Summary
La proliferación de cardiomiocitos después de una lesión es un proceso dinámico que requiere una sinfonía de señales extracelulares de poblaciones de células no miocitos. Utilizando el trazado de linaje, la CLARIDAD pasiva y las técnicas tridimensionales de microscopía confocal de montaje completo, podemos analizar la influencia de una variedad de tipos de células en la reparación y regeneración cardíaca.
Abstract
Las enfermedades cardiovasculares son las que más se operando a todas las demás causas de muerte y son responsables de un asombroso 31% de las muertes en todo el mundo. Esta enfermedad se manifiesta en lesiones cardíacas, principalmente en forma de un infarto agudo de miocardio. Con poca resiliencia después de una lesión, el tejido cardíaco una vez sano será reemplazado por tejido cicatricial fibroso, no contráctelo y a menudo será un preludio de la insuficiencia cardíaca. Para identificar nuevas opciones de tratamiento en medicina regenerativa, la investigación se ha centrado en vertebrados con capacidades regenerativas innatas. Uno de estos organismos modelo es el ratón neonatal, que responde a una lesión cardíaca con una sólida regeneración miocárdica. Con el fin de inducir una lesión en el ratón neonatal que es clínicamente relevante, hemos desarrollado una cirugía para ocluir la arteria descendente anterior izquierda (LAD), reflejando un infarto de miocardio desencadenado por la aterosclerosis en el corazón humano. Cuando se combina con la tecnología para realizar un seguimiento de los cambios tanto dentro de las poblaciones de cardiomiocitos como de no miocitos, este modelo nos proporciona una plataforma para identificar los mecanismos que guían la regeneración del corazón. Obtener información sobre los cambios en las poblaciones de células cardíacas después de la lesión una vez se basó en gran medida en métodos como la sección de tejidos y el examen histológico, que se limitan al análisis bidimensional y a menudo dañan el tejido en el proceso. Además, estos métodos carecen de la capacidad de rastrear los cambios en los linajes celulares, sino que proporcionan simplemente una instantánea de la respuesta a la lesión. Aquí, describimos cómo los métodos tecnológicamente avanzados en los modelos de trazado de linaje, la limpieza de órganos enteros y la microscopía tridimensional (3D) de montaje completo se pueden utilizar para dilucidar los mecanismos de reparación cardíaca. Con nuestro protocolo para la cirugía de infarto de miocardio de ratón neonatal, la limpieza de tejidos y la toma de imágenes de órganos enteros en 3D, las complejas vías que inducen la proliferación de cardiomiocitos pueden desentrañarse, revelando nuevas dianas terapéuticas para la regeneración cardíaca.
Introduction
El corazón ha sido considerado durante mucho tiempo como un órgano post-mitótico, sin embargo, la evidencia reciente demuestra que la renovación de cardiomiocitos ocurre en el corazón humano adulto en alrededor del 1% por año1. Sin embargo, estas bajas tasas de rotación de cardiomiocitos son insuficientes para reponer la pérdida masiva de tejido que se produce después de una lesión. Un corazón que ha sufrido un infarto de miocardio perderá alrededor de mil millones de cardiomiocitos, a menudo sirviendo como preludio de la insuficiencia cardíaca y la muerte súbita cardíaca2,3. Con más de 26 millones de personas afectadas por insuficiencia cardíaca en todo el mundo, existe una necesidad insatisfecha de terapias que puedan revertir los daños infligidos por la enfermedad cardíaca4.
Con el fin de cerrar esta brecha en las terapias, los científicos han comenzado a investigar los mecanismos evolutivamente conservados que subyacen a la regeneración endógena después de la lesión. Un modelo para estudiar la regeneración cardíaca de los mamíferos es el ratón neonatal. Dentro de la semana siguiente al nacimiento, los ratones neonatales tienen una respuesta regenerativa robusta después de daños cardíacos5. Hemos demostrado previamente que los ratones neonatales pueden regenerar su corazón a través de la proliferación de cardiomiocitos después de una resección apical5. Aunque esta técnica puede evocar la regeneración cardíaca en los neonatos, la cirugía carece de relevancia clínica para las lesiones cardíacas humanas. Con el fin de imitar una lesión humana en el modelo de ratón neonatal, hemos desarrollado una técnica para inducir un infarto de miocardio a través de una oclusión de la arteria coronaria6. Esta técnica requiere ligadura quirúrgica de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), que es responsable de entregar 40%–50% de la sangre al miocardio ventricular izquierdo6,7. Por lo tanto, la cirugía resulta en un infarto que afecta a una porción significativa de la pared ventricular izquierda. Este daño al miocardio estimulará la proliferación de cardiomiocitos y la regeneración del corazón en los neonatos5.
La cirugía de oclusión de la arteria coronaria proporciona un método altamente reproducible y directamente traslacional para descubrir el funcionamiento interno de la regeneración cardíaca. La cirugía neonatal es paralela a la aterosclerosis de la arteria coronaria en el corazón humano, donde la acumulación de placa dentro de las paredes internas de las arterias puede causar una oclusión y posterior infarto de miocardio8. Debido a un vacío en los tratamientos terapéuticos para pacientes con insuficiencia cardíaca, una oclusión en el LAD se asocia con tasas de mortalidad que alcanzan hasta el 26% dentro de un año después de la lesión9,y en consecuencia se ha llamado el "fabricante de viudas". Los avances en el tratamiento requieren un modelo que refleje con precisión los complejos efectos fisiológicos y patológicos de las lesiones cardíacas. Nuestro protocolo quirúrgico para lesiones cardíacas de ratón neonatal proporciona una plataforma que permite a los investigadores investigar las señales moleculares y celulares que señalan la regeneración cardíaca de los mamíferos después de la lesión.
Investigaciones recientes ponen de relieve la relación dinámica entre el entorno extracelular y la proliferación de los cardiomiocitos. Por ejemplo, la ventana regenerativa postnatal se puede extender disminuyendo la rigidez de la matriz extracelular que rodea el corazón10. Los biomateriales de la matriz extracelular neonatal también pueden promover la regeneración cardíaca en corazones adultos de mamíferos después de una lesión cardíaca11. También acompañando la proliferación de cardiomiocitos es una respuesta angiogénica12,13; la formación de arterias colaterales únicas en el corazón regenerador del ratón neonatal demostró ser esencial para estimular la regeneración cardíaca12. Además, nuestro laboratorio ha demostrado que la señalización nerviosa regula la proliferación de cardiomiocitos y la regeneración cardíaca a través de la modulación de los niveles de factor de crecimiento, así como la respuesta inflamatoria después de la lesión14. Estos hallazgos enfatizan la necesidad de rastrear las poblaciones de células no miocitos en respuesta a una lesión cardíaca. Para lograr este objetivo, hemos aprovechado el sistema de recombinación Cre-lox en líneas de ratones transgénicos para incorporar la expresión constitutiva o condicional de proteínas fluorescentes de reportero para el rastreo de linaje. Además, podemos utilizar métodos avanzados para determinar el patrón de expansión clonal con la línea de ratón Rainbow, que se basa en la expresión estocástica de los reporteros fluorescentes multicolores dependientes de Cre para determinar la expansión clonal de las poblaciones de células objetivo15. El uso del trazado de linaje con la cirugía de oclusión de la arteria coronaria neonatal es una poderosa herramienta para disuacar los intrincados mecanismos celulares de la regeneración cardíaca.
El seguimiento del linaje de células etiquetadas fluorescentes con imágenes tridimensionales (3D) de órganos enteros es difícil de lograr utilizando la técnica tradicional de seccionamiento y reconstrucción, especialmente cuando las poblaciones celulares son frágiles, como las fibras nerviosas o los vasos sanguíneos. Mientras que las imágenes directas de montaje completo del órgano mediante seccionamiento óptico pueden capturar poblaciones celulares superficiales, las estructuras que residen profundamente dentro del tejido permanecen inaccesibles. Para eludir estas barreras, se han desarrollado técnicas de limpieza de tejidos para reducir la opacidad de los tejidos de órganos enteros. Recientemente, se han realizado avances significativos a los métodos basados en hidrogel rígido con imágenes rígidas híbridos con acrilamida transparente, que limpian el tejido fijo mediante la extracción de lípidos16. También se toman medidas para homogeneizar el índice de refracción y, posteriormente, reducir la dispersión de la luz durante la toma de imágenes17. Uno de estos métodos es la CLARIDAD activa, que acelera la descomposición de los lípidos mediante el uso de electroforesis para penetrar el detergente en todo el tejido18. Aunque eficaz, este método de limpieza de tejido requiere equipos costosos y puede causar daño tisular, haciendo que el enfoque sea incompatible con poblaciones celulares frágiles como los nervios cardíacos19. Por lo tanto, empleamos el enfoque pasivo CLARITY, que se basa en el calor para facilitar suavemente la penetración del detergente, ayudando así en la retención de intrincadas estructuras celulares20,21.
Por lo general, se piensa que la CLARIDAD Pasiva es menos eficiente que la CLARITY18activa, ya que la técnica suele ir acompañada de dos obstáculos principales: la incapacidad de eliminar toda la profundidad del órgano y la gran cantidad de tiempo necesario para limpiar los tejidos adultos. Nuestro enfoque pasivo DE CLARITY supera ambas barreras con un proceso de limpieza expeditado que es capaz de eliminar completamente el tejido cardíaco neonatal y adulto. Nuestra técnica pasiva de limpieza de tejido CLARITY ha alcanzado una eficiencia que permite la visualización de una variedad de poblaciones de células cardíacas, incluyendo poblaciones raras distribuidas por todo el corazón adulto. Cuando el corazón despejado se muestra con microscopía confocal, se puede iluminar la arquitectura del patrón específico de la célula durante el desarrollo, la enfermedad y la regeneración.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio y de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Escuela de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin-Madison. Todos los métodos se realizaron en líneas de ratón transgénicas (B6) y transgénicas de tipo salvaje C57BL/6J (B6) y líneas de ratón transgénicas obtenidas de Jackson Laboratories.
1. Oclusión de la arteria coronaria (infarto de miocardio) Inducida a través de la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en ratones neonatales de 1 día de edad6
- Separe los cachorros neonatales de 1 día de edad de la madre colocándolos en una jaula limpia junto con parte del material de anidación original.
- Coloque la mitad de la jaula en una almohadilla de calentamiento a fuego medio. Los cachorros deben permanecer en el lado no calentado de la jaula, sólo se colocan en el lado calentado después de la cirugía.
- Cree un área quirúrgica estéril bajo un microscopio operativo. Reunir equipo quirúrgico esterilizado (Tabla 1).
- Anestesiar el cachorro a través de la hipotermia: envuelva el cachorro en gasa para evitar el contacto directo de la piel con el hielo y enterrarlo en un lecho de hielo durante aproximadamente 3-4 min. Compruebe la hipotermia de los ratones periódicamente realizando un pellizco en el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo. Sin embargo, los neonatos toleran bien la hipotermia, la exposición prolongada a la hipotermia puede provocar congelación y mortalidad posterior.
- Una vez anestesiado, coloque el ratón sobre el área quirúrgica en la posición supina, asegurando los brazos y las piernas con cinta adhesiva. Esterilice el área quirúrgica del ratón con una solución antiséptica.
- Localice la región inferior del pecho y haga una incisión transversal en la piel con pequeñas tijeras diseladores. Para ampliar la vista quirúrgica de las costillas, separe la piel del músculo levantando suavemente la piel con un par de fórceps de vendaje y presione suavemente contra los músculos intercostales con las tijeras pequeñas en la posición cerrada.
- Localice el cuarto espacio intercostal(Figura 1A)y haga una pequeña punción superficial usando fórceps afilados, teniendo cuidado de no perforar ningún órgano interno. Realizar una disección contundente mediante el ensanchamiento de la zona entre los músculos intercostales con fórceps de vendaje. El posicionamiento anatómico adecuado de la incisión es esencial para un acceso adecuado al corazón.
- Guíe suavemente el corazón fuera de la cavidad torácica colocando un dedo y aplicando una presión creciente en el lado izquierdo del abdomen mientras mantiene abierto el espacio intercostal con fórceps de apósito(Figura 1B). Una vez que el corazón está fuera del pecho, retire los fórceps del vendaje, alivie la presión y permita que el corazón descanse sobre los músculos intercostales.
- Localice el LAD como el área del corazón que tiene menos sangre en la masa y está en la posición anatómica correcta(Figura 1C). El LAD solo se puede ver bajo el microscopio si se accede al corazón a los pocos minutos de comenzar la cirugía.
- Realice la ligadura LAD suturando el LAD con una sutura 6-0(Figura 1D). Ate un nudo cuadrado dos veces para inducir el infarto de miocardio(Figura 1E). La profundidad de la sutura en el miocardio puede variar, sin embargo, el posicionamiento anatómico adecuado de la ligadura LAD es crucial para la reproducibilidad. Al ligar el LAD, la sutura debe ser tirada firmemente pero con cuidado para no cortar el LAD. El blanqueamiento en el ápice del corazón se verá inmediatamente(Figura 1E)
- Permita que el corazón vuelva a caer en la cavidad torácica; este proceso se puede facilitar suavemente con fórceps de vendaje. Sutura las costillas junto con un nudo de cirujano seguido de un nudo cuadrado, usando fórceps contundentes para levantar el conjunto superior de costillas mientras pasa una sutura 6-0 a través del conjunto superior e inferior de costillas.
- Retire la cinta que se utilizó para asegurar las patas traseras del cachorro.
- Adherir la piel mediante la colocación de una pequeña cantidad de pegamento de la piel en la parte superior del abdomen. Luego, agarra la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps finos y cubre la región del pecho expuesta. Limitar la cantidad de exceso de pegamento que queda en los cachorros, ya que esto puede aumentar la probabilidad de rechazo y canibalismo por parte de la madre.
- Facilitar inmediatamente la recuperación de la anestesia colocando el cachorro en una almohadilla de calentamiento a fuego medio. Cambie periódicamente la colocación de los neonatos para calentar uniformemente todas las partes del cuerpo.
- Permita que el neonato permanezca directamente en la almohadilla de calentamiento durante 10-15 min. Típicamente, el movimiento se recupera dentro de 5 minutos de ser colocado sobre el calor.
- Limpie la sangre residual y péguela con una toallita con alcohol.
- Cubre los aromas extraños en los neonatos frotando todo el cuerpo con ropa de cama de la jaula original. Coloque el cachorro en la jaula del lado calentado mientras se realizan otras cirugías.
- Una vez que todas las cirugías se hayan completado y los cachorros estén calientes y móviles, transfiera la basura junto con el material de anidación original a la jaula de la madre.
- Monitoree a los ratones durante 30-60 minutos después de la cirugía y observe la aceptación de la madre de los cachorros anidando y/o acicalándose.
- Revise a los ratones la mañana siguiente a la cirugía. Si la madre está angustiada y no ha anidado a los cachorros, considere una madre adoptiva para los cachorros.
2. Borrar el corazón del ratón con claridad pasiva21,22,23
- Anestetizar el ratón con isoflurano. Realice un pellizco de dedo del dedo del dedo del ratón para asegurarse de que el ratón está completamente sedado.
- Coloque el ratón en un área quirúrgica limpia en la posición supina, asegurando los brazos y las piernas con cinta adhesiva.
- Mantenga la sedación de isoflurano en el ratón usando un cono nasal hasta que se extraiga el corazón.
- Abra la parte inferior del pecho sosteniendo el pelaje justo debajo del proceso de xifoide con fórceps de tejido y haga una incisión que abarque el ancho de la caja torácica usando las tijeras de diselación grandes.
- Corte junto a las porciones distales de la caja torácica con tijeras quirúrgicas.
- Exponga el músculo del diafragma agarrando el proceso de xifoide con fórceps tisulares. Separe el diafragma con fórceps curvos.
- Mientras mantiene una comprensión del proceso de xifoide, tire del tejido cranealmente hasta que el corazón latiendo sea accesible.
- Sujete el corazón a la base con fórceps curvos y diseccione el corazón de la cavidad torácica cortando la aorta y la vena cava superior con tijeras de iridectomía.
- Mientras el corazón todavía late, coloca el corazón en un plato de Petri lleno de PBS para que el corazón bombee la sangre dentro mientras sigue latiendo. El infarto de miocardio se puede confirmar comprobando que la colocación de la sutura está en la posición anatómica adecuada para la ligadura LAD.
- Apriete suavemente el corazón con fórceps para permitir que el corazón expulse la sangre residual.
- Transfiera el corazón del ratón a un vial desechable de 2,5 ml de cáscara de vidrio con 2 ml de PBS. Lavar la sangre residual incubando el corazón en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) varias veces. Cambie la solución PBS cada vez hasta que PBS permanezca claro.
- Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de frío 4% paraformaldehído (PFA). Incubar durante 4 horas en RT(Figura 2A).
- Después de la incubación, deseche el PFA y el vial con 2 ml de PBS. Lavar el corazón en una coctelera durante 10 minutos en RT. Repita el paso de lavado dos veces, drenando y llenando el vial con nuevo PBS cada vez para lavar completamente el exceso de PFA.
- Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de 4% de acrilamida y 0,5% de solución VA-044. Incubar durante la noche a 4oC.
- Al día siguiente, realice la polimerización transfiriendo el vial a un bloque de calor establecido a 37oC durante 3 horas.
- Transfiera el corazón a un nuevo vial de cáscara de vidrio y repita el paso 2.12 (ciclo de lavado DE PBS).
- Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de solución de compensación (Tabla 2). Incubar a 37oC hasta que el corazón se despeje. Cambie la solución y rellene con una solución de compensación fresca cada 2-3 días. El proceso de compensación podría tardar hasta varias semanas(Figura 2B-C).
NOTA: Los corazones P1 suelen tardar entre 3 y 5 días, mientras que los corazones P21 pueden tardar casi un mes antes de que se complete la incubación de la solución. - Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de PBS y repita el paso 2.12 (ciclo de lavado de PBS). Rellene el vial con PBS fresco e incubar durante la noche a 37 oC.
- Si se realizará inmunostaining, omita los pasos 2.21–2.22 y proceda a la Sección 3 para la inmunomancha. Si se basa únicamente en fluorescencia endógena, proceda con los pasos 2.21–2.22 y omita la Sección 3.
- Deseche PBS y cambie la solución a Refractive Index Matching Solution (RIMS)(Tabla 3). Incubar durante la noche a 37oC.
- Después de la incubación, el tejido despejado se puede almacenar en la solución RIMS en RT. El tejido puede parecer blanco y opaco en el centro cuando se transfiere por primera vez a RIMS; tejido debe volverse transparente después de ser incubado en RIMS a temperatura ambiente durante varias semanas (Figura 2D).
3. Opcional: Mancha inmunohistoquímica del corazón del ratón de montaje completo
- Retire el corazón despejado de la solución RIMS y colóquelo en un vial de vidrio limpio de 2,5 ml con 2 ml de PBST (PBS con 0,1% De tritón-X 100)
- Lave el corazón en PBST 3 veces en un rotador orbital con incubaciones de 30 minutos a RT.
- Bloquear la unión de anticuerpos no específicos sumergiendo el corazón en 2 ml de tampón de bloqueo del 20% (diluido en PBST) e incubar con rotación durante 3 horas en RT. Transfiera a 4 oC a la mancha con rotación durante la noche.
NOTA: El tampón de bloqueo está hecho de suero normal que coincide con la especie en la que se elevó el anticuerpo secundario. - Lave el corazón en PBST 3 veces con rotación para incubaciones de 5 minutos a RT.
- Sumerja el corazón en anticuerpos primarios (diluido en un tampón de bloqueo del 2% con PBST) y evite la exposición a la luz envolviendo el vial de vidrio en papel de aluminio. Incubar con rotación durante la noche a RT.
NOTA: A partir de este momento, la lámina de aluminio debe utilizarse continuamente para proteger el secundario de la exposición a la luz ambiental. - Incubar durante 24 horas adicionales con rotación a 4oC.
- Después de la tinción primaria, repita el paso 3.2 (ciclo de lavado PBST largo) para eliminar el anticuerpo primario no unido del tejido. Extienda el lavado con una incubación durante la noche con rotación en RT.
- Trabajando en un área con iluminación limitada para prevenir la exposición a la luz de anticuerpos secundarios, sumergir el corazón en anticuerpos secundarios (diluido en un tampón de bloqueo del 2% con PBST) e incubar con rotación durante 3 horas en RT. Transfiera a 4 oC para manchar con rotación durante la noche.
- Al día siguiente, repita el paso 3.2 (ciclo de lavado PBST largo) para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
- Reemplace la solución por un búfer de bloqueo del 2% (diluido en PBST). Retire el anticuerpo residual sin consolidar lavando durante la noche con rotación en RT.
- Al día siguiente, compruebe que el exceso de anticuerpos secundarios se ha eliminado mediante microscopía confocal. Extienda el lavado según sea necesario, reemplazando diariamente la solución de tampón de bloqueo del 2%. Proceda una vez poco o ningún secundario no específico está presente.
- Almacene el corazón inmunomanchado en PBS a 4 oC.
- Directamente antes de la microscopía de montaje completo, incubar el corazón en la solución RIMS durante la noche a 37 oC. Extienda la incubación 24 horas adicionales si el tejido aún no está completamente despejado.
- Almacene el corazón completamente despejado e inmunoconservado en RIMS en RT.
4. Visualización de poblaciones no miocitos en 3D con imágenes de microscopía confocal de un solo fotón del corazón de ratón despejado
NOTA: Si los corazones del ratón se cosechan embrionariasmente, continúe con la sección 4.1. Para los corazones de ratón cosechados postnatalmente, continúe con la sección 4.2.
- Imagen del corazón de ratón embrionario despejado
- Llene la diapositiva de depresión del microscopio con la solución PBS.
- Recoja cuidadosamente el corazón despejado con fórceps curvos y coloque el tejido en la diapositiva.
- Monte el portaobjetos con una cubierta de vidrio. El tejido ahora se puede crear una imagen bajo un microscopio confocal.
- Imagen del corazón de ratón postnatal despejado
- Llene la mitad de la cámara de la diapositiva de depresión con solución de PBS. Con el fin de crear una cámara lo suficientemente grande como para adaptarse a un corazón de ratón adulto, una diapositiva de depresión de polipropileno impresa en 3D fue hecha a medida(Figura 4).
- Recoja cuidadosamente el corazón despejado con fórceps curvos y coloque el tejido en la cámara. Llene el volumen restante de la cámara con PBS.
- Llene la cámara con PBS para que la superficie del líquido forme una cúpula por encima de la parte superior de la cámara. Monte el portaobjetos de la cubierta. El tejido ahora se puede crear una imagen bajo un microscopio confocal vertical.
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Representative Results
A menudo, los dos pasos más desafiantes son guiar el corazón fuera de la cavidad torácica y ligar el LAD. Para solucionar estos pasos, se pueden realizar ajustes en la colocación de la punción inicial entre los cuartos músculos intercostales; si la punción y la disección contundente están demasiado cerca del esternón, es posible que el corazón no pueda salir de la cavidad torácica(Figura 1A).
Además, puede ser necesario aumentar la presión en el abdomen izquierdo para facilitar este proceso(Figura 1B). Las complicaciones también pueden ocurrir al descansar el corazón en los músculos intercostales. Encontramos que el corazón permanecerá fuera de la cavidad sin retirarse cuando la disección contundente se mantiene a un tamaño mínimo y se realiza principalmente en la dirección horizontal. Esta orientación también permite una visualización clara y accesibilidad al LAD(Figura 1C).
Al colocar la aguja de sutura detrás del LAD, se sugiere penetrar profundamente en la pared anterior del ventrículo izquierdo, ya que una ligadura superficial tiene menos espacio para el ajuste en la colocación final de la sutura(Figura 1D). Ate la sutura alrededor del LAD debe realizarse con movimientos controlados y constantes, ya que el LAD es frágil y cortar esta arteria coronaria y la pared anterior causará mortalidad(Figura 1E). Dentro de 5-10 minutos después de la cirugía completada, el neonato debe estar animado y respirar normalmente.
Al proceder al protocolo pasivo CLARITY, los corazones cosechados de una línea de ratón que incorpora un reportero fluorescente endógeno para el trazado de linaje celular deben protegerse de la luz(Figura 2), lo que se puede lograr envolviendo el vial de vidrio en papel de aluminio. Durante el paso de limpieza, el tiempo de incubación en la solución de compensación es variable dependiendo de la edad del ratón cuando se cosecha el corazón. Este paso se completa cuando todo el tejido es consistentemente opaco, sin decoloración en el centro(Figura 2B-C). Los corazones se volverán cada vez más transparentes después de su almacenamiento en la solución RIMS a temperatura ambiente durante un par de días(Figura 2D). Cabe señalar que la expansión del tejido puede ocurrir durante el proceso de limpieza.
Nuestro protocolo pasivo CLARITY permite una penetración efectiva de anticuerpos y, por lo tanto, es compatible con métodos de inmunohistoquímica para etiquetar proteínas de interés. Esto se validó en Actl6bCre; Ratones transgénicos Rosa26tdT, que etiquetan las neuronas maduras con la proteína de reportero tdTomato (tdT). Los nervios cardíacos son principalmente superficiales, con algunas poblaciones que residen en la capa epicardial, por lo tanto utilizamos esta población celular como un modelo de prueba de mayor para la reproducibilidad de la señal de reportero endógeno(Figura 3A),así como la preservación de la conformación de proteínas del reportero antes y después de LA CLARIDAD(Figura 3B-C). Nuestros resultados representativos de Actl6bCre; Los ratonestdT Rosa26 muestran que la señal de proteína tdT endógena que se ve en los nervios de un corazón P7 no aclarado fue recapitulada fielmente en los nervios de los corazones P7 inmunoetiquetados no claros y despejados(Figura 3). Para inmunoetiquetar los nervios tdT positivos, un anticuerpo primario de proteína fluorescente roja (RFP) (policlonal de conejo; dilución 1:200; Rockland #600-401-379) se utilizó junto con un anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 (policlonal de cabra; dilución 1:1000; Invitrogen #A-11008). Para visualizar el corazón aclarado del ojo durante los pasos de inmunoinso y toma de imágenes, se puede utilizar brevemente una linterna ultravioleta para iluminar el corazón.
Figura 1: Inducción del infarto de miocardio en el ratón neonatal a través de la oclusión arterial coronaria de la arteria descendente anterior izquierda (LAD). (A) Se encuentra el cuarto espacio intercostal, indicado por un solo asterisco (*), y se realiza una disección contundente. (B) Se aplica presión en el abdomen izquierdo para guiar el corazón fuera de la cavidad torácica. (C) El LAD, marcado por un doble asterisco (**), se identifica como la arteria predominante y por posición anatómica. (D, E) Luego se pasa una sutura detrás del LAD y se ata un nudo cuadrado alrededor del LAD para inducir una oclusión de la arteria coronaria y un infarto posterior. (E) Una vez completado, el blanqueamiento se puede ver debajo de la sutura, en el ápice del corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Progreso del método de claridad pasiva en un corazón de ratón P14. Los corazones fueron cosechados de ratones P14,(A)fijos, y (B-D) se sometieron al protocolo pasivo CLARITY. Para los corazones tomados en un punto de tiempo P14, el paso de incubación de la solución de compensación es (B) incompleto cuando la decoloración en el centro del corazón es evidente, se ve después de 6 días, y (C) completar cuando el corazón aparece uniformemente opaco, visto después de 10 días. (D) Después de almacenar el corazón en RIMS, el tejido se elimina por completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes 3D de montaje completo de corazones de ratón P7 con microscopía confocal. Imágenes 3D de montaje completo representativas de P7 Actl6bCre; Los corazones de ratones transgénicos Rosa26tdT se muestran como proyecciones de máxima intensidad de imágenes apiladas en z. Se crearon corazones para mostrar (A) fluorescencia endógena tdTomato (tdT) directamente después de la cosecha (rojo) (B) inmunomanchación de nervios tdT positivos en un corazón no aclarado (Alexa Fluor 488; verde) y (C) inmunoetiquetado reproducible de nervios tdT positivos en un corazón despejado (Alexa Fluor 488; verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diapositivas de depresión de polipropileno impresas en 3D. Para tomar imágenes de las muestras cardíacas posnatales, se imprimieron diapositivas de depresión personalizadas en 3D en polipropileno. Las dimensiones de la corredera son de 25 mm x 75 mm x 1 mm, con un pozo de depresión deslizante de 13 mm de diámetro y (A) 6,5 mm o (B) 17 mm de profundidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tipo de equipo | Descripción | Empresa | Número de catálogo |
| Vial de vidrio | Vial de 12 x 35 mm con tapa | Fisherbrand | 03-339-26A |
| 6-0 Suturas de Prolene | Suturas de polipropileno | Ethicon | 8889H |
| Sharp Forceps | Punta fina, recta, 4.25 en | Sigma-Adrich | Z168777 |
| Dressing Forceps | Disección, 4,5 en | Fisherbrand | 13-812-39 |
| Soporte de aguja | Mayo-Hegar, 6 en | Fisherbrand | 08-966 |
| Pequeña tijera de diselación | Borde de corte de 30 mm | Walter Stern Inc | 25870-002 |
| Fuerzas de tejido | Tejido medio, 1X2 Dientes | Excelta | 16050133 |
| Tijeras de diselación grandes | Recto, 6 en | Fisherbrand | 08-951-20 |
| Tijeras de iridectomía | Borde de corte de 2 mm | Herramientas científicas finas | 15000-03 |
| Fuerzas curvadas | Half Curved, Serrado, 4 en | Excelta | 16-050-146 |
Tabla 1: Equipo quirúrgico.
| Solución de compensación | |||
| Reactivo | Final | Cantidad | Notas |
| Sulfato de dodecilo de sodio (SDS) | 8,0% p/v | 40 g | |
| Acido bórico | 1,25% p/v | 6.25 g | |
| 1-tioglicerol | 0,5% p/v | 5 L/ml | Añadido según sea necesario a la solución |
| Añadir 400 ml de vaso ultrapuro H20 a 1 L. Mezclar en SDS y ácido bórico con agitación magnética. | |||
| Ajuste el pH a 8,5 con 6M NaOH. Lleve el volumen a 500 ml y Autoclave. | |||
| Almacene la solución a temperatura ambiente. | |||
| Otros reactivos de CLARIDAD | |||
| Reactivo | Final | Acción | Notas |
| Pfa | 4.0% | 16% | Diluido en PBS |
| Acrilamida | 4.0% | 40% | Diluido en PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Añadido según sea necesario a la solución |
Tabla 2: Solución de compensación y otros reactivos de claridad.
| Reactivo | Final | Cantidad |
| Búfer de fosfato | 0.02 M | 90 mL |
| Histodenz | 133,3% p/v | 120 g |
| Azida sódica | 0,05% p/v | 45 mg |
| Añadir 90 ml de búfer de fosfato de 0,02 M a una botella de medios de vidrio de 250 ml envuelta en papel de aluminio. | ||
| Mezclar en reactivos listados con agitación magnética. Deje que los componentes se disuelvan durante la noche. | ||
| Solución Vortex y purificación de filtro con sistema de filtración en una botella estéril de 250 ml de medios de vidrio. | ||
| Envuelva la botella en papel de aluminio y almacene la solución a temperatura ambiente. | ||
Tabla 3: Solución de coincidencia de índices de refracción (RIMS).
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Discussion
Las interacciones células celulares entre los cardiomiocitos y las poblaciones no miocitos son un factor determinante de si el corazón sufrirá fibrosis o reparación después de una lesión. Se han realizado descubrimientos demostrando que una variedad de tipos de células, incluyendo nervios14,células epicardiales24, macrófagos peritoneales25, arteriolas12,,13,y células endoteliales linfáticas26,todos juegan un papel esencial en la mediación de la reparación cardíaca. Estos linajes celulares y otros de interés se pueden rastrear genéticamente durante el desarrollo, la enfermedad y la regeneración mediante la aplicación de las tecnologías Cre-lox y CRISPR-Cas9 en ratones. Cuando se combina con métodos avanzados de limpieza de órganos y microscopía avanzada, las contribuciones de las poblaciones no miocitos se pueden evaluar con precisión, abriendo la puerta a la difusión de los objetivos celulares y moleculares de la regeneración miocárdica después de una lesión.
La eficiencia del protocolo depende de la ligadura constante y reproducible del LAD durante la cirugía de oclusión de la arteria coronaria. Los ratones neonatales son sensibles a la exposición prolongada a la hipotermia; por lo tanto, la cirugía no sólo debe realizarse con precisión, sino también en cuestión de minutos. De principio a fin, la cirugía de infarto de miocardio debe tardar menos de 8 minutos. Recomendamos practicar primero en varias camadas del mismo fondo que los ratones experimentales hasta que se logre la competencia.
La progresión de la reparación cardíaca se puede evaluar mediante ecocardiografía para medir la función cardíaca (es decir, acortamiento fraccionado, fracción de eyección, volumen sistólico y diastólico) una vez dentro de los 3 a 7 días después de la cirugía y otra vez poco antes de cosechar el corazón , sugerida entre 21 y 28 días después de una lesión. Los corazones se pueden recolectar para limpiar en múltiples puntos de tiempo después de la cirugía de infarto de miocardio.
El paso de limpieza (paso 2.17) está sujeto a variaciones en la duración dependiendo de la edad y la tensión del ratón desde el que se extraje el corazón, lo que puede resultar en diferencias en el tamaño del corazón. Para un ratón de fondo B6, la duración de compensación basada en la edad se estima de la siguiente manera: P1 (7-10 días), P7 (14-17 días), P14 (21-24 días), P21 (28-31 días), P28 (35-38 días). Aunque el enfoque principal de nuestro laboratorio es la limpieza del corazón, nuestro método pasivo CLARITY ha tenido éxito para limpiar los pulmones de los ratones (resultados inéditos) y no prevemos ningún límite para aplicar ampliamente esto a otros órganos. En general, nuestro proceso de limpieza acelerada es muy valorado por la capacidad de limpiar los tejidos rápida y eficazmente.
Cabe señalar que pueden surgir complicaciones al aplicar técnicas de limpieza de tejidos en órganos con reporteros endógenos en subpoblaciones raras. La señal de reportero en poblaciones de células densas (como los miocitos23)parece ser más resistente al proceso de limpieza y, por lo tanto, la señal se conserva típicamente; sin embargo, otras poblaciones celulares más sensibles (como los nervios cardíacos) son propensas a tener una señal de proteína fluorescente endógena apaciada después de una fijación o limpieza prolongadas. Esto se hizo evidente en el Actl6bCre; El modelo de ratón reportero Rosa26tdT, donde los corazones P7 fijados brevemente durante 15 minutos mostraron una señal tdT fuerte(Figura 3A),sin embargo, esta señal fluorescente se acalmtó después de la fijación durante 1 hora o durante la noche en la Solución de Compensación (no se muestran los datos). En el escenario de la señal de reportero perdida, la tinción de anticuerpos dirigida a la proteína del reportero es compatible con la limpieza de tejido para amplificar la señal(Figura 3). La adición de un paso de inmunoetiquetado puede ser ventajosa para los tejidos sometidos a imágenes extensas, ya que los anticuerpos conjugados son resistentes a la lejía y producen una expresión estable y a largo plazo. Con la capacidad de rastrear proteínas endógenamente y a través de la inmunomancha, nuestro protocolo permite la localización precisa de poblaciones de células cardíacas raras que residen en lo profundo del corazón.
Los corazones despejados pueden someterse a un rastreo de linaje o a un análisis de expresión de proteínas fluorescentes mediante microscopía confocal 3D de montaje completo. El microscopio confocal está equipado con líneas láser optimizadas para excitar a reporteros florescentes (o anticuerpos secundarios conjugados), por ejemplo: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) y APC (Cy5, Alexa Fluor 647) a 405 nm, 488 nm, 561 nm y 683 nm, respectivamente. Para muestras de corazón que no pueden caber en una diapositiva de depresión, común si el corazón cosechado postnatalmente, se puede hacer una diapositiva de depresión personalizada mediante impresión 3D en polipropileno. Las diapositivas personalizadas siguieron las dimensiones de una diapositiva de depresión del microscopio (25 mm x 75 mm x 1 mm), variando la profundidad del pozo a 6,5 mm o 17 mm(Figura 4).
Con el fin de visualizar las líneas celulares del reportero en 3D, el microscopio confocal está configurado para adquirir imágenes apiladas en z en todo el corazón. Al tomar imágenes de corazones más grandes, es posible que todo el corazón no pueda ser capturado en una sola imagen apilada en z, incluso con un objetivo de aumento bajo. En este escenario, una serie de varias imágenes apiladas en z tomadas en diferentes regiones del corazón se pueden unir utilizando una función de imagen grande. Esto se logra calibrando el microscopio a la lente objetivo adecuada y especificando el campo para el área de escaneo de imagen grande. A continuación, las imágenes apiladas en z se someten a una reconstrucción 3D utilizando un programa de renderizado de volumen y una proyección de intensidad máxima(Figura 3). Las imágenes de alta resolución adquiridas se pueden analizar para determinar el patrón preciso de celdas espaciales 3D de poblaciones de células objetivo.
En conjunto, este protocolo proporciona una poderosa herramienta molecular para entender los cambios celulares dinámicos que se producen durante la reparación y regeneración cardíaca. Este método describe los pasos para inducir un infarto de miocardio, realizar la limpieza de órganos enteros, rastrear poblaciones específicas de células y analizar el patrón de células 3D. En conjunto, estas técnicas proporcionan acceso a poblaciones de células traza que antes eran inaccesibles debido a su escasa presencia o ubicación dentro del tejido. Esto permitirá seguir investigando las cuestiones de suma importancia para avanzar en los enfoques terapéuticos en la medicina regenerativa, en particular las destinadas a estimular la regeneración cardíaca endógena.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El financiamiento para este proyecto fue proporcionado por la Escuela de Medicina y Salud Pública de la UW del Programa de Asociación de Wisconsin (A.I.M.), y un Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J.
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
