Summary
Dette papiret beskriver protokoller for evaluering av Tfh og GC B respons i musemodell av influensavirusinfeksjon.
Abstract
T Follicular Helper (Tfh) celler er en uavhengig CD4+ T celle delsett spesialisert på å gi hjelp for germinal center (GC) utvikling og generering av høy affinitet antistoffer. Ved influensavirusinfeksjon induseres robuste Tfh- og GC B-celleresponser for å lette effektiv virusutryddelse, noe som gir en kvalifisert musemodell for Tfh-assosiert studie. I dette papiret beskrev vi protokoller ved påvisning av grunnleggende Tfh-assosiert immunrespons under influensavirusinfeksjon hos mus. Disse protokollene inkluderer: intranasal inokulasjon av influensavirus; flytcytometri farging og analyse av polyklonale og antigenspesifikke Tfh-celler, GC B-celler og plasmaceller; immunofluorescence påvisning av GCer; immunosorberende analyse (ELISA) av influensavirusspesifikt antistoff i serum. Disse analysene kvantifiserer i utgangspunktet differensieringen og funksjonen til Tfh-celler i influensavirusinfeksjon, og gir dermed hjelp til studier i å belyse differensieringsmekanisme og manipulasjonsstrategi.
Introduction
I det siste tiåret har mange studier vært fokusert på den nylig identifiserte CD4+ T celleundersett, Tfh celle undergruppe, for sine viktige roller i germinal center (GC) B utvikling. B cellelymfom 6 (Bcl6), som hovedsakelig betraktes som en genrepressor, er den lineagedefinerende faktoren til Tfh-celler for bevis på at ektopisk uttrykk for Bcl6 er tilstrekkelig til å drive Tfh differensiering mens mangel på Bcl6 resulterer i forsvunnet Tfh differensiering1,2,3. I motsetning til andre CD4+ T hjelper undergrupper som utfører sin effektorfunksjon ved migrering til betennelsesstedene, gir Tfh-celler B-cellehjelp hovedsakelig i B-cellefollikelsonen av milt og lymfeknute. Samtidige molekyler ICOS og CD40L, spiller betydelige roller i samspillet mellom Tfh og GC B-celler. Under Tfh differensiering overfører ICOS nødvendige signaler fra kognate B-celler og fungerer også som en reseptor som mottar migrasjonssignaler fra tilskuer B-celler for B-cellesonelokalisering 4,5. CD40L er en mediator av signaler fra Tfh celler for B-celler spredning og overlevelse6. En annen faktor som spiller lignende rolle som CD40L er cytokin IL21, som hovedsakelig utskilles av Tfh-celler. IL21 regulerer direkte GC B celler utvikling og produksjon av høy affinitet antistoffer, men dens rolle i Tfh differensiering er fortsatt kontroversiell7,8. PD-1 og CXCR5, som nå brukes oftest i å identifisere Tfh-celler i flytcytometrianalyse, spiller også betydelige roller i differensieringen og funksjonen til dette delsettet. CXCR5 er reseptoren for B celle follikulær chemokin og medierer lokalisering av Tfh celler i B cellesekkene9. PD-1 er nå identifisert for ikke bare å ha follikulær veiledningsfunksjon, men overfører også kritiske signaler i prosessen med GC B-cellers affinitet modning10. Basert på disse funnene kan evaluering av uttrykket av disse molekylene i utgangspunktet gjenspeile modningen og funksjonen til Tfh-celler.
GC er en indusert forbigående mikroanatomiisk struktur i sekundære lymfoide organer og svært avhengig av Tfh-celler, og dermed være en perfekt avlesning for å evaluere Tfh-respons. I GC, etter å ha mottatt signaler mediert av cytokiner og samtidig stimulerende molekyler, er B-celler gjenstand for klasseveksling og somatisk hypermutasjon for å generere høyaffinitetsantistoffer11. Differensial antistoff klasseveksling skjer i differensial cytokin nisje, der IL4 og IL21 indusere IgG1 klasse bytte mens IFNγ induserer IgG2 klasse bytte12. Plasmaceller er produsenter av utskillede antistoffer og er terminalt differensierte celler. Som Tfh-celler er utvikling av B-celler i GC forbundet med dynamisk uttrykk for mange betydelige molekyler. Basert på den nåværende studien kan GC B-celler identifiseres som B220+PNA+Fas+ eller B220+GL7+Fas + cellerog plasmaceller, sammenlignet med deres forløpere, nedregulere uttrykk for B220 og overgulere CD138 uttrykk13. Des des, begge disse egenskapene kan oppdages i flyt cytometri og immunofluorescence analyse, og dermed være hensiktsmessig evaluering av GC respons.
Robuste cellulære og humorale responser induseres i influensavirusinfeksjon, med Tfh- og Th1-celler som dominerer CD4+ T-cellerespons14, noe som gjør det til en perfekt modell for Tfh-cellerdiensieringsstudie. Influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), som er en vanlig mustilpasset stamme, brukes ofte i denne studien14,15,16. Her beskriver vi noen grunnleggende protokoller for Tfh studierelevante analyser i influensavirusinfeksjon: 1) intranasal inokulasjon av PR8-virus; 2) antigenspesifikke Tfh-celler, GC B og plasmaceller og IL21-deteksjon med strømningscytometri; 3) histologisk visualisering av GC; 4) påvisning av antigenspesifikt antistofftiter i serum med ELISA. Disse protokollene gir de nødvendige teknikkene for nye forskere i Tfh-assosiert studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Institut Pasteur i Shanghai, Kina. Alle forsøkene ble utført basert på institusjonelle dyrepleie- og brukskomité-godkjente dyreprotokoller.
MERK: Virusinfeksjon av mus og isolering av organer bør utføres under ABSL2 tilstand.
1. Inokulasjon av PR8 influensavirus og registrering av musvekt
- Forbered 8 uker gamle hann C57BL/6 mus for infeksjon i ABSL2-rommet.
MERK: Denne protokollen er også egnet i eksperimenter med hunnmus. - Fortynning av PR8-virus: ta ut viruset fra -80 °C fryseren og inkuber på is til det smelter til væske. Vortex lagerviruset grundig og fortynne viruset til 2 PFU/ μL med steril fosfatbufret saltvann (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) i et forhåndskjølt 1,5 ml rør.
-
Mus bedøvelse: veie hver mus og beregne volumet (4 ganger (μL) musevekten (g)) av natrium pentobarbital (2 mg / ml) som skal brukes. Injiser det beregnede volumet av natriumpentobarbital intraperitoneally.
MERK: Dette trinnet er å få mus til å puste jevnt og fredelig, slik at nøyaktig titer av virus kan inokuleres intranasalt. For raske eller langsomme hjerteslag indikerer upassende bedøvelse. I tillegg anbefales bruk av veterinær salve for å unngå tørrhet i øyet. - Intranasal inokulasjon: vortex fortynnet PR8 virus grundig. Pipet 10 μL og utfør forsiktig intranasal inokulasjon på den ene siden dråpe for dråpe. Etter å ha fullført inokulasjon av alle musene i ett bur (maksimalt 5 mus) på denne siden, gjenta inokulasjon på den andre siden (hold pusten av musen fredelig og stødig gjennom inokulasjonen). Hver mus er infisert med 40 PFU av PR8 virus totalt.
- Plasser musene i sternal recumbency i varme bur for bedre vekkelse.
- Overvåk musevekten daglig i 10 dager. (Infeksjonsdagen registreres som dag 0).
2. Isolering av lymfocytter fra milt og mediastinal lymfeknute (mLN)
- Mus euthanization: sett musene i et lite kammer og euthanize musene ved å pumpe inn CO2 fredelig fra bunnen av kammeret. Ta mus ut når de ikke beveger seg og utfører cervical forvridning for å sikre at mus dør helt. Dypp musene med 75% etanol og overfør til biosikkerhetshetten.
- Immobiliser musene med disseksjonsnåler på den absorberende papirbelagte disseksjonsskumplaten. Skjær huden langs abdominal midtlinjen og bakbenene med disseksjonsaks og strekk huden med pinsett. Immobilisere den strukket huden med disseksjon nåler.
- Forbered to 6 cm retter for hver mus og hold dem på isen. Sett en 70-μm celle sil i hver tallerken og tilsett 5 ml DMEM supplert med 1% fosterbovin serum (DMEM (1% FBS))
- Miltisolasjon: kutt bukhinnen for å utsette bukhulen med disseksjonsaks. Ta milten og legg den i den tilberedte parabolen.
- mLN isolasjon: kutt membranen og bunnen av burribben til nærheten av thymus. Trekk ribben til side og fest den med disseksjonsnåler for å eksponere thoraxhulen. Trekk lungen til høyre og bruk pinsett for å ta mLN, under hjertet og nær ventral side av luftrøret.
- Legg mLN i den tilberedte parabolen.
- Få enkeltcelleopphengene: mesh milten eller mLN forsiktig med et stempel på 3 ml sprøyte gjennom 70-μm cellesil. Skyll cellesilen med 1 ml frisk DMEM (1 % FBS). Resuspend celle suspensjon og overføre til en 15 ml sentrifuge rør.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Fjern supernatant og legg til 1 ml DMEM (1% FBS).
- Resuspend cellepellet med 1 ml-pipette grundig. Tilsett 4 ml DMEM (1% FBS) i miltcelleoppheng og hold dem på is for følgende operasjoner.
MERK: Det er nødvendig å bruke cellepelleten på nytt med 1 ml medium for det første, ikke 5 ml, for heltisolering av enkeltceller fra pellet.
Fra dette trinnet og utover kan alle operasjonene utføres i det vanlige laboratoriet. -
Milt celletelling
- Resuspend celler ved å snu rørene opp og ned i flere ganger. Ta 10 μL i 90 μL av røde blodlegemer (RBC) lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Inkuber ved romtemperatur (RT) i 3 min og tilsett 900 μL kald PBS for å avslutte reaksjonen.
- Sentrifuge ved 400 x g i 6 min ved 4 °C og fjern supernatant. Resuspend med 100 μL kald PBS. Ta 10 μL celler i 10 μL på 0,4% w / v trypan blå og ta 10 μL ut av blandingen for celletelling med hemocytometeret.
- Beregning: beregn celler som vanlig metode. Kort sagt teller du celletall i to diagonale hjørnetorg på hemocytometeret og får N1, N2 for hvert hjørne kvadrat. Cellekonsentrasjonen av cellesuspensjonen på 5 ml skal beregnes som (N1+N2)/2 x 104 /ml.
3. Immunstaining av polyklonale Tfh-celler med PD-1 og CXCR5
- Farging med biotin-anti-CXCR5 antistoff.
- Gjenoppussende cellesuspensjoner ved å dreie røret opp og ned. Ta 2 x 106 celler inn i FACS-røret og tilsett 2 ml fargingsbuffer (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Vask med vortex på vortex oscillasjonsenheten.
- Sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kast det overnaturlige ved å helle ut væsken og dypp rørmunningen på det absorberende papiret to ganger.
- Løsne cellepelleten med restvæsken ved å trykke på bunnen av røret. Sett røret i rørholderen på is.
MERK: Volumet av restvæske er ca. 25 μL. - Tilsett 0,2 μL med antimus-CD16/CD32 (Fc-reseptorblokker) for hvert rør. Vortex ved å tappe røret bunnen forsiktig og inkubere på is i 10 min.
MERK: Klargjør antistoffblandingen for flere prøver ved fortynning med 5μL fargingsbuffer for hvert rør. Oppskriften på blandingen skal tilberedes ved å fortynne (n/10+1) x 0,2 μL Fc-reseptorblokker i (n/10+1) x 5 μL farging buffer og tilsett 5,2 μL blanding i hvert rør. - Tilsett 0,3 μL biotin-anti mus CXCR5 i rester 30 μL av farging buffer for hvert rør og virvel ved å trykke på rørbunnen.
MERK: Klargjør blandingen som beskrevet i trinn 3.1.4. - Inkuber på is i 1 time med forsiktig resuspending celler ved å trykke på røret på 30 min.
MERK: Vortex ved 30 min er å unngå celleaggregater for bedre farging. - Tilsett 2 ml fargingsbuffer og virvel på vortex oscillasjonsenheten. Sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C og kast supernatanten som beskrevet i trinn 3.1.2. Vortex ved å tappe røret og inkubere på is for påfølgende farging.
- Farging med andre overflatemarkører.
- Klargjør antistoffblanding (tabell 1) som beskrevet i trinn 3.1.4.
- Tilsett antistoffblanding i hvert rør. Vortex ved å trykke på rørbunnen og inkubere på is i 30 min.
- Vask celler med 2 ml fargingsbuffer. Sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C.
- Kast det overnaturlige og tilsett 400 μL fargingsbuffer. Vortex røret på vortex oscillasjon enheten og holde røret i mørket til strømning cytometri analyse.
4. Immunstaining av PR8 influensavirus NP-spesifikke Tfh-celler
MERK: Denne protokollen for farging NP-spesifikke Tfh-celler er fra tidligerestudier 15,17.
- Utfør biotin-CXCR5-farging som beskrevet i trinn 3.1, bortsett fra at cellenummeret tatt for farging er 3 x 106 for nok antigenspesifikke celler som skal registreres i strømningscytometri.
- Tilsett 0,3 μL APC-konjugert-IAbNP311-325 MHC klasse II (NP311-325) tetramer i røret fra 3.1.7. Klargjør blandingen for flere prøver som i trinn 3.1.4
MERK: Det er viktig å flekke tetramer før tilsetning av anti-CD4 antistoff som bindingen mellom CD4 og anti-CD4 antistoff ville forstyrre optimal tetramer farging. - Resuspend celleblandingen ved å forsiktig tappe røret og inkubere i mørket ved RT i 30 min.
MERK: Dekk et vått papir på munningen av rør for å redusere fordampning - Tilsett blandingen av andre overflatemarkører (tabell 1) og fortsett inkubasjonen ved RT i 30 min.
- Vask og gjenbruk celler som beskrevet i trinn 3.2.3 og 3.2.4.
5. Immunstaining av Bcl6 i polyklonale Tfh-celler
- Utfør overflatemarkører (tabell 2) flekker som beskrevet i avsnitt 3, bortsett fra at den siste vasken med 2 ml PBS, i stedet for farbuffer.
- Sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kast de overnaturlige og gjenbrukte cellepellets ved å trykke forsiktig på rørbunnen.
- Tilsett 300 μL med 3,7 % formaldehydoppløsning (fortynnet fra 37 % formaldehyd med PBS) i røret for cellefiksering. Vortex på vortex oscillasjon enheten og inkubere ved RT i 20 min.
- Tilsett 2 ml fargingsbuffer for vask og sentrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C. Kast de overnaturlige og gjenbrukscellene ved å trykke forsiktig på røret.
- Tilsett 300 μL på 0,2 % Triton-X 100 og gjenoppusse celler ved virvel på vortex oscillasjonsenheten. Inkuber ved RT i 15 min.
- Tilsett 2 ml fargingsbuffer for vask. Sentrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C. Kast overnaturlige og gjenbruke celler ved å trykke forsiktig på rørbunnen.
- Tilsett 1,5 μL PE-anti-Bcl6 antistoff for hvert rør. Trykk forsiktig på rørbunnen for å bruke blandingen på nytt og inkubere ved RT i 2 timer ved å trykke forsiktig på røret hver 30.
MERK: Dekk et vått papir på munningen av rør for å redusere blandingen fordampning. - Tilsett 2 ml PBS supplert med 0,01% Triton-X 100 i røret. Vortex og sentrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C.
- Gjenta vasken som trinn 5.8. Resuspend celler med 400 μL av farging buffer. Hold cellene i mørket på isen til strømmen cytometri analyse.
6. Intracellulær farging av IL21
- Stimulere celler med PMA (phorbol 12-myristate 13-acetat) og ionomycin.
- Ta 2 x 106 celler fra miltcellesuspensjon og sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kast den supernaturlige og gjenbrukte cellepelleten med 500 μL komplett T-cellemedium. Overfør cellene til 24-brønnsplaten.
- Tilsett 20 nmol PMA og 2 μmol ionomycin i 500 μL av komplett medium18 og bland godt ved å pipetter opp og ned.
- Tilsett løsning tilberedt i trinn 6.2 i cellefjæring i 24-brønnsplaten og bland ved å riste platen. Sett opp den ustimulerte kontrollen ved å legge til 500 μL komplett T-cellemedium uten tilsetning av PMA og ionomycin i cellene. Inkuber i en CO2 inkubator ved 37 °C i 4 timer.
- Tilsett 10 μmol BFA (Brefeldin A, oppløst med metanol) i hver brønn for å blokkere Golgi-apparatet mediert proteintransport. Sett platen tilbake til celleinkubatoren og inkuber i 2 timer.
- Utfør celleoverflatemarkørfarging.
- Resuspend celler ved å forsiktig pipettering opp og ned og overføre cellene til en FACS rør. Tilsett 1 ml fargingsbuffer i røret og sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C.
- Utfør Fc-reseptor blokkering flekker som trinn 3.1.4.
- Utfør flekker på celleoverflaten (tabell 3) som beskrevet i trinn 3.2.1 til 3.2.3 unntatt vaskeceller med 2 ml PBS.
- Sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kast de overnaturlige og gjenbrukscellene ved å trykke på rørbunnen.
- Tilsett 0,2 μL reagens fra Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell-fargesettet og inkuber røret i mørket ved RT i 10 min for å utføre farging av døde celler.
- Tilsett 2 ml PBS i røret og virvelen på vortex oscillasjonsenheten. Sentrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Utfør cellefikseringen som beskrevet i trinn 5.3 og 5.4.
- Tilsett 300 μL farbuffer for å gjenbruke celler og oppbevar rørene i kjøleskapet på 4 °C over natten. Sentrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C for å fjerne supernatanten.
MERK: Dette trinnet kan utelates og fortsette å trinn 6.7 direkte etter trinn 6.5. - Tilsett 1 ml saponinbuffer (fargingsbuffer supplert med 0,2 % (w/v) saponin) i røret og virvelen på vortex oscillasjonsenheten. Inkuber på is i 20 min for å utføre cellepermeabilisering.
- Sentrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C og kast supernatant.
- Tilsett 0,5 μL av menneskelig Fc-IL21 reseptor i hvert rør. Forbered antistoffblandingen for flere som trinn 3.1.4, bortsett fra at fortynne antistoffet med saponinbuffer i stedet for farbuffer.
- Inkuber ved RT i 1 time med forsiktig å trykke på rørbunnen for å gjenbruke celler ved 30 min.
- Tilsett 2 ml saponinbuffer for å vaske celler og sentrifuge ved 500 x g i 6 min. Kast overnaturlig og gjenta vasken én gang.
- Tilsett 0,1 μL APC-anti-human Ig(H+L) i hvert rør. Forbered blandingen for flere prøver som trinn 3.1.4, bortsett fra at fortynnet antistoff med saponinbuffer i stedet for farbuffer.
- Inkuber prøvene på is i 30 min. og vask som trinn 6.11.
- Resuspend celler med 400 μL av farging buffer. Hold prøven i mørket på isen til strømningscytometrianalysen.
7. GC B og plasmaceller flekker
- Ta celler og utføre anti-Fc-reseptor antistoff farging som trinn fra 3.1.1 til 3.1.4.
- Utfør overflatemarkører flekker (Tabell 4) som trinn fra 3.1.5 til 3.1.7 bortsett fra at inkubasjonstiden er 30 min i stedet for 1 time.
- Resuspend celler med 400 μL av farging buffer. Hold prøvene i mørket på isen til strømningscytometrianalysen.
8. Isolering av serum fra blod
- På dag 14 etter infeksjon (d.p.i 14), samle blodet fra ansiktsvenen og holde blodprøver i et 4 °C kjøleskap over natten.
MERK: Utfør blodinnsamling ved ABSL2-tilstand, og fra dette trinnet kan alle prosedyrene utføres i det vanlige laboratoriet. - Sentrifuger blodet ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Isoler serumet med 200 μL pipette nøye for å unngå forurensning av røde celler. Aliquot i 3 rør for hver prøve og lagre dem ved -80 ° C.
9. Analyse av HA-spesifikk antistofftiter med ELISA
- Coat ELISA plater med 50 μL av 2 μg / ml HA proteinoppløsning per brønn og inkuber dem i 4 ° C kjøleskap over natten.
- Vask tre ganger med 200 μL PBS-fortynnet 0,05 % tween (PBST). Tilsett 100 μL PBST-fortynnet 5% skummet melk i hver brønn og inkuber ved RT i 2 timer for å blokkere den uspesifikke bindingen.
- Serumfortynning og inkubasjon: klargjør 3 % BSA i PBS som fortynningsbuffer. Fortynn serumet i fortynningsbufferen som 01:50, 1:150, 1:450, ...... til 1:36450 (3 ganger seriell fortynning anbefales). Tilsett 50 μL fortynnet serum til hver brønn og inkuber i kjøleskapet på 4 °C over natten.
- Kast serumet og vask brønnene raskt én gang ved å tilsette 200 μL PBST i hver brønn (rist det mykt, kast deretter). Vask deretter platene langsomt på shakeren med 200 μL PBST tre ganger i 5 min hver.
- Tilsett 100 μL HRP-merket sekundært antistoff spesifikt for totalt IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, fortynnet med PBST) og inkuber ved RT i 1 time. Vask platene med PBST som beskrevet i 9.4.
- Ta ut likt volum av buffer A og buffer B (TMB) fra 4 °C lagring og varm opp i minst 30 minutter ved RT før bruk. Bland A og B og tilsett 100 μL TMB i hver brønn og inkuber dem i 10-30 minutter ved RT ved å riste mykt.
MERK: Dette er en kort beskrivelse av TMB Subtrate ReagensSett (BD,555214) manuell. - Pipette 100 μL på 2M H2SO4 i hver brønn for å avslutte reaksjonen. Les OD450-verdien gjennom instrumentet.
- Dataanalyse: Få den endelige OD450-verdien ved å trekke fra bakgrunnssignalet (OD450-verdien for tom brønn). Tegn kurven som tilsvarer en antistoffisotype for hver prøve med fortynningsfaktoren på X-aksen og OD450-verdien på Y-aksen.
10. Histologi
- Isoler miltene på d.p.i 10. Løs dem i 3,7% formaldehydløsning i 1 time ved RT. Kast fikseringsbufferen og vask med PBS i 5 min på shakeren i tre ganger.
- Dehydrere miltene i PBS (10% sukrose) ved 4 °C i 1 time og dehydrere dem deretter i PBS (30% sukrose) ved 4 °C med risting mykt til miltene synker til bunnen av 15 ml-røret.
- Ta ut dehydrert miltene, bygg dem inn i optimal skjæretemperaturforbindelse og kryoseksjonert.
- Forkjøl acetonen ved -20 °C. Inkuber vevsseksjonene med forkjølet aceton i 10 min. Vask vevet med PBS i tre ganger.
- Gjennomsyre vevsseksjonene med PBS som inneholder 0,2% Triton X-100 i 20 min og vask dem i tre ganger med PBS.
- Blokker den ikke-spesifikke bindingen med PBS som inneholder 10% normalt geiteserum (blokkerende buffer) i 1 time ved RT og vask vevsseksjonene med PBS en gang.
- Blokker den ikke-spesifikke bindingen med STREPTAVIDIN/BIOTIN-blokkeringssett.
MERK: Ikke la prøvene tørke fra dette trinnet og fremover. - Farging med primært antistoff: tilsett blokkerende buffer-fortynnet biotin-PNA (25 μg / ml) og rotte anti-mus IgD (2,5 μg / ml) på vevseksjonene nøye. Inkuber vevsseksjonene i det våte kammeret i 4 °C fryseren over natten.
- Vask raskt vevsseksjonene med PBST en gang. Vask raskt vevsseksjonene i PBST med risting sakte i 5 min. Gjenta vasken i tre ganger.
- Fortynn Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) og Alexa Fluor 555-Geit-anti rotte IgG (1:500) antistoffer med blokkerende buffer og legg dem på vevseksjonene nøye
- Inkuber ved RT i 1 time.
- Vask vevsseksjonene som trinn 10,8 og monter forsiktig med den forlengede oppløsningen. Dekk vevet med dekkslepper forsiktig og hold dem i mørket ved 4 ° C til konfokal analyse.
- Analyser størrelsen på GC-reaksjonen ved å telle GC-tallene per områdestørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av musmorbiditet i influensavirusinfeksjon
Etter influensavirusinfeksjon er mus mindre aktive og anorektiske på grunn av sykdom, noe som gjenspeiles av alvorlig vekttap, et vanlig symptom for å overvåke musens sykelighet19. Som vist i figur 1abegynte PR8 virusinfeksjonsmus å gå ned i vekt på dag 6, nådde det høyeste tapsnivået på dag 8 og gikk tilbake til startnivået på dag 10. Som forventet ble vekttap ikke observert gjennom hele perioden hos PBS-behandlede kontrollmus. For in vivo symptomer fører virusinfeksjon til robust lymfocytter utvidelse i drenering lymfeknute, mLN i dette tilfellet. Derfor ble signifikant større størrelse på MLN observert hos PR8 virusinfeksjonsmus enn i kontrollmus (figur 1b). Samlet viste disse musene alle forventede symptomer og var kvalifisert for den påfølgende Tfh-assosierte immunresponsstudien.
Påvisning av Tfh differensiering og funksjonsrelaterte molekyler
For å analysere Tfh differensiering ble mus ofret på dag 5, 7, 10 og 14 etter infeksjon og ML Eller milt ble isolert for flytcytometrianalyse. Figur 2a og figur 2b viser Tfh-populasjonsstrategien, med Tfh inngjerdet som PD-1hi CXCR5hiceller og ikke-Tfh som PD-1laveCXCR5lave celler. Med denne gating strategien ble kinetikken til Tfh differensiering under influensavirusinfeksjon analysert. Som vist i figur 2c, Tfh differensiering initialisert på dag 5 og toppet på dag 10. Så vi tok prøver av dag 10 for videre analyse. Som vist i figur 3able robust Tfh-cellediensjon indusert i influensavirusinfiserte mus sammenlignet med kontrollmus. For å analysere influensavirusspesifikke Tfh-celler ble fluorokrommerket IAbNP311–325 MHC klasse II tetramers (NP311-325) lagt til i polyklonal tfh celler flekker panel (Tabell 1). Både i ML-er og milter fra influensavirusinfiserte mus ble NP311-325-spesifikkeCD4+ T-celler signifikant indusert og NP311-325-spesifikkeTfh-celler kunne analyseres ved tilsetning av PD-1 og CXCR5 i analyse(figur 3e). På grunn av viktige roller bcl6 i Tfh differensiering, Bcl6+CXCR5+ celler kan også representere Tfh befolkningen. Konsekvent ble Tfh-celler identifisert med denne strategien også indusert robust (figur 3b). Vi analyserte videre uttrykk for Bcl6 i Tfh- og ikke-Tfh-celler. Som vist i figur 3c, indikerer høyere uttrykk for Bcl6 i Tfh-celler enn i ikke-Tfh-celler vellykket Bcl6-farging. Med lignende strategi, ICOS, ble et annet Tfh-assosiert molekyl også analysert (figur 3d). På grunn av den spesialiserte rollen til Tfh-celler i å gi hjelp til B-celler, kan analyse av uttrykket av IL21, som utskilles hovedsakelig av Tfh-celler og demonstrert for å direkte regulere B-cellers overlevelse og spredning, avsløre Tfh-cellers funksjon til en viss grad. Som vist i figur 3fviste intracellulær farging av IL21 at PR8-infeksjon induserte betydelig høyere produksjon av denne cytokinen, med ustimulerte celler som gatingkontroll. Samlet sett kan disse analysene gjenspeile grunnleggende informasjon om Tfh differensiering og gi innsikt i B-cellehjelpsevnen.
Påvisning av GC B og plasmaceller utvikling og influensa virusspesifikke antistoffer i serum
Hovedfunksjonen til Tfh-celler er å gi B-cellehjelp i GCer, der antistoffklasseveksling og affinitetsmodning oppstår. Så GC B utvikling kan indirekte reflektere differensiering og funksjon av Tfh celler. GC B-celler kan gated som B220+PNA+Fas+ celler (Figur 2d). Gjennom denne gating strategien analyserte vi kinetikken til GC B-cellerespons og fant ut at GC B-responsen startet på dag 10 og fortsatte å øke på dag 14 (figur 2e). Sammenligning mellom PR8 virusinfiserte og kontrollmus viste at robust GC B ble indusert både i mLN og milt etter influensavirusinfeksjon(figur 4a), som er i samsvar med den induserte Tfh-differensieringen hos PRB-virusinfiserte mus. I tillegg gir Immunofluorescence farging med IgD og PNA visualiserte bilder som indikerer indusert GC-reaksjon (grønne områder) hos PR8 virusinfiserte mus (figur 4d). Plasmaceller, identifisert som IgDlavCD138+ celler(figur 2d),ble også generert i PR8 virus-infiserte mus (figur 4b). Tidligere studier har identifisert at IFNƳ og IL21 kan skilles ut fra både Th1 og Tfh celler i virusinfeksjon og indusere IgG2 og IgG1 klasseveksling,henholdsvis 20. Figur 4c viser genereringen av influensavirusspesifikt antistoff ved ELISA-analyse av HA-spesifikk IgM, total IgG, IgG1, IgG2b og IgG2C. Sammen gjenspeiler alle disse analysene Tfh-assosiertE B-celleresponser i influensavirusinfeksjon.
Figur 1: Karakterisering av musen sykelighet. 8 uker gamle hannmus ble smittet med 40 PFU pr8 influensavirus ved intranasal inokulasjon. Mus ble veid daglig i 10 dager (a) og mlNer ble isolert på d.p.i 10 (b). Feilfeltene i (a) representerer gjennomsnittet ± SD. n = 4 mus per gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating strategi av Tfh celler og GC B celler. (a)Lymfocytter er definert av FSC-A og SSC-A, og celle singlets er inngjerdet med FSC-A, FSC-H og SSC-A, SSC-W. (b)Etter gating i CD4+ T-celler, overflatemarkører CD62L og CD44 brukes til å skille de naive T-cellene (CD44loCD62Lhi)og aktiverte T-celler (CD44hiCD62Llo). Polyklonale Tfh-celler kan gated fra aktiverte T-celler som PD-1hi CXCR5hi populasjon, omvendt, ikke-Tfh celler som PD-1lavCXCR5lav. PR8 virusspesifikke Tfh-celler er definert som CD4+CD44+ NP311-325 tetramer+PD-1hi CXCR5hi celler. (c,e) Kinetikk av Tfh frekvens i aktiverte celler (c) og GC B frekvens i B220+ celler (e). (d)GC B-celler er inngjerdet som B220+ PNA+FAS+ celler, og plasmaceller er IgD-CD138+ celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av Tfh differensiering i PR8 virus-infiserte mus. Mus ble ofret på d.p.i 10 og mlner og milter ble isolert for Tfh differensieringsanalyse. (a) Tfh prosent i mlner og milter i PR8 virus-infiserte mus og PBS-behandlede mus (øvre panel). Statistikken over Tfh-celler (nedre panel). (b)Den intracellulære fargingen av Bcl6 i CD4+CD44hi T-celler (øvre panel). Statistikken over Bcl6+CXCR5+ celler (nedre panel). (c) Bcl6 og (d) ICOS uttrykk i Tfh (linjerød) og ikke-Tfh celler (heldekkende grå). (e)Gating av NP311-325-spesifikke CD4+ T-celler i mlner og milter av PR8 virus-infiserte og PBS-behandlet mus (venstre panel). Prosentandelen av PR8 virusspesifikke Tfh-celler i ML-er og milter (midtre panel). "Isotype" indikerer farging med irrelevant tetramerkontroll. Statistikken over NP311-325-spesifikkeCD4+ T-celler (høyre panel). (f)Intracellulær farging av IL-21 i milt CD4+ T-celler fra PR8 virusinfiserte og PBS-behandlede mus, den uprikasjon vist som kontroll (venstre). Statistikken over IL-21 farging (høyre). **P < 0,01, ***P < 0,001 og **** P < 0,0001 (tosidig student t-test). Feilfeltene representerer gjennomsnittet ± SD. n = 3 mus per gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av GC B cellerelatert respons hos PR8 virusinfeksjonsmus. Mus ble ofret på d.p.i 10 og mlnene og miltene ble isolert for analyse. (a) Prosentandelen av GC B-celler (øvre panel). Statistikken over GC B-celler (nedre panel). (b) Prosentandelen av plasmaceller (øvre panel). Statistikken over plasmaceller (nedre panel). (c)Kvantifisering av PR8-virus HA-spesifikke IgG, IgM, IgG1, IgG2b og IgG2c i serum (d.p.i 14) av PR8 virusinfeksjonsmus og PBS-behandlede mus. (d)Konfokal mikroskopi av B-cellesekkene (IgD+, Rød) og GCer (PNA+, Grønn) i miltprøvene av PR8 virusinfeksjonsbefate mus og PBS-behandlede mus (d.p.i 10). *P < 0,5, **P < 0,01 og ***P < 0,001 (tosidig student t-test). Feilfeltene representerer gjennomsnittet ± SD. n = 3 mus per gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| overflatemarkør | fluorokrom | Klone | volum per prøve(ul) |
| Cd4 (andre personer) | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | I 1999 ble det | 0.2 |
| CD62L Leilighet | FITC | Mel-14 Leilighet | 0.2 |
| ICOS | 2007: 100 000 00 | 7E.17G9 Inn | 0.2 |
| 1999– 2 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | Pe | 0.2 |
Tabell 1: Overflatemarkør (unntatt CXCR5) antistoffpanel for farging av Tfh-celler (PD-1hiCXCR5hi).
| overflatemarkør | fluorokrom | Klone | volum per prøve(ul) |
| Cd4 (andre personer) | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | I 1999 ble det | 0.2 |
| 1999– 2 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | 2007: 100 000 00 | 0.5 |
Tabell 2: Overflatemarkørantistoffer (unntatt CXCR5) panel for farging Bcl6 i Tfh-celler.
| overflatemarkør | fluorokrom | Klone | volum per prøve(ul) |
| Cd4 (andre personer) | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | I 1999 ble det | 0.2 |
Tabell 3: Overflatemarkør antistoffer panel for intracellulær farging av IL21.
| overflatemarkør | fluorokrom | Klone | volum per prøve(ul) |
| B220 Gjestgiveri | Apc | Ra3-6B2 Leilighet | 0.2 |
| IgD | eFluor 450 | 11-26c leilighet | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | Jo2 | 0.3 |
| Pna | FITC | 0.3 | |
| CD138 Leilighet | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tabell 4: Overflatemarkør antistoffer panel for farging GC B og plasma B-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av spesialiserte roller i å gi B-celle hjelp for å generere høy affinitet antistoffer, Tfh celler har blitt grundig studert i mekanismene for differensiering og manipulasjon for å gi nye strategier for vaksine design. Influensavirusinfeksjon induserer kraftige Tfh- og GC B-celler, og er dermed en passende modell for dette forskningsfeltet. I denne artikkelen beskrev vi protokoller for influensavirusinfeksjon ved intranasal inokulasjon, evaluering av Tfh-assosiert respons ved strømningscytometri, immunofluorescence og ELISA. Disse analysene vil lette påvisning av Tfh differensiering, GC B utvikling og influensa virusspesifikke antistoffer og hjelpe forskere utforske og identifisere nye avgjørende molekyler i immunresponsen.
I studier med influensavirus-infiserte mus modeller, vekttap er en vanlig indikator på mus sykelighet. Forventet vektendring kinetikk hos influensavirusinfiserte mus er som beskrevet i figur 1a, noe som gjenspeiler riktig immunrespons indusert hos musene. Imidlertid ville unormale tilfeller regelmessig forekomme, hvor musene mister vekten eller ikke viser noen vektnedgang gjennom hele observasjonsperioden. Ifølge våre erfaringer ville disse musene for det meste bære unormal lavere eller høyere immunrespons, og dermed forstyrre eksperimentresultatene. For å unngå slike variasjoner, bør for det første mus som brukes i eksperimentet være sex og alderstilpasset for å garantere lignende responsiv evne til virus. Konsekvent virustitre for hver mus er også viktig21. Viruset titer som brukes i denne protokollen er 40 PFU. Imidlertid kan virustitre for å indusere passende vektendring kinetikk i hvert laboratorium være variabel på grunn av inkonsekvens i virustitre evalueringsprosedyre og musestammer som brukes i forsøket. Så vi anbefaler titrering av virustitre for infeksjon er nødvendig før immunresponsrelevante studien.
I denne protokollen identifiserte vi Tfh-celler med ofte brukte markører PD-1, CXCR5 og den essensielle transkripsjonsfaktoren Bcl6. Selv om både PD-1hiCXCR5hi og Bcl6+CXCR5+ celler kan betegnes som Tfh celler, representerer de forskjellig befolkning og ikke har forløper-avkom forholdet basert på det faktum at ikke alle PD-1hiCXCR5hi celler er Bcl6+ og ikke alle Bcl6+CXCR5hi cellene er PD-1hiCXCR5hi. Denne fenotypen kan forklares av heterogeniteten til Bcl6-uttrykket i Tfh-celler22. ICOS, et kritisk molekyl for både Tfh differensiering og migrasjon bør også inkluderes i analyse av Tfh differensiering. I tillegg bør andre funksjonsrelaterte co-stimulerende molekyler, som OX40 og CD40L også oppdages for deres uttrykksnivå, men ikke inkludert i denne protokollen. IL21 og IL4 er begge Tfh-utskillede cytokiner som spiller roller i å indusere IgG1 klassebytte. Protokoll for å oppdage IL21-uttrykk er beskrevet i dette papiret. Men på grunn av vanskeligheten med påvisning av IL4 i Tfh-celler, ble IL4-GFP-reportermus brukt i tidligere studier23. I denne protokollen brukte vi også fluorokromemerkede NP tetramers for å oppdage NP311-325-spesifikke Tfh-celler. Likevel gir grensen i mengden NP311-325-spesifikke Tfh-celler vanskeligheten med videre analyse. Derfor er adoptivoverføringseksperiment av influensa hemagglutinin spesifikt TCR transgen (Tg) CD4+ (TS-1) T-celler, som kan isoleres fra TS-1-mus, en alternativ strategi for å løse dette problemet24.
Her identifiserte vi GC B som B220+PNA+Fas+ celler i flytcytometrifarging. En alternativ markør kombinasjonsstrategi for å definere GC B som GL7hiFashi celler brukes også i andre papirer14,16. Vi bruker også immunofluorescence for å visualisere GCer med kombinasjon av anti-IgD og PNA. Heri tillegg av CD3 antistoff kan bidra til å visualisere Tfh celler, og dermed muliggjøre studie av samspillet mellom disse to celletyper10.
Gitt differensiering av Tfh-celler er en flertrinns og multifaktoriell prosess, er ytterligere analyse av andre betydelige molekyler på flere tidspunkter nødvendig for å belyse mer detaljert mekanisme i Tfh differensiering. I tillegg er parametere som oppdages her også ofte brukt i andre modeller18. Derfor, foruten i influensavirusinfeksjon, kan protokoller beskrevet her, spesielt den immunoppnående delen, også gi instruksjoner i Tfh-assosiert studie med andre modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker stabene i flow cytometri anlegget, ABSL2 anlegget og SPF dyr anlegget i Institut Pasteur of Shanghai for deres tekniske hjelp og råd. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: Strategic Priority Research Program av Det kinesiske vitenskapsakademiet (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
