Summary
이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.
Abstract
막 모형 시스템 또는 약 납품 운반대로 리포솜을 채택하는 대부분의 연구는 대량 판독 기술에 의존하고 따라서 본질적으로 앙상블의 모든 리포솜이 동일하다고 가정합니다. 그러나 단일 입자 수준에서 리포솜을 관찰할 수 있는 새로운 실험 플랫폼은 개별 리포좀에 대한 단백질 막 상호 작용 또는 약물 담체 특성에 대한 매우 정교하고 정량적인 연구를 수행할 수 있게 해 주었으며, 따라서 앙상블 평균에서 오류를 방지. 여기에서 우리는 형광 기지를 둔 현미경 분석법을 사용하여 단 하나 리포좀을 준비, 검출 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시하고, 그 같은 단 하나 입자 측정을 촉진하. 이 설정은 개별 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미징할 수 있게 하며 샘플 내 크기와 조성 불균질성을 드러내기 위해 사용됩니다. 추가적으로, 프로토콜은 단 하나 리포솜 수준에서 리포솜 공부의 이점, 분석결과의 한계 및 그밖 연구 질문을 공부하기 위하여 그것을 수정할 때 고려될 중요한 특징을 기술합니다.
Introduction
리포솜은 기초와 응용 연구 에서 둘 다 무겁게 이용되는 구형 인지질 기지를 둔 소포입니다. 이들은 우수한 멤브레인 모델 시스템으로 기능하며, 이들의 생리화학적 특성은 리포좀1,2를구성하는 지질 성분을 변화시킴으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문이다. 또한, 리포솜은 향상된 약동학 및 약력학뿐만 아니라 높은 생체 적합성3을제공하는 가장 많이 사용되는 약물 전달 나노 캐리어 시스템을 구성합니다.
몇 년 동안, 리포솜은 주로 대량 기술을 사용하여 연구되어 앙상블 평균 판독 값에만 액세스 할 수 있습니다. 이것은 앙상블에 있는 모든 리포좀이 동일하다는 것을 가정하기 위하여 이 연구 결과의 대다수를 지도했습니다. 그러나 이러한 앙상블 평균 값은 기본 데이터 집합이 평균 값 주위에 균일하게 분포되어 있는 경우에만 정확하지만 데이터 집합에 여러 독립 모집단이 포함된 경우 거짓및 편향된 결론을 나타낼 수 있습니다. 또한, 전체 인구를 나타내는 앙상블 의미를 가정하면 리포솜 사이의 불균질성 내에 있는 정보를 간과할 수 있다. 최근에는 단일 리포좀을 조사할 수 있는 정량적 분석이 등장하여, 리포좀 크기4,지질조성5,6,및 캡슐화 효율7을포함한 중요한 물리화학적 특성에 대하여 개별 리포좀 들 사이의 큰 불균질성을 드러내며, 단일 리포좀 수준에서 리포좀을 연구하는 것의 중요성을 강조하고 있다.
리포솜 성질의 앙상블 평균화가 편향된 결과로 나타난 연구 영역은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용을 연구하고있다8,9. 전통적으로, 이러한 과정을 연구하는 연구원은 다른 기공 크기9필터를통해 압출에 의해 다른 앙상블 평균 직경리포솜을 준비하는 것으로 제한되었습니다. 그러나, 단일 리포좀 어세스를 사용하여 개별 리포좀의 직경을 추출하는 것은 큰 인구 중복을 밝혀, 리포솜을 사용하여 압출 100 nm 및 200 nm 필터는 그들의 크기 분포에 70% 중첩까지 표시4. 이것은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용10의대량 측정을 심각하게 편향시킬 수 있었다. 단일 리포솜 분석법을 사용하여 막 단백질 상호 작용 연구를 수행, 연구원은 대신 샘플 내에서 크기 다분산성을 활용, 각 단일 실험 내에서 리포좀 직경의 넓은 범위를 연구 할 수 있도록, 막 곡률과 조성이 막에 단백질 모집에 영향을 미칠 수있는 방법의 새로운 발견을 촉진4,11,12. 단일 리포솜 분석에 의한 또 다른 분야는 단백질 매개 막융합13,14의기계적 연구에 있다. 이러한 운동 측정의 경우 개별 융합 이벤트를 연구하는 능력은 융합 프로세스의 실험 적 동기화의 필요성을 완화하여 대량 앙상블 측정에서 수행되는 주공간 평균화에서 손실되었을 새로운 기계적 통찰력을 허용했습니다. 추가적으로, 단 하나 리포솜은 개별 적인 단백질의 측정을 허용하고 막 단백질 구조 역학15,16에새로운 지식을 제안하는 막 스캐폴드로 이용되었습니다. 더욱이, 이러한 프로테올리포좀 기반 설정은 개별 막 트랜스멤브레인수송기(17) 및 모공 형성 단백질복합체(18)의 기능뿐만 아니라 생리활성막-투과펩타이드(19)의 기전을 연구하는 것을 가능하게 하였다. 단일 리포솜은 또한10-19 L의 부피에서 효소 반응을 위한 챔버로서 사용되는 표면 고정된 단일 리포솜을 가진 연질 나노유체학으로서 사용되어 왔으며, 최소한의 제품소비로스크리닝 검거및 복잡성을 증가시키고 있다.
최근, 단일 리포솜 검사에서는 이전에 는 미리 정연하지 않은 수준의 세부 사항에서 약물 전달 리포좀을 특성화하는 데 사용되었습니다. 연구자들은 개별리포좀(21)의표면에 부착된 중합체의 양에서 유의한 불균질성을 정량화할 수 있었다. 단일 리포좀 검사는 또한 혈장과 같은 복합 매체에서 약물 전달 리포좀의 측정을 허용하고, 지질 앵커를 통해 리포좀 표면에 고정된 원소가 생체 내 순환 중에 경험한 조건을 모방하는 조건에 노출될 때 해리에 취약할 수 있는 방법을밝혀냅니다 22. 전반적으로, 단일 리포솜 assays의 다양성과 유용성은 이 설치가 해결하기 위하여 채택된 문제의 큰 다양성에 의해 입증되고, 우리는 방법론이 새로운 과학적인 필드에서 계속 개발되고 사용을 찾아내려고 구상합니다.
여기에서 우리는 개별 리포솜이 높은 처리량 방식으로 공부될 수 있도록 하는 형광 현미경 계 단 하나 리포좀 분석법을 기술합니다(그림 1). 이 방법을 설명하기 위해, 우리는 앙상블 내에서 개별 리포좀 사이의 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 데 사용합니다. 이 분석은 통과 유리 표면에 고정된 단일 리포좀의 형광 현미경 이미징을 사용합니다. 우리는 먼저 적절한 형광 리포솜 라벨링 및 고정을 보장하는 리포솜 제조 공정의 중요한 단계를 설명합니다. 그런 다음, 적절한 리포솜 표면 밀도를 보장하기 위한 절차를 개략적으로 설명하기 전에 리포솜 고정을 용이하게 하는 데 필요한 표면 준비를 설명합니다. 우리는 고품질의 이미지를 획득하는 데 중요한 현미경 매개 변수에 대해 논의하고 간단한 데이터 분석을 수행하는 방법을 설명하여 리포솜 크기와 조성 불균질성을 추출 할 수 있습니다. 이 일반적인 프로토콜은 관심 있는 연구원이 그 또는 그녀의 특정 연구 관심사를 위한 분석학을 더 개발하기 위한 좋은 기초를 제공해야 합니다.
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Protocol
1. 리포솜 준비
참고 : 간단히, 리포솜의 준비는 일반적으로 세 가지 중요한 단계를 포함 : 1) 원하는 지질 조성물의 건조 지질 필름의 준비; 2) 리포좀 형성을위한 지질의 재수화; 및 3) 리포좀 인구의 크기와 라멜라성을 조절한다.
- 지질을 측정하고 테르-부탄올:물(9:1)에 유리 병에 녹입니다.
- 용해 POPC (1-팔미토일-2-올레오일 글리세로-3-포스포콜린; MW = 760 g/mol) ~ 50mM.
- 콜레스테롤(MW = 387 g/mol)을 25mMM으로 용해시면 됩니다.
- 용해 도피-Atto488 (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-Atto488; MW = 1,316 g/mol) ~ 0.1 mM.
- 용해 도피-Atto655 (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-Atto655; MW = 1,368 g/mol) ~ 0.1 mM.
- 용해 DSPE-PEG2000-비오틴 (1,2-디스테릴-스니케로-글리세로-3-포스페이타놀라민-N-[바이오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; MW = 3,017 g/mol) ~ 0.1mM.
참고: 지질을 55°C로 가열하고 자기 교반을 사용하여 지질의 완전한 용해를 보장합니다. 또는 초음파 처리 욕을 사용하십시오. 사용되지 않은 지질 스톡은 -20°C에서 몇 개월 동안 보관될 수 있다.
- 1.1단계에서 준비된 지질 주식을 POPC:콜레스테롤:콜레스테롤:도페-아토488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-비오틴 68.95:30:0.5:0.5:0.05, POPC 138 μL, 콜레스테롤 120 μL, 형광으로 표지된 각 지질 500μL, 및 50 μL DSPE-PEG-비오틴을 신선한 유리 병으로.
참고 : 정확한 리포솜 조성물은 관심있는 특정 질문을 해결하기 위해 쉽게 수정 할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. - 유리 병의 뚜껑을 풀고 액체 질소로 바이알을 스냅 동결시됩니다.
- 하룻밤 동안 냉동 지질 혼합물을 동결 유구화.
- 건조 지질에 200 mM D-소르비톨 완충제 (소르비톨 완충제)의 1 mL을 추가합니다.
- 혼합물을 45°C로 가열하고 적어도 1시간 동안 자기 교반에 노출시다.
참고: 완충제는 해결되고 있는 특정 질문(예를 들면, 막 단백질 상호 작용을 공부하기 위한 생리적 조건, 또는 약물 전달 리포좀을 공부하기 위한 특정 임상적으로 승인된 완충제)를 반영해야 한다. 그러나, 특정 완충액이 연구에 필요하지 않은 경우, 리포솜의 다층성도를 감소시키기 위해 이온이 없는 버퍼를 재수화시키기 위해 적용될 수 있다. - 액체 질소에 바이알을 찍어 지질 현탁액을 동결하고 현탁액이 완전히 동결 될 때까지 기다립니다.
- 혼합물이 완전히 해동 될 때까지 55 °C에서 가열 욕조에 냉동 현탁액을 담급니다.
- 리포솜 현탁액이 총 11회 동결/해동 주기에 노출될 때까지 1.7 단계와 1.8단계를 반복합니다.
참고: 반복된 동결/해동 주기는 리포솜 다과체 분석의 정확도에 가장 중요한 리포솜다과멜화(23)를감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 다층계 리포솜이 리포좀의 형광 강도대 리포솜 크기 비율을 왜곡하기 때문에 가장 중요합니다. 다층부미성은 일반적으로 제형에서 0.5% 이상의 PEGylated 지질을 포함할 때 본질적으로 낮다(예: 약물 전달을 위한 리포좀에서 통상적으로 행함)(예컨대 약물 전달을 위한 리포좀에서행함).24. - 미니 압출 키트를 사용하여 800 nm 폴리 카보네이트 필터를 통해 리포솜 현탁액을 한 번 압출합니다. 압출 키트 조립에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오(재료 표참조).
- 리포솜을 밤새 4°C에 보관합니다.
2. 이미징 챔버의 표면 준비
- 소 혈청 알부민을 준비 (BSA; 1 mg / mL), BSA-비오틴 (1 mg / mL) 및 스트렙타비딘 (0.025 mg / mL) 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-피페라진에탄에설포닉산 95 mMCl NaPes (완충액).
참고: 리포좀 파열을 방지하기 위해, 재수화에 사용되는 소르비톨 버퍼와 표면 준비에 사용되는 HEPES 버퍼는 동위원소여야 합니다. 따라서 실험 전에 버퍼의 삼투압을 확인하는 것이 좋습니다. - BSA 1,200 μL과 BSA-비오틴 120 μL을 혼합하고 현미경 검사법용 8 개의 잘 슬라이드에 혼합물의 300 μL을 각각 잘 추가하십시오.
참고 : 여기에서 우리는 유리 바닥 (재료 표참조)이있는 시판 되는 8 개의 잘 현미경 슬라이드를 사용하지만 프로토콜은 맞춤형 현미경 챔버에 쉽게 적용 할 수 있습니다. - 실온(RT)에서 20분 동안 슬라이드를 인큐베이팅합니다.
- HEPES 버퍼 300 μL로 슬라이드를 8x 세척합니다.
참고: 표면을 건조하면 손상될 수 있으므로 몇 초 이상 버퍼없이 우물을 방치하지 않도록 주의하십시오. 또한 파이펫 팁으로 표면이 긁히지 않도록 주의하십시오. 따라서 우물에서 버퍼를 흡입 할 때 가장자리 또는 모서리에서 수행하십시오. - 스트렙타비딘 250 μL을 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- 2.4단계에서 설명한 8개의 세차서를 반복한다.
- 현미경 슬라이드를 300 μL의 소르비톨 완충액으로 각 우물에서 4°C로 저장합니다. 용매의 증발은 표면을 손상시킬 수 있으므로 현미경 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 준비된 슬라이드를 즉시 사용하지 않는 한 파라필름으로 밀봉하십시오.
3. 리포솜 고정
- 리포좀 현탁액을 소르비톨 완충액에서 약 20 μM 총 지질로 희석한다. 섹션 1의 절차는 약 10 mM 총 지질의 리포좀 현탁액을 산출할 것이다.
- 슬라이드를 현미경에 놓고 유리/버퍼 인터페이스에서 증가된 레이저 반사 신호를 사용하여 챔버 표면에 초점을 맞춥니다.
- 신선한 HEPES 완충액300 μL로 챔버를 4x 세척합니다.
- 희석된 리포솜 스톡 10 μL(총 지질 20 μM)을 미세원원지 튜브에 넣습니다.
- 챔버에서 완충액 100 μL을 꺼내, 3.4 단계에서 제조 된 미세 원심 분리튜브에 추가하고, 적절하게 혼합하고, 110 μL을 챔버에 다시 넣습니다.
- 현미경의 밑에 표본을 놓고, 표면에 고정되는 리포좀을 관찰하기 위하여 리포좀 불소에서 신호를 검출할 수 있는 기초현미경 설정을 이용하십시오.
- 개별 리포좀을 식별하기에 충분히 희소하고 높은 처리량 측정을 용이하게 할 만큼 조밀한 리포솜 표면 밀도를 목표로 합니다. 전형적으로 50 μm x 50 μm 시야각을 사용하여, 프레임당 300-400 리포솜이 최적이다(도2). 이것은 일반적으로 5-10 분 이내에 달성 될 수있다.
참고: 시야에서 빠르게 움직이는 형광 입자만 검출되는 경우, 고정 공정에 중요한 성분(BSA-비오틴, 스트렙타비딘, DOPE-PEG-비오틴)의 부재 또는 너무 낮은 농도가 원인일 수 있습니다. 리포좀이 검출되지 않으면 낮은 리포좀 농도, 형광 검출을 위한 부적절한 설정 또는 유리 표면에 없는 초점 평면으로 이미징할 수 있습니다. - 적절한 리포솜 표면 밀도에 도달하면 200 μL의 HEPES 버퍼로 챔버를 3x 세척하십시오.
참고: 고정 운동학은 크기 및 전하와 같은 리포좀 특성에 따라 달라지므로 항상 각 리포좀 제형에 최적화되어야 합니다.
4. 이미지 획득
참고: 이 섹션은 실험을 수행하는 연구원이 사용할 수 있는 현미경 시스템에 많이 의존할 것입니다. 따라서, 이미징을 수행하는 방법에 대한 전반적인 가이드라인이 설명될 것이다. 그러나 정확한 설정과 적용 방법은 현미경 설정마다 다릅니다. 예를 들어, 일부 시스템은 원하는 방출 필터 조합을 선택할 수 있으며, 다른 현미경에는 특정 사전 설정 필터가 장착되어 있습니다.
- 단일 리포솜 이미징을 위한 현미경을 설치합니다. 최적의 이미지 품질과 후속 데이터 분석을 보장하기 위해 높은 그레이스케일 해상도와 개별 리포좀을 오버샘플링할 수 있는 픽셀 구성표를 사용합니다. 50 μm x 50 μm 영역에 대해 16 픽셀 및 최소 1,024 x 1,024 픽셀의 비트 깊이가 권장됩니다. 사용 가능한 경우 노이즈를 줄이기 위해 라인 평균을 유익하게 적용할 수 있습니다(예: 라인당 3회 스캔).
- 중요하지 않은 프레임 대 프레임 표백과 배경에서 개별 리포좀을 명확하게 구별할 수 있는 강력한 신호를 보장하는 여기 레이저 파워를 선택합니다. 최적의 설정은 사용되는 특정 현미경뿐만 아니라 형광공 조합에 따라 달라집니다. 이 편향 강도 정량화로 인해 검출기가 포화되지 않았는지 확인합니다.
- 리포좀에 있는 DOPE-Atto488 및 DOPE-Atto655 불소 둘 다 화상 진찰은 다중 채널을 화상 진찰을 요구합니다. 따라서 교차 여기를 피하기 위해 각 채널이 순차적으로 이미지화되어 있는지 확인합니다. 예를 들어, 먼저 488 nm에서 흥미 진진하고 495-560 nm에서 방출을 읽음으로써 하나의 이미지를 가져 가라. 그 후, 633 nm에서 흥미 진진한하지만 660-710 nm에서 만 방출을 읽고 다른 이미지를 가져 가라. 특이사항은 사용 가능한 현미경 시스템(예: 레이저 및 필터)에 따라 달라집니다.
- 표면의 다른 영역을 커버해야, 샘플의 적어도 10 이미지를 획득, 따라서 적어도 이미징 3,000 개별 리포좀. 표면 밀도가 리포솜/프레임 300보다 낮으면 더 많은 이미지를 수집합니다. 모든 새 이미지에 대해 현미경을 다시 초점을 맞춥니다.
참고: 2채널 이미징의 경우 데이터 분석 중에 서로 다른 형광 채널에서 동일한 리포솜을 가진 이미지 쌍을 쉽게 식별할 수 있도록 이미지 파일의 이름을 지정해야 합니다. - 조성 불균질성의 측정과 관련된 실험적 불확도를 정량화하기 위해, 재초점 전후에 리포솜의 동일한 영역을 이미지화한다(도 3 및 텍스트의 설명 참조).
- 현미경 소프트웨어에서 이미지를 .tiff 파일로 내보냅니다. 동일한 리포솜의 두 채널을 개별적으로 내보냅니다.
5. 데이터 분석
참고 : 특별히 개발 된 자동화 된 2D 가우시안 피팅 루틴은 이전에6,11,12를사용했습니다. 그러나, 방법의 적용가능성을 높이기 위해 모든 실험실에서 용이하게 구현될 수 있는 데이터 분석 과정이 설명되어 있다.
- 동일한 이미징 필드에 있는 두 개의 서로 다른 형광 채널의 .tiff 이미지 쌍을 FIJI(FIJI는 ImageJ) 소프트웨어에 로드합니다.
- 이미지 메뉴에서 색상을선택하고 채널 병합 기능을 사용하여 두 채널의 합성을 만듭니다.
- 두 개의 서로 다른 채널에서 이미지된 리포좀이 양호한 동지역화를 표시하는지 또는 눈에 보이는 드리프트가 발생했는지 관찰합니다.
참고 : 두 형광 채널 사이의 드리프트의 경우 (두 채널의 신호 사이의 체계적이고 동등한 X-Y 오프셋으로 인식), 프레임 중 하나는 피지의 이미지 메뉴에서 변환 > 번역 기능을 사용하여 변환 할 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지 조작에는 주의를 기울여야 합니다. 따라서 리포좀을 이미징할 때 가능한 한 많이 표류하지 않는 것이 좋습니다. - ComDet 플러그인(v.0.3.6.1 이상)이 설치되어 있는지 확인하거나 플러그인 메뉴에서 이 작업을 수행하십시오.
- ComDet 플러그인을 열어 플러그인 메뉴로 이동하여 ComDet v.0.3.6.1 > 파티클 감지를선택하여 파티클을 감지합니다.
- ComDet에서 두 채널에서 파티클 감지를 개별적으로 선택해야 합니다. 공동 지역화된 점 사이의 최대 거리를 대략적인 입자 크기와유사하게 설정합니다. 일반적으로 여기에 설명된 설정에 4픽셀이 적합합니다.
- 신호 대 잡음 비는 형광량이 적은 희미한 입자도 감지할 수 있어야 합니다. ComDet에서 두 채널의 감지 감도를 매우 희미한 입자(SNR = 3)로설정하여 이 비율을 3으로 설정합니다.
참고: 이 SNR 값은 일반적으로 적절하지만 더 높게 설정해야 할 수 있습니다(예: 리포솜으로 식별되고 거짓 긍정으로 이어질 수 있는 이미지 노이즈가 많은 경우). - 확인을누르기 전에 두 채널에서 양방향 으로 계산되고 감지된 파티클계산이 있는 상자가 선택되어 있는지 확인합니다.
- 분석을 실행하면 결과 및 요약이 있는 두 개의 팝업 창이 표시됩니다. 데이터를 내보내면 .txt 파일로 테이블을 저장하고 소프트웨어로 가져와서 선택한 데이터 처리 소프트웨어로 공동 지역화 데이터(파티클 좌표 및 감지된 각 파티클의 통합 강도)가 포함된 결과입니다.
- 각 리포솜이 데이터 세트에 한 번만 포함되어 있고 채널1/channel2와 channel2/channel1 비율이 모두 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 따라서 Abs_frame = 1만 단계 5.11에 플롯되도록 데이터를 필터링합니다.
참고 : 공동 지역화 = 1을선택하면 이미지의 노이즈에서 거짓 긍정을 분석에서 제거 할 수 있습니다. 그러나 두 개의 형광 성분 중 하나만 있는 리포좀도 분석에서 제외되므로 분석에서 중요한 데이터 요소를 잠재적으로 제거할 수 있습니다. - 감지된 각 리포솜에 대한 강도 비율을 포함하는 데이터로 열의 히스토그램을 플로팅합니다.
- 연구된 리포좀 시스템에 대한 조성 불균질의 정도는 강도 비 분포의 폭으로 나타낸다. 불균질성을 정량화하기 위해, 강도 비율 히스토그램을 가우시안 함수에 맞추고 평균(μ) 및 표준 편차(sigma)를 추출한다. 대표 결과 섹션을 참조하십시오.
- 불균질성(DI)에 대한 값은 이제 DI= 시그마/μ로 정의된 변동계수를 사용하여 계산할 수 있습니다.
6. 리포솜 크기 교정
- 리포솜 스톡의 일부를 꺼내, 단계 1.10에 기재된 바와 같이 50 nm 폴리카보네이트 필터를 통해 21x를 압출한다.
- 미세원심지 튜브에 800 μL의 소르비톨 완충액에 리포솜 현탁액의 10 μL을 첨가하여 리포좀을 희석시다.
- 희석된 리포솜 샘플을 폴리프로필렌 일회용 큐벳으로 옮김.
- 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 크기를 측정합니다. 리포솜 현탁액의 크기와 다분산성을 측정하기 위해 적어도 3개의 독립적인 실행을 수행한다.
참고: 필요한 경우 측정을 위해 더 농축된 리포솜 현탁액을 사용하십시오. DLS에 대한 대안(예를 들어, 나노입자 추적 분석)은 리포좀의 크기를 측정하기 위해 적용될 수도 있다. 이러한 입자 크기 측정을 실행하는 방법에 대한 설명은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. - 4.1 단계 와 4.2 단계에서 정의된 것과 정확히 동일한 실험 설정을 사용하여 현미경의 교정 리포솜을 이미지화합니다.
- 캘리브레이션 이미지에서 각 교정 리포솜에 대한 통합 강도를 추출합니다: 단계 5.1-5.10에 기재된 바와 같이 리포솜 형광 강도를 포함하는 여과된 결과 시트를 추출합니다. 결과 테이블에서 "통합Int" 열을 추출합니다.
- 그 막에 표지된 리포좀의 총 통합 강도는 리포솜의 표면적에 비례하기 때문에, 직경의 제곱에 비례하기 때문에, 형광 강도의 제곱근 강도 히스토그램을 플롯 교정 리포좀.
- 6.7단계에서 생성된 일체형 히스토그램에 적당히 로그 정규 분포를 맞추고 캘리브레이션 리포좀의 평균 형광 강도를 추출한다.
- 제곱근 강도(IntSqrt)와리포솜 크기 사이의 관계를 결정하기 위해, DLS 측정으로부터 얻어진 수에 의해 칭량된 평균 리포솜 직경(Dia)을 사용하여 보정 계수(C)를 계산한다: Dia = C x IntSqrt는 C= Dia/IntSqrt와동일하다.
- 조성 불균질 성 실험에서 리포솜에 대한 IntSqrt 값을 계산하고 보정 계수를 곱하여 이를 직경으로 변환합니다.
- 약 50 nm-800 nm에서 에 걸쳐 리포솜의 인구에 대한 리포솜 크기의 함수로서 불균질성을 달성, 조성 불균질 리포좀에 대한 직경의 함수로 강도 비 값을 플롯.
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Representative Results
기재된 프로토콜에 따라 단일 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미지화할 수 있게한다(도 1). 리포좀의 성공적인 표면 고정은 회절 제한된 강도 반점이 이미지에 나타나야함에 따라 챔버(프로토콜에서 3.6단계)에 리포좀 용액을 첨가한 즉시 명백해야한다(도 1B 및 도 1C).
좋은 통계를 달성하고 분석의 높은 처리량 능력을 이용하기 위해, 수천 리포솜을 이미지화해야합니다. 적당한 수의 이미지로 이 작업을 수행하려면 샘플당 이미지 수가 ~10으로 감소하여 획득 및 분석해야 하는 이미지 수를 제한하므로 프레임당 300-400 리포좀의 밀도를 달성하기 위해 충분한 리포솜을 고정하는 것이 좋습니다. 밀도가 낮을수록 데이터 분석에 더 많은 시간이 소요되는 반면, 밀도가 높을수록 이미지 분석 소프트웨어가 단일 리포좀을 구별하기가 어려울 수 있습니다. 300-400 리포솜이 어떻게 생겼는지 시각적으로 인상을 얻으려면 그림 2A를참조하십시오. 그러나 일부 응용 분야(예를 들어, BSA 표면에 강한 배경 결합을 유도하는 경향이 있는 단백질과의 막-단백질 상호 작용)의 경우 오른쪽 상단에 있는 그림 2A와 같이 약간 더 낮은 밀도를 사용하는 것이 좋습니다.
경우에 따라 이미지를 획득할 때 그림 2B에설명된 대로 전체 시야를 적절한 초점으로 얻기가 어렵습니다. 이러한 문제는 샘플 플레이트가 기울어지고 있음을 나타낼 수 있으며, 이는 현미경의 시편 홀더에 제대로 배치되지 않은 플레이트에서 발생할 수 있습니다. 또한 리포좀이 크고 흐릿해 보이는 경우 챔버의 버퍼가 증발하여 표면이 건조되었을 수 있습니다. 장시간 이미징을 하거나 RT보다 높은 온도에서 측정을 수행할 때 이 문제를 염두에 두는 것이 특히 중요합니다. 제대로 저장되고 건조된 리포좀의 차이를 설명하기 위해, 챔버를 건조시키기 전과 후에 동일한 샘플의 이미지가 도 2C에도시되어 있다.
최적의 화질을 보장한 후, 두 개의 이미징 채널에서 각 리포좀에 대한 통합 강도는 이 프로토콜의 섹션 5의 단계에 따라 추출될 수 있다. 이렇게 하면 고유한 강도 값 목록이 생성되어 각 개별 리포솜에 대한 강도 비율을 계산할 수 있습니다. 조성적 불균질성은 히스토그램 강도로부터 평가되며, 전형적으로 평균 비 값 주위의 가우시안 분포를나타낸다(도 3A). 가우시안 분포로부터의 강한 편차가 관찰되는경우(그림 3B)이미징 채널 중 적어도 하나에 대한 검출 민감도 문제를 나타내며, 이는 약한 신호를 나타내는 리포좀의 서브세트가 배제되었음을 시사한다. 이는 이미징 시스템의 검출 한계, 또는 데이터 분석에서 리포좀을 제외하기 때문일 수 있다(예를 들어, 특정 최소 임계값을 적용하는 경우; 단계 5.7 참조).
프로토콜에서 단계 5.11-5.13에 기재된 바와 같이 DI 값을 계산하는 것은 제제의 개별 리포좀 들 사이의 조성적 불균질성의 정량적 측정을 제공할 것이다. 여기서 연구된 리포좀 시스템의 경우, DI = 0.23±0.01(도 3C). 이 값은 다양한 리포솜 특성 또는 제제 방법이 조성불균질에 미치는 영향을 체계적으로 비교하는데 사용될 수 있다. DI 값의 의미를 개념화하기 위해, 우리는 강도 비율 히스토그램에 의해 표시되는 정규 분포를 참조, 그들은 경험적 68-95-99.7 규칙을 준수 의미. 이 규칙은 평균 값에 대한 1, 2 및 세 가지 표준 편차 내에 속하는 인구의 백분율을 설명합니다. 여기서 발견된 0.23±0.01의 DI 값에 대해, 모집단내의 리포솜의 32%가 앙상블의 평균 몰 비로부터 23% 이상 차이가 나는 강도 비율을 가질 것이라는 것을의미한다(도 3D).
대조군 실험의 경우 재초점 전후(섹션 4.6) 전후에 동일한 리포솜을 이미징하기 위해, 실제 실험과 동일한 데이터 분석 및 결과 플로팅이 수행된다. 이렇게 하면 DI 값의 실험 적 불확실성의 정량화를 허용하며, 이는 DI불확실성 = 0.10±0.01(도3E)으로밝혀졌다. DI불확실성 값은 고용된 이미징 시스템에 의존하겠지만, 공초점 현미경 설정은 일관되게 약 0.105,6의DI불확실성 값을 초래한다는 것을 발견했습니다. 여기서 리포좀 시스템에 대해 발견된 DI 값 = 0.23±0.01은 실험 불확실성의 2배 이상이며, 이는 제제의 개별 리포좀 들 사이의 유의한 조성불균질의 존재를 시사한다.
섹션 6에 설명된 크기 교정 실험을 수행하면 임의의 리포솜 강도 값이 나노미터의 물리적 직경으로 변환될 수 있습니다. 이 방법은 훨씬 낮은 처리량을 가지고 있지만, 광학적으로 나노 미터 크기의 리포솜을 해결하는 능력을 가지고 극저온 전자 현미경 검사법 과 같은 다른 이미징 기술25에 대해 검증되었습니다. 실제 실험에 사용되는 것과 동일한 현미경 설정을 사용하여 대조군 샘플을 이미징하는 것은, DLS에 의해 결정된 평균 리포솜 직경과 평균 리포솜 세기를 상관시키는 것이 가능해졌다(도4A). 다음 단계는 극히 작은 리포솜을 만드는 것에 대한 물리적 제약에 기초하여, 전형적으로 로그 정규 분포를 표시할 리포솜 강도 분포를 묘사하는것이다(도 4B). 분포가 로그 정규 분포에 의해 잘 설명되지 않는 경우(가장 자주 낮은 강도 값을 가진 리포솜 누락으로 인해) 데이터 분석 동안 낮은 현미경 검출 감도 또는 지나치게 엄격한 파라미터로 인해 리포솜 모집단의 일부가 제외되었다는 것을의미한다(그림 4C). 편견없는 데이터 해석을 보장하기 위해 이러한 문제를 파악하고 해결하는 것이 중요합니다. 다음으로, 도 4B에서 각 개별 리포좀에 대한 강도 값은 도 4A(도 4D)에서결정된 보정 계수를 사용하여 실제 직경으로 변환될 수 있다. 각 리포좀의 크기를 결정한 후, 직경의 함수로서 DI는 이제 각 개별 리포좀에 대한 직경 대 강도 비를 플로팅하여 조사할 수있다(도 4E). 이 깔때기와 같은 데이터 구조는 리포솜 크기가6감소할 때 DI 값이 증가한다는 이전 연구 결과를 확증합니다. 중요한 것은, 평균 값을 중심으로 강도 비율의 확산의 대칭 증가는 리포좀의 평균 조성에 체계적인 크기 의존적 변동이 없음을 시사한다.
그림 1: 단일 리포솜 분석. (A)리포솜은 형광으로 표지된 지질 도피-Atto488 및 DOPE-Atto655의 등쪽 함량으로 제조되고 비오틴/스트렙타비딘 결합을 사용하여 BSA 표면에 고정됩니다. (B)고정된 리포솜은 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되어 단일 리포좀에서 형광 강도를 검출할 수 있습니다. 스케일 바 = 8 μm.(C)(B)에서녹색 영역의 줌은 두 채널 사이에 반전형광 신호를 표시하는 두 개의 인접한 리포좀에 대한 표면 강도 플롯으로 묘사되어 조성 불균질의 개념을 도시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 최적화 및 함정. (A)왼쪽 상단은 50 μm x 50 μm 프레임에 고정된 29개의 리포솜을 나타낸다. 이들은 리포솜 불균일성의 높은 처리량 조사를 위한 가능성을 이용하기 위하여 프레임 당 너무 적은 리포솜입니다. 오른쪽 상단은 프레임당 123개의 리포솜을 보여줍니다. 이는 최적이 아닌 밀도이지만 많은 이미지를 획득한 경우 사용할 수 있습니다. 왼쪽 하단은 프레임당 300-400 리포솜을 보여줍니다. 여기서 설명한 프로토콜에 최적입니다. 오른쪽 하단은 프레임당 1,500개 이상의 리포솜을 나타내며, 이는 개별 리포좀을 구별하기에는 너무 많습니다. 단일 스팟이 실제로 동일한 회절 제한 스팟 내에서 고정된 두 개의 리포솜이 될 위험이 높습니다. (B)챔버가 시편 홀더에 제대로 배치되지 않으면 전체 시야를 적절한 초점으로 얻는 것은 불가능합니다. 왼쪽 현미경에서 플레이트는 다각측량 주위로 기울어져 왼쪽 아래 모서리가 초점이 벗어나게 됩니다. 오른쪽 현미경에서 플레이트는 세로 축 주위로 기울어져 더 무거운 기울기를 초래합니다. 왼쪽 아래모서리와 오른쪽 위 모서리모두 초점이 맞지 않습니다. (C)장시간 또는 높은 온도에서 이미징하면 버퍼가 증발하여 챔버 밖으로 건조될 수 있습니다. 우리는 챔버가 3 분 동안 건조하기 위하여 방치된 전후에 리포솜을 화상 진찰에 의해 여기에서 이 시나리오를 설명하고, 그 후에 챔버에 신선한 완충을 추가하여 재우적였습니다. 생성된 리포솜은 더 크고, 흐릿하며, 형광 강도가 낮으며, 접시에 퍼지는 것처럼 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 리포솜 조성 불균일성을 정량화하기 위한 강도 비 히스토그램. (A)도피-아토488 및 도피-Atto655형광의 강도 비율은 히스토그램으로 플롯된 각 개별 리포좀에 대해. (B)이미징 중 또는 데이터 처리 단계에서 잠재적감도 문제를 설명하는 잘린 가우시안 분포. (C)강도 히스토그램을 가우시안 함수로 피팅하면 DI 값을 계산하는 데 사용되는 평균 및 표준 편차를 추출할 수 있습니다. (D)DI 값이 0.23인 DI 값은 앙상블의 평균 몰 비율과 23% 이상 차이가 있는 인구의 32%로 변환될 수 있다. (e)대조군 실험은 재초점 전후에 동일한 리포솜을 이미징한 후 실제 실험과 동일한 데이터 처리 절차를 수행하였다. 이를 통해 DI 정량화에 대한 실험 오차를 결정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 리포솜 강도를 nm의 물리적 직경으로 변환합니다. (a)교정 계수를 결정하기 위해 DLS 데이터와 비교하여 50 nm 압출 교정 리포좀의 강도 히스토그램. (B)실험 리포솜으로부터의 IntSqrt 값의 히스토그램은 전형적으로 매우 작은 리포좀을 생성하는 것에 대한 물리적 제약으로 인해 로그-정규 분포를 산출한다. (C)비 로그 정상 IntSqrt 값 히스토그램은 검출 감도가 있는 문제 또는 데이터 처리 중에 작은 리포솜이 제외되었다는 것을 나타냅니다. (D)(B)의리포솜 강도는 보정 계수를 이용하여 실제 리포솜 직경으로 변환된다. (e)리포솜 직경의 함수로 플롯된 각 리포좀의 강도 비를 표시하여 리포솜 크기의 함수로서 조성불균성을 조사할 수 있게 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 단일 리포솜 분석이 개별 리포좀 사이의 조성 불균질성을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하지만 플랫폼은 매우 다재다능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이전에 소개에서 도시되고 논의된 바와 같이, 프로토콜은 막-막 융합, 단백질 막 상호 작용, 또는 리포좀 약물 담체 특성화의 양상을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 해결되는 모든 과학적 질문에 대해, 단일 리포솜 분석의 힘은 앙상블의 개별 구성 요소를 감지하고 따라서 앙상블 평균 효과에 의해 편향되지 않은 정량적 판독을 갖는 능력에 있다.
단일 리포솜 분석법은 Z 방향 단면이 리포솜 층 위의 용액에서 원치 않는 배경 형광을 제거 할 수있는 전체 내부 반사 또는 공초점 현미경과 같은 표면 이미징 양식에 최적으로 적합합니다. 그러나, 이 양상은 펩티드, 단백질 또는 그밖 리포좀과 같은 형광표지된 화합물이 해결책에 추가되고 화상 진찰 도중 거기 남아 있는 연구 결과를 위해 가장 중요합니다. 예를 들어, 여기서 설명된 형식으로 분석이 사용되는 경우, 여기서 형광 염료가 고정된 리포솜으로 제한되는 경우, 이 분석기는 원칙적으로 보다 광범위하게 이용 가능한 광시야 현미경을 사용하여 수행될 수 있으며, 검출을 제공할 수 있다. 시스템이 충분히 민감합니다.
a 선험자는 분석법에 사용되는 리포솜을 제조하는데 사용되는 방법에 대하여 아무런 제한도 없다. 여기서 우리는 동결 건조 기술의 사용을 자세히 설명합니다. 그러나, 이전에는 클로로포름 계 지질 수화 또는 에탄올 주사 기반 기법이분석5,6에사용되는 리포좀을 제조하는 데 사용되어 왔다. 중요한 매개 변수는 고정을 보장하기 위해 지질 혼합물에 생체 면역 지질의 분획의 포함이다 (0.05 mol% 권장). 또 다른 필수 요소는 소량의 형광 표지 지질을 포함하는 것이다. 전반적으로, 첨가된 지질 염료의 양은 담금질 효과를 피하고 지질 염료가 리포좀의 물리화학적 특성을 현저하게 변화시키는 것을 피하기 위해 가능한 한 낮게 유지되어야 한다. 지질 염료의 양은 농도에 의해 설정되며, 여기서 리포좀당 개별 지질 염료의 수의 스토스 변이는 지질 염료의 평균 양에 비해 유의하게 된다(자세히 논의하기 위한 Larsen 등6 참조). 이 한도 를 밑으로 내려가면 추출된 강도에 큰 불확실성이 발생합니다. 마지막으로, 지질 염료의 양은 좋은 신호 대 잡음 비로 단일 리포좀을 정확하게 검출할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다. 물론 이 기준은 이미징 시스템에 크게 의존하지만, 우리는 지질 염료 농도가 0.05와 0.5 mol % 사이의 대부분의 경우잘 작동한다는 것을 발견했습니다.
리포솜에 포함할 지질 염료를 선택하는 첫 번째 전제 조건은 여기 및 방출 특성이 이미징 시스템의 조명 및 검출 기능과 일치한다는 것입니다. 둘째, 방법의 감도와 정확성을 높이기 위해 우리는 높은 양자 수율과 광 안정성을 모두 염료를 사용하는 것이 좋습니다, 우리는 이전에 성공적으로 다른 여기 파장6,11염료를 사용했다. 지질 분할이 인위적으로 높은 불균질성으로 이어지지 않도록 유사한 물리 화학 적 특성을 가진 지질 앵커를 선택하는 데주의를 기울여야합니다. 예를 들어, 이 프로토콜의 경우, 우리는 DOPE에 하나의 형광포를 갖는 동안, 그리고 DPPE에 하나의 형광단을 모두 고정하고 다른 하나는 리포좀 집단에 내재된 불균질성과 관련이 없는 불소 분포 이질성으로 이어질 수 있었다. 특히 이중 컬러 이미징의 경우 염료와 채널 간에 상당한 출혈, 교차 통화 및 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 피하기 위해 좁은 여기 및 방출 스펙트럼과 가능한 한 작은 스펙트럼 중복이 있는 염료를 선택하는 것이 중요합니다. 형광포극 환경의 변화와 관련된 유물을 피하기 위해 우리는 염료와 함께 일하는 것을 선호하며, 이는 Hughes et al.26에의해 결정된 바와 같이 매우 낮은 막 상호 작용 성향을 보여주기 위해 실험적으로 입증되었다. 마지막으로, 특정 리포좀 지질 조성이 실험 설계에 대한 어려운 요건이 아닌 경우, 개별 리포좀이 서로 격퇴하고 단일 리포좀(12)으로서 효율적으로 고정화되도록 하기 위해음전하 지질의 최대 10mol%를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
단일 리포솜 분석법의 장점은 작은 실험 부피이며, 이는 실험당 사용되는 고가또는 희귀 화합물의 양을 크게 감소시킬 수 있다. 여기에서 우리는 150-300 μL 사이의 실험 부피를 가진 표준 및 상업적으로 이용 가능한 챔버의 사용을 기술합니다. 그러나, 50-80 μL의 범위로 부피를 감소시킬 수 있는 맞춤형 현미경 챔버를 사용할 수 있습니다. 또한, 리포솜 소비는 매우 낮으며, 최종 농도는 약 2 μM 총 지질이다.
단일 리포솜 분석법의 단점은 전술한 고정 경향의 변화로 인해 챔버 내의 지질 농도를 조절하기 어렵다는 것이다. 부가적으로, 막 단백질 상호작용을 연구하기 위한 분석방법을 적용하는 것에 대하여, 형광 강도로부터 직접 결합된 단백질의 농도 또는 수를 결정하는 것은 도전적이다.
분석법에서 리포좀을 멤브레인 모델 시스템(예를 들어, 형광 화합물, 펩티드 또는 단백질의 막 상호작용을 연구하기 위해)을 사용하는 경우, 단백질 성분에 대한 낮은 비특이적 결합을 촉진하는 것이 중요하다. Immobilization. 그렇지 않은 경우, 리포좀에 대한 특정 결합의 검출을 방지할 수 있는 높은 배경 신호를 검출할 수 있다. 높은 비특이적 배경이 검출되면 우리는 이전에 성공적으로 노이트라비딘 또는 아비딘으로 스트렙타비딘에서 변경하여 배경을 감소시켰다.
유세포 분석과 같은 다른 기술을 사용하여 단일 리포솜 검출을 수행하면 현미경 기반 분석법에 비해 검출 처리량이 증가할 수 있습니다. 그러나 유동 세포계가 세포와 같은 훨씬 크고 밝은 샘플을 연구하는 데 최적화되어 있다는 점을 감안할 때 대부분의 검출 시스템은 개별 리포좀에서 상대적으로 약한 형광을 검출할 만큼 민감하지 않습니다. 따라서 새롭고 보다 민감한 유동 세포측정법이 개발되고 있는 동안 현미경 기반 분석법은 효율적으로 수행될 때 리포솜 불균질성을 해명하고 실험당 수천 개의 리포좀을 모니터링하는 최상의 솔루션을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 독립적 인 연구를위한 덴마크위원회에 의해 투자되었다 [보조금 번호 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
