Summary
Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.
Abstract
La plupart des recherches utilisant des liposomes comme systèmes de modèles membranaires ou porteurs de médicaments s'appuient sur des techniques de lecture en vrac et supposent donc intrinsèquement que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Cependant, de nouvelles plates-formes expérimentales capables d'observer les liposomes au niveau d'une seule particule ont permis d'effectuer des études très sophistiquées et quantitatives sur les interactions protéines-membranes ou les propriétés des porteurs de médicaments sur des liposomes individuels, évitant ainsi les erreurs de la moyenne d'ensemble. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation, la détection et l'analyse de liposomes simples à l'aide d'un test de microscopie à base de fluorescence, facilitant ces mesures à partiilule unique. La configuration permet d'imagerie liposomes individuels d'une manière massive parallèle et est utilisé pour révéler la taille intra-échantillon et les inhomogénéités de composition. En outre, le protocole décrit les avantages de l'étude des liposomes au niveau liposome unique, les limites de l'assay, et les caractéristiques importantes à considérer lors de sa modification pour étudier d'autres questions de recherche.
Introduction
Les liposomes sont des vésicules sphériques à base de phospholipides qui sont fortement utilisées à la fois dans la recherche fondamentale et appliquée. Ils fonctionnent comme d'excellents systèmes de modèle membranaire, parce que leurs propriétés physiochimiques peuvent être facilement manipulées en variant les composants lipidiques composant le liposome1,2. En outre, les liposomes constituent le système de nanoporteur de livraison de médicaments le plus utilisé, offrant une pharmacocinétique et une pharmacodynamiie améliorées ainsi qu'une biocompatibilité élevée3.
Pendant de nombreuses années, les liposomes ont principalement été étudiés à l'aide de techniques en vrac, ne donnant accès qu'aux valeurs moyennes de lecture de l'ensemble. Cela a conduit la majorité de ces études à supposer que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Toutefois, ces valeurs moyennes d'ensemble ne sont correctes que si l'ensemble de données sous-jacent est uniformément réparti autour de la valeur moyenne, mais peut représenter une conclusion fausse et biaisée si l'ensemble de données comprend plusieurs populations indépendantes, par exemple. En outre, en supposant que l'ensemble signifie représenter l'ensemble de la population peut négliger l'information contenue dans l'inhomogénéité entre les liposomes. Ce n'est que récemment que des essais quantitatifs ont émergé qui sont capables de sonder les liposomes simples, révélant de grandes inhomogénéités entre les liposomes individuels en ce qui concerne les propriétés physicochimiques importantes, y compris la taille liposome4, composition lipidique5,6, et l'efficacité de l'encapsulation7, soulignant l'importance d'étudier les liposomes au niveau liposome unique.
Un domaine de recherche où la moyenne d'ensemble des propriétés liposome a été montrée aux résultats de biais est étudiant les interactions de protéine-membrane dépendantes de liposome8,9. Traditionnellement, les chercheurs qui étudient de tels processus ont été limités à la préparation de liposomes avec différents diamètres moyens d'ensemble par extrusion à travers des filtres avec différentes tailles de pores9. Cependant, l'extraction du diamètre des liposomes individuels à l'aide d'essais liposome simples a révélé de grands chevauchements de population, avec des liposomes extrudés utilisant des filtres de 100 nm et 200 nm affichant jusqu'à 70% de chevauchement dans leur distribution de taille4. Ceci pourrait sérieusement biaiser des mesures en vrac des interactions protéine-membrane dépendantes de la taille liposome10. En effectuant les études d'interaction membrane-protéine à l'aide de l'analyse liposome unique, les chercheurs ont plutôt profité de la taille-polydispersity dans l'échantillon, leur permettant d'étudier un large éventail de diamètres de liposome dans chaque expérience, facilitant de nouvelles découvertes de la façon dont la courbure et la composition de membrane peuvent affecter le recrutement de protéine aux membranes4,11,12. Un autre domaine où l'application d'essais liposome simples a prouvé instrumental est dans les études mécanistes de la fusion de membrane protéine-négociée13,14. Pour de telles mesures cinétiques, la capacité d'étudier des événements individuels de fusion a atténué le besoin de synchronisation expérimentale du processus de fusion, permettant de nouvelles perspicacités mécanistes qui auraient autrement été perdues dans la moyenne spatiotemporale faite dans les mesures d'ensemble en vrac. En outre, les liposomes simples ont été employés comme échafaudage de membrane, permettant la mesure des protéines individuelles et offrant de nouvelles connaissances sur la dynamique structurale de protéine transmembrane15,16. En outre, ces configurations à base de protéoliposome ont permis d'étudier la fonction des transporteurs transmembranaires individuels17 et les complexes protéiques de formation de pores18 ainsi que le mécanisme des peptides bioactifs de lamembrane-perméabilisant19. Les liposomes simples ont également été utilisés comme nanofluidiques de matière molle avec des liposomes simples immobilisés de surface servant de chambres pour des réactions enzymatiques dans des volumes de 10-19 L, augmentant le débit et la complexité des essais de criblage avec la consommation minimale de produit20.
Récemment, des essais de liposome simples ont été employés pour caractériser des liposomes d'administration de drogue à un niveau précédemment non-precendented de détail. Les chercheurs ont été en mesure de quantifier des inhomogénéités significatives dans la quantité de polymère attachée à la surface des liposomes individuels21. Les essais de liposome simples ont également permis des mesures des liposomes d'administration de drogue dans les médias complexes, tels que le plasma sanguin, révélant comment les éléments ancrés à la surface de liposome par des ancres de lipide peuvent être susceptibles à la dissociation quand les liposomes sont exposés aux conditions imitant ceux éprouvés pendant la circulation in vivo22. Dans l'ensemble, la polyvalence et l'utilité des essais de liposome unique sont corroborées par la grande variété de problèmes que ces configurations ont été employées pour traiter, et nous prévoyons que la méthodologie continuera d'être développée et de trouver l'utilisation dans de nouveaux domaines scientifiques.
Ici, nous décrivons un test de liposome unique à base de fluorescence qui permet d'étudier les liposomes individuels d'une manière à haut débit (figure 1). Pour illustrer la méthode, nous l'utilisons pour quantifier la taille et l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels au sein d'un ensemble. L'assay utilise l'imagerie au microscope à fluorescence de liposomes simples immobilisés sur une surface de verre passivated. Nous décrivons d'abord les étapes critiques dans le processus de fabrication de liposome qui assure l'étiquetage fluorescent approprié et l'immobilisation. Ensuite, nous décrivons la préparation de surface nécessaire pour faciliter l'immobilisation de liposome avant d'exposer la procédure pour assurer les densités appropriées de surface de liposome. Nous discutons des paramètres de microscopie importants pour l'acquisition d'images de haute qualité et délinuons comment effectuer l'analyse simple de données, permettant l'extraction de la taille de liposome et de l'inhomogénéité compositionnelle. Ce protocole générique devrait fournir une bonne base pour le chercheur intéressé de développer l'essai plus loin pour son intérêt spécifique de recherche.
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Protocol
1. Préparation Liposome
REMARQUE : En bref, la préparation des liposomes comprend habituellement trois étapes cruciales : 1) la préparation des films secs de lipide de la composition désirée de lipide ; 2) réhydratation des lipides pour la formation des liposomes ; et 3) contrôlant la taille et la lamillarité de la population liposome.
- Peser les lipides et les dissoudre dans tert-butanol:water (9:1) dans des flacons de verre.
- Dissoudre le POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW de 760 g/mol) à 50 mm.
- Dissoudre le cholestérol (MW à 387 g/mol) à 25 mm.
- Dissoudre DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto488; MW de 1 316 g/mol) à 0,1 mm.
- Dissoudre DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto655; MW de 1 368 g/mol) à 0,1 mm.
- Dissoudre DSPE-PEG2000-biotine (1,2-distearyl-sn-glycero-3-phosphatethanolamine-N-[biotinyl(polyéthylène glycol)-2000]; MW de 3 017 g/mol) à 0,1 mm.
REMARQUE : Chauffez les lipides à 55 oC et utilisez l'agitation magnétique afin d'assurer la dissolution complète des lipides. Vous pouvez également utiliser un bain de sonication. Les stocks lipidiques inutilisés peuvent être stockés à -20 oC pendant plusieurs mois.
- Mélanger les stocks lipidiques préparés à l'étape 1.1 à un rapport molaire de POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotine 68.95:30:0.5:0.5:0.05, en ajoutant 138 'L de POPC, 120 'L de cholestérol, 500 'L de chaque lipide fluorescent, et 50 'L de lipide fluorescent, et 50 'L de DSPE-PEG-biotine à une fiole de verre frais.
REMARQUE : La composition exacte du liposome peut facilement être modifiée afin d'aborder la question spécifique d'intérêt. Voir la discussion pour plus de détails. - Desserrer le couvercle de la fiole de verre, et casser le flacon dans l'azote liquide.
- Lyophiliser le mélange de lipides congelés pendant la nuit.
- Ajouter 1 ml de tampon D-sorbitol de 200 mM (tampon sorbitol) aux lipides secs.
- Chauffer le mélange à 45 oC et exposer à l'agitation magnétique pendant au moins 1 h.
REMARQUE : Le tampon doit refléter la question spécifique qui est abordée (p. ex., les conditions physiologiques pour l'étude des interactions membrane-protéine, ou un tampon spécifique approuvé cliniquement pour étudier les liposomes d'administration de médicaments). Toutefois, si un tampon spécifique n'est pas nécessaire pour l'étude, un tampon sans ions peut être appliqué pour la réhydratation afin de réduire la multilamellarity des liposomes. - Congelez la suspension lipidique en trempant le flacon dans de l'azote liquide et attendez que la suspension soit complètement gelée.
- Tremper la suspension congelée dans un bain chauffant à 55 oC jusqu'à ce que le mélange soit complètement décongelé.
- Répétez les étapes 1.7 et 1.8 jusqu'à ce que la suspension liposome ait été exposée à un total de 11 cycles de gel/dégel.
REMARQUE : Les cycles répétés de gel/dégel ont montré pour réduire la multilamellarityliposome 23,qui est primordiale pour la précision de l'essai unique de liposome, car les liposomes de multilamellar fausseront l'intensité de fluorescence contre le rapport de taille de liposome des liposomes. La multilamellarity est habituellement basse en incluant plus de 0.5% lipide PEGylated dans la formulation (tel que généralement fait dans les liposomes pour l'administration de drogue)24. - Extrudez la suspension liposome une fois à travers un filtre en polycarbonate de 800 nm à l'aide d'un mini kit d'extrusion. Suivez les instructions du fabricant pour l'assemblage du kit d'extrusion (voir Tableau des matériaux).
- Conserver les liposomes à 4 oC pendant la nuit.
2. Préparation de surface de la chambre d'imagerie
- Préparer l'albumine de sérum bovin (BSA; 1 mg/mL), la BSA-biotine (1 mg/mL) et la streptavidine (0,025 mg/mL) dans 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide) 95 mM NaCl buffer (HEPES buffer).
REMARQUE : Pour prévenir l'éclatement liposomique, le tampon sorbitol utilisé pour la réhydratation et le tampon HEPES utilisé pour la préparation de surface doivent être isotoniques. Il est donc recommandé de vérifier l'osmolarité des tampons avant l'expérience. - Mélanger 1 200 l de BSA et 120 l de BSA-biotine et ajouter 300 l de mélange à chaque puits dans une glissière de 8 puits pour la microscopie.
REMARQUE: Ici, nous utilisons un microscope à 8 puits disponible dans le commerce avec un fond de verre (voir tableau des matériaux),mais le protocole peut facilement être adapté à des chambres de microscope personnalisées. - Incuber la glissière pendant 20 min à température ambiante (RT).
- Laver la glissière 8x avec 300 l de tampon HEPES.
REMARQUE : Veillez à ne pas laisser les puits sans tampon pendant plus de quelques secondes, car le dessèchement de la surface l'endommagera. En outre, veillez à ne pas rayer la surface avec la pointe de pipette car cela l'endommagera également. Ainsi, lors de l'aspiration tampon d'un puits, le faire à partir du bord ou du coin. - Ajouter 250 l de streptavidin e et incuber pendant 10 min à RT.
- Répétez les 8 lavages décrits à l'étape 2.4.
- Entreposer la lame du microscope avec 300 l de tampon de sorbitol dans chaque puits à 4 oC. L'évaporation du solvant endommagera la surface, alors mettez la lame de microscope dans un plat De Petri et scellez-la avec du parafilm à moins que la glissière préparée ne soit utilisée immédiatement.
3. Immobilisation Liposome
- Diluer la suspension liposome à environ 20 m lipides totaux dans le tampon sorbitol. La procédure dans la section 1 donnera une suspension liposome d'environ 10 mM lipidique total.
- Placez la diapositive sur le microscope et concentrez-vous sur la surface de la chambre en utilisant le signal de réflexion laser accru de l'interface verre/tampon comme guide.
- Laver la chambre 4x avec 300 l de tampon HEPES frais.
- Ajouter 10 liposomes dilués (20 m lipides totaux) à un tube de microcentrifuge.
- Sortir 100 l de tampon de la chambre, ajouter au tube de microcentrifuge préparé à l'étape 3.4, mélanger correctement, et remettre les 110 l dans la chambre.
- Mettez le spécimen sous le microscope, et utilisez un réglage rudimentaire de microscope capable de détecter le signal du fluorophore liposome(s) pour observer les liposomes étant immobilisés sur la surface.
- Visez une densité de surface liposome qui est à la fois assez clairsemée pour indentifier les liposomes individuels et assez dense pour faciliter les mesures à haut débit. En règle générale, l'utilisation d'un champ de vision de 50 m x 50 m, 300 à 400 liposomes par image est optimale (figure 2). Ceci peut généralement être réalisé dans un délai de 5 à 10 minutes.
REMARQUE : Si seulement des particules fluorescentes en mouvement rapide sont détectées dans le champ de vision, une absence ou une concentration trop faible de l'un des composants essentiels au processus d'immobilisation (BSA-biotine, streptavidin, DOPE-PEG-biotine) pourrait en être la cause. Si aucun liposomes n'est détecté, il pourrait être lié à une faible concentration de liposomes, à des réglages inappropriés pour la détection de la fluorescence, ou potentiellement à l'imagerie avec un plan focal qui n'est pas à la surface du verre. - Une fois qu'une densité de surface liposome appropriée est atteinte, lavez la chambre 3x avec 200 l de tampon HEPES.
REMARQUE : Soyez conscient que la cinétique d'immobilisation dépend également des propriétés liposome telles que la taille et la charge et devrait donc toujours être optimisée pour chaque formulation de liposome.
4. Acquisition d'images
REMARQUE : Cette section dépendra beaucoup du système de microscope à la disposition du chercheur qui effectue l'expérience. Ainsi, des lignes directrices générales sur la façon d'effectuer l'imagerie seront décrites. Cependant, les paramètres exacts et la façon de les appliquer varient entre les différentes configurations de microscope. Par exemple, certains systèmes permettent de choisir n'importe quelle combinaison de filtre d'émission souhaitée, tandis que d'autres microscopes sont équipés de filtres préréglés spécifiques.
- Installez le microscope pour l'imagerie de liposomes simples. Pour assurer une qualité d'image optimale et une analyse de données ultérieure, utilisez une résolution à haute échelle grise et un schéma de pixels qui permet de suréchantillonner les liposomes individuels. Une profondeur de 16 et au moins 1 024 x 1 024 pixels pour une surface de 50 m x 50 m est recommandée. S'il est disponible, la moyenne des lignes peut être appliquée de façon bénéfique pour réduire le bruit (p. ex., 3 scans par ligne).
- Sélectionnez une puissance laser d'excitation qui assure à la fois un blanchiment non significatif d'un cadre à l'image et un signal assez fort pour discriminer clairement les liposomes individuels de l'arrière-plan. Le réglage optimal dépendra du microscope spécifique utilisé ainsi que de la combinaison fluorophore. Assurez-vous que les détecteurs ne sont pas saturés, car cela va biaiser la quantification de l'intensité.
- L'imagerie des fluorophores DOPE-Atto488 et DOPE-Atto655 dans les liposomes nécessite l'imagerie de plusieurs canaux. Ainsi, assurez-vous que chaque canal est image de façon séquentielle pour éviter la contre-excitation. Par exemple, prenez d'abord une image en excitant à 488 nm et en lisant l'émission à 495 à 560 nm. Par la suite, prendre une autre image en excitant à 633 nm, mais la lecture de l'émission seulement à 660-710 nm. Les détails dépendront du système de microscope (p. ex., quels lasers et filtres) disponibles.
- Assurez-vous de couvrir différentes zones de la surface, en acquérant au moins 10 images de l'échantillon, donc l'imagerie d'au moins 3.000 liposomes individuels. Si la densité de surface est inférieure à 300 liposomes/frame, acquérir plus d'images. Assurez-vous de recentrer le microscope pour chaque nouvelle image.
REMARQUE : Pour l'imagerie à deux canaux, assurez-vous de nommer les fichiers d'image afin que des paires d'images avec les mêmes liposomes dans différents canaux de fluorescence puissent facilement être identifiées lors de l'analyse des données. - Afin de quantifier l'incertitude expérimentale liée à la mesure de l'homogénéité de la composition, imagez la même zone de liposomes avant et après le recentrage (voir la figure 3 et la description dans le texte).
- Exportez les images du logiciel de microscope en tant que fichiers .tiff. Exporter les deux canaux des mêmes liposomes individuellement.
5. Analyse des données
REMARQUE : Des routines d'ajustement 2D Gaussian automatisées spécialement développées ont déjà été employées6,11,12. Cependant, pour augmenter l'applicabilité de la méthode, un processus d'analyse de données qui peut être facilement mis en œuvre dans tous les laboratoires est décrit.
- Chargez la paire correspondante d'images .tiff de deux canaux de fluorescence différents dans le même champ d'imagerie dans le logiciel FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
- Dans le menu Image, choisissez Couleuret utilisez la fonction Merge Channel pour créer un composite des deux canaux.
- Observez si les liposomes représentés dans deux canaux différents affichent une bonne colocalisation ou si la dérive visible s'est produite.
REMARQUE: En cas de dérive entre les deux canaux de fluorescence (reconnu comme un décalage systématique et égal X-Y entre le signal dans les deux canaux), l'un des cadres peut être traduit à l'aide de la fonction Transformer 'gt; Traduire dans le menu Image de FIJI. Cependant, il faut faire attention à une telle manipulation d'image. Il est donc recommandé d'éviter la dérive autant que possible lors de l'imagerie des liposomes. - Assurez-vous que le plugin ComDet (v.0.3.6.1 ou plus récent) est installé, ou faites-le dans le menu Plugins.
- Ouvrez le plugin ComDet pour détecter les particules en allant au menu Plugins et en choisissant ComDet v.0.3.6.1 .
- Dans ComDet, assurez-vous de choisir les particules de détection sur les deux canaux fonction individuelle. Définir la distance maximale entre les taches co-localisées similaires à la taille approximative des particules. Habituellement, 4 pixels est approprié pour les paramètres décrits ici.
- Le rapport signal-bruit devrait permettre de détecter même les particules sombres avec une faible quantité de fluorescence. Dans ComDet, réglez ce rapport à 3 en définissant la sensibilité de détection dans les deux canaux à des particules très dim (SNR 3).
REMARQUE : Bien que cette valeur SNR soit habituellement appropriée, il pourrait être nécessaire de la fixer plus haut (par exemple, s'il y a beaucoup de bruit d'image qui peut être identifié comme liposomes et conduire à de faux positifs). - Assurez-vous que les cases avec Calcul Colocalisation et Plot Detected Particles in Both Channels sont vérifiés, avant d'appuyer sur OK.
- Après l'exécution de l'analyse, deux fenêtres pop-up avec Résultats et Résumé s'affichent. Exportation de la table de données Résultats contenant les données de colocalisation (coordonnées de particules et intensité intégrée de chaque particule détectée) vers un logiciel de traitement des données de choix en sauvant la table comme fichier .txt et en l'important dans le logiciel.
- Assurez-vous que chaque liposome n'est inclus qu'une seule fois dans l'ensemble de données et non à la fois le canal1/canal2 ainsi que le ratio canal2/canal1. Ainsi, filtrer les données de sorte que seule Abs_frame 1 est tracée à l'étape 5.11.
REMARQUE : En choisissant Colocalized 1, les faux positifs du bruit dans les images peuvent être supprimés de l'analyse. Cependant, tout liposomes avec un seul des deux composants fluorescents présents sera également exclu de l'analyse, ce qui pourrait supprimer des points de données importants de l'analyse. - Tracez un histogramme de la colonne avec des données contenant le ratio d'intensité pour chaque liposome détecté.
- Le degré d'inhomogénéité de composition pour le système liposomique étudié est représenté par la largeur de la distribution du rapport d'intensité. Pour quantifier l'inhomogénéité, adaptez l'histogramme du rapport d'intensité à une fonction gaussienne et extrayez la moyenne et l'écart standard (sigma). Voir la section Résultats représentatifs.
- Une valeur pour le degré d'inhomogénéité (DI) peut maintenant être calculée en utilisant le coefficient de variation défini comme DI - sigma / .
6. Calibration de taille de Liposome
- Retirez une partie du stock de liposome et extrudez 21x à travers un filtre en polycarbonate de 50 nm tel que décrit à l'étape 1.10.
- Diluer les liposomes en ajoutant 10 L de la suspension liposome à 800 ll de tampon sorbitol dans un tube microcentrifuge.
- Transférer l'échantillon dilué de liposome dans une cuvette à usage unique en polypropylène.
- Mesurer la taille à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Effectuez au moins trois courses indépendantes pour mesurer la taille et la polydispersité de la suspension liposome.
REMARQUE : Si nécessaire, utilisez une suspension liposome plus concentrée pour la mesure. Des alternatives au DLS (p. ex., l'analyse du suivi des nanoparticules) peuvent également être appliquées pour mesurer la taille des liposomes. Une description de la façon d'exécuter une telle détermination de la taille des particules dépasse le cadre de ce protocole. - Imagez les liposomes d'étalonnage au microscope en utilisant exactement les mêmes paramètres expérimentaux tels que définis dans les étapes 4.1 et 4.2.
- Extraire l'intensité intégrée pour chaque liposome d'étalonnage dans les images d'étalonnage : Extraire la feuille de résultats filtrés contenant des intensités de fluorescence liposome telles que décrites dans les étapes 5.1-5.10. À partir du tableau des résultats, extraire la colonne "IntegratedInt".
- Étant donné que l'intensité totale intégrée d'un liposome étiqueté dans sa membrane est proportionnelle à la surface du liposome et est donc proportionnelle au carré de son diamètre, tracez un histogramme d'intensité de racine carrée de l'intensité de fluorescence du liposomes d'étalonnage.
- Adaptez l'histogramme d'intensité intégré produit à l'étape 6.7 avec une distribution normale de journal et extrayez l'intensité moyenne de fluorescence des liposomes d'étalonnage.
- Pour déterminer la relation entre l'intensité de la racine carrée (IntSqrt) et la taille du liposome, calculez le facteur de correction (C) en utilisant le diamètre liposome moyen (Dia) pesé par le nombre obtenu à partir des mesures DLS: Dia ' C x IntSqrt est équivalent à C ' Dia / IntSqrt.
- Calculez les valeurs intSqrt pour les liposomes dans l'expérience d'homogénéité compositionnelle et convertissez-les en diamètres en se multipliant avec le facteur de correction.
- Tracer la valeur du rapport d'intensité en fonction du diamètre pour les liposomes d'homogénéité compositionnelle, atteignant ainsi l'inhomogénéité en fonction de la taille du liposome pour une population de liposomes s'étendant d'environ 50 nm-800 nm.
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Representative Results
En suivant le protocole décrit, il est possible d'imager des liposomes uniques d'une manière parallèle massive (figure 1). L'immobilisation réussie de surface des liposomes devrait être immédiatement apparente lors de l'ajout de la solution liposome à la chambre (étape 3.6 dans le protocole) car les taches d'intensité limitée de diffraction devraient apparaître dans l'image(figure 1B et figure 1C).
Afin d'obtenir de bonnes statistiques et d'exploiter les capacités de haut débit de l'assay, plusieurs milliers de liposomes doivent être photographiés. Pour ce faire, dans un nombre raisonnable d'images, il est recommandé d'immobiliser suffisamment de liposomes pour atteindre une densité de 300 à 400 liposomes par image, car cela ramènera le nombre d'images par échantillon à 10, limitant ainsi le nombre d'images qui doivent être acquises et analysées. Une densité plus faible rendra l'analyse des données plus longue, tandis qu'une densité plus élevée peut rendre difficile pour le logiciel d'analyse d'image de distinguer les liposomes simples. Pour avoir une idée visuelle de ce à quoi ressemblent 300 à 400 liposomes, voir Figure 2A. Il convient de noter, cependant, que pour certaines applications (par exemple, les interactions membrane-protéine avec une protéine qui tend à susciter une forte liaison de fond à la surface BSA), il est recommandé d'utiliser une densité légèrement inférieure, comme dans la figure 2A en haut à droite.
Parfois, lors de l'acquisition d'images, il est difficile d'obtenir l'ensemble du champ de vision dans le point propre, comme illustré dans la figure 2B. De tels problèmes pourraient indiquer que la plaque d'échantillon est inclinée, qui peut résulter de la plaque ne pas être placé correctement sur le support de spécimen sur le microscope. En outre, si les liposomes semblent grands et flous, le tampon dans la chambre pourrait s'être évaporé et la surface desséchée. Il est particulièrement important de garder cette question à l'esprit lors de l'imagerie pendant de longues périodes ou lors de l'exécution de mesures à des températures supérieures à RT. Pour illustrer la différence entre les liposomes correctement stockés et séchés, une image du même échantillon avant et après le dessèchement de la chambre est montrée dans la figure 2C.
Après avoir assuré une qualité d'image optimale, l'intensité intégrée de chaque liposome dans les deux canaux d'imagerie peut être extraite suivant les étapes de la section 5 de ce protocole. Cela créera une liste de valeurs d'intensité uniques, ce qui nous permettra de calculer le rapport d'intensité pour chaque liposome individuel. L'inhomogénéité compositionnelle est évaluée à partir d'histogrammes de rapport d'intensité, révélant généralement une distribution gaussienne autour d'une valeur moyenne de rapport (Figure 3A). Notez que si de fortes déviations par rapport à une distribution gaussienne sont observées (figure 3B), il indique un problème de sensibilité de détection pour au moins un des canaux d'imagerie, ce qui suggère qu'un sous-ensemble de liposomes montrant un signal plus faible ont été exclus. Cela pourrait être dû à la fois à la limite de détection du système d'imagerie, ou à l'exclusion des liposomes dans l'analyse des données (p. ex., lors de l'application d'un certain seuil minimum; voir l'étape 5.7).
Le calcul de la valeur de l'ID tel que décrit dans les étapes 5.11-5.13 du protocole fournira une mesure quantitative de l'homogénéité compositionnelle entre les liposomes individuels de la préparation. Pour le système liposomique étudié ici, DI 0,23 à 0,01 (figure 3C). Cette valeur peut être utilisée pour comparer systématiquement la façon dont les différentes propriétés liposome ou méthodes de préparation affectent l'homogénéité compositionnelle. Pour conceptualiser la signification de la valeur DI, nous nous référons à la distribution normale affichée par l'histogramme de rapport d'intensité, signifiant qu'ils obéiront à la règle empirique 68-95-99.7. Cette règle décrit le pourcentage d'une population qui se situe dans un, deux et trois écarts types autour de la valeur moyenne. Pour la valeur DeI de 0,23 à 0,01 trouvée ici, cela signifie que 32 % des liposomes de la population auront un rapport d'intensité qui diffère de plus de 23 % du rapport molaire moyen de l'ensemble (figure 3D).
Pour l'imagerie d'expérience de contrôle les mêmes liposomes avant et après le recentrage (section 4.6), la même analyse de données et le tracé de résultat comme pour l'expérience réelle est effectuée. Cela permet de quantifier l'incertitude expérimentale de la valeur DI, qui s'est avérée êtrel'incertitude d'ID 0,10 à 0,01 (figure 3E). Bien que la valeurd'incertitude d'ID dépendra du système d'imagerie employé, il a été constaté que les configurations de microscope confocaldonnent uniformément donnent lieu à des valeursd'incertitude d'ID d'environ 0.105,6. La valeur dI de DI - 0,23 - 0,01 trouvé pour le système liposomique ici est plus de deux fois l'incertitude expérimentale, ce qui suggère la présence d'une inhomogénéité compositionnelle significative entre les liposomes individuels de la préparation.
L'exécution de l'expérience d'étalonnage de taille décrite à la section 6 permettra de transformer les valeurs arbitraires d'intensité du liposome en diamètres physiques en nanomètres. La méthode a été validée par rapport à d'autres techniques d'imagerie25 telles que la microscopie électronique cryogénique, qui a la capacité de résoudre optiquement les liposomes de taille nanométrique, bien qu'avec un débit beaucoup plus faible. En imagerie de l'échantillon témoin en utilisant exactement les mêmes paramètres de microscope utilisés pour les expériences réelles, il est maintenant possible de corréler l'intensité liposome moyenne au diamètre liposome moyen déterminé par DLS (Figure 4A). L'étape suivante consiste à représenter la distribution de l'intensité du liposome, qui, en fonction des contraintes physiques contre la création de liposomes extrêmement petits, affichera généralement une distribution normale journal (Figure 4B). Si la distribution n'est pas bien décrite par une distribution normale de journal (le plus souvent en raison de liposomes manquants avec des valeurs de faible intensité), cela signifie qu'une partie de la population de liposomes a été exclue en raison de la faible sensibilité de détection de microscope ou des paramètres trop stricts pendant l'analyse de données (figure 4C). Il est important d'attraper et d'aborder ces questions afin d'assurer une interprétation impartiale des données. Ensuite, les valeurs d'intensité de chaque liposome individuel de la figure 4B peuvent être converties en diamètres réels à l'aide du facteur de correction déterminé à la figure 4A (figure 4D). Après avoir déterminé la taille de chaque liposome, le DI en fonction du diamètre peut maintenant être étudié en traçant le rapport d'intensité par rapport au diamètre pour chaque liposome individuel (Figure 4E). Cette structure de données en funnel-like corrobore les résultats antérieurs que la valeur DI augmente lorsque la taille du liposome diminue6. Fait important, l'augmentation symétrique de la propagation des rapports d'intensité autour d'une valeur moyenne suggère qu'il n'y a pas de variation systématique dépendante de la taille dans la composition moyenne des liposomes.
Figure 1 : L'exemple liposome simple. (A) Les liposomes sont formulés avec une teneur equimolar des lipides fluorescents dOPE-Atto488 et DOPE-Atto655 et immobilisés sur une surface de BSA à l'aide d'un lien biotine/streptavidin. (B) Les liposomes immobilisés sont représentés à l'aide d'un microscope confocal, permettant de détecter les intensités de fluorescence des liposomes simples. Barres d'échelle de 8 m . (C) Zoom de la zone verte dans (B) représenté comme parcelle d'intensité de surface pour deux liposomes adjacents affichant le signal fluorescent inversé entre les deux canaux, illustrant le concept d'homogénéité compositionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Optimisation et pièges. (A) Le haut à gauche montre 29 liposomes immobilisés dans un cadre de 50 m x 50 m. Ce sont trop peu de liposomes par image pour exploiter la possibilité d'une enquête à haut débit de l'inhomogénéité liposome. Le haut à droite montre 123 liposomes par image. Il s'agit d'une densité sous-optimale, mais peut être utilisé si de nombreuses images sont acquises. Le bas à gauche montre 300 à 400 liposomes par image. C'est optimal pour le protocole décrit ici. Le bas à droite montre plus de 1500 liposomes par image, ce qui est trop pour distinguer les liposomes individuels. Il y a un risque élevé qu'une seule tache soit réellement deux liposomes immobilisés dans le même endroit limité de diffraction. (B) Si la chambre n'est pas placée correctement dans le porte-spécimen, il sera impossible d'obtenir tout le champ de vision dans le bon foyer. Dans le micrographe gauche, la plaque est inclinée autour de l'axe de traversée, ce qui donne lieu à l'angle inférieur gauche étant hors de discussion. Dans le micrographe droit, la plaque s'incline autour de l'axe longitudinal, donnant lieu à une inclinaison plus lourde. Le coin inférieur gauche et supérieur droit sont flous. (C) Si l'imagerie pendant de longues périodes ou à des températures élevées le tampon peut s'évaporer, conduisant à dessèchement hors de la chambre. Nous avons illustré ce scénario ici par des liposomes d'imagerie avant et après que la chambre a été laissée sécher pendant 3 min, puis rewetted en ajoutant tampon frais à la chambre. Les liposomes qui en résultent sont plus grands, flous, ont une intensité de fluorescence plus faible et semblent être étalés sur la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Histogrammes de rapport d'intensité pour quantifier l'inhomogénéité compositionnelle liposome. (A) Le rapport d'intensité de la fluorescence DOPE-Atto488 et DOPE-Atto655 pour chaque liposome individuel tracé comme histogramme. (B) Une distribution gaussienne tronquée illustrant un problème de sensibilité potentiel, soit pendant l'imagerie, soit à l'étape du traitement des données. (C) L'ajustement de l'histogramme d'intensité avec une fonction gaussienne permet d'extraire l'écart moyen et standard utilisé pour calculer la valeur DI. (D) Une valeur DI de 0,23 peut être traduite à 32% de la population différente de plus de 23% du rapport molaire moyen de l'ensemble. (E) Control experiment imaging the same liposomes before and after refocusing and then performing the same data treatment procedure as for the actual experiment. Cela permet de déterminer l'erreur expérimentale pour la quantification DI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Convertir l'intensité du liposome en diamètre physique en nm. (A) Histogramme d'intensité des liposomes d'étalonnage extrudés de 50 nm par rapport aux données dLS afin de déterminer le facteur d'étalonnage. (B) Un histogramme de la valeur IntSqrt des liposomes expérimentaux donne généralement une distribution log-normale en raison des contraintes physiques contre la création de très petits liposomes. (C) Un histogramme de valeur IntSqrt non log-normal indique soit des problèmes de sensibilité à la détection, soit que de petits liposomes ont été exclus pendant le traitement des données. (D) Les intensités liposome dans (B) sont converties en diamètres liposome réels en utilisant le facteur de correction. (E) Le rapport d'intensité de chaque liposome tracé en fonction du diamètre du liposome peut maintenant être affiché permettant l'étude de l'inhomogénéité compositionnelle en fonction de la taille du liposome. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il est important de noter que si nous décrivons en détail comment l'analyse des liposomes simples peut être utilisée pour étudier l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels, la plate-forme est très polyvalente. Comme indiqué précédemment et discuté dans l'introduction, le protocole peut facilement être adapté pour étudier des aspects de la fusion membrane-membrane, des interactions protéine-membrane, ou de la caractérisation liposomique de porteur de drogue. Pour toutes les questions scientifiques abordées, la puissance de l'essai liposome unique réside dans la capacité de détecter les composants individuels de l'ensemble et donc d'avoir une lecture quantitative, pas biaisée par les effets de moyenne ensemble.
L'analyse monographique est parfaitement adaptée aux modalités d'imagerie de surface telles que la réflexion interne totale ou le microscope confocal, où la section de direction Z peut éliminer la fluorescence de fond indésirable de la solution au-dessus de la couche liposome. Cependant, cet aspect est le plus important pour les études où des composés étiquetés fluorescents, tels que des peptides, des protéines ou d'autres liposomes sont ajoutés à la solution et y restent pendant l'imagerie. Par exemple, si l'essai est utilisé dans le format décrit en détail ici, où les colorants fluorescents sont limités aux liposomes immobilisés, l'essai pourrait en principe être effectué à l'aide de microscopes largechamp plus largement disponibles, fournissant la détection système est assez sensible.
A priori il n'y a pas de limitations en ce qui concerne la méthode utilisée pour préparer les liposomes utilisés dans l'assay. Ici, nous décrivons en détail l'utilisation d'une technique de lyophilisation. Cependant, des techniques de réhydratation lipidique à base de chloroforme ou d'injection d'éthanol ont été utilisées pour fabriquer des liposomes utilisés dans l'analyse5,6. Un paramètre critique est l'inclusion d'une fraction infime de lipides biotinylated dans le mélange lipidique pour assurer l'immobilisation (0,05 mol% recommandé). Un autre élément nécessaire est d'inclure une petite quantité de lipides fluorescents étiquetés. Dans l'ensemble, la quantité de lipide-colorant ajouté doit être maintenue aussi bas que possible pour éviter les effets d'étanchéité et pour éviter le lipide-colorant de modifier de manière significative les propriétés physicochimiques du liposome. La limite inférieure de la quantité de colorant lipidique est fixée par la concentration, où la variation stochastique du nombre de colorants lipidiques individuels par liposome devient significative par rapport à la quantité moyenne de colorants lipidiques (voir Larsen etal.6 pour une discussion approfondie). En dessous de cette limite, il y aura de grandes incertitudes dans les intensités extraites. Enfin, la quantité de colorant lipidique doit être suffisamment élevée pour une détection précise des liposomes simples avec un bon rapport signal-bruit. Bien que ce critère dépend bien sûr fortement du système d'imagerie, nous avons constaté que les concentrations de colorant lipidique entre 0,05 et 0,5 mol% fonctionnent bien dans la grande majorité des cas.
Pour choisir le colorant lipidique à inclure dans le liposome, la première condition préalable est que les propriétés d'excitation et d'émission correspondent aux capacités d'éclairage et de détection du système d'imagerie. Deuxièmement, pour augmenter la sensibilité et la précision de la méthode, nous recommandons d'utiliser des colorants avec des rendements quantiques élevés et la photostabilité, et nous avons déjà utilisé avec succès des colorants avec différentes longueurs d'onde d'excitation6,11. Il faut prendre soin de choisir des ancres lipidiques ayant des propriétés physicochimiques similaires pour s'assurer que le cloisonnement des lipides ne mène pas à une inhomogénéité artificiellement élevée. Par exemple, pour ce protocole, nous avons ancré les deux fluorophores utilisant DOPE, tout en ayant un fluorophore sur DOPE et un autre sur DOPE pourrait conduire à des hétérogénéités de distribution de fluorophore non liées à l'homogénéité inhérente dans la population liposome. Particulièrement pour l'imagerie de double couleur il est important de choisir des colorants avec des spectres étroits d'excitation et d'émission et le plus petit chevauchement spectral autant que possible pour éviter le saignement significatif-à travers, la conversation croisée, et le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) entre des colorants et des canaux. Pour éviter les artefacts liés à la variation de l'environnement fluorophore, nous préférons travailler avec des colorants, qui ont été prouvés expérimentalement pour montrer une propension à l'interaction à membrane extrêmement faible telle que déterminée par Hughes et al.26. Enfin, si une composition lipidique liposome spécifique n'est pas une exigence difficile pour la conception expérimentale, il peut être bénéfique d'inclure jusqu'à 10 mol% de lipides chargés négativement pour s'assurer que les liposomes individuels se repoussent les uns les autres et sont efficacement immobilisés comme liposomes simples12.
Un avantage de l'analyse liposome simple est le petit volume expérimental, qui peut réduire considérablement la quantité de composés coûteux ou rares utilisés par expérience. Ici, nous décrivons l'utilisation de chambres standard et disponibles dans le commerce avec un volume expérimental entre 150 et 300 L. Cependant, des chambres de microscope sur mesure qui peuvent réduire le volume à une gamme de 50 à 80 L peuvent être utilisées. En outre, la consommation de liposome est très faible, avec une concentration finale autour de 2 m lipides totaux.
Un inconvénient de l'effort liposome simple est qu'il est difficile de commander la concentration de lipide dans la chambre due aux variations des tendances d'immobilisation décrites ci-dessus. En outre, en ce qui concerne l'application de l'évaluation pour l'étude des interactions membrane-protéine, il est difficile de déterminer la concentration ou le nombre de protéines liées directement à partir de l'intensité de fluorescence.
Lors de l'utilisation des liposomes dans l'assay comme systèmes de modèle membranaire (par exemple, pour étudier l'interaction membranaire des composés fluorescents, des peptides ou des protéines), il est important d'assurer une faible liaison non spécifique aux composants protéiques qui facilitent le Immobilisation. Si ce n'est pas le cas, un signal de fond élevé peut être détecté qui pourrait empêcher la détection de la liaison spécifique aux liposomes. Si un arrière-plan non spécifique élevé est détecté, nous avons déjà réussi à réduire l'arrière-plan en passant de la streptavidine à la neutravidin ou à l'avidine.
L'exécution d'une détection unique de liposome utilisant d'autres techniques comme la cytométrie de flux pourrait potentiellement offrir un débit de détection accru comparé à l'essai basé sur le microscope. Cependant, étant donné que les cytomètres de débit sont optimisés pour étudier des échantillons beaucoup plus grands et plus lumineux comme les cellules, le système de détection de la plupart n'est pas assez sensible pour détecter la fluorescence relativement faible d'un liposome individuel. Ainsi, alors que la cytométrie de flux nouvelle et plus sensible est en cours de développement, l'essai au microscope offre la meilleure solution pour élucider les inhomogénéités liposome lorsqu'il est effectué efficacement et la surveillance de milliers de liposomes par expérience.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par le Conseil danois pour la recherche indépendante [accord 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
