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Immunology and Infection

चूहों में इन्फ्लूएंजा ए वायरस संक्रमण के दौरान टी कूप सहायक कोशिकाओं और अंकुरित केंद्र प्रतिक्रिया का मूल्यांकन

Published: June 27, 2020 doi: 10.3791/60523
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1
1CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2School of Life Science, University of Science and Technology of China, 3State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के माउस मॉडल में टीएफएच और जीसी बी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

टी कूप सहायक (Tfh) कोशिकाओं एक स्वतंत्र CD4+ टी सेल सबसेट अंकुरित केंद्र (जीसी) विकास और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए मदद प्रदान करने में विशेषज्ञता है । इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में, प्रभावी वायरस उन्मूलन की सुविधा के लिए मजबूत टीएफएच और जीसी बी सेल प्रतिक्रियाएं प्रेरित होती हैं, जो टीएफएच से जुड़े अध्ययन के लिए एक योग्य माउस मॉडल प्रदान करती हैं। इस पेपर में हमने चूहों में इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के दौरान बेसिक टीएफएच से जुड़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने में प्रोटोकॉल का वर्णन किया । इन प्रोटोकॉल में शामिल हैं: इन्फ्लूएंजा वायरस का इंट्रानासल टीका; पॉलीक्लोनल और एंटीजन-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाओं, जीसी बी कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला और विश्लेषण; जीसी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन; सीरम में इन्फ्लूएंजा वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी के एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) । ये परख मूल रूप से इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में टीएफएच कोशिकाओं के भेदभाव और कार्य की मात्रा निर्धारित करते हैं, इस प्रकार भेदभाव तंत्र और हेरफेर रणनीति को स्पष्ट करने में अध्ययन के लिए मदद प्रदान करते हैं।

Introduction

हाल के दशक में, कई अध्ययनों को अंकुरित केंद्र (जीसी) बी विकास में अपनी आवश्यक भूमिकाओं के लिए नए पहचाने गए सीडी 4+ टी सेल सबसेट, टीएफएच सेल सबसेट पर केंद्रित किया गया है। बी सेल लिंफोमा 6 (बीसीएल6), जिसे मुख्य रूप से जीन दमनकारी माना जाता है, इस साक्ष्य के लिए टीएफएच कोशिकाओं का वंश-परिभाषित कारक है कि बीसीएल 6 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति टीएफएच भेदभाव को चलाने के लिए पर्याप्त है, जबकि बीसीएल6 के परिणाम की कमी गायब हो गई टीएफएच विभेदन1,2,3। अन्य सीडी 4+ टी सहायक सबसेट सूजन की साइटों पर माइग्रेशन द्वारा अपने प्रभावक कार्य करने के विपरीत, टीएफएच कोशिकाएं मुख्य रूप से तिल्ली और लिम्फ नोड के बी सेल कूप क्षेत्र में बी सेल सहायता प्रदान करती हैं। सह-उत्तेजक अणु आईसीओएस और सीडी 40एल, टीएफएच और जीसी बी कोशिकाओं के बीच बातचीत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टीएफएच भेदभाव के दौरान, आईसीओ कॉग्नेट बी कोशिकाओं से आवश्यक संकेतों को प्रसारित करता है और बी सेल जोन स्थानीयकरण4,5के लिए दर्शक बी कोशिकाओं से माइग्रेशन सिग्नल प्राप्त करने वाले रिसेप्टर के रूप में भी कार्य करता है। CD40L बी कोशिकाओं के प्रसार और अस्तित्व6के लिए टीएफएच कोशिकाओं से संकेतों का एक मध्यस्थ है । CD40L के समान भूमिका निभाने वाला एक अन्य कारक साइटोकिन आईएल21 है, जो मुख्य रूप से टीएफएच कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है। IL21 सीधे जीसी बी कोशिकाओं के विकास और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी के उत्पादन को नियंत्रित करता है, लेकिन Tfh भेदभाव में अपनी भूमिका अभी भी विवादास्पद7,8है । पीडी-1 और सीएक्ससीआर 5, जो अब प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में टीएफएच कोशिकाओं की पहचान करने में सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं, इस सबसेट के विभेदन और कार्य में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। CXCR5 बी सेल कूप केमोकिन का रिसेप्टर है और बी सेल कूप9में टीएफएच कोशिकाओं के स्थानीयकरण में मध्यस्थता करता है। पीडी-1 की पहचान अब न केवल कूप मार्गदर्शन समारोह के लिए की गई है बल्कि जीसी बी कोशिकाओं आत्मीयता परिपक्वता10की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण संकेतों को भी प्रसारित करती है । इन निष्कर्षों के आधार पर, इन अणुओं की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन मूल रूप से टीएफएच कोशिकाओं की परिपक्वता और कार्य को प्रतिबिंबित कर सकता है।

जीसी माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में एक प्रेरित क्षणिक माइक्रोएनाटॉमिकल संरचना है और टीएफएच कोशिकाओं पर अत्यधिक निर्भर है, इस प्रकार टीएफएच प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श रीडआउट है। जीसी में, साइटोकिन्स और सह-उत्तेजक अणुओं द्वारा मध्यस्थता किए गए संकेतों को प्राप्त करने के बाद, बी कोशिकाएं उच्च-आत्मीयता एंटीबॉडी11उत्पन्न करने के लिए वर्ग स्विचिंग और दैहिक हाइपरम्यूटेशन के अधीन हैं। अंतर एंटीबॉडी वर्ग स्विचिंग अंतर साइटोकिन आला में होता है, जिसमें आईएल4 और आईएल21 आईजीजी 1 वर्ग स्विचिंग को प्रेरित करते हैं जबकि IFNγ आईजीजी 2 वर्ग स्विचिंग12को प्रेरित करता है। प्लाज्मा कोशिकाएं गुप्त एंटीबॉडी के उत्पादक हैं और मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं। टीएफएच कोशिकाओं की तरह, जीसी में बी कोशिकाओं का विकास कई महत्वपूर्ण अणुओं की गतिशील अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है। वर्तमान अध्ययन के आधार पर, जीसी बी कोशिकाओं को B220 + PNA+Fas+ या B220+GL7+Fas +कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है, उनके अग्रदूतों की तुलना में, B220 की अभिव्यक्ति को कम करना और CD138 अभिव्यक्ति13को बढ़ाया जा सकता है । क्या अधिक है, इन दोनों विशेषताओं प्रवाह साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण में पता लगाया जा सकता है, इस प्रकार जीसी प्रतिक्रिया का उचित मूल्यांकन किया जा रहा है ।

मजबूत सेलुलर और विनोदी प्रतिक्रियाएं इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में प्रेरित होती हैं, टीएफएच और टीएच1 कोशिकाओं पर हावी होने वाली सीडी 4+ टी सेल रिस्पांस14,जो इसे टीएफएच कोशिकाओं के भेदभाव अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल बनाती है। इन्फ्लूएंजा ए/प्यूर्टो रिको/8/34 एच1एन1 (पीआर8), जो आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला माउस-अनुकूलित तनाव है, अक्सर इस अध्ययन में14,15,16का उपयोग किया जाता है । यहां, हम टीएफएच अध्ययन के कुछ बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं-इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में प्रासंगिक परख: 1) पीआर 8 वायरस का इंट्रानासल टीका; 2) एंटीजन-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाएं, जीसी बी और प्लाज्मा कोशिकाएं और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ आईएल21 का पता लगाना; 3) जीसी के हिस्टोलॉजिकल विज़ुअलाइज़ेशन; 4) एलिसा के साथ सीरम में एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी टाइटर का पता लगाना। ये प्रोटोकॉल टीएफएच से जुड़े अध्ययन में नए शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक तकनीक प्रदान करते हैं।

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Protocol

पशु प्रयोगों को चीन के शंघाई के संस्थान पाश्चर की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी प्रयोग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के आधार पर किए गए थे ।

नोट: चूहों के वायरस संक्रमण और अंगों के अलगाव ABSL2 हालत के तहत किया जाना चाहिए ।

1. PR8 इन्फ्लूएंजा वायरस का टीका और चूहों के वजन की रिकॉर्डिंग

  1. ABSL2 कमरे में संक्रमण के लिए 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों को तैयार करें ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल मादा चूहों के साथ प्रयोगों में भी उपयुक्त है।
  2. पीआर 8 वायरस का कमजोर पड़ना:वायरस को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर निकालें और बर्फ पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि यह तरल में पिघल न जाए। भंवर स्टॉक वायरस अच्छी तरह से और एक पूर्व ठंडा 1.5 ml ट्यूब में बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, १३५ mm NaCl, २.७ mm KCL, 10 mm Na2HPO4,१.८ mm KH 2 पीओ4)के साथ2PFU/μL के लिए वायरस पतला ।
  3. चूहों एनेस्थेटाइजेशन: प्रत्येक माउस का वजन करें और उपयोग किए जाने वाले सोडियम पेंटोबार्बिटल (2 मिलीग्राम/एमएल) की मात्रा (4 गुना (μL) माउस वजन (जी)) की गणना करें। सोडियम पेंटोबार्बिटल इंट्रापेरिटोनली की गणना की गई मात्रा को इंजेक्ट करें।
    नोट: यह कदम चूहों को तेजी से और शांति से सांस लेने के लिए है, ताकि वायरस के सटीक टाइटर को इंट्रानासॉलीय रूप से टीका लगाया जा सके। बहुत तेज या धीमी गति से दिल की धड़कन अनुचित एनेस्थेटाइजेशन का संकेत देती है। इसके अलावा, आंखों के सूखेपन से बचने के लिए पशु चिकित्सक मरहम के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
  4. इंट्रानसल टीका:पतला पीआर 8 वायरस को अच्छी तरह से भंवर। पिपेट 10 माइक्रोन और सावधानी से ड्रॉप करके एक तरफ ड्रॉप पर इंट्रानासल टीका करें। इस तरफ एक पिंजरे (अधिकतम 5 चूहों) में सभी चूहों का टीका खत्म करने के बाद, दूसरी तरफ टीका दोहराएं (टीका के माध्यम से माउस की सांस शांतिपूर्ण और स्थिर रखें)। प्रत्येक माउस कुल में पीआर8 वायरस के 40 PFU से संक्रमित है।
  5. बेहतर पुनरुद्धार के लिए गर्म पिंजरों में स्टर्नल रेक्यूम्बेंसी में चूहों को रखें।
  6. 10 दिनों के लिए दैनिक माउस वजन की निगरानी करें। (संक्रमण दिवस 0 दिन के रूप में दर्ज की गई है) ।

2. तिल्ली और मध्यस्थ लिम्फ नोड (एमएलएन) से लिम्फोसाइट्स का अलगाव

  1. माउस इच्छामृत्यु:चूहों को एक छोटे से कक्ष में रखें और कक्ष के नीचे से शांति से सीओ2 में पंप करके चूहों को इच्छामृत्यु दें। चूहों को बाहर निकालें जब वे आगे नहीं बढ़ते हैं और चूहों को पूरी तरह से मरने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करते हैं। चूहों को 75% इथेनॉल के साथ डुबो दें और जैवसेफ्टी हुड में स्थानांतरित करें।
  2. शोषक कागज से ढके विच्छेदन फोम प्लेट पर विच्छेदन सुइयों के साथ चूहों को स्थिर करें। पेट के मिडलाइन और पिछले पैरों के साथ त्वचा को विच्छेदन कैंची से काटें और चिमटी के साथ त्वचा को फैलाएं। विच्छेदन सुइयों के साथ फैला हुआ त्वचा को स्थिर करें।
  3. प्रत्येक माउस के लिए दो 6 सेमी व्यंजन तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें। प्रत्येक डिश में 70-माइक्रोन सेल छन्नी डालें और 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (डीएमईएम (1% एफबीएस) के साथ पूरक डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें)
  4. तिल्ली अलगाव: विच्छेदन कैंची के साथ पेट की गुहा का पर्दाफाश करने के लिए पेरिटोनम काटें। तिल्ली लें और तैयार डिश में डाल दें।
  5. एमएलएन अलगाव: डायाफ्रामा और पिंजरे की पसली के नीचे थाइमस के आसपास काटें। पसली को एक तरफ खींचें और छाती गुहा को बेनकाब करने के लिए विच्छेदन सुइयों के साथ पिन करें। फेफड़ों को दाईं ओर खींचें और चिमटी का उपयोग एमएलएन लेने के लिए करें, दिल के नीचे और श्वासनली के वेंट्रल साइड के पास।
  6. तैयार डिश में एमएलएन डाल दें।
  7. एकल सेल निलंबन प्राप्त करें: 70-माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से 3 एमएल सिरिंज के एक प्लंजर के साथ धीरे-धीरे तिल्ली या एमएलएन जाल। ताजा डीएमईएम (1% एफबीएस) के 1 मिलीएल के साथ सेल छन्नी कुल्ला। सेल निलंबन को फिर से खर्च करें और 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट निकालें और डीएमईएम (1% एफबीएस) के 1 मिलीएल जोड़ें।
  9. सेल पेलेट को 1 एमएल-पिपेट के साथ अच्छी तरह से रीसुस्ल करें। डीएमईएम (1% एफबीएस) के 4 एमएल को तिल्ली सेल निलंबन में जोड़ें और उन्हें निम्नलिखित कार्यों के लिए बर्फ पर रखें।
    नोट: गोली से पूरी तरह से अलग करने के लिए, 5 एमएल नहीं, सबसे पहले माध्यम के 1 एमएल के साथ सेल पेलेट को फिर से खर्च करना आवश्यक है।
    इस कदम से आगे, सभी संचालन नियमित प्रयोगशाला में किया जा सकता है।
  10. तिल्ली सेल गिनती
    1. कई बार ट्यूबों को ऊपर और नीचे मोड़कर कोशिकाओं को फिर से उठाया। रेड ब्लड सेल (आरबीसी) लाइसिस बफर (10 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 7.5, 155एम एनएच4सीएल) के 90 माइक्रोन में 10 माइक्रोन लें। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट और प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए ठंडे PBS के ९०० माइक्रोन जोड़ें ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। ठंड पीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ पुनर्सुस्ल। कोशिकाओं के 10 माइक्रोन को 0.4% w/v ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोल में लें और हीमोसाइटोमीटर के साथ सेल काउंटिंग के लिए मिश्रण से 10 माइक्रोन लें।
    3. गणना: नियमित विधि के रूप में कोशिकाओं की गणना करें। संक्षेप में, हीमोसाइटोमीटर पर दो विकर्ण कोने वर्गों में सेल संख्या गिनती और प्रत्येक कोने वर्ग के लिए N1, N2 मिलता है । 5-एमएल सेल सस्पेंशन की सेल एकाग्रता की गणना (N1 +N2) /2 x 104/एमएल के रूप में की जानी चाहिए ।

3. पीडी-1 और सीएक्ससीआर 5 के साथ पॉलीक्लोनल टीएफएच कोशिकाओं का इम्यूनोस्टेटिंग

  1. बायोटिन-एंटी-सीएक्ससीआर 5 एंटीबॉडी के साथ धुंधला।
    1. ट्यूब को ऊपर और नीचे करके सेल निलंबन को फिर से उठाया जाता है। FACS ट्यूब में 2 x 106 कोशिकाओं को लें और स्टेनिंग बफर (पीबीएस (1% एफबीएस, 1 एमएमएम ईडीटीए)) के 2 मिलील जोड़ें। भंवर दोलन डिवाइस पर भंवर से धोएं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। तरल बाहर डालने का कार्य करके सुपरनेट को त्यागें और शोषक कागज पर ट्यूब मुंह को दो बार डुबोएं।
    3. ट्यूब के नीचे दोहन करके अवशेष तरल के साथ सेल गोली को ढीला करें। ट्यूब होल्डर में ट्यूब को बर्फ पर रख दें।
      नोट: अवशेष तरल की मात्रा लगभग 25 माइक्रोन है।
    4. प्रत्येक ट्यूब के लिए एंटी-माउस सीडी 16/सीडी32 (एफसी-रिसेप्टर अवरोधक) का 0.2 माइक्रोल जोड़ें। भंवर ट्यूब नीचे धीरे से दोहन और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट द्वारा ।
      नोट: प्रत्येक ट्यूब के लिए धुंधला बफर के 5μL के साथ कमजोर पड़ने से कई नमूनों के लिए एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। मिश्रण के लिए नुस्खा पतला (n/10 +1) x 0.2 μL एफसी-रिसेप्टर अवरोधक (n/10 +1) x 5 μL धुंधला बफर और प्रत्येक ट्यूब में 5.2 μL मिश्रण जोड़ने के द्वारा तैयार किया जाना चाहिए।
    5. ट्यूब के नीचे टैप करके प्रत्येक ट्यूब और भंवर के लिए धुंधला बफर के अवशेष 30 माइक्रोन में बायोटिन-एंटी माउस CXCR5 के 0.3 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: चरण 3.1.4 में वर्णित मिश्रण तैयार करें।
    6. 30 मिनट पर ट्यूब को टैप करके धीरे-धीरे पुनर्व्यनशील कोशिकाओं के साथ 1 घंटे के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: 30 मिनट पर भंवर बेहतर धुंधला करने के लिए सेल समुच्चय से बचने के लिए है ।
    7. भंवर दोलन डिवाइस पर स्टेनिंग बफर और भंवर के 2 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और चरण 3.1.2 में वर्णित सुपरनैंट को त्यागें। बाद में धुंधला करने के लिए ट्यूब और बर्फ पर इनक्यूबेट दोहन करके भंवर।
  2. अन्य सतह मार्कर के साथ धुंधला।
    1. 3.1.4 चरण में वर्णित एंटीबॉडी मिश्रण(तालिका1) तैयार करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब में एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें। भंवर ट्यूब नीचे दोहन और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट द्वारा ।
    3. स्टेनिंग बफर के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    4. सुपरनेट को त्यागें और धुंधला बफर के 400 माइक्रोल जोड़ें। भंवर दोलन डिवाइस पर ट्यूब भंवर और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण तक अंधेरे में ट्यूब रखने के लिए।

4. PR8 इन्फ्लूएंजा वायरस एनपी-विशिष्ट Tfh कोशिकाओं की इम्यूनोस्टेटिंग

नोट: एनपी-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाओं को धुंधला करने का यह प्रोटोकॉल पिछले अध्ययनों से15,17है ।

  1. बायोटिन-सीएक्ससीआर 5 धुंधला करें जैसा कि चरण 3.1 में वर्णित है सिवाय इसके कि स्टेनिंग के लिए लिया गया सेल नंबर प्रवाह साइटोमेट्री में दर्ज किए जाने वाले पर्याप्त एंटीजन-विशिष्ट कोशिकाओं के लिए 3 x10 6 है।
  2. एपीसी-संयुग्मित-आईएबीएनपी 311-325 एमएचसी वर्ग द्वितीय(एनपी 311-325)टेट्रामर के 0.3 माइक्रोन को 3.1.7 से ट्यूब में जोड़ें। चरण 3.1.4 के रूप में कई नमूनों के लिए मिश्रण तैयार
    नोट: विरोधी सीडी 4 एंटीबॉडी के अलावा से पहले टेट्रामर को दाग देना महत्वपूर्ण है क्योंकि सीडी 4 और एंटी-सीडी 4 एंटीबॉडी के बीच बाध्यकारी इष्टतम टेट्रामर धुंधला में हस्तक्षेप करेगा।
  3. धीरे ट्यूब दोहन और 30 मिनट के लिए आरटी में अंधेरे में इनक्यूबेट द्वारा सेल मिश्रण को फिर से खर्च करें ।
    नोट: वाष्पीकरण को कम करने के लिए ट्यूबों के मुंह पर एक गीला कागज कवर
  4. अन्य सतह मार्कर(तालिका 1)का मिश्रण जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेशन जारी रखें।
  5. चरण 3.2.3 और 3.2.4 में वर्णित कोशिकाओं को धोएं और पुन: रखें।

5. पॉलीक्लोनल टीएफएच कोशिकाओं में बीसीएल6 का इम्यूनोस्टेटिंग

  1. धारा 3 में वर्णित सतह मार्कर(टेबल 2)धुंधला करें सिवाय इसके कि बफर को धुंधला करने के बजाय पीबीएस के 2 एमएल के साथ अंतिम धोना।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ट्यूब के नीचे धीरे-धीरे टैप करके सुपरनैंट और रिसिपेंड सेल छर्रों को त्यागें।
  3. सेल निर्धारण के लिए ट्यूब में 3.7% फॉर्मलडिहाइड समाधान (पीबीएस के साथ 37% फॉर्मलडिहाइड से पतला) के 300 माइक्रोन जोड़ें। भंवर दोलन डिवाइस पर भंवर और 20 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर धोने और अपकेंद्रित्र के लिए धुंधला बफर के 2 एमएल जोड़ें। ट्यूब को धीरे-धीरे टैप करके सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को त्यागें।
  5. भंवर दोलन डिवाइस पर भंवर द्वारा 0.2% ट्राइटन-एक्स 100 और रिसिप्ट कोशिकाओं के 300 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  6. धोने के लिए धुंधला बफर के 2 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ट्यूब के नीचे धीरे-धीरे टैप करके सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को त्यागें।
  7. प्रत्येक ट्यूब के लिए पीई-एंटी-बीसीएल6 एंटीबॉडी का 1.5 माइक्रोन जोड़ें। धीरे से ट्यूब नीचे दोहन करने के लिए मिश्रण को फिर से खर्च और धीरे से हर 30 मिनट ट्यूब दोहन के साथ 2 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
    नोट: मिश्रण वाष्पीकरण को कम करने के लिए ट्यूबों के मुंह पर एक गीले कागज को कवर करें।
  8. ट्यूब में 0.01% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ पूरक पीबीएस के 2 मिलीएल जोड़ें। भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  9. चरण 5.8 के रूप में धो लें। धुंधला बफर के 400 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण तक बर्फ पर अंधेरे में कोशिकाओं को रखें।

6. IL21 के इंट्रासेलुलर धुंधला

  1. पीएमए (फरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट) और आयनोमाइसिन के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
    1. 2 x 106 कोशिकाओं को प्लीहा सेल सस्पेंशन से लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट और रिसिपेंड सेल पेलेट को 500 माइक्रोन के साथ कंप्लीट टी सेल मीडियम के साथ छोड़ दें। कोशिकाओं को 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
    2. 20 nmol PMA और 2 μmol आयनोमाइसिन को पूर्ण मध्यम18 के 500 माइक्रोन में जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. 24-वेल प्लेट में सेल निलंबन में चरण 6.2 में तैयार समाधान जोड़ें और प्लेट मिलाते हुए मिलाएं। कोशिकाओं में पीएमए और आयनोमाइसिन के अलावा बिना 500 माइक्रोन पूर्ण टी सेल माध्यम जोड़कर अउत्जीव नियंत्रण स्थापित करें। 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक CO2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट।
    4. गोलगी तंत्र मध्यस्थता प्रोटीन परिवहन को अवरुद्ध करने के लिए प्रत्येक कुएं में 10 माइक्रोमोल बीएफए (ब्रेफेल्डिन ए, मेथनॉल के साथ भंग) जोड़ें। प्लेट को सेल इनक्यूबेटर में वापस रखें और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. सेल सतह मार्कर धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    1. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से उठाया और कोशिकाओं को एक FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में धुंधला बफर के 1 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
    2. चरण 3.1.4 के रूप में एफसी-रिसेप्टर अवरोधक धुंधला प्रदर्शन करें।
    3. पीबीएस के 2 एमएल के साथ वाशिंग सेल को छोड़कर चरण 3.2.1 से 3.2.3 चरणों में वर्णित सेल सतह मार्कर(टेबल3) का प्रदर्शन करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ट्यूब बॉटम को टैप करके सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को त्याग दें।
  3. लाइव/डेड फिक्सेबल एक्वा सेल स्टेनिंग किट से रिएजेंट का ०.२ माइक्रोन जोड़ें और मृत कोशिकाओं के धुंधला प्रदर्शन करने के लिए 10 मिनट के लिए आरटी में अंधेरे में ट्यूब को इनक्यूबेट करें ।
  4. भंवर दोलन डिवाइस पर ट्यूब और भंवर में पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
  5. चरण 5.3 और 5.4 में वर्णित सेल निर्धारण करें।
  6. कोशिकाओं को फिर से पेंड करने के लिए स्टेनिंग बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूबों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें। सुपरनेट को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    नोट: इस चरण को छोड़ा जा सकता है और चरण 6.5 के बाद सीधे 6.7 चरण जारी रख सकता है।
  7. भंवर दोलन डिवाइस पर ट्यूब और भंवर में सैपोनिन बफर (0.2% (w/v) सैपोनिन के साथ सप्लीमेंट बफर के 1 मिलील जोड़ें। सेल पारमेबिलाइजेशन करने के लिए 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
  9. प्रत्येक ट्यूब में मानव एफसी-IL21 रिसेप्टर के 0.5 माइक्रोन जोड़ें। बफर को धुंधला करने के बजाय सैपोनिन बफर के साथ उस पतला एंटीबॉडी को छोड़कर चरण 3.1.4 के रूप में कई के लिए एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें।
  10. 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट धीरे से 30 मिनट पर कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए ट्यूब नीचे दोहन के साथ ।
  11. 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र धोने के लिए सैपोनिन बफर के 2 एमएल जोड़ें। सुपरनेट को त्यागें और एक बार धो लें।
  12. प्रत्येक ट्यूब में एपीसी-एंटी-ह्यूमन आईजी (एच + एल) का 0.1 माइक्रोल जोड़ें। 3.1.4 चरण के रूप में कई नमूनों के लिए मिश्रण तैयार करें सिवाय इसके कि बफर को धुंधला करने के बजाय सैपोनिन बफर के साथ पतला एंटीबॉडी।
  13. 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को इनक्यूबेट करें और चरण 6.11 के रूप में धोएं।
  14. धुंधला बफर के 400 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण तक बर्फ पर अंधेरे में नमूना रखें।

7. जीसी बी और प्लाज्मा कोशिकाओं धुंधला

  1. कोशिकाओं को लें और 3.1.1 से 3.1.4 तक के चरणों के रूप में एंटी-एफसी-रिसेप्टर एंटीबॉडी धुंधला करें।
  2. 3.1.5से 3.1.7 तक के चरणों के रूप में सतह मार्कर धुंधला (टेबल 4) करें, सिवाय इसके कि इनक्यूबेशन समय 1 घंटे के बजाय 30 मिनट है।
  3. धुंधला बफर के 400 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। नमूनों को प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण तक बर्फ पर अंधेरे में रखें।

8. रक्त से सीरम का अलगाव

  1. दिन 14 के बाद संक्रमण (d.p.I 14), चेहरे की नस से रक्त इकट्ठा और एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रक्त के नमूने रात भर रहते हैं ।
    नोट: ABSL2 हालत में रक्त संग्रह प्रदर्शन और इस कदम से आगे सभी प्रक्रियाओं नियमित रूप से प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर रक्त को सेंट्रलाइज करें। लाल कोशिकाओं के प्रदूषण से बचने के लिए सीरम को 200 माइक्रोल पिपेट के साथ सावधानी से अलग करें। प्रत्येक नमूने के लिए 3 ट्यूबों में Aliquot और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. एलिसा के साथ एचए-विशिष्ट एंटीबॉडी टिटर की परख

  1. कोट एलिसा प्लेटें 2 μg/mL HA प्रोटीन समाधान के 50 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रात भर इनक्यूबेट।
  2. पीबीएस-पतला 0.05% ट्वीन (पीबीएसटी) के 200 माइक्रोन के साथ तीन बार धोएं। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करने के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीटीएसटी-पतला 5% स्किम्ड दूध का 100μL जोड़ें और आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. सीरम कमजोर पड़ने और इनक्यूबेशन: कमजोर पड़ने बफर के रूप में पीबीएस में 3% बीएसए तैयार करें। 1:50, 1:150, 1:450 के रूप में कमजोर पड़ने बफर में सीरम पतला...... 1:36450 (3 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने की सिफारिश की है) । प्रत्येक अच्छी तरह से पतला सीरम के 50 माइक्रोन जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में इनक्यूबेट करें।
  4. सीरम को त्यागें और प्रत्येक कुएं में पीबीएसएल के 200 माइक्रोन जोड़कर एक बार कुओं को धो लें (इसे धीरे से हिलाएं, फिर त्यागें)। फिर धीरे-धीरे 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पीबीएसएल के 200 माइक्रोन के साथ शेखर पर प्लेटें धोएं।
  5. कुल आईजीजी, आईजीएम, आईजीजी 1, आईजीजी 2बी, आईजीजी 2सी (1:5000, पीबीटीएसटी के साथ पतला) और 1 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट के लिए एचआरपी-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी विशिष्ट के 100 माइक्रोन जोड़ें। 9.4 में वर्णित पीबीएएसटी द्वारा प्लेटों को धोएं।
  6. बफर ए और बफर बी (टीएमबी) की बराबर मात्रा को 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से बाहर निकालें और उपयोग से पहले आरटी में कम से कम 30 मिनट तक गर्म करें। ए और बी को मिलाएं और प्रत्येक कुएं में टीएमबी के 100 माइक्रोन जोड़ें और उन्हें धीरे-धीरे हिलाकर आरटी में 10-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह टीएमबी सब्सट्रेट रिएजेंट सेट (बीडी,555214) मैनुअल का संक्षिप्त विवरण है।
  7. प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 2एम एच2एसओ 4 के पिपेट 100माइक्रोल। साधन के माध्यम से OD450 मूल्य पढ़ें।
  8. डेटा विश्लेषण: पृष्ठभूमि संकेत (खाली अच्छी तरह से OD450 मूल्य) घटाकर अंतिम OD450 मूल्य प्राप्त करें। एक्स एक्सिस पर कमजोर पड़ने वाले कारक और वाई एक्सिस पर OD450 मूल्य के साथ प्रत्येक नमूने के एंटीबॉडी आइसोटाइप के अनुरूप वक्र ड्रा करें।

10. हिसटोलॉजी

  1. d.p.i 10 पर तिल्ली को अलग करें । उन्हें आरटी में 1 घंटे के लिए 3.7% फॉर्मलडिहाइड समाधान में ठीक करें। फिक्सेशन बफर को छोड़ें और तीन बार के लिए शेखर पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धोएं।
  2. पीबीएस (10% सुक्रोज) में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लीहा को निर्जलित करें और फिर उन्हें पीबीएस (30% सुक्रोज) में 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्जलित करें, जब तक कि तिल्ली 15 एमएल ट्यूब के नीचे तक नहीं डूबती।
  3. निर्जलित प्लीहा बाहर निकालें, उन्हें इष्टतम काटने के तापमान यौगिक और क्रायोसेक्शन में एम्बेड करें।
  4. एसीटोन को -20 डिग्री सेल्सियस पर प्री-चिल करें। 10 मिनट के लिए पूर्व ठंडा एसीटोन के साथ ऊतक वर्गों को इनक्यूबेट करें। ऊतक को तीन बार पीबीएस से धोएं।
  5. 20 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स-100 वाले पीबीएस के साथ ऊतक अनुभागों को पार करें और उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  6. आरटी में 1 घंटे के लिए 10% सामान्य बकरी सीरम (अवरुद्ध बफर) वाले पीबीएस के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करें और एक बार पीबीएस के साथ ऊतक अनुभागों को धोएं।
  7. स्ट्रेप्टाविडिन/बायोटिन ब्लॉकिंग किट के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को ब्लॉक करें।
    नोट: इस कदम से नमूनों को सूखने न दें।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला: ऊतक वर्गों पर बफर-पतला बायोटिन-पीएनए (25 μg/mL) और चूहा विरोधी माउस IgD (2.5 μg/mL) को ध्यान से जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में गीले चैंबर में टिश्यू सेक्शन को इनक्यूबेट करें।
  9. एक बार पीबीएसटी के साथ टिश्यू सेक्शन को जल्दी से धोएं। पीबीएसटी में ऊतक वर्गों को धीरे-धीरे 5 मिनट तक हिलाते हुए धोएं। तीन बार के लिए धो लें।
  10. पतला एलेक्सा फ्लोरर 488-स्ट्रेप्टाविडिन (1:500) और एलेक्सा फ्लोर 555-बकरी-एंटी चूहा आईजीजी (1:500) बफर को अवरुद्ध करने के साथ एंटीबॉडी और उन्हें ऊतक वर्गों पर ध्यान से जोड़ें
  11. 1 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  12. ऊतक वर्गों को चरण 10.8 के रूप में धोएं और लंबे समय तक समाधान के साथ सावधानी से माउंट करें। टिश्यू को कवरस्लिप के साथ ध्यान से कवर करें और कॉन्फोकल एनालिसिस तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें।
  13. प्रति क्षेत्र आकार जीसी संख्या की गिनती करके जीसी प्रतिक्रिया के परिमाण का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में माउस रुग्णता का लक्षण वर्णन
इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के बाद, चूहों कम सक्रिय और बीमारी के कारण एनोरेक्सिक होते हैं, जो गंभीर वजन घटाने से परिलक्षित होता है, माउस रुग्णता19की निगरानी के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला लक्षण। जैसा कि चित्रा 1एमें दिखाया गया है, पीआर8 वायरस से संक्रमित चूहों ने 6 दिन पर वजन कम करना शुरू कर दिया, 8 दिन पर उच्चतम हानि स्तर पर पहुंच गया और 10 दिन पर प्रारंभिक स्तर पर लौट आया । जैसा कि अपेक्षित था, पीबीएस-इलाज नियंत्रण चूहों में अवधि के माध्यम से वजन घटाने को नहीं देखा गया था। वीवो लक्षणों में, वायरस संक्रमण इस मामले में ड्रेनिंग लिम्फ नोड, एमएलएन में मजबूत लिम्फोसाइट्स विस्तार की ओर जाता है। इसलिए, नियंत्रण चूहों(चित्रा 1b)की तुलना में पीआर 8 वायरस संक्रमित चूहों में एमएलएन का काफी बड़ा आकार देखा गया। एक साथ लिया, इन चूहों सभी अपेक्षित लक्षण दिखाया और बाद में Tfh से जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अध्ययन के लिए योग्य थे ।

टीएफएच भेदभाव और कार्य से जुड़े अणुओं का पता लगाना
Tfh भेदभाव का विश्लेषण करने के लिए, चूहों को संक्रमण के बाद 5, 7, 10 और 14 दिन पर बलिदान किया गया था और एमएलएन या तिल्ली प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए अलग-थलग थे। चित्रा 2a और चित्रा 2b Tfh जनसंख्या गेटिंग रणनीति दिखाते हैं, टीएफएच के साथ पीडी-1हाय सीएक्ससीआर 5हाय कोशिकाओं और गैर-टीएफएच के रूप में पीडी-1 कम CXCR5कमकोशिकाओं के रूप में गेटेड किया गया है। इस गेटिंग रणनीति के साथ, इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के दौरान टीएफएच भेदभाव की काइनेटिक्स को परख लिया गया था। जैसा कि चित्रा 2c में दिखाया गया है, टीएफएच भेदभाव 5 दिन में शुरू किया गया और 10 दिन में नुकीला। तो हम आगे के विश्लेषण के लिए 10 दिन के नमूने ले लिया । जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, नियंत्रण चूहों की तुलना में इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमित चूहों में मजबूत टीएफएच सेल भेदभाव प्रेरित किया गया था। इन्फ्लूएंजा वायरस-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरोक्रोम-लेबल IAbNP311-325 MHC वर्ग II टेट्रामर्स(एनपी 311-325)पॉलीक्लोनल टीएफएच कोशिकाओं में जोड़ा गया था पैनल(तालिका 1)धुंधला । दोनों mLNs और इंफ्लूएंजा वायरस से प्लीहा-संक्रमित चूहों,एनपी 311-325-विशिष्टसीडी 4+ टी कोशिकाओं को काफी प्रेरित किया गया औरएनपी 311-325-विशिष्टTfh कोशिकाओं के विश्लेषण में पीडी-1 और CXCR5 के अलावा विश्लेषण किया जासकता है (चित्रा 3e)। टीएफएच भेदभाव में बीसीएल6 की आवश्यक भूमिकाओं के कारण, बीसीएल 6+सीएक्ससीआर 5+ कोशिकाएं भी टीएफएच आबादी का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं। लगातार, इस रणनीति के साथ पहचाने गए टीएफएच कोशिकाओं को भी मजबूती से प्रेरित किया गया(चित्रा 3b)। हमने टीएफएच और गैर-टीएफएच कोशिकाओं में बीसीएल6 की अभिव्यक्ति का और विश्लेषण किया। जैसा कि चित्रा 3 सीमें दिखाया गया है, टीएफएच कोशिकाओं में बीसीएल 6 की उच्च अभिव्यक्ति की तुलना में गैर-टीएफएच कोशिकाओं में सफल बीसीएल 6 धुंधला इंगित करता है। इसी तरह की रणनीति के साथ, आईसीओएस, एक और टीएफएच से जुड़े अणु का भी विश्लेषण किया गया(चित्र 3 डी)। बी कोशिकाओं के लिए मदद प्रदान करने में Tfh कोशिकाओं की विशेष भूमिका के कारण, IL21 की अभिव्यक्ति की परख, जो मुख्य रूप से Tfh कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है और सीधे बी कोशिकाओं के अस्तित्व और प्रसार को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया जाता है, कुछ हद तक Tfh कोशिकाओं कार्य प्रकट कर सकता है। जैसा कि चित्रा 3fमें दिखाया गया है, आईएल21 के इंट्रासेलुलर स्टेनिंग से पता चला है कि पीआर 8 संक्रमण ने इस साइटोकिन के काफी अधिक उत्पादन को प्रेरित किया, जिसमें गेटिंग नियंत्रण के रूप में अउत्सुयुक्त कोशिकाएं थीं। एक साथ लिया, इन परख Tfh भेदभाव की बुनियादी जानकारी को प्रतिबिंबित और बी सेल में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है मदद की क्षमता ।

सीरम में जीसी बी और प्लाज्मा कोशिकाओं के विकास और इन्फ्लूएंजा वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाना
टीएफएच कोशिकाओं का मुख्य कार्य जीसी में बी सेल सहायता प्रदान करना है, जिसमें एंटीबॉडी क्लास स्विचिंग और आत्मीयता परिपक्वता होती है। तो जीसी बी विकास अप्रत्यक्ष रूप से भेदभाव और Tfh कोशिकाओं के कार्य को प्रतिबिंबित कर सकता है । जीसी बी कोशिकाओं को B220+PNA+Fas+ कोशिकाओं(चित्रा 2d)के रूप में गेट किया जा सकता है । इस गेटिंग रणनीति के माध्यम से, हमने जीसी बी सेल प्रतिक्रिया के काइनेटिक्स को आसकत किया और पाया कि जीसी बी प्रतिक्रिया 10 दिन में शुरू हुई और 14 दिन(चित्रा 2e)में वृद्धि जारी रही। PR8 वायरस संक्रमित और नियंत्रण चूहों के बीच तुलना मजबूत जीसी बी दोनों mLN और तिल्ली में इंफ्लूएंजा वायरस संक्रमण(चित्रा 4a),जो पीआरबी वायरस संक्रमित चूहों में प्रेरित Tfh भेदभाव के अनुरूप है के बाद प्रेरित किया गया दिखाया । इसके अलावा, आईजीडी और पीएनए के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग पीआर8 वायरस संक्रमित चूहों(चित्रा 4d)में प्रेरित जीसी प्रतिक्रिया (हरे क्षेत्रों) का संकेत देने वाली कल्पना छवियां प्रदान करता है। आईजीडीकमसीडी138+ कोशिकाओं(चित्रा 2डी)के रूप में पहचाने जाने वाले प्लाज्मा कोशिकाएं भी पीआर8 वायरस से संक्रमित चूहों(चित्रा 4बी)में उत्पन्न हुई थीं । पिछले अध्ययनों से यह पहचान की गई है कि IFNƳ और आईएल21 को वायरस संक्रमण में Th1 और Tfh कोशिकाओं दोनों से स्रावित किया जा सकता है और क्रमशः20,IgG2 और IgG1 वर्ग स्विचिंग को प्रेरित कर सकता है। चित्रा 4c एचए-विशिष्ट आईजीएम, कुल आईजीजी, आईजीजी1, आईजीजी 2बी और आईजीजी 2सी की एलिसा परख द्वारा इन्फ्लूएंजा वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी की पीढ़ी को दर्शाया गया है। एक साथ, इन परख के सभी इंफ्लूएंजा वायरस संक्रमण में Tfh से जुड़े बी सेल प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित ।

Figure 1
चित्रा 1: माउस रुग्णता का लक्षण वर्णन। 8 सप्ताह पुराने पुरुष चूहों को इंट्रानासल टीका द्वारा पीआर8 इन्फ्लूएंजा वायरस के ४० PFU से संक्रमित किया गया था । चूहों को 10 दिनों(ए)के लिए दैनिक तौला गया था और एमएलएन को डी.पी.आई 10(बी)पर अलग-थलग कर दिया गया था। में त्रुटि सलाखों(क)समूह प्रति एसडी एन = 4 चूहों ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: टीएफएच कोशिकाओं और जीसी बी कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति। (क)लिम्फोसाइट्स को एफएससी-ए और एसएससी-ए द्वारा परिभाषित किया गया है, और सेल सिंगल्स को एफएससी-ए, एफएससी-एच और एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू के साथ गेट किया जाता है । (ख)सीडी 4+ टी कोशिकाओं में गेटिंग के बाद, सतह मार्कर CD62L और CD44 का उपयोग भोले टी कोशिकाओं (सीडी 44लोसीडी 62एलहाय)और सक्रिय टी कोशिकाओं (सीडी 44हायसीडी62एल लो) को अलग करने के लिए किया जाताहै। पॉलीक्लोनल टीएफएच कोशिकाओं को सक्रिय टी कोशिकाओं से पीडी-1हाय सीएक्ससीआर 5हाय आबादी के रूप में गेट किया जा सकता है, इसके विपरीत, गैर-टीएफएच कोशिकाओं को पीडी-1कमCXCR5कमके रूप में। PR8 वायरस-विशिष्ट Tfh कोशिकाओं को सीडी 4+सीडी 44+ एनपी 311-325 टेट्रामर+पीडी-1 हाय सीएक्ससीआर 5हाय कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कियागया है। (ग,ई) बी220+ कोशिकाओं(ई)में सक्रिय कोशिकाओं(सी)और जीसी बी आवृत्ति में टीएफएच आवृत्ति की काइनेटिक्स। (घ)जीसी बी कोशिकाओं को B220+ PNA+FAS+ कोशिकाओं के रूप में गेट किया जाता है, और प्लाज्मा कोशिकाएं आईजीडी-सीडी138+ कोशिकाएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: PR8 वायरस संक्रमित चूहों में Tfh भेदभाव का विश्लेषण। चूहों को d.p.i 10 पर बलिदान किया गया था और टीएफएच भेदभाव विश्लेषण के लिए mLNs और तिल्ली अलग थे। (क)पीआर8 वायरस संक्रमित चूहों और पीबीएस-इलाज चूहों (ऊपरी पैनल) में mLNs और प्लीहा में Tfh प्रतिशत । टीएफएच कोशिकाओं (निचले पैनल) के आंकड़े। (ख)सीडी 4+सीडी 44आईआई टी सेल्स (अपर पैनल) में बीसीएल6 का इंट्रासेल्युलर धुंधला। बीसीएल6+CXCR5+ कोशिकाओं (लोअर पैनल) के आंकड़े। (ग)बीसीएल6 औरआईसीओएक्सप्रेशन इन टीएफएच (लाइन-रेड) और नॉन-टीएफएच सेल्स (सॉलिड-ग्रे) । ईएमएनमेंएनपी 311-325-विशिष्ट सीडी 4+ टी कोशिकाओं की गेटिंग और पीआर8 वायरस-संक्रमित और पीबीएस-इलाज चूहों (बाएं पैनल) की तिल्ली। एमएलएन और प्लीहा (मध्य पैनल) में पीआर8 वायरस-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाओं का प्रतिशत। "आइसोटाइप" अप्रासंगिक टेट्रामर नियंत्रण के साथ धुंधला इंगित करता है। एनपी311-325के आंकड़े -विशिष्ट सीडी 4+ टी कोशिकाओं (सही पैनल) । (च)पीआरएपी वायरस से संक्रमित और पीबीएस-इलाज चूहों से प्लीहा सीडी 4+ टी कोशिकाओं में आईएल-21 का इंट्रासेल्युलर धुंधला, नियंत्रण के रूप में दिखाया गया अउत्मेशन (बाएं)। आईएल-21 धुंधला (दाएं) के आंकड़े । **P & 0.01, ***P< 0.001 और **** पी एंड एलटी; 0.0001 (दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट)। त्रुटि सलाखों के समूह प्रति एसडी ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । n = 3 चूहों प्रति समूह । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पीआर 8 वायरस संक्रमित चूहों में जीसी बी सेल से जुड़ी प्रतिक्रिया का विश्लेषण। चूहों को d.p.i 10 पर बलिदान किया गया था और mLNs और तिल्ली विश्लेषण के लिए अलग थे । }जीसीबी सेल्स (अपर पैनल) का प्रतिशत। जीसी बी कोशिकाओं (निचले पैनल) के आंकड़े। (ख)प्लाज्मा कोशिकाओं का प्रतिशत (ऊपरी पैनल) । प्लाज्मा कोशिकाओं (निचले पैनल) के आंकड़े। (ग)पीआर8 वायरस-विशिष्ट आईजीजी, आईजीएम, आईजीजी 1, आईजीजी2बी और आईजीजी2सी का सीआरएपी (डी.पी.आई.14) में PR8 वायरस संक्रमित चूहों और पीबीएस-उपचारित चूहों का परिमाणीकरण । (घ)पीआर8 वायरस संक्रमित चूहों और पीबीएस-उपचारित चूहों (d.p.i 10) के तिल्ली नमूनों में बी सेल रोम (आईजीडी+,लाल) और जीसीएस (पीएनए+,ग्रीन) की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी । * पी एंड एलटी; 0.5, **पी एंड एलटी; 0.01, और ***पी एंड एलटी; 0.001 (दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट)। त्रुटि सलाखों के समूह प्रति एसडी ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । n = 3 चूहों प्रति समूह । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सतह मार्कर फ्लोरोक्रोम क्लोन प्रति नमूना मात्रा (उल)
सीडी 4 Percp-eFluor 710 जीके1.5 0.2
सीडी44 ईवॉल्व 605 आईएम7 0.2
सीडी62एल फिटसी एमईएल-14 0.2
आईसीओएस बीवी421 7E.17G9 0.2
पीडी1 पीई/Cy7 29F.1A12 0.3
स्ट्रेप्टाविडिन शारीरिक शिक्षा 0.2

तालिका 1: सतह मार्कर (CXCR5 को छोड़कर) टीएफएच कोशिकाओं (पीडी-1हायCXCR5हाय)को धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी पैनल।

सतह मार्कर फ्लोरोक्रोम क्लोन प्रति नमूना मात्रा (उल)
सीडी 4 Percp-eFluor 710 जीके1.5 0.2
सीडी44 फिटसी आईएम7 0.2
पीडी1 पीई/Cy7 29F.1A12 0.3
स्ट्रेप्टाविडिन बीवी421 0.5

तालिका 2: टीएफएच कोशिकाओं में बीसीएल6 को धुंधला करने के लिए सतह मार्कर एंटीबॉडी (CXCR5 को छोड़कर) पैनल।

सतह मार्कर फ्लोरोक्रोम क्लोन प्रति नमूना मात्रा (उल)
सीडी 4 Percp-eFluor 710 जीके1.5 0.2
सीडी44 फिटसी आईएम7 0.2

तालिका 3: IL21 के इंट्रासेलुलर धुंधला के लिए सतह मार्कर एंटीबॉडी पैनल।

सतह मार्कर फ्लोरोक्रोम क्लोन प्रति नमूना मात्रा (उल)
B220 एपीसी RA3-6B2 0.2
आईजीडी ईफ्लूर 450 11-26c 0.2
सीडी95 पीई/Cy7 जो2 0.3
पीएनए फिटसी 0.3
सीडी138 शारीरिक शिक्षा 281-2 0.2

तालिका 4: जीसी बी और प्लाज्मा बी कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए सतह मार्कर एंटीबॉडी पैनल।

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Discussion

उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी पैदा करने के लिए बी-सेल मदद प्रदान करने में विशेष भूमिकाओं के कारण, टीके डिजाइन के लिए नई रणनीतियों को प्रदान करने के लिए भेदभाव और हेरफेर के तंत्र में टीएफएच कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण जोरदार Tfh और जीसी बी कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं लाती है, इस प्रकार अनुसंधान के इस क्षेत्र के लिए एक उपयुक्त मॉडल जा रहा है । इस पेपर में, हमने इंट्रानासल टीका द्वारा इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के प्रोटोकॉल, प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोफ्लोनेस और एलिसा द्वारा टीएफएच से जुड़ी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन वर्णित किया है। इन परख Tfh भेदभाव, जीसी बी विकास और इंफ्लूएंजा वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने की सुविधा होगी और शोधकर्ताओं का पता लगाने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में नए महत्वपूर्ण अणुओं की पहचान करने में मदद ।

इन्फ्लूएंजा वायरस से संक्रमित चूहों मॉडल के साथ अध्ययन में, वजन घटाने माउस रुग्णता का एक आमतौर पर इस्तेमाल किया संकेतक है । इंफ्लूएंजा वायरस से संक्रमित चूहों में अपेक्षित वजन परिवर्तन काइनेटिक्स चित्रा 1aमें वर्णित है, जो चूहों में प्रेरित उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दर्शाता है। हालांकि, असामान्य मामले नियमित रूप से होते हैं, जिसमें चूहे अपना वजन कम करते हैं या अवलोकन अवधि के माध्यम से कोई वजन गिरावट नहीं दिखाते हैं। हमारे अनुभवों के अनुसार, इन चूहों ज्यादातर असामान्य कम या उच्च प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहन, इस प्रकार प्रयोग परिणामों में खलल न डालें । इस तरह की विविधताओं से बचने के लिए, सबसे पहले प्रयोग में इस्तेमाल चूहों सेक्स और उम्र मिलान के लिए वायरस के लिए इसी तरह की उत्तरदायी क्षमता की गारंटी होना चाहिए । प्रत्येक माउस के लिए लगातार वायरस टियर भी महत्वपूर्ण है21. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाला वायरस टाइटर 40 पीएलयू है। हालांकि, प्रत्येक प्रयोगशाला में उचित वजन परिवर्तन गतिज को प्रेरित करने के लिए वायरस टिटर वायरस टिटर मूल्यांकन प्रक्रिया और प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले माउस उपभेदों में विसंगति के कारण परिवर्तनशील हो सकता है। इसलिए हम सलाह देते हैं कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया-प्रासंगिक अध्ययन से पहले संक्रमण के लिए वायरस टिटर का शीर्षक आवश्यक है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने अक्सर उपयोग किए जाने वाले मार्कर पीडी-1, सीएक्ससीआर 5 और आवश्यक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बीसीएल 6 के साथ टीएफएच कोशिकाओं की पहचान की। यद्यपि पीडी-1हायसीएक्ससीआर 5हाय और बीसीएल 6+सीएक्ससीआर 5+ कोशिकाओं को टीएफएच कोशिकाओं के रूप में चिह्नित किया जा सकता है, वे विभिन्न आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं और इस तथ्य के आधार पर अग्रदूत-संतति संबंध नहीं है कि सभी पीडी-1हायसीएक्ससीआर 5एचएसआईवीटी 6+ हैं और सभी बीसीएल6+सीएक्ससीआर5 एचएसआईवी5 सेल नहीं हैं। इस फेनोटाइप को टीएफएच कोशिकाओं22में बीसीएल 6 अभिव्यक्ति की विषमता द्वारा समझाया जा सकता है । आईसीओएस, टीएफएच भेदभाव और प्रवासन दोनों के लिए एक महत्वपूर्ण अणु को भी टीएफएच भेदभाव के विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, अन्य फ़ंक्शन से जुड़े सह-उत्तेजक अणुओं, जैसे OX40 और CD40L को भी उनके अभिव्यक्ति के स्तर के लिए पता लगाया जाना चाहिए, हालांकि इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है। IL21 और IL4 दोनों Tfh-स्रावित साइटोकिन्स IgG1 वर्ग स्विचन को प्रेरित करने में भूमिकाएं निभा रहे हैं । इस पेपर में IL21 अभिव्यक्ति का पता लगाने का प्रोटोकॉल बताया गया है। हालांकि, टीएफएच कोशिकाओं में आईएल4 का पता लगाने में कठिनाई के कारण, आईएल4-जीएफपी रिपोर्टर चूहों का उपयोग पिछले अध्ययनों में23था। इस प्रोटोकॉल में, हमनेएनपी 311-325 -विशिष्टटीएफएच कोशिकाओं का पता लगाने के लिए फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले एनपी टेट्रामर्स का भी उपयोग किया। फिर भी,एनपी 311-325-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाओं की मात्रा में सीमा आगे के विश्लेषण में कठिनाई प्रदान करती है। इसलिए, इंफ्लूएंजा हेमाग्लुटिनिन विशिष्ट-टीसीआर ट्रांसजेनिक (टीजी) सीडी 4+ (टीएस-1) टी कोशिकाओं का दत्तक हस्तांतरण प्रयोग, जिसे टीएस-1 चूहों से अलग किया जा सकता है, इस समस्या को हल करने में एक वैकल्पिक रणनीति है24।

यहां हमने जीसी बी को प्रवाह साइटोमेट्री स्टेनिंग में B220+PNA+Fas+ कोशिकाओं के रूप में पहचाना। जीसी बी को जीसी बी को जीएल7हायफासहाय कोशिकाओं के रूप में परिभाषित करने के लिए एक वैकल्पिक मार्कर संयोजन रणनीति का उपयोग अन्य कागजों में भी किया जाता है14,16। हम एंटी-आईजीडी और पीएनए के संयोजन के साथ जीसी की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का भी उपयोग करते हैं। सीडी 3 एंटीबॉडी के अलावा टीएफएच कोशिकाओं की कल्पना करने में मदद कर सकते हैं, इस प्रकार इन दो सेल प्रकार10के बीच बातचीत का अध्ययन करने में सक्षम हो सकते हैं।

टीएफएच कोशिकाओं के भेदभाव को देखते हुए एक बहुमंचीय और बहुकारक प्रक्रिया है, टीएफएच भेदभाव में अधिक विस्तृत तंत्र को स्पष्ट करने के लिए कई समय बिंदुओं पर अन्य महत्वपूर्ण अणुओं की अतिरिक्त परख आवश्यक है। इसके अलावा, यहां पाए गए मापदंडों का उपयोग आमतौर पर अन्य मॉडलों में भी कियाजाताहै। इसलिए, इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल, विशेष रूप से इम्यूनोस्टेपिंग भाग, अन्य मॉडलों के साथ टीएफएच से जुड़े अध्ययन में भी निर्देश प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनकी तकनीकी मदद और सलाह के लिए शंघाई के इंस्टीटयूट पाश्चर के फ्लो साइटोमेट्री फैसिलिटी, एबीएसएल2 फैसिलिटी और एसपीएफ एनिमल फैसिलिटी के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: चीनी विज्ञान अकादमी (XDB29030103), चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFA0502202), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31570886) का रणनीतिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehyde Sigma F1635
Anti-CD16/32 mouse Thermo Fisher Scientific 14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer NIH
Bcl-6 PE Biolegend 358504 clone:7D1
Biotin-CXCR5 Thermo Fisher Scientific 13-7185-82 clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-0041-82 clone:GK1.5
CD44 eVolve 605 Thermo Fisher Scientifi 83-0441-42 clone:IM7
CD44 FITC Thermo Fisher Scientifi 11-0441-82 clone:IM7
CD62L FITC BD Pharmingen 553150 clone:MEL-14
ICOS BV421 Biolegend 564070 clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7 Biolegend 135216 clone:29F.1A12
Streptavidin BV421 BD Pharmingen 563259
Streptavidin PE BD Pharmingen 554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehyde Sigma F1635
anti-human IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-605-098
Brefeldin A Sigma B6542
human FCc IL-21 receptor R&D System
ionomycin Sigma I0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit Thermo Fisher Scientific L34966
PMA Sigma P1585
Saponin MP 102855
GC B and plasma cells staining
B220 APC Thermo Fisher Scientific 17-0452-81 clone:RA3-6B2
CD138 PE BD Pharmingen 561070 clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7 BD Pharmingen 557653 clone:Jo2
IgD eFluor 450 Thermo Fisher Scientific 48-5993-82 clone:11-26c
PNA FITC Sigma L7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HA Sino Biological 11684-V08H
BSA SSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
TMB Substrate Reagent Set BD Pharmingen 555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG Life Technology A21434
anti-mouse IgD Biolegend 405702
biotinylated PNA Vector laboratories B-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidin Life Technology S11223
normal goat serum SouthernBiotech 0060-01
Pro-long gold antifade reagent Thermo Fisher Scientific P3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit Vector laboratories SP-2002

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References

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जोवे में इस महीने अंक 160 टी कूप सहायक कोशिकाएं अंकुरण केंद्र इन्फ्लूएंजा ए वायरस संक्रमण बीसीएल6 टेट्रामर फ्लो साइटोमेट्री एंजाइम लिंक्ड इम्यूनोसोरेरेंट परख इम्यूनोफ्लोरेसेंस
चूहों में इन्फ्लूएंजा ए वायरस संक्रमण के दौरान टी कूप सहायक कोशिकाओं और अंकुरित केंद्र प्रतिक्रिया का मूल्यांकन
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Wang, M., Huang, Y., Gu, W., Wang,… More

Wang, M., Huang, Y., Gu, W., Wang, H. Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (160), e60523, doi:10.3791/60523 (2020).

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