Summary
Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.
Abstract
De meeste onderzoek met liposomen als membraan modelsystemen of dragers van de levering van geneesmiddelen is afhankelijk van bulk read-out technieken en dus intrinsiek veronderstelt dat alle liposomen van het ensemble identiek zijn. Echter, nieuwe experimentele platforms die liposomen kunnen observeren op het niveau van één deeltje hebben het mogelijk gemaakt om zeer verfijnde en kwantitatieve studies uit te voeren over eiwit-membraan interacties of geneesmiddel drager eigenschappen op individuele liposomen, dus het voorkomen van fouten uit het ensemble gemiddelde. Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden, opsporen en analyseren van enkele liposomen met behulp van een microscopie-test op basis van fluorescentie, die dergelijke metingen van één deeltjes vergemakkelijkt. De Setup maakt het mogelijk om individuele liposomen op een enorme parallelle manier te laten zien en wordt gebruikt om intra-samplegrootte en compositionele inhomogeniteiten te onthullen. Bovendien beschrijft het protocol de voordelen van het bestuderen van liposomen op het enkele liposoom niveau, de beperkingen van de assay en de belangrijke functies die overwogen moeten worden bij het wijzigen van andere onderzoeksvragen.
Introduction
Liposomen zijn sferische fosfolipide-gebaseerde blaasjes die sterk worden gebruikt zowel in basis-en toegepast onderzoek. Ze functioneren als uitstekende membraan modelsystemen, omdat hun fysiochemische eigenschappen gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd door de lipide-componenten die de liposoom1,2vormen, tevariëren. Ook, liposomen vormen de meest gebruikte drug levering nanocarrier systeem, het aanbieden van verbeterde farmacokinetiek en farmacodynamiek, alsmede hoge biocompatibiliteit3.
Voor vele jaren, liposomen zijn voornamelijk bestudeerd met behulp van bulk technieken, geven alleen toegang tot ensemble gemiddelde uitleeswaarden. Dit heeft geleid tot de meerderheid van deze studies om aan te nemen dat alle liposomen in het ensemble identiek zijn. Dergelijke ensemble-gemiddelde waarden zijn echter alleen correct als de onderliggende gegevensset uniform is verdeeld rond de gemiddelde waarde, maar een valse en bevooroordeelde conclusie kan vertegenwoordigen als de gegevensset meerdere onafhankelijke populaties bevat, bijvoorbeeld. Bovendien, ervan uitgaande dat het ensemble betekent om de hele bevolking te vertegenwoordigen, kan de informatie die zich verveelt binnen de onhomogeniteit tussen liposomen, vergeten. Pas recentelijk zijn kwantitatieve testen naar voren gekomen die in staat zijn enkele liposomen te onderzoeken, waardoor grote homogeniteiten tussen individuele liposomen worden onthuld met betrekking tot belangrijke fysisch-chemische eigenschappen, waaronder liposoom size4, lipide-compositie5,6en inkapings efficiëntie7, waarbij het belang van het bestuderen van liposomen op het enkele liposoom niveau wordt benadrukt.
Een onderzoeksgebied waar het gemiddelde van de liposoom eigenschappen van het ensemble is aangetoond dat de resultaten van de liposoom grootte afhankelijke eiwit-membraan interacties8,9bestuderen. Traditioneel, onderzoekers bestuderen van dergelijke processen zijn beperkt tot het voorbereiden van liposomen met verschillende ensemble gemiddelde diameters door extrusie door middel van filters met verschillende porie maten9. Echter, het extraheren van de diameter van individuele liposomen met behulp van enkele liposoom-assays heeft grote populatie overlapt onthuld, met liposomen geëxtrudeerd met 100 nm en 200 nm-filters die tot 70% overlappen in hun grootteverdeling4. Dit kan ernstige bias bulk metingen van liposoom grootte afhankelijke eiwit-membraan interacties10. Het uitvoeren van de membraan-eiwit interactiestudies met behulp van de enkelvoudige liposoom Assay, onderzoekers in plaats daarvan profiteerde van de grootte-polydispersiteit in het monster, waardoor ze een breed scala van liposoom diameters binnen elk experiment te bestuderen, het faciliteren van nieuwe ontdekkingen van hoe membraan kromming en samenstelling kan invloed hebben op eiwit werving voor membranen4,11,12. Een ander gebied waar de toepassing van één liposoom assays heeft bewezen instrumentale is in mechanistische studies van eiwit-gemedieerde membraan fusie13,14. Voor dergelijke kinetische metingen, de mogelijkheid om individuele fusie-evenementen te bestuderen verlicht de noodzaak voor de experimentele synchronisatie van het fusieproces, waardoor nieuwe mechanistische inzichten die anders zou zijn verloren in de spatiotemporele gemiddelden gedaan in bulk ensemble metingen. Daarnaast zijn enkele liposomen gebruikt als een membraan steiger, waardoor individuele eiwitten kunnen worden gemeten en nieuwe kennis kan worden gemaakt over transmembraan proteïne Structural Dynamics15,16. Bovendien maakten dergelijke op proteoliposome gebaseerde opstellingen het mogelijk om de functie van individuele transmembraan transporters te bestuderen17 en Pore-vormende proteïne complexen18 en het mechanisme van bioactieve membraan-permeabilizing peptiden19. Enkele liposomen zijn ook gebruikt als zachte stof nanofluïdica met oppervlakte-geïmmobiliseerde enkele liposomen die als kamers dienen voor enzymatische reacties in volumes van 10-19 L, waardoor de doorvoer en complexiteit van de screening testen met minimaal productverbruik20.
Onlangs zijn enkele liposoom-assays gebruikt voor het karakteriseren van medicijn leveringsliposomen op een eerder onprecenspringende detailniveau. Onderzoekers waren in staat om significante inhomogeneities te kwantificeren in de hoeveelheid polymeer die aan het oppervlak van individuele liposomen is bevestigd21. De enkele liposoom assays ook toegestaan metingen van de levering van de drug liposomen in complexe media, zoals bloed plasma, onthullen hoe elementen verankerd aan het liposoom oppervlak door middel van lipide ankers kunnen worden vatbaar voor dissociatie wanneer liposomen worden blootgesteld aan omstandigheden nabootsen die ervaren tijdens in vivo circulatie22. Over het algemeen worden de veelzijdigheid en het nut van de enkelvoudige liposoom-assays onderbouwd door de grote verscheidenheid aan problemen die deze opstellingen hebben gehanteerd om aan te pakken, en we stellen voor dat de methodologie zal blijven worden ontwikkeld en het gebruik in nieuwe wetenschappelijke velden te vinden.
Hier beschrijven we een fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom assay die het mogelijk maakt individuele liposomen op een hoge doorvoer te laten studeren (Figuur 1). Om de methode te illustreren, gebruiken we het om de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen individuele liposomen binnen een ensemble te kwantificeren. De assay maakt gebruik van fluorescentiemicroscoop beeldvorming van enkele liposomen geïmmobiliseerd op een gepassiveerde glazen oppervlak. We beschrijven eerst de kritische stappen in het liposoom fabricageproces dat zorgt voor een goede fluorescerende liposoom labeling en immobilisatie. Vervolgens beschrijven we de oppervlakte voorbereiding die nodig is om de liposoom-immobilisatie te vergemakkelijken voordat de procedure wordt beschreven voor het waarborgen van geschikte liposoom-oppervlakte dichtheden. We bespreken de microscopie parameters belangrijk voor het verwerven van afbeeldingen van hoge kwaliteit en afbakenen hoe eenvoudige data-analyse uit te voeren, waardoor de extractie van liposoom grootte en compositorische inhomogeniteit. Dit generieke protocol zou een goede basis moeten vormen voor de geïnteresseerde onderzoeker om de assay verder te ontwikkelen voor zijn of haar specifieke onderzoeksinteresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van liposoom
Opmerking: in het kort bevat de bereiding van liposomen meestal drie cruciale stappen: 1) bereiding van droge lipide-films van de gewenste lipide-samenstelling; 2) rehydratie van de lipiden voor de vorming van liposomen; en 3) beheersing van de grootte en lamellariteit van de liposoom populatie.
- Weeg de lipiden af en los ze op in tert-butanol: water (9:1) in glazen flesjes.
- Los POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine; MW = 760 g/mol) tot 50 mM.
- Los cholesterol (MW = 387 g/mol) op tot 25 mM.
- Ontbinden DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-Atto488; MW = 1.316 g/mol) tot 0,1 mM.
- Ontbinden DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-Atto655; MW = 1.368 g/mol) tot 0,1 mM.
- Ontbinden DSPE-PEG2000-Biotine (1,2-distearyl-SN-glycero-3-fosfatethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleenglycol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) tot 0,1 mM.
Opmerking: hitte lipiden tot 55 °C en gebruik magnetisch roeren om een volledige ontbinding van de lipiden te garanderen. U ook een sonicatiebad gebruiken. Ongebruikte lipiden voorraden kunnen gedurende enkele maanden bij-20 °C worden bewaard.
- Meng de lipide-voorraden bereid in stap 1,1 naar een molaire verhouding van POPC: cholesterol: DOPE-Atto488: DOPE-Atto655: DOPE-PEG-Biotine 68.95:30:0,5:0,5:0,05, door toevoeging van 138 μL POPC, 120 μL cholesterol, 500 μL van elk fluorescently gelabelde lipide, en 50 μL DSPE-PEG-Biotine op een frisse glazen injectieflacon.
Opmerking: de exacte samenstelling van het liposoom kan gemakkelijk worden aangepast om de specifieke vraag van belang aan te pakken. Zie discussie voor meer informatie. - Maak de deksel van de glazen injectieflacon los en klik de injectieflacon in vloeibare stikstof in de vriezer.
- Lyophilize het bevroren lipide mengsel 's nachts.
- Voeg 1 mL 200 mM D-Sorbitol buffer (sorbitol buffer) toe aan de droge lipiden.
- Verwarm het mengsel tot 45 °C en bloot aan magnetisch roeren gedurende ten minste 1 uur.
Opmerking: de buffer moet overeenkomen met de specifieke vraag die wordt behandeld (bijv. fysiologische omstandigheden voor het bestuderen van membraan-eiwit interacties, of een specifieke klinisch goedgekeurde buffer voor het bestuderen van liposomen voor het leveren van geneesmiddelen). Echter, als een specifieke buffer niet vereist is voor het onderzoek, kan een buffer zonder ionen worden toegepast voor rehydratatie om de multilamellariteit van de liposomen te verminderen. - Vries de lipide suspensie door de injectieflacon in vloeibare stikstof te dompelen en wacht tot de suspensie volledig is bevroren.
- Dompel de bevroren suspensie in een verwarmingbad bij 55 °C tot het mengsel volledig ontdooid is.
- Herhaal de stappen 1,7 en 1,8 totdat de liposoom suspensie is blootgesteld aan een totaal van 11 Vries/ontdooien cycli.
Opmerking: herhaalde vries/dooi cycli hebben aangetoond dat het liposoom multilamellariteit23vermindert, wat van essentieel belang is voor de nauwkeurigheid van de enkelvoudige liposoom test, omdat multilamellaire liposomen de fluorescentie intensiteit versus de grootte verhouding van de liposoom van de liposomen zullen scheeftrekken. De multilamellariteit is meestal inherent laag bij het opnemen van meer dan 0,5% Gepegyleerd lipide in de formulering (zoals gewoonlijk gedaan in liposomen voor de levering van geneesmiddelen)24. - Extruderen de liposoom suspensie eenmaal via een 800 nm polycarbonaat filter met behulp van een mini extrusieset. Volg de instructies van de fabrikant voor montage van de extrusiekit (Zie tabel met materialen).
- Bewaar de liposomen 's nachts bij 4 °C.
2. oppervlakte voorbereiding van de beeldvormings kamer
- Bereid bovien serumalbumine (BSA; 1 mg/mL), BSA-Biotine (1 mg/mL) en streptavidine (0,025 mg/mL) in 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur) 95 mM NaCl-buffer (HEPES-buffer).
Opmerking: om Liposomale barsten te voorkomen, moet de sorbitol-buffer die wordt gebruikt voor rehydratatie en de HEPES-buffer die wordt gebruikt voor oppervlakte voorbereiding, isotone zijn. Het wordt daarom aanbevolen om de osmolariteit van de buffers vóór het experiment te controleren. - Meng 1.200 μL BSA en 120 μL BSA-Biotine en voeg 300 μL van het mengsel toe aan elk goed in een 8-put voor microscopie.
Opmerking: hier gebruiken we een in de handel verkrijgbare 8 well Microscoop Slide met een glazen bodem (Zie tabel van materialen), maar het protocol kan eenvoudig worden aangepast aan op maat gemaakte Microscoop kamers. - Inbroed de glijbaan gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Was de glijbaan 8x met 300 μL HEPES-buffer.
Let op: Zorg ervoor dat u de putjes niet langer dan een paar seconden zonder buffer laat, want het uitdrogen van het oppervlak zal het beschadigen. Zorg er bovendien voor dat u het oppervlak niet krabt met de pipetpunt, want dit zal het ook beschadigen. Dus, wanneer aspirerende buffer uit een put, doe het vanaf de rand of hoek. - Voeg 250 μL streptavidine toe en inincuberen gedurende 10 min bij RT.
- Herhaal de 8 wast beschreven in stap 2,4.
- Bewaar de Microscoop glijbaan met 300 μL sorbitol buffer in elke put bij 4 °C. Verdamping van het oplosmiddel zal het oppervlak beschadigen, dus zet de Microscoop dia in een Petri schaaltje en verzegel het met Parafilm tenzij de bereide glijbaan onmiddellijk wordt gebruikt.
3. Liposome immobilisatie
- Verdun de liposoom suspensie tot ongeveer 20 μM totaal lipide in sorbitol buffer. De procedure in sectie 1 zal een liposoom suspensie van ongeveer 10 mM totaal lipide opleveren.
- Plaats de dia op de Microscoop en concentreer u op het oppervlak van de kamer met behulp van het verhoogde Laser reflectie signaal van de glas/buffer interface als leidraad.
- Was de kamer 4x met 300 μL verse HEPES-buffer.
- Voeg 10 μL verdunde liposoom kolf (20 μM totaal lipide) toe aan een micro centrifugebuis.
- Neem 100 μL buffer uit de kamer, voeg toe aan de microcentrifuge buis bereid in stap 3,4, meng goed en plaats de 110 μL terug in de kamer.
- Plaats het preparaat onder de Microscoop en gebruik een rudimentale Microscoop-instelling die het signaal van de liposoom fluorophore (s) kan detecteren om de liposomen te observeren die op het oppervlak worden geïmmobiliseerd.
- Streef naar een liposoom oppervlaktedichtheid die tegelijkertijd schaars genoeg is om individuele liposomen te indentificeren en dicht genoeg dat het hoge doorvoer metingen vergemakkelijkt. Meestal met een 50 μm x 50 μm gezichtsveld is 300 − 400 liposomen per frame optimaal (Figuur 2). Dit kan meestal worden bereikt binnen 5 − 10 min.
Opmerking: als er alleen snel bewegende fluorescerende deeltjes worden gedetecteerd in het gezichtsveld, kan een afwezigheid of te lage concentratie van een van de componenten die kritisch zijn voor het immobilisatie proces (BSA-biotine, streptavidin, DOPE-PEG-Biotine) de oorzaak zijn. Als er geen liposomen worden gedetecteerd, kan het ofwel gerelateerd zijn aan een lage concentratie van liposomen, onjuiste instellingen voor de fluorescentiedetectie, of mogelijk beeldvorming met een brandvlak niet op het glazen oppervlak. - Nadat een geschikte liposoom oppervlaktedichtheid is bereikt, was de kamer 3x met 200 μL Hepes-buffer.
Opmerking: Houd er rekening mee dat de immobilisatie kinetiek ook afhankelijk is van liposoom eigenschappen zoals grootte en lading en daarom altijd moet worden geoptimaliseerd voor elke liposoom formulering.
4. beeld verwerving
Opmerking: deze sectie zal veel afhangen van het Microscoop systeem dat beschikbaar is voor de onderzoeker die het experiment uitvoert. Er worden dus algemene richtlijnen beschreven voor het uitvoeren van de beeldvorming. Echter, de exacte instellingen en hoe ze toe te passen zal variëren tussen de verschillende Microscoop opstellingen. Sommige systemen kunnen bijvoorbeeld een gewenste combinatie van emissie filters kiezen, terwijl andere microscopen zijn uitgerust met specifieke, vooraf ingestelde filters.
- Stel de Microscoop in voorbeeld vormende enkele liposomen. Voor een optimale beeldkwaliteit en de daaropvolgende gegevensanalyse gebruikt u een hoge grijstinten-resolutie en een pixel schema waarmee u afzonderlijke liposomen oversampling. Een bitdiepte van 16 en ten minste 1.024 x 1.024 pixels voor een oppervlakte van 50 μm x 50 μm wordt aanbevolen. Indien beschikbaar kan regel middeling worden toegepast om ruis te verminderen (bijvoorbeeld 3 scans per lijn).
- Selecteer een excitatie Laser vermogen dat zowel een niet-significant frame-naar-frame bleken als sterk genoeg signaal garandeert om individuele liposomen duidelijk te discrimineren op de achtergrond. De optimale instelling hangt af van de specifieke Microscoop die wordt gebruikt en van de de-combinatie. Zorg ervoor dat de detectoren niet verzadigd zijn, want dit zal de kwantificering van de intensiteit vooroordelen.
- Beeldvorming van zowel de DOPE-Atto488 als de DOPE-Atto655 fluoroforen in de liposomen vereist Imaging meerdere kanalen. Zorg er dus voor dat elk kanaal opeenvolgend wordt afgebeeld om Kruis excitatie te voorkomen. Neem bijvoorbeeld eerst een afbeelding met spannende 488 nm en lees emissie bij 495 − 560 Nm. Daarna, neem een ander beeld door spannende op 633 nm maar lezing emissie alleen bij 660 − 710 nm. De bijzonderheden zijn afhankelijk van het Microscoop systeem (bijv. welke lasers en filters) beschikbaar zijn.
- Zorg ervoor dat u verschillende gebieden van het oppervlak bestrijkt, waarbij u ten minste 10 afbeeldingen van het monster verkrijgt, waardoor ten minste 3.000 individuele liposomen worden weergegeven. Als de oppervlaktedichtheid lager is dan 300 liposomen/frame, verkrijgt u meer afbeeldingen. Zorg ervoor dat u de Microscoop opnieuw richt voor elke nieuwe afbeelding.
Let op: voor twee-kanaals beeldvorming, zorg ervoor dat de naam van de afbeeldingsbestanden, zodat paren van beelden met dezelfde liposomen in verschillende fluorescentie kanalen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd tijdens de data-analyse. - Om de experimentele onzekerheid met betrekking tot de meting van de compositionele inhomogeniteit te kwantificeren, moet voor en na het opnieuw scherpstellen hetzelfde gebied van liposomen worden weer (Zie Figuur 3 en beschrijving in de tekst).
- Exporteer de afbeeldingen van de Microscoop-software als. TIFF-bestanden. Exporteer de twee kanalen van dezelfde liposomen afzonderlijk.
5. gegevensanalyse
Opmerking: speciaal ontwikkelde geautomatiseerde 2D Gaussiaanse aanpassings routines zijn eerder gebruikt6,11,12. Echter, om de toepasbaarheid van de methode te verhogen een Data-analyseproces dat gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in alle laboratoria wordt beschreven.
- Laad de corresponderende paar. TIFF-afbeeldingen van twee verschillende fluorescentie kanalen in hetzelfde beeldveld in de FIJI-software (FIJI is just ImageJ).
- Kies kleurin het menu afbeelding en gebruik de functie kanaal samenvoegen om een samengestelde van de twee kanalen te maken.
- Kijk of de liposomen die in twee verschillende kanalen zijn afgebeeld, een goede colokalisatie vertonen of dat er zichtbare drift is opgetreden.
Opmerking: in het geval van drift tussen de twee fluorescentie kanalen (herkend als een systematische en gelijke X-Y offset tussen het signaal in de twee kanalen), kan een van de frames worden vertaald met behulp van de Transform ≫ vertalen functie in het beeld menu van Fiji. Echter, zorg moet worden genomen met dergelijke beeldmanipulatie. Het wordt daarom aanbevolen om in plaats daarvan zoveel mogelijk drift te vermijden bij het beeldvorming van de liposomen. - Zorg ervoor dat de plug-in ComDet (v. 0.3.6.1 of nieuwer) is geïnstalleerd, of doe dit in het menu plugins .
- Open de plug-in ComDet om deeltjes te detecteren door naar het menu plugins te gaan en comdet v. 0.3.6.1 te kiezen ≫ deeltjes te detecteren.
- In ComDet, zorg ervoor dat u de detect deeltjes op beide kanalen individueel functie te kiezen. Stel de maximale afstand in tussen co-gelokaliseerde plekken die vergelijkbaar zijn met de geschatte deeltjesgrootte. Meestal is 4 pixels geschikt voor de hier beschreven instellingen.
- De signaal-ruis verhouding moet de detectie van gelijkmatige Dim deeltjes mogelijk maken met een geringe hoeveelheid fluorescentie. Stel in ComDet deze verhouding in op 3 door de gevoeligheid van de detectie in beide kanalen in te stellen op zeer Dim-deeltjes (SNR = 3).
Opmerking: Hoewel deze SNR-waarde meestal geschikt is, kan het nodig zijn om deze hoger in te stellen (bijvoorbeeld als er veel beeldruis is die kan worden geïdentificeerd als liposomen en leidt tot valse positieven). - Zorg ervoor dat de dozen met Bereken Colokalisatie en plot gedetecteerde deeltjes in beide kanalen worden gecontroleerd, voordat u op OKdrukt.
- Na het uitvoeren van de analyse, twee pop-up vensters met resultaten en Samenvatting zal tonen. Exporteer de resultaten van de gegevenstabel met de colokalisatie gegevens (deeltjes coördinaten en geïntegreerde intensiteit van elk gedetecteerd deeltje) naar een gegevensverwerkings software naar keuze door de tabel op te slaan als een. txt-bestand en deze in de software te importeren.
- Zorg ervoor dat elke liposoom slechts één keer in de gegevensset is opgenomen en niet zowel de Channel1/Channel2 als de Channel2/Channel1 ratio. Filter de gegevens dus alleen Abs_frame = 1 is uitgezet in stap 5,11.
Opmerking: door te kiezen voor Cogelokaliseerde = 1, false positieven van ruis in de afbeeldingen kunnen worden verwijderd uit de analyse. Echter, eventuele liposomen met slechts één van de twee fluorescerende componenten die aanwezig zijn, zullen ook worden uitgesloten van de analyse, waardoor mogelijk belangrijke gegevenspunten uit de analyse worden verwijderd. - Plot een histogram van de kolom met gegevens die de intensiteits ratio voor elke gedetecteerde liposoom bevatten.
- De mate van compositorische inhomogeniteit voor het onderzochte Liposomale systeem wordt weergegeven door de breedte van de verdeling van de intensiteits verhoudingen. Om de inhomogeniteit te kwantificeren, past u het histogram van de intensiteit ratio aan met een Gaussiaanse functie en extraheert u het gemiddelde (μ) en de standaarddeviatie (Sigma). Zie de sectie representatieve resultaten.
- Een waarde voor de mate van inhomogeniteit (DI) kan nu worden berekend met behulp van de variatiecoëfficiënt die is gedefinieerd als DI = Sigma/μ.
6. Liposome grootte kalibratie
- Neem een deel van de liposoom kolf en extruderen 21x door een 50 nm polycarbonaat filter zoals beschreven in stap 1,10.
- Verdun de liposomen door 10 μL van de liposoom suspensie toe te voegen aan 800 μL sorbitol buffer in een micro centrifugebuis.
- Breng het verdunde liposoom monster over in een polypropyleen Cuvette voor eenmalig gebruik.
- Meet de grootte met Dynamische lichtverstrooiing (DLS). Voer ten minste drie onafhankelijke runs uit om de grootte en polydispersiteit van de liposoom suspensie te meten.
Opmerking: gebruik indien nodig een meer geconcentreerde liposoom suspensie voor de meting. Er kunnen ook alternatieven voor DLS (bijv. de tracking analyse van nanodeeltjes) worden toegepast om de grootte van de liposomen te meten. Een beschrijving van het uitvoeren van dergelijke bepaling van de deeltjesgrootte valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol. - Beeld de kalibratie liposomen op de microscoop met exact dezelfde experimentele instellingen als gedefinieerd in de stappen 4,1 en 4,2.
- Extraheer de geïntegreerde intensiteit voor elke kalibratie-liposoom in de kalibratie beelden: Extraheer de gefilterde resultaten fiche met liposomen fluorescentie intensiteiten zoals beschreven in stappen 5.1 − 5.10. Uit de resultatentabel, pak de ' IntegratedInt ' kolom.
- Omdat de totale geïntegreerde intensiteit van een liposoom met het label in zijn membraan evenredig is aan het oppervlak van het liposoom en dus evenredig is met het kwadraat van de diameter, plot een kwadraat van de wortel intensiteit histogram van de intensiteit van de fluorescentie van de kalibratie liposomen.
- Monteer het in stap 6,7 geproduceerde geïntegreerde intensiteits histogram met een normale stam verdeling en extraheer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de kalibratie liposomen.
- Om de relatie tussen de vierkantswortel intensiteit (intSQRT) en de grootte van het liposoom te bepalen, berekent u de correctiefactor (C) met behulp van de gemiddelde liposoom diameter (dia) gewogen door het aantal dat is verkregen uit de DLS-metingen: dia = c x intSQRT is equivalent aan C = dia/intSQRT.
- Bereken de intSQRT -waarden voor de liposomen in het samenstellings-inhomogeniteits experiment en zet deze om in diameters door deze te vermenigvuldigen met de correctiefactor.
- Plot de waarde van de intensiteits ratio als een functie van diameter voor de compositionele inhomogeniteitsliposomen, waardoor de inhomogeniteit wordt bereikt als een functie van liposoom grootte voor een populatie liposomen van ongeveer 50 nm − 800 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het beschreven protocol is het mogelijk om enkele liposomen op een enorme parallelle manier te afbeelen (Figuur 1). De succesvolle oppervlakte-immobilisatie van liposomen moet onmiddellijk zichtbaar zijn na de toevoeging van de liposoom oplossing aan de kamer (stap 3,6 in het Protocol), aangezien diffractie-punten met beperkte intensiteit in de afbeelding moeten worden weergegeven (Figuur 1B en Figuur 1C).
Om goede statistieken te bereiken en de hoge doorvoer capaciteiten van de assay te benutten, moeten enkele duizend liposomen worden afgebeeld. Om dit te doen in een redelijk aantal afbeeldingen, wordt het aanbevolen om voldoende liposomen te immobiliseren om een dichtheid van 300 − 400-liposomen per frame te bereiken, omdat dit het aantal afbeeldingen per monster tot ~ 10 zal brengen, waardoor het aantal afbeeldingen dat moet worden verworven en geanalyseerd, wordt beperkt. Een lagere dichtheid zal de data-analyse meer tijdrovend maken, terwijl een hogere dichtheid het lastig kan maken voor de beeldanalyse software om enkele liposomen te onderscheiden. Zie Figuur 2avoor een visuele indruk van wat 300 − 400 liposomen eruit zien. Opgemerkt moet echter worden dat voor sommige toepassingen (bijv. membraan-eiwit interacties met een eiwit dat de neiging heeft om sterke achtergrond binding aan het oppervlak van de BSA te wekken) het wordt aanbevolen om een iets lagere dichtheid te gebruiken, zoals in Figuur 2a in de rechterbovenhoek.
Af en toe, bij het verwerven van afbeeldingen is het moeilijk om het hele gezichtsveld in de juiste focus te krijgen, zoals geïllustreerd in Figuur 2B. Dergelijke problemen kunnen erop duiden dat de monster plaat kantelbaar is, wat kan voortvloeien uit de plaat die niet op de juiste wijze op de preparaathouder op de Microscoop wordt geplaatst. Ook, als de liposomen lijken groot en wazig, de buffer in de kamer kan hebben verdampte en het oppervlak uitgedroogd. Het is vooral belangrijk om deze kwestie in gedachten te houden bij beeldvorming voor lange perioden of bij het uitvoeren van metingen bij temperaturen hoger dan RT. Om het verschil tussen goed opgeslagen en uitgedroogde liposomen te illustreren, wordt een afbeelding van hetzelfde monster vóór en na het uitdrogen van de kamer weergegeven in Figuur 2C.
Na een optimale beeldkwaliteit kan de geïntegreerde intensiteit voor elke liposoom in de twee beeldvormings kanalen worden geëxtraheerd na de stappen in punt 5 van dit protocol. Hierdoor wordt een lijst met unieke intensiteitswaarden gemaakt, waardoor we de intensiteits ratio voor elke individuele liposoom kunnen berekenen. De samenstellings inhomogeniteit wordt geëvalueerd uit histogrammen van de intensiteits ratio, waarbij doorgaans een Gaussiaanse verdeling rond een gemiddelde ratio wordt onthuld (Figuur 3a). Merk op dat als er sterke afwijkingen van een Gaussiaanse verdeling worden waargenomen (Figuur 3B), dit duidt op een detectie gevoeligheids probleem voor ten minste één van de beeldvormings kanalen, wat suggereert dat een subset van liposomen die een zwakker signaal vertonen, is uitgesloten. Dit kan het gevolg zijn van zowel de detectielimiet van het beeldvormings systeem, als het uitsluiten van liposomen in de gegevensanalyse (bijvoorbeeld bij het toepassen van een bepaalde minimumdrempel; Zie stap 5,7).
Het berekenen van de DI-waarde zoals beschreven in de stappen 5.11 − 5.13 in het protocol zal een kwantitatieve maatstaf vormen voor de samenstellings onhomogeniteit tussen de individuele liposomen van het preparaat. Voor het Liposomale systeem dat hier is bestudeerd, DI = 0,23 ± 0,01 (Figuur 3C). Deze waarde kan worden gebruikt om systematisch te vergelijken hoe variërende liposoom eigenschappen of bereidingsmethoden de compositorische inhomogeniteit beïnvloeden. Om de betekenis van de DI-waarde te conceptualiseren, verwijzen we naar de normale verdeling die wordt weergegeven door het histogram van de intensiteit ratio, wat betekent dat ze de empirische 68 -95-99,7 regel zullen gehoorzamen. Deze regel beschrijft het percentage van een populatie dat binnen één, twee en drie standaardafwijkingen rond de gemiddelde waarde valt. Voor de DI-waarde van 0,23 ± 0,01 die hier wordt aangetroffen, betekent dit dat 32% van de liposomen in de populatie een intensiteits ratio heeft die meer dan 23% verschilt van de gemiddelde molaire verhouding van het ensemble (Figuur 3D).
Voor de controle-experiment Imaging dezelfde liposomen voor en na het opnieuw scherpstellen (sectie 4,6), dezelfde gegevensanalyse en resultaat plotten als voor het eigenlijke experiment wordt uitgevoerd. Dit maakt de kwantificering mogelijk van de experimentele onzekerheid van de DI-waarde, die DI-onzekerheid = 0,10 ± 0,01 (Figuur 3E) bleek te zijn. Hoewel de di-onzekerheids waarde afhankelijk zal zijn van het toegepaste beeldvormings systeem, bleek dat confocale Microscoop-opstellingen consequent leiden tot di-onzekerheids waarden van ongeveer 0,105,6. De DI-waarde van DI = 0,23 ± 0,01 gevonden voor het Liposomale systeem is hier meer dan twee keer de experimentele onzekerheid, wat suggereert dat de aanwezigheid van significante compositorische inhomogeniteit tussen de individuele liposomen van het preparaat.
Door het kalibratie-experiment voor de grootte zoals beschreven in sectie 6 uit te voeren, kan het arbitraire intensiteitswaarden worden omgezet in fysieke diameters in nanometers. De methode is gevalideerd tegen andere beeldvormingstechnieken25 zoals cryogene elektronenmicroscopie, die een vermogen heeft om de liposomen van nanometer formaat optisch op te lossen, hoewel met veel lagere doorvoer. Imaging van het controlemonster met exact dezelfde Microscoop-instellingen als gebruikt voor de eigenlijke experimenten, is het nu mogelijk de gemiddelde liposoom intensiteit te correleren met de gemiddelde liposoom diameter bepaald door DLS (Figuur 4A). De volgende stap is het weergeven van de intensiteit van de liposoom verdeling, die op basis van de fysieke beperkingen tegen het maken van extreem kleine liposomen, meestal zal een log normale verdeling (Figuur 4B). Als de verdeling niet goed beschreven wordt door een normale stam verdeling (meestal als gevolg van ontbrekende liposomen met lage intensiteitswaarden) betekent dit dat een deel van de liposoom populatie werd uitgesloten vanwege de lage Microscoop detectiegevoeligheid of te strikte parameters tijdens de data-analyse (Figuur 4C). Het is belangrijk om deze kwesties te vangen en aan te pakken om onbevooroordeelde gegevens interpretatie te waarborgen. Vervolgens kunnen de intensiteitswaarden voor elke individuele liposoom in Figuur 4B worden omgezet in werkelijke diameters met gebruikmaking van de correctiefactor bepaald in Figuur 4a (Figuur 4D). Na het bepalen van de grootte van elke liposoom, kan de DI als een functie van diameter worden onderzocht door het uitzetten van de intensiteit verhouding versus diameter voor elke individuele liposoom (Figuur 4E). Deze trechter achtige gegevensstructuur bevestigt eerdere bevindingen dat de DI-waarde toeneemt wanneer de grootte van het liposoom6afneemt. Belangrijk is dat de symmetrische toename in de spreiding van de intensiteits verhoudingen rond een gemiddelde waarde suggereert dat er geen systematische grootte afhankelijke variatie is in de gemiddelde samenstelling van liposomen.
Figuur 1: de enkelvoudige liposoom test. A) liposomen worden geformuleerd met een equimolaire inhoud van de fluorescently gelabelde LIPIDEN dope-Atto488 en dope-Atto655 en geïmmobiliseerd op een oppervlak van BSA met behulp van een Biotine/streptavidin-koppeling. B) de geïmmobiliseerde liposomen worden afgebeeld met behulp van een confocale Microscoop, waardoor de fluorescentie intensiteiten van de enkele liposomen kunnen worden opgespoord. Schaal staven = 8 μm. (C) zoom van het groene gebied in (B) afgebeeld als oppervlakte-intensiteit plot voor twee aangrenzende liposomen die omgekeerd fluorescerende signaal tussen de twee kanalen weergeven, ter illustratie van het concept van compositorische inhomogeniteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: optimalisatie en valkuilen. (A) linksboven toont 29 liposomen geïmmobiliseerd in een 50 μm x 50 μm frame. Dit zijn te weinig liposomen per frame om de mogelijkheid te benutten voor onderzoek met een hoge doorvoer van liposoom-inhomogeniteit. De rechterbovenhoek toont 123 liposomen per frame. Dit is een suboptimale dichtheid, maar kan worden gebruikt als veel afbeeldingen worden verkregen. Linksonder staan 300 − 400 liposomen per frame. Dit is optimaal voor het protocol dat hier wordt beschreven. De rechterbenedenhoek toont meer dan 1.500 liposomen per frame, wat te veel is om individuele liposomen te onderscheiden. Er is een hoog risico dat een enkele vlek daadwerkelijk twee liposomen wordt geïmmobiliseerd binnen dezelfde diffractie beperkte plek. B) indien de kamer niet op de juiste wijze in de preparaathouder wordt geplaatst, is het onmogelijk om het hele gezichtsveld in de juiste focus te krijgen. In de linker Microscoop wordt de plaat gekanteld rond de traverse as, waardoor de linker benedenhoek niet scherp is. In de rechter Microscoop is de plaat gekanteld rond de lengteas, wat leidt tot een zwaardere helling. Zowel de linker-als de rechterbenedenhoek zijn niet scherp. C) als beeldvorming voor lange perioden of bij verhoogde temperaturen kan de buffer verdampen, wat leidt tot uitdroging uit de kamer. We illustreerde dit scenario hier door beeldvormende liposomen voor en na de kamer werd gelaten om te drogen voor 3 minuten, en vervolgens opnieuw bevooerd door het toevoegen van verse buffer aan de kamer. De resulterende liposomen zijn groter, wazig, hebben een lagere intensiteit van de fluorescentie en lijken op de plaat te worden verspreid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: intensiteit ratio histogrammen voor het kwantificeren van liposoom compositorische inhomogeniteit. A) de intensiteits ratio van dope-Atto488 en dope-Atto655 fluorescentie voor elk afzonderlijk liposoom dat als histogram is uitgezet. B) een afgeknotte Gaussiaanse verdeling die een mogelijk gevoeligheids probleem illustreert, hetzij tijdens de beeldvorming of in de gegevensbehandelings stap. C) het aanpassen van het intensiteits histogram met een Gaussiaanse functie maakt het mogelijk om de gemiddelde en standaarddeviatie te extraheren die wordt gebruikt om de di-waarde te berekenen. D) een di-waarde van 0,23 kan worden omgerekend naar 32% van de populatie die met meer dan 23% verschilt van de gemiddelde molaire verhouding van het ensemble. E) controle-experiment Imaging dezelfde liposomen voor en na het opnieuw scherpstellen en vervolgens dezelfde gegevens behandelingsprocedure uitvoeren als voor het eigenlijke experiment. Hierdoor kan de experimentele fout voor de kwantificering worden bepaald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: de intensiteit van het liposoom omzetten in een fysieke diameter in nm. A) het intensiteits histogram van de 50 nm geëxtrudeerde kalibratie liposomen in vergelijking met de DLS-gegevens om de kalibratiefactor te bepalen. B) een histogram van de intSQRT -waarde van de experimentele liposomen levert doorgaans een log-normale verdeling op vanwege de fysieke beperkingen tegen het maken van zeer kleine liposomen. (C) een niet-log-normaal intSQRT -waarde histogram duidt op problemen met detectiegevoeligheid of dat kleine liposomen zijn uitgesloten tijdens de gegevensbehandeling. D) de liposoom intensiteiten in (B) worden omgezet in werkelijke liposoom diameters met behulp van de correctiefactor. E) de intensiteits ratio van elk liposoom dat is uitgezet als functie van de liposoom diameter kan nu worden weergegeven, waardoor het onderzoek naar de samenstellings inhomogeniteit als functie van de grootte van de liposoom mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is belangrijk op te merken dat hoewel we in detail beschrijven hoe de enkelvoudige liposomen test kan worden gebruikt om de compositorische inhomogeniteit tussen individuele liposomen te bestuderen, het platform zeer veelzijdig is. Zoals eerder getoond en besproken in de inleiding, het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van aspecten van membraan-membraan fusie, eiwit-membraan interacties, of Liposomale drug Carrier karakterisering. Voor alle wetenschappelijke vragen die worden behandeld, ligt de kracht van de enkelvoudige liposoom test in de mogelijkheid om de individuele componenten van het ensemble te detecteren en aldus een kwantitatieve uitlezen, niet bevooroordeeld door Ensemble Middelings effecten.
De enkelvoudige liposoom test is optimaal geschikt voor oppervlakte beeldvormings modaliteiten zoals de totale inwendige reflectie of confocale Microscoop, waarbij de Z-richting snijden ongewenste achtergrond fluorescentie uit de oplossing boven de liposoom laag kan elimineren. Dit aspect is echter van het grootste belang voor studies waarbij fluorescently gelabelde verbindingen, zoals peptiden, eiwitten of andere liposomen, aan de oplossing worden toegevoegd en daar blijven tijdens de beeldvorming. Als de test bijvoorbeeld wordt gebruikt in het formaat dat hier gedetailleerd wordt beschreven, waarbij de fluorescerende kleurstoffen beperkt zijn tot de geïmmobiliseerde liposomen, kan de test in principe worden uitgevoerd met behulp van breder beschikbare Widefield-microscopen, waardoor de detectie systeem is gevoelig genoeg.
A priori zijn er geen beperkingen ten aanzien van de methode die wordt gebruikt om de in de test gebruikte liposomen voor te bereiden. Hier beschrijven we in detail het gebruik van een Vries droogtechniek. Eerder werden echter op basis van chloroform gebaseerde lipide-rehydratie-of ethanol-injectietechnieken gebruikt om liposomen te fabriceren die in de assay5,6worden toegepast. Een kritische parameter is de opname van een minuut Fractie van biotinyleerd lipiden in het lipide mengsel om immobilisatie te garanderen (0,05 mol% aanbevolen). Een ander noodzakelijk element is het opnemen van een kleine hoeveelheid fluorescently gelabelde lipide. Over het algemeen moet de hoeveelheid lipide-Dye die wordt toegevoegd zo laag mogelijk worden gehouden om beide afschrikken effecten te vermijden en om te voorkomen dat de lipide-kleurstof de fysisch-chemische eigenschappen van de liposoom significant wijzigt. De ondergrens van de hoeveelheid lipide kleurstof wordt bepaald door de concentratie, waarbij de stochastische variatie in het aantal individuele lipide-kleurstoffen per liposoom significant wordt in vergelijking met de gemiddelde hoeveelheid lipide-kleurstoffen (Zie Larsen et al.6 voor een grondige bespreking). Onder deze limiet zullen grote onzekerheden in de geëxtraheerde intensiteiten worden geïntroduceerd. Tot slot moet de hoeveelheid lipide-kleurstof hoog genoeg zijn voor een nauwkeurige detectie van de enkele liposomen met een goede signaal-ruis verhouding. Hoewel dit criterium natuurlijk sterk afhangt van het beeldvormings systeem, hebben we geconstateerd dat de lipiden kleurstof concentraties tussen 0,05 en 0,5 mol% in de overgrote meerderheid van de gevallen goed werken.
Om te kiezen welke lipide-kleurstof in het liposoom moet worden opgenomen, is de eerste voorwaarde dat de excitatie-en emissie-eigenschappen overeenkomen met de verlichtings-en detectiemogelijkheden van het beeldvormings systeem. Ten tweede, om de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de methode te verhogen, raden we aan om kleurstoffen te gebruiken met zowel hoge kwantum opbrengsten als foto stabiliteit, en we hebben eerder met succes kleurstoffen gebruikt met verschillende excitatie golflengten6,11. Er moet worden gezorgd voor het kiezen van lipide ankers met vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen om ervoor te zorgen dat lipide-partitionering niet leidt tot kunstmatig hoge inhomogeniteit. Voor dit protocol bijvoorbeeld, hebben we beide fluoroforen met behulp van dope verankerd, terwijl het hebben van één de op dope en een andere op dppe kan leiden tot de distributie heterogeneities die geen verband houden met de inherente inhomogeniteit in de liposoom populatie. Speciaal voor Dual Color Imaging is het belangrijk om kleurstoffen te kiezen met een smalle excitatie en emissiespectra en de kleinste spectrale overlap, om significante overloop, crosstalk en fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET) tussen kleurstoffen en kanalen te voorkomen. Om artefacten in verband met variatie in de de-omgeving te voorkomen, werken we liever met kleurstoffen, die experimenteel zijn bewezen om extreem lage membraan interactie-neiging te vertonen zoals bepaald door Hughes et al.26. Tot slot, als een specifieke liposoom lipide samenstelling niet een harde eis is voor het experimentele ontwerp, kan het voordelig zijn om tot 10 mol% van negatief geladen lipiden op te nemen om ervoor te zorgen dat individuele liposomen elkaar afstoten en efficiënt worden geïmmobiliseerd als enkele liposomen12.
Een voordeel van de enkelvoudige liposoom test is het kleine experimentele volume, dat de hoeveelheid dure of zeldzame verbindingen die per experiment wordt gebruikt, sterk kan verminderen. Hier beschrijven we het gebruik van standaard en in de handel verkrijgbare kamers met een experimenteel volume tussen 150 – 300 μL. Er kunnen echter op maat gemaakte Microscoop kamers worden gebruikt die het volume tot een bereik van 50 – 80 μL kunnen reduceren. Ook, de liposoom consumptie is zeer laag, met een uiteindelijke concentratie rond 2 μM totaal lipide.
Een nadeel van de enkelvoudige liposoom test is dat het moeilijk is om de lipide concentratie in de kamer te beheersen vanwege de variaties in immobilisatie tendensen die hierboven zijn beschreven. Bovendien is het, met betrekking tot de toepassing van de test voor het bestuderen van membraan-eiwit interacties, uitdagend om de concentratie of het aantal gebonden eiwitten direct te bepalen aan de intensiteit van de fluorescentie.
Bij het gebruik van de liposomen in de assay als membraan modelsystemen (bijv. om de membraan interactie van fluorescerende stoffen, peptiden of eiwitten te bestuderen) is het belangrijk om te zorgen voor een lage niet-specifieke binding aan de eiwit componenten die de Immobilisatie. Als dit niet het geval is, kan een hoog achtergrond signaal worden gedetecteerd dat de detectie van de specifieke binding aan de liposomen kan voorkomen. Als een hoge niet-specifieke achtergrond wordt gedetecteerd, hebben we eerder met succes de achtergrond verkleind door van streptavidine naar Neutravidin of avidin te veranderen.
Het uitvoeren van één liposoom detectie met behulp van andere technieken zoals flow cytometrie kan mogelijk een verhoogde detectie doorvoer bieden in vergelijking met de op Microscoop gebaseerde assay. Echter, gezien het feit dat Flow Cytometers zijn geoptimaliseerd voor het bestuderen van veel grotere en helderdere monsters zoals cellen, het detectiesysteem van de meeste is niet gevoelig genoeg voor het detecteren van de relatief zwakke fluorescentie van een individuele liposoom. Dus terwijl er nieuwe en meer gevoelige flow cytometrie wordt ontwikkeld, biedt de op Microscoop gebaseerde test de beste oplossing voor het verhelderende liposomen-inhomogeniteiten wanneer deze efficiënt wordt uitgevoerd en duizenden liposomen per experiment worden bewaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek [subsidie nummer 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
