beide barrières met een snel clearingproces dat in staat is om neonatale en volwassen hartweefsel volledig te zuiveren. Onze passieve CLARITY tissue clearing techniek heeft een efficiëntie bereikt die de visualisatie van een verscheidenheid van hartcelpopulaties mogelijk maakt, met inbegrip van zeldzame populaties verspreid over het volwassen hart. Wanneer het gewiste hart wordt afgebeeld met confocale microscopie, kan de architectuur van celspecifieke patronen tijdens ontwikkeling, ziekte en regeneratie worden verlicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor het gebruik en de verzorging van proefdieren en in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee in de School of Medicine and Public Health aan de Universiteit van Wisconsin-Madison. Alle methoden werden uitgevoerd op wilde type C57BL/6J (B6) en transgene muislijnen verkregen van Jackson Laboratories.
1. Coronaire Slagader Occlusie (Myocardial Infarct) Geïnduceerd via ligatie van de linker voorste aflopende slagader (LAD) in 1-dag-oude neonatale muizen6
- Scheid de 1-daagse neonatale pups van de moeder door ze in een schone kooi te plaatsen, samen met een aantal van het originele nestmateriaal.
- Plaats de helft van de kooi op een verwarmingskussen ingesteld op middelhoog vuur. De pups moeten aan de onverwarmde kant van de kooi blijven, maar pas na de operatie op de verwarmde kant worden geplaatst.
- Maak een steriele chirurgische ruimte onder een operatiemicroscoop. Verzamel gesteriliseerde chirurgische apparatuur(tabel 1).
- Verdoven de pup via onderkoeling: wikkel de pup in gaas om direct huidcontact met ijs te voorkomen en begraaf het in een ijsbed voor ongeveer 3-4 min. Controleer onderkoeling van de muizen periodiek door het uitvoeren van een teen knijpen. Neonaten tolereren onderkoeling goed, echter, langdurige blootstelling aan onderkoeling kan leiden tot bevriezing en daaropvolgende mortaliteit.
- Eenmaal verdoofd, plaats de muis op het chirurgische gebied in de supine positie, het vastzetten van de armen en benen met tape. Steriliseren van het chirurgische gebied van de muis met een antiseptische oplossing.
- Zoek de onderste borst regio en maak een dwarse incisie in de huid met kleine ontleden schaar. Om het chirurgische zicht van de ribben te verbreden, scheidt u de huid van de spier door de huid voorzichtig op te tillen met een paar verbandtangen en zachtjes tegen de intercostale spieren te drukken met de kleine schaar in de gesloten positie.
- Zoek de vierde intercostale ruimte(figuur 1A)en maak een kleine, oppervlakkige punctie met behulp van scherpe tangen, oppassen dat u geen inwendige organen doorboort. Voer een botte dissectie door het verbreden van het gebied tussen de intercostale spieren met dressing tangen. Een goede anatomische positionering van de incisie is essentieel voor de juiste toegang tot het hart.
- Leid het hart voorzichtig uit de borstholte door een vinger te plaatsen en toenemende druk aan de linkerkant van de buik toe te passen terwijl u de intercostale ruimte openhoudt met verbandtangen(figuur 1B). Zodra het hart buiten de borst is, verwijder de dressing tangen, verlichten de druk, en laat het hart te rusten op de intercostale spieren.
- Zoek de LAD als het gebied van het hart dat minder gepoold bloed heeft en zich in de juiste anatomische positie bevindt(figuur 1C). De LAD kan alleen worden gezien onder de microscoop als het hart wordt benaderd binnen een paar minuten na het begin van de operatie.
- Voer LAD-ligatie uit door de LAD te hechten met een 6-0 hechting(figuur 1D). Bind twee keer een vierkante knoop om een hartinfarct te veroorzaken (figuur 1E). De diepte van de hechting in het myocardium kan variëren, maar een goede anatomische positionering van de LAD-ligatie is cruciaal voor reproduceerbaarheid. Bij het ligaturen van de LAD, moet de hechting strak worden getrokken, maar zorgvuldig om de LAD niet te verbreken. Blancheren aan de top van het hart zal onmiddellijk worden gezien (Figuur 1E)
- Laat het hart terug glijden in de borstholte; dit proces kan voorzichtig worden vergemakkelijkt met dressing tangen. Hecht de ribben samen met een chirurg knoop gevolgd door een vierkante knoop, met behulp van stompe tangen om de bovenste set van ribben te tillen, terwijl het passeren van een 6-0 hechting door de bovenste en onderste set van ribben.
- Verwijder de tape die werd gebruikt om de achterpoten van de pup te beveiligen.
- Hecht de huid aan elkaar door het plaatsen van een kleine hoeveelheid huidlijm op de bovenbuik. Pak vervolgens de huid van de onderbuik met fijne tangen en bedek het blootgestelde borstgebied. Beperk de hoeveelheid overtollige lijm die overblijft op de pups, omdat dit de kans op afstoting en kannibalisme door de moeder kan verhogen.
- Onmiddellijk vergemakkelijken het herstel van anesthesie door het plaatsen van de pup op een verwarmingskussen ingesteld op middelhoog vuur. Schakel periodiek de plaatsing van de neonaten om alle delen van het lichaam gelijkmatig op te warmen.
- Laat het neonaat 10-15 min direct op het verwarmingskussen blijven.
- Maak het restbloed schoon en lijm met een alcoholdoekje.
- Bedek buitenlandse geuren op neonaten door het hele lichaam te wrijven met beddengoed uit de oorspronkelijke kooi. Plaats de pup in de kooi aan de verwarmde kant, terwijl andere operaties worden uitgevoerd.
- Zodra alle operaties zijn voltooid en pups zijn warm en mobiel, breng het nest samen met het originele nestmateriaal naar de kooi van de moeder.
- Controleer de muizen gedurende 30-60 min na de operatie en kijk uit voor de acceptatie van de pups door de moeder te laten nestelen en/of verzorgen.
- Controleer de muizen de ochtend na de operatie. Als moeder bedroefd is en de pups niet heeft genest, overweeg dan een pleegmoeder voor de pups.
2. Clearing the Mouse Heart with Passive CLARITY21,22,23
- Verdoven de muis met isoflurane. Voer een teensnufje uit om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd is.
- Plaats de muis op een schoon, chirurgisch gebied in de supine positie, het vastzetten van de armen en benen met tape.
- Handhaven isoflurane sedatie op de muis met behulp van een neuskegel totdat het hart wordt geëxtraheerd.
- Open de onderste borst door de vacht net onder het xiphoid-proces te houden met weefseltangen en maak een incisie over de breedte van de ribbenkast met behulp van de grote ontledende schaar.
- Snijd naast de distale delen van de ribbenkast met chirurgische schaar.
- Stel de membraanspier bloot door het xiphoid-proces met weefseltangen te grijpen. Maak het middenrif los met gebogen tangen.
- Met behoud van een greep van het xiphoid proces, trek het weefsel cranially totdat het kloppende hart toegankelijk is.
- Grijp het hart aan de basis met gebogen tangen en ontleed het hart uit de borstholte door het snijden van de aorta en superieure vena cava met iridectomie schaar.
- Terwijl het hart nog klopt, plaats het hart in een petrischaaltje gevuld met PBS, zodat het hart pompen uit het bloed binnen als het blijft kloppen. Hartinfarct kan worden bevestigd door te controleren of de plaatsing van de hechting is in de juiste anatomische positie voor LAD ligatie.
- Knijp voorzichtig in het hart met tangen om het hart het resterende bloed te laten verdrijven.
- Breng het muishart over in een wegwerp 2,5 mL glazen schil flacon met 2 mL PBS. Was het resterende bloed weg door het hart op een shaker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) meerdere keren uit te broeden. Wijzig de PBS-oplossing telkens totdat PBS duidelijk blijft.
- Gooi de PBS weg en vul de flacon met 2 mL koude 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 4 uur bij RT (figuur 2A).
- Gooi na incubatie de PFA en de flacon weg met 2 mL PBS. Was het hart op een shaker voor 10 minuten op RT. Herhaal de wasstap twee maal, aftappen en vullen van de flacon met nieuwe PBS elke keer volledig weg te wassen overtollige PFA.
- Gooi PBS weg en vul de flacon met 2 mL van 4% acrylamide en 0,5% VA-044 oplossing. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Voer de volgende dag polymerisatie uit door de flacon gedurende 3 uur over te brengen naar een warmteblok van 37 °C.
- Breng het hart in een nieuwe glazen schaal flacon en herhaal stap 2.12 (PBS wascyclus).
- Verwijder PBS en vul de flacon met 2 mL clearingoplossing (tabel 2). Incubeer bij 37 °C tot het hart is gewist. Verander de oplossing en vul elke 2-3 dagen met verse Clearing Solution. Het opruimproces kan enkele weken duren (figuur 2B-C).
LET OP: P1-harten duren meestal ongeveer 3-5 dagen, terwijl P21-harten bijna een maand kunnen duren voordat clearingoplossing-incubatie is voltooid. - Gooi PBS weg en vul de flacon met 2 mL PBS en herhaal stap 2.12 (PBS wascyclus). Vul de flacon bij met verse PBS en broed 's nachts bij 37 °C.
- Als immunostaining wordt uitgevoerd, slaat u stappen 2.21–2.22 over en gaat u over tot sectie 3 voor immunovlekken. Als u uitsluitend vertrouwt op endogene fluorescentie, gaat u verder met de stappen 2.21–2.22 en slaat u sectie 3 over.
- Verwijder PBS en wijzig de oplossing in Refractive Index Matching Solution (RIMS) (tabel 3). Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Na incubatie kan het gewiste weefsel worden opgeslagen in RIMS-oplossing bij RT. Weefsel kan wit en ondoorzichtig lijken in het midden wanneer het voor het eerst in RIMS wordt overgebracht; weefsel moet transparant worden nadat het enkele weken bij kamertemperatuur in velgen is geïncubeerd(figuur 2D).
3. Optioneel: Immunohistochemie Kleuring van het hele-mount muishart
- Verwijder het gewiste hart uit de RIMS-oplossing en plaats in een schone 2,5 mL glazen flacon met 2 mL PBST (PBS met 0,1% Triton-X 100)
- Was het hart in PBST 3 keer op een orbitale rotator met 30 min incubaties bij RT.
- Blokkeer niet-specifieke antilichaambinding door het hart onder te dompelen in 2 mL van 20% blokkerende buffer (verdund in PBST) en uitte met rotatie gedurende 3 uur bij RT. Breng over naar 4 °C om 's nachts te bevlekken met rotatie.
OPMERKING: Het blokkeren van buffer is gemaakt van normaal serum dat overeenkomt met de soort waarin het secundaire antilichaam is verhoogd. - Was het hart in PBST 3 keer met rotatie voor 5 min incubaties bij RT.
- Dompel het hart onder in het primaire antilichaam (verdund in 2% blokkerenbuffer met PBST) en voorkom lichtblootstelling door het glasflesl in aluminiumfolie te wikkelen. Incubeer met rotatie 's nachts bij RT.
OPMERKING: Vanaf dit punt moet aluminiumfolie continu worden gebruikt om de secundaire te beschermen tegen blootstelling aan omgevingslicht. - Incubeer nog eens 24 uur met rotatie bij 4 °C.
- Na primaire kleuring herhaalt u stap 3.2 (lange PBST-wascyclus) om het ongebonden primaire antilichaam uit het weefsel te verwijderen. Verleng de was met een 's nachts incubatie met rotatie bij RT.
- Werken in een gebied met beperkte verlichting om secundaire blootstelling aan antilichaamlicht te voorkomen, dompel het hart onder in secundair antilichaam (verdund in 2% blokkerenbuffer met PBST) en incubeer met rotatie gedurende 3 uur bij RT. Breng over naar 4 °C om te bevlekken met 's nachts rotatie.
- Herhaal op de volgende dag stap 3.2 (lange PBST wascyclus) om ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
- Vervang de oplossing door 2% blokkeringsbuffer (verdund in PBST). Verwijder resterende ongebonden antilichaam door 's nachts te wassen met rotatie bij RT.
- Controleer de volgende dag of overtollig secundair antilichaam is verwijderd met behulp van confocale microscopie. Breid de was indien nodig uit en vervang dagelijks de 2% blokkerende bufferoplossing. Ga zodra weinig tot geen niet-specifieke secundaire aanwezig is.
- Bewaar het met immuun gekleurde hart in PBS bij 4 °C.
- Vlak voor de volledig monterenmicroscopie, broed het hart in RIMS oplossing 's nachts op 37 °C. Verleng de incubatie met nog eens 24 uur als het weefsel nog steeds niet volledig is geklaard.
- Bewaar het volledig gerooide en immuungekleurde hart in RIMS bij RT.
4. Visualiseren niet-myocyte populaties in 3D met Single-Photon Confocale Microscopie Imaging van de Gewist Muis Hart
OPMERKING: Als muisharten embryonaal worden geoogst, gaat u verder met punt 4.1. Voor muisharten die postnataal worden geoogst, gaat u verder met punt 4.2.
- Beeldvorming van de gewistembryonale muis hart
- Vul de microscoop depressie dia met de PBS oplossing.
- Pak voorzichtig het gewiste hart op met gebogen tangen en plaats het weefsel op de glijbaan.
- Monteer de glijbaan met een glazen coverslip. Het weefsel kan nu worden afgebeeld onder een confocale microscoop.
- Imaging de gewistpostnatale muis hart
- Vul de helft van de kamer van de depressie dia met PBS oplossing. Om een kamer te creëren die groot genoeg is om een volwassen muishart te passen, werd een 3D-geprinte polypropyleendepressiedia op maat gemaakt (figuur 4).
- Pak voorzichtig het gewiste hart op met gebogen tangen en plaats het weefsel in de kamer. Vul het resterende volume van de kamer met PBS.
- Vul de kamer met PBS, zodat het oppervlak van de vloeistof vormt een koepel boven de bovenkant van de kamer. Monteer de dekselschuif. Het weefsel kan nu worden afgebeeld onder een rechtopstaande confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vaak zijn de twee meest uitdagende stappen begeleiden het hart uit de borstholte en ligating de LAD. Om deze stappen op te lossen, kunnen aanpassingen worden gedaan bij de plaatsing van de eerste punctie tussen de vierde intercostale spieren; als de punctie en de botte dissectie zich te dicht bij het borstbeen bevinden, kan het hart de borstholte mogelijk niet verlaten(figuur 1A).
Bovendien kan een verhoogde druk op de linkerbuik nodig zijn om dit proces te vergemakkelijken(figuur 1B). Complicaties kunnen ook optreden bij het rusten van het hart op de intercostale spieren. We vonden het hart buiten de holte zal blijven zonder zich terug te trekken wanneer de botte dissectie tot een minimale grootte wordt gehouden en voornamelijk in de horizontale richting wordt uitgevoerd. Deze oriëntatie zorgt ook voor een duidelijke visualisatie en toegankelijkheid van de LAD(figuur 1C).
Bij het plaatsen van de hechtingsnaald achter de LAD wordt voorgesteld om diep door te dringen in de voorste wand van de linker ventrikel, omdat een oppervlakkige ligatie minder ruimte heeft voor aanpassing in de uiteindelijke hechtingsplaatsing(figuur 1D). Het binden van de hechting rond de LAD moet worden uitgevoerd met gecontroleerde, gestage bewegingen, omdat de LAD kwetsbaar is en deze kransslagader doorsnijdt en de voorste wand sterfte zal veroorzaken (figuur 1E). Binnen 5-10 minuten nadat de operatie is voltooid, moet het neonaat levendig zijn en normaal ademen.
Bij de voortzetting van de passieve CLARITY protocol, harten geoogst uit een muislijn die een endogene fluorescerende reporter voor cel lineage tracing bevat moet worden beschermd tegen licht(figuur 2), die kan worden bereikt door het verpakken van het glas flacon in aluminiumfolie. Tijdens de clearing stap, de tijd die uitbroedt in Clearing Solution is variabel, afhankelijk van de leeftijd van de muis toen het hart werd geoogst. Deze stap is voltooid wanneer het hele weefsel consistent ondoorzichtig is, zonder verkleuring in het midden(figuur 2B-C). De harten zullen steeds transparanter worden na opslag in RIMS-oplossing op kamertemperatuur voor een paar dagen (Figuur 2D). Opgemerkt moet worden dat weefselexpansie kan optreden tijdens het clearingproces.
Ons passieve CLARITY-protocol maakt effectieve antilichaampenetratie mogelijk en is dus compatibel met immunohistochemiemethoden om eiwitten(en) van belang te etiketteren. Dit werd gevalideerd in Actl6bCre; Rosa26tdT transgene muizen, die het etiket volwassen neuronen met de tdTomato (tdT) reporter eiwit. De hartzenuwen zijn voornamelijk oppervlakkig, met sommige populaties die in de epicardiale laag wonen, daarom gebruikten we deze celpopulatie als een proof-of-principal model voor de reproduceerbaarheid van endogene reporter signaal(figuur 3A), evenals behoud van reporter eiwit conformatie voor en na CLARITY(Figuur 3B-C). Onze representatieve resultaten van Actl6bCre; Rosa26tdT muizen tonen aan dat de endogene tdT eiwit signaal gezien in zenuwen van een onduidelijke P7 hart getrouw werd gerecapituleerd in zenuwen van zowel onduidelijke en gewist tdT immunolabeled P7 harten (Figuur 3). Om tdT-positieve zenuwen immunolabel te maken, een rood fluorescerend eiwit (RFP) primair antilichaam (konijnpolyklonale; 1:200 verdunning; Rockland #600-401-379) werd gebruikt samen met een Alexa Fluor 488 secundaire antilichaam (geitenpolyklonale; 1:1000 verdunning; Invitrogen #A-11008). Om het gewiste hart door oog te visualiseren tijdens immunovlekken en beeldvormingsstappen, kan een ultraviolette zaklamp kort worden gebruikt om het hart te verlichten.
Figuur 1: Inductie van hartinfarct in de neonatale muis door coronaire slagader Occlusie van de linker voorste aflopende slagader (LAD). (A) De vierde intercostale ruimte, aangegeven door een enkel sterretje (*), bevindt zich en een botte dissectie wordt uitgevoerd. (B) Druk wordt toegepast op de linkerbuik om het hart te begeleiden uit de borstholte. (C) De LAD, gekenmerkt door een dubbel sterretje (**), wordt geïdentificeerd als de overheersende slagader en door anatomische positie. (D, E) Een hechting wordt vervolgens doorgegeven achter de LAD en een vierkante knoop is gebonden rond de LAD om een kransslagader occlusie en daaropvolgende infarct te induceren. (E) Eenmaal voltooid, blancheren kan worden gezien onder de hechting, aan de top van het hart. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Progressie van de passieve helderheidsmethode op een P14-muishart. Harten werden geoogst van P14 muizen, (A) vast, en (B-D) onderging de passieve CLARITY protocol. Voor harten genomen op een P14-tijdpunt, Clearing Solution incubatiestap is (B) onvolledig wanneer verkleuring in het midden van het hart is duidelijk, gezien na 6 dagen, en (C) compleet wanneer het hart lijkt gelijkmatig ondoorzichtig, gezien na 10 dagen. (D) Nadat het hart is opgeslagen in VELGEN, wordt het weefsel volledig gewist. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Whole-Mount 3D Imaging van P7 Mouse Hearts met Confocalmicroscopie. Representatieve 3D-afbeeldingen van P7 Actl6bCre; Rosa26tdT transgene muizen harten worden weergegeven als maximale intensiteit projecties van z-gestapelde beelden. Harten werden afgebeeld om te tonen (A) endogene tdTomato (tdT) fluorescentie direct na het oogsten (rood) (B) immunostaining van tdT-positieve zenuwen in een onduidelijk hart (Alexa Fluor 488; groen) en (C) reproduceerbare immunolabeling van tdT-positieve zenuwen in een helder hart (Alexa Fluor 488; groen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: 3D-geprinte polypropyleen depressie dia's. Om de postnatale hartmonsters in beeld te brengen, werden aangepaste depressiedia's 3D afgedrukt op polypropyleen. De schuifafmetingen zijn 25 mm x 75 x 1 mm, met een schuifdepressie met een diameter van 13 mm en (A) 6,5 mm of (B) 17 mm diep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Type apparatuur | Beschrijving | Bedrijf | Catalogusnummer |
| Glazen Flacon | 12 x 35mm Flacon met dop | Fisherbrand (Visserbrand) | 03-339-26A |
| 6-0 Prolene Hechtingen | Polypropyleen hechtingen | Ethiek | 8889H |
| Scherpe Kracht | Fijne tip, Straight, 4.25 in | Sigma-Adrich (Sigma-Adrich) | Z168777 |
| Dressing Forceps | Ontleden, 4,5 in | Fisherbrand (Visserbrand) | 13-812-39 |
| Naaldhouder | Mayo-Hegar, 6 in | Fisherbrand (Visserbrand) | 08-966 |
| Kleine ontleden schaar | 30 mm Snijkant | Walter Stern Inc | 25870-002 |
| Weefsel Kracht | Medium weefsel, 1X2 tanden | Excelta | 16050133 |
| Grote ontledenschaar | Recht, 6 in | Fisherbrand (Visserbrand) | 08-951-20 |
| Iridectomie Schaar | 2 mm Snijkant | Fijne wetenschap Tools | 15000-03 |
| Gebogen Tangen | Half gebogen, gekarteld, 4 in | Excelta | 16-050-146 |
Tabel 1: Chirurgische Apparatuur.
| Clearing-oplossing | |||
| Reagens | Definitieve | Bedrag | Notities |
| Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) | 8,0% w/v | 40 g | |
| Boorzuur | 1,25% w/v | 6,25 g | |
| 1-thioglycerol | 0,5% w/v | 5 μL/mL | Toegevoegd als dat nodig is om oplossing |
| Voeg 400 ml ultrapure H20 tot 1 L bekerglas toe. Meng sds en boorzuur met magnetisch roeren. | |||
| Pas de pH aan tot 8,5 met 6M NaOH. Breng het volume op 500 ml en Autoclave. | |||
| Winkel oplossing op kamertemperatuur. | |||
| Andere duidelijkheid Reagentia | |||
| Reagens | Definitieve | Voorraad | Notities |
| Pfa | 4.0% | 16% | Verdund in PBS |
| Acrylamide | 4.0% | 40% | Verdund in PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Toegevoegd als dat nodig is om oplossing |
Tabel 2: Clearing-oplossing en andere reagentia voor de duidelijkheid.
| Reagens | Definitieve | Bedrag |
| Fosfaatbuffer | 0,02 M | 90 mL |
| Histodenz Histodenz | 133,3% w/v | 120 g |
| NatriumAzide | 0,05% w/v | 45 mg |
| Voeg 90 mL 0,02 M Fosfaatbuffer toe aan 250 mL glazen mediafles verpakt in aluminiumfolie. | ||
| Meng in reagentia vermeld met magnetische roeren. Laat componenten 's nachts oplossen. | ||
| Vortex oplossing en filter zuiveren met filtratie systeem in een steriele 250 mL glazen media fles. | ||
| Wikkel fles in aluminiumfolie en winkel oplossing op kamertemperatuur. | ||
Tabel 3: Refractive Index Matching Solution (RIMS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cel-cel interacties tussen cardiomyocyten en niet-myocyte populaties zijn een bepalende factor van de vraag of het hart fibrose zal ondergaan of herstellen na letsel. Ontdekkingen zijn gedaan waaruit blijkt dat een verscheidenheid van celtypes, waaronder zenuwen14, epicardiale cellen24, peritoneale macrofagen25, arterioles12,13, en lymfatische endotheelcellen26, spelen allemaal een essentiële rol bij het bemiddelen van cardiale reparatie. Deze cellijnen en anderen van belang kunnen genetisch worden getraceerd tijdens de ontwikkeling, ziekte en regeneratie door toepassing van Cre-lox en CRISPR-Cas9 technologieën in muizen. In combinatie met orgaanclearing en geavanceerde microscopiemethoden kunnen de bijdragen van niet-myocytepopulaties nauwkeurig worden beoordeeld, waardoor de deur wordt geopend om cellulaire en moleculaire doelen van myocardiale regeneratie na letsel op te helderen.
De efficiëntie van het protocol is afhankelijk van consistente en reproduceerbare ligatie van de LAD tijdens coronaire oclusie chirurgie. Neonatale muizen zijn gevoelig voor langdurige blootstelling aan onderkoeling; de operatie moet dus niet alleen nauwkeurig maar ook binnen enkele minuten worden uitgevoerd. Van start tot finish duurt de hartinfarctsoperatie minder dan 8 minuten. We raden aan eerst te oefenen op verschillende nesten met dezelfde achtergrond als de experimentele muizen totdat de vaardigheid is bereikt.
Progressie van hartherstel kan worden beoordeeld door echocardiografie te gebruiken om de hartfunctie te meten (d.w.z. fractionele verkorting, uitwerpfractie, systolisch en diastolisch volume) eenmaal binnen 3 tot 7 dagen na de operatie en opnieuw kort voor het oogsten van het hart , voorgesteld tussen 21- en 28-dagen na letsel. Harten kunnen worden verzameld voor clearing op meerdere tijdpunten na hartinfarct chirurgie.
De clearingstap (stap 2.17) is onderhevig aan variatie in duur, afhankelijk van de leeftijd en de stam van de muis waaruit het hart is geoogst, wat kan leiden tot verschillen in hartgrootte. Voor een B6-achtergrondmuis wordt de clearingduur op basis van leeftijd als volgt geschat: P1 (7-10 dagen), P7 (14-17 dagen), P14 (21-24 dagen), P21 (28-31 dagen), P28 (35-38 dagen). Hoewel de primaire focus van ons laboratorium is hart clearing, onze passieve HELDERHEID methode is succesvol geweest voor het opruimen van muizen longen (ongepubliceerde resultaten) en we voorzien geen limiet op het breed toepassen van deze op andere organen. Over het algemeen wordt ons versnelde clearingproces zeer gewaardeerd voor het vermogen om weefsels snel en effectief te wissen.
Opgemerkt moet worden dat complicaties kunnen ontstaan bij het toepassen van weefselclearingtechnieken in organen met endogene verslaggevers in zeldzame subpopulaties. Reporter signaal in dichte celpopulaties (zoals myocyten23) lijken beter bestand tegen het clearing proces en dus het signaal wordt meestal behouden; echter, andere meer gevoelige celpopulaties (zoals hartzenuwen) zijn gevoelig voor het hebben van endogene fluorescerende eiwit signaal gedoofd na langdurige fixatie of clearing. Dit werd duidelijk in de Actl6bCre; Rosa26tdT reporter muis model, waar P7 harten kort vast gedurende 15 minuten toonde sterke tdT signaal (Figuur 3A), maar dit fluorescerende signaal werd gedoofd na fixatie voor 1 uur of 's nachts incubatie in de Clearing Solution (gegevens niet getoond). In het scenario van verloren reporter signaal, antilichaam vlekken gericht op de reporter eiwit is compatibel met weefsel clearing om het signaal te versterken (Figuur 3). De toevoeging van een immunolabelingstap kan voordelig zijn voor weefsels die uitgebreide beeldvorming ondergaan, omdat geconjugeerde antilichamen bleekbestendig zijn en stabiele, langetermijnexpressie produceren. Met de mogelijkheid om eiwitten endogeen en door middel van immunostaining te volgen, maakt ons protocol op unieke wijze nauwkeurige lokalisatie mogelijk van zeldzame hartcelpopulaties die diep in het hart wonen.
Gewiste harten kunnen lineage tracing of fluorescerende eiwitexpressie analyse ondergaan met behulp van whole-mount 3D confocale microscopie. De confocale microscoop is uitgerust met laserlijnen geoptimaliseerd om florescent verslaggevers (of geconjugeerde secundaire antilichamen), bijvoorbeeld: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555), en APC (Cy5, Alexa Fluor 647) bij 405 nm, 488 nm, 561 nm, en 683 nm, respectievelijk. Voor hartmonsters niet in staat om te passen in een depressie dia - vaak als het hart postnataal geoogst - een aangepaste depressie dia kan worden gemaakt door 3D-printen op polypropyleen. Aangepaste dia's volgden afmetingen van een microscoopdepressiedia (25 mm x 75 mm x 1 mm), waarbij de putdiepte werd gewijzigd in 6,5 mm of 17 mm (figuur 4).
Om de reporter cellijnen in 3D te visualiseren, is de confocale microscoop ingesteld op z-gestapelde beelden te verwerven in het hart. Bij het imaging grotere hart, kan het hele hart niet in staat zijn om te worden vastgelegd in een enkele z-gestapelde beeld, zelfs met een lage vergroting doelstelling. In dit scenario kan een reeks van meerdere z-gestapelde afbeeldingen die in verschillende hartgebieden zijn gemaakt, aan elkaar worden genaaid met behulp van een grote beeldfunctie. Dit wordt bereikt door de microscoop te kalibreren naar de juiste objectieve lens en het veld te specificeren voor het grote beeldscangebied. Vervolgens ondergaan z-gestapelde afbeeldingen een 3D-reconstructie met behulp van een volumerenderingprogramma en maximale intensiteitsprojectie(figuur 3). De hoge resolutie beelden verworven kan worden geanalyseerd om nauwkeurige 3D ruimtelijke cel patronen van gerichte celpopulaties te bepalen.
Gezamenlijk biedt dit protocol een krachtig moleculair hulpmiddel om de dynamische cellulaire veranderingen te begrijpen die optreden tijdens cardiale reparatie en regeneratie. Deze methode beschrijft de stappen om een hartinfarct te induceren, hele orgaanclearing uit te voeren, celspecifieke populaties te traceren en 3D-celpatronen te analyseren. Samen bieden deze technieken toegang tot sporencelpopulaties die voorheen ontoegankelijk waren vanwege hun schaarse aanwezigheid of locatie binnen het weefsel. Dit zal nader onderzoek mogelijk maken naar vragen die van het grootste belang zijn voor de vooruitgang van therapeutische benaderingen in de regeneratieve geneeskunde, met name die gericht op het stimuleren van endogene hartregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De financiering voor dit project werd verstrekt door de UW School of Medicine and Public Health van het Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), en een American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J.
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
