Summary
מרחב הספסל, הטיפוח-תרגול מסייע לאפיון מיקרוראלגל ולמיטוב הפרודוקטיביות לפני המשך התהליך העוקב. Photobioreactors חקנים לספק את השליטה הנחוצה עבור ניסויים מיקרוראלגל אמין ולאחר והוא יכול להיות מותאם בבטחה לטפח מיקרואצות עם גזים מאכל (CO2, כך2, לא2) מתוך העירונית או התעשייה בעירה.
Abstract
פוטוביריאקטורים הם מערכות טיפוח מוארות לניסויים על מיקרואורגניזמים phototrophic. מערכות אלו מספקות סביבה סטרילית לטיפוח-תרגול של microalgal עם טמפרטורה, pH, הרכב ושליטה בקצב הזרימה. בסולם הספסל, פוטוביריאקטורים הם יתרון לחוקרים ללמוד מאפיינים microalgal, פרודוקטיביות, ואופטימיזציה הצמיחה. בקשקשים תעשייתיים, פוטוביריאקטורים יכולים לשמור על טוהר המוצר ולשפר את יעילות הייצור. הסרטון מתאר את ההכנה והשימוש בפוטוביושחקן בקנה מידה לטיפוח microalgal, כולל השימוש הבטוח של כניסות גז מאכל, ופרטים מדידות רלוונטיות ביומסה וחישובי פרודוקטיביות ביומסה. באופן ספציפי, הווידאו ממחיש אחסון תרבות microalgal והכנה לחיסונים, הרכבה פוטוביריאקטור ועיקור, מדידות ריכוז ביומסה, ומודל לוגיסטי עבור פרודוקטיביות ביומסה microalgal עם קצב חישובים כולל מקסימום הכולל ביומסה המוצרים. בנוסף, כיוון שקיים עניין גובר בניסויים לטיפוח מיקרואצות באמצעות פליטת גז מדומה או ממשית, הווידאו יכסה את העיבודים לציוד פוטוביריאקטור הדרוש לעבודה עם גזים מיואכל ולדון בדיגום בטוח ב תרחישים כאלה.
Introduction
פוטוביריאקטורים שימושיים לניסויים מבוקרים ולטיפוח של מוצרים מיקרואליגל טהורים יותר מאשר בריכות פתוחות. טיפוח מיקרוגל בפוטוביריאקטורים בקנה מידה תומך בפיתוח ידע בסיסי שניתן להשתמש בו לעיבוד היקף. שינויים קלים בתנאי הסביבה יכולים לשנות באופן משמעותי ניסויים מיקרוביולוגית ולבלבל את התוצאות1. תהליך סטרילי עם טמפרטורה, pH, ושליטה באמצעות גז הוא יתרון עבור לימוד מאפיינים microalgal וביצועים בתנאים מגוונים. בנוסף, השליטה על ריכוזי גז הקלט, טמפרטורה, להטות כוח מערבוב, ו-pH בינוני יכול לתמוך במינים שונים, כי הם מאתגרים אחרת לטפח. ניתן להפעיל פוטוביריאשחקנים כתהליך אצווה עם הזנה רציפה של הגז והעברת הצלעות, או כשיטת זרימה באמצעות כימוסטטיסטיקה עם הזנת גז רציפה והעברת כניסות מזינים של שפכים בתוספת השפעה וקולחים. כאן, אנו מדגימים את תהליך האצווה עם הזנת גז רציפה והגזז.
השימוש בפוטוביריאקטורים מטפל בכמה אתגרי טיפוח והפקה של microalgal. השדה מאבקים בדרך כלל עם חששות של זיהום על ידי מיקרואורגניזמים אחרים, ניצול המצע יעיל (אשר חשוב במיוחד במקרה של CO2 הקלה או טיפול בשפכים)2, בקרת pH, השתנות תאורה, ופרודוקטיביות ביומסה3. פוטוביאורנים מאפשרים לחוקרים ללמוד מגוון רחב של פוטוטרונים במערכות אצווה מבוקרות היטב, בהן אפילו מינים הגדלים לאט מוגנים מפני טורפים או מיקרואורגניזמים מתחרים4. מערכות אצווה אלה גם טוב יותר להקל על שיעורי ניצול2 גדול יותר ופרודוקטיביות ביומסה משום שהם סגורים מערכות כי הם נוטים יותר להיות בשיווי משקל עם גזים שסופקו. טכנולוגיית פוטוביריאקטור מציעה גם בקרת pH, העדר הפריע לפרודוקטיביות ביומסה גבוהה במחקרים קודמים5. בסולם הספסל, רמת השליטה המוצעים על ידי פוטוביריאקטורים הוא יתרון לחוקרים. בקנה מידה תעשייתי גדול יותר, photobioreactors חקנים ניתן להשתמש כדי לשמור על טוהר מסחרי ביורוקט ולשפר את יעילות הייצור עבור nutraceutical קוסמטיים, מזון, או להאכיל יישומים6.
מיקרואצות הם עניין רב עבור biosequestration של CO2 כי הם יכולים לתקן במהירות CO2 כמו פחמן ביומסה. עם זאת, מקורות אנתרופוגניים ביותר של CO2 מזוהמים עם גזים אחרים רעיל, רעילים או מזהמים (NOx, כל כךx, CO, Hg), תלוי בתהליך הבעירה מקור דלק. הריבית הגוברת של CO בר קיימא2 קיבוע על יש התפתחות של טכנולוגיות photobioreactor שחקן לטיפול CO2-עשיר פליטת, כגון אלה מתחנות כוח שנורו פחם (שולחן 1). למרבה הצער, יש סיכון הגלום בחשיפה אנושית וסביבתית למזהמים מורעלים ורעילים במהלך תהליכי המחקר וההיקף. ככזה, תיאור ההרכבה בטוחה ותפעול של ריאקטורים באמצעות גזים מאכל הוא הכרחי ומאלף.
שיטה זו מהווה לשימוש ב-2 ל-photobioreactor חקן בקנה מידה לצמיחה של מיקרואצות תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים בקפידה. הפרוטוקול מתאר אחסון microalgal, הכנת הרשת, והתקנת פוטוביוריאקטור ועיקור. מעבר לפעולה בסיסית, עבודה זו מתארת מדידות ביומסה microalgal וחישובי פרודוקטיביות ביומסה, והסתגלות של ציוד לטיפוח מיקרואליגל עם גזים מאכל. הפרוטוקול המתואר להלן מתאים לחוקרים המבקשים להפעיל שליטה ניסיונית גדולה יותר, לייעל את תנאי הצמיחה microalgal, או תרבות האקסון מגוון של חיידקים phototrophic. שיטה זו אינה מתארת חומרים מתאימים לטיפוח חיידקים המייצרים או צורכים גזים דליקים (כגון CH4, H2וכו '). 7. לאחר מכן
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שימוש בטוח ודיגום של פוטוביריאקטור עם גזים מקורוזיגים
הערה: שיטה זו אינה מתארת הליכים מתאימים לדיגום בטוח של תרבויות microalgal המייצרים או צורכים גזים דליקים במיוחד.
- לנהל גז רעיל כסיכון לבריאות האדם.
הערה: לתוכנית היגיינה כימית של אוניברסיטת איווה, המחברים עבדו עם רכזת בטיחות אש האוניברסיטה בריאות הסביבה & בטיחות התעשייה שוטר היגיינה לפתח פרוטוקול בטיחות לעבודה עם גזים רעילים. - להקים מערכת ניטור גז רעיל עם חיישנים עבור כל אחד הגזים רעילים בשימוש. כיול את החיישנים בהתאם להוראות היצרן. מבחן גבשושיות (לבדוק חיישן ופונקציונליות אזעקה עם גזים כיול) לעתים קרובות, על פי הוראות היצרן. תאתר את מוניטור הגז. ממש מחוץ למכסה המנוע
- לפני תחילת כל ניסויים גז מאכל, להודיע לאנשי הצוות הסמוך של הסיכון מערכת אזעקה. תודיע גם למגיבי החירום. המתאימים הצבת סימנים על כניסות מעבדה המציינות אילו גזים מסוכנים נמצאים בשימוש.
- הדריכו את כל אנשי הצוות הקרובים. להתפנות אם מתגלה גז רעיל תודיעו למפקחים על המעבדה. ולצוותי החירום
הערה: בהפסקת חשמל, המגדל המסדיר גז יעצור את זרימת הגז כאשר הוא יאבד את הכוח. עם זאת, אם חימום החדר, אוורור, מיזוג אוויר (HVAC) מערכת או מזגן לרדת ללא הפסקת חשמל, זה יגרום גז רעיל דולף.
- הדריכו את כל אנשי הצוות הקרובים. להתפנות אם מתגלה גז רעיל תודיעו למפקחים על המעבדה. ולצוותי החירום
- לדגם את הריכוז המצטבר האפשרי של גזים רעילים בחדר אם מכסה המנוע נכשל באמצעות האגודה האמריקנית להיגיינה התעשייה (AIHA) מידול מתמטי גיליון אלקטרוני IH MOD8 עבור כל גז.
- השג את אספקת החדר/שיעור אוויר פליטה, Q, ב m3 דקות-1 מבניין הצוות תחזוקה hvac או הטכנאי hvac. חשב את עוצמת הקול, V, של המעבדה (L x W x H) ב-m3. לחשב את קצב פליטת זיהום, G, של כל סוג של גז רעיל ב mg min-1, באמצעות משוואה 1 המותאם מתוך חוק הגז האידיאלי:
1
כאשר P הוא שבר של הלחץ המופעל על ידי הגז הרעיל ב 1 כספומט (ppm גז/106 עמודים לדקה), Qgas הוא קצב הזרימה של הגז ב-L min-1, R הוא קבוע גז אוניברסלי (0.082057 L · atm · מול1· K-1), T הוא טמפרטורה k ו- MW הוא הגז ' משקל מולקולרי g מול-1. - השתמש בערכים עבור V, Qו- G עבור כל גז (מחושב בשלב 1.4.1) במודל חדר מעורב עם אפשרות להפסיק את הדור והדגם לטהר את החדר בגיליון האלקטרוני של IH MOD כדי לחשב את ריכוזי הגז המצטבר של החדר עבור כל גז מעל 1440 דקות (24 שעות) תקופת הדמיה. השווה ערכים אלה למגבלות החשיפה (טבלה 2)9.
- השג את אספקת החדר/שיעור אוויר פליטה, Q, ב m3 דקות-1 מבניין הצוות תחזוקה hvac או הטכנאי hvac. חשב את עוצמת הקול, V, של המעבדה (L x W x H) ב-m3. לחשב את קצב פליטת זיהום, G, של כל סוג של גז רעיל ב mg min-1, באמצעות משוואה 1 המותאם מתוך חוק הגז האידיאלי:
12. הכנת המיקרוגל
- הכינו מינים של מיני מיקרואליאוס, או זנים אחרים של microalgal שנבחרו לצילום, לפני תחילת הניסוי על-ידי העברתו מאחסון, בין אם הקפאת שמורות או תרבית במדיה של אגר.
- הוסף 30-50 מ ל של בינונית צמיחה microalgal סטרילי (משולשת חנקן מדיום בסיס של הבסיס [3N-BBM], שולחן 3) ל סטרילי (150-250 מ"ל) לנענע בקבוקון הכתיר עם פקק קצף.
הערה: אלא אם כן הבקבוקון מוקף בבקבוק, רק חמישית מאמצעי האחסון של השייק צריך להיות מאוכלס על ידי מדיה נוזלית. - השתמש בקבינט אבטחה טיחות כדי לשמור על עקרות בעת העברת תאים לשיפוע או לנענע בקבוקון. עבור תרבויות על אגר, להשתמש בלולאה סטרילית להעביר מיקרואצות מן הצלחת אגר שלה או להטות את הבקבוקון לנער. עבור תרבויות הקפאה, בהדרגה להפשיר את הדגימה cryopreserved ולשטוף משם את כימיות על פי הפרוטוקול הנבחר10, ואז להוסיף את התאים הבקבוקון לנער.
- התאים התרבותיים ב-3N-BBM במהירות 20/25 ° צ' מתחת לגיל 16 h:8h אור: כהה ורועד ב 115-130 סל ד.
- מעקב אחר צמיחת microalgal לאורך זמן באמצעות מדידות דחיסות אופטית (OD) (כמו בסעיפים 5 ו-6). הניחו למיקרואצות להגיע לשלב הצמיחה האקספוננציאלי (2-4 ימים) לפני העברת תאים לפוטוביריאקטור.
הערה: בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לשטוף את התאים בתווך תרבותי (מחקר זה) ו/או מרוכז במספר מדרגות צנטריפוגה לפני החיסון הביוריאקטור.
- הוסף 30-50 מ ל של בינונית צמיחה microalgal סטרילי (משולשת חנקן מדיום בסיס של הבסיס [3N-BBM], שולחן 3) ל סטרילי (150-250 מ"ל) לנענע בקבוקון הכתיר עם פקק קצף.
3. התקנה ותפעול של פוטוביוריאקטור
- השתמש בפוטוביולקטור (איור 1) כדי לשלוט בטמפרטורה, ברמת החומציות, בקצב הערבוב, בשיעורי זרימת הגז ובקצבי הזרימה של פתרון הקלט.
הערה: ניתן להשתמש בפוטוביריאקטור כדי לשלוט בזרימה של עד ארבעה פתרונות קלט שונים, בדרך כלל חומצה, בסיס, אנטיקצף ומצע.- הכינו 100 mL כל אחד N NaOH ו 1 N HCl ולהוסיף כל אחד 250 mL בקבוק פתרון הקלט. השתמש בהסגר משני עבור פתרונות אלה.
- לאחסן פתרונות קלט של מונים בבקבוקים בעלי התקנה אוטומטית המצוידים בצינורות טבילה ובצינור אוורור עם פילטר אוויר סטרילי ומוטבע. לחבר את צינורות הטבילה לתוך ארבע יציאות הקלט של photobioreactor חקן באמצעות צינורות אוטוקלטים ובמהלך הפעולה photobioreactor חקן, שוקעת צינורות לטבול בפתרונות הקלט. להעביר את 1.6 mm dimeter בתוך (ID) אוטומטי אבובים בין פתרונות הקלט ואת היציאות שלהם באמצעות משאבות פריסטלטיות נפרדות אשר עשוי להיות נשלט על ידי שיעורי זרימה ידנית שנבחרו או על ידי משוב מ-pH וברמת קצף הבדיקות (במקרה של חומצה, בסיס ופתרונות נגד קצף).
- כיול את ה-pH. a לפני האוטוקלינג.
- לחבר את הגשוש pH כדי מגדל הבקרה photobioreactor שחקן ידי התאמת הגשוש לקו חיבור ומתפתל לנעול. השתמש ב-pH 4 ו-pH 7 מאגרי לכייל את מד pH. המתן עד לייצוב הערכים לפני קבלת ערך ה-pH.
- לנתק את הגשוש pH מכבל מד pH המחבר את הגשוש למגדל הבקרה.
- פני השטח לעקר עם 70% אתנול או לחיטוי הגשוש עם הכור. כדי החיטוי, המכסה את הבדיקה pH בחוזקה עם רדיד אלומיניום.
הערה: אם החללית היא אוטומטית, יש סיכון של קורוזיה של הפנים בדיקה מפני נזקי קיטור. שיטת הסגירה אינה מבטיחה לחלוטין את מניעת הנזק. - להוסיף 10 מ"מ 4-(2-הידרויקסיל) פיפראזין -1-חומצה אתאנסולפונית (HEPES) מאגר למדיום התרבות כדי לשלוט טוב יותר pH.
- הכנס ובורג סגרו את האצבע הקרה ואת המצות הפליטה על לוחית הראש פוטוביוריאקטור.
- הכנס את יציאת החיסון ובוא לברגים במקומם הדוק. הוסף אורך של צינורות אוטוקלקות לחלק של החיסון מעל לוחית הזיהוי של פוטוביריאקטור. לפני הסגירה הביוריאקטור, להדק את האבובים סגור עם מהדק צינור אוטומטי הקיים.
- הצמד אבובים הכתיר עם מסננים סטרילי לכל יציאות photobioreactor חקן לא בשימוש.
- הצמדת חומצה ופתרונות קלט בסיסים ליציאות הקלט פוטוביריאקטור באמצעות אבובים הניתן לתיקון אוטומטי. הוסף 1.5 L של מדיום התרבות.
- להפעיל את הכור ופתרונות הקלט המשויכים ל-30-45 דקות ב-121 ° צ' בהתאם לנפח העבודה.
הערה: אם המדיום התרבותי מושפע לרעה על ידי אוטוקלינג, הוסף את המדיה לאחר התיקון בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינארי. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
התראה: הכור יהיה חם לאחר הסרת החיטוי. - חבר את המנוע מדחף לפיר מדחף ולהדק את המדידה.
- ארגון לוחות אור LED סימטרי מחוץ ללוח הבקרה בהתאם לדרישות התאורה.
- לפני האוטוקלינג, למדוד ולהקליט את עוצמת האור עם פומטר. מניחים את החיישן המאיר בתוך כלי הצילום ומפנים את החיישן לכיוון מקור האור.
- התחבר עד שני צילינדרים גז כדי לספק את פליטת הכוח מדומה המופעל פחם (שולחן 1) למיקרואצות ב photobioreactor חקן.
הערה: ריכוזי הגז המשמשים במחקר זה מתקרבת לאלה של תחנת הכוח של אוניברסיטת איווה.- להרכיב את החיבורים בין הצילינדר גז, גז הוויסות מגדל, ו photobioreactor חקן הטבעת. לחבר רגולטורים מתאימים המסוגל. ללחוץ על הדלק לצילינדרים לצרף 6 מ"מ ללחוץ צינורות עמידים בלחץ על צינור שקע הווסת בארב בטוח עם מהדק צינור. הצמד את הקצה השני של צינורות עמידים ללחץ הגז המסדיר את כניסת הגז מגדל באמצעות צינור בארב 6 מ"מ גזע חיבור מהיר התאמה מאובטח עם מלחציים צינור. לחבר 3.2 mm מזהה צינורות גז הוויסות מגדל הגז באמצעות אחר 6 מ"מ חיבור מהיר התאמה ולחבר את הקצה השני של אבובים שקע ליציאת טבעת הצלצול בראש השחקן photobioreactor חקן.
הערה: עבור גז קלט שני, חזור על השלב 3.9.1, אך השתמש בצורה מעוצבת בצורת T כדי לאחד את שני קווי הגז של הקלט לקטע אחד של צינור מחובר ליציאת טבעת הצלעות. - הגדר את הלחץ לשקע 20 psi על כל וסת הגז ולהשתמש בממשק ביוריאקטור חקן להגדיר שיעורי זרימת הגז ניסיוני.
הערה: חשב ודווח על נפח האוויר בתנאים סטנדרטיים לכל נפח של נוזל לדקה (vvm); לחלק את קצב זרימת הגז הנפחי על ידי נפח התרבות. דוח ביחידות של מינייוט.
- להרכיב את החיבורים בין הצילינדר גז, גז הוויסות מגדל, ו photobioreactor חקן הטבעת. לחבר רגולטורים מתאימים המסוגל. ללחוץ על הדלק לצילינדרים לצרף 6 מ"מ ללחוץ צינורות עמידים בלחץ על צינור שקע הווסת בארב בטוח עם מהדק צינור. הצמד את הקצה השני של צינורות עמידים ללחץ הגז המסדיר את כניסת הגז מגדל באמצעות צינור בארב 6 מ"מ גזע חיבור מהיר התאמה מאובטח עם מלחציים צינור. לחבר 3.2 mm מזהה צינורות גז הוויסות מגדל הגז באמצעות אחר 6 מ"מ חיבור מהיר התאמה ולחבר את הקצה השני של אבובים שקע ליציאת טבעת הצלצול בראש השחקן photobioreactor חקן.
- כאשר מתפצל עם יותר מצילינדר גז אחד, לאשר את הריכוז המסופק2 שסופקו על photobioreactor חקן עם חיישן CO2 .
- חבר תוכנה (לדוגמה, GasLab) תואם חיישן CO2 ליציאת USB של מחשב. הורד את התוכנה העדכנית ביותר המתאימה למודל חיישן CO2 . פתח את התוכנה והקלט את מודל החיישן, מרווח זמן המדידה ומשך הרישום של נתוני המדידה.
- מניחים את חיישן CO2 ואת צינור הגז משולב (לפני חיבור הצינור עם bioreactor חקן) ב 100 ל 250 מ ל, הכתיר, ספינה פרקו (חיצוני ל bioreactor חקן).
הערה: במהלך הניסוי, שיתוף השטח הקדמי2 ריכוזים עשויים להיות נמדד מתוך אחד צינורות אוורור על כותרת הראש photobioreactor שחקן. - הפעל את מדידות הריכוז CO2 על ממשק המשתמש ולחכות את המדידות כדי equi,.
- השתמש בממשק המשתמש photobioreactor שחקן כדי לכוונן את שיעורי זרימת הגז מכל טנק עד קצב הזרימה הכולל הרצוי (0.1 L דקות-1) ו-CO2 ריכוז (12%) מושגת.
- בממשק המשתמש של photobioreactor שחקן, השתמש בפונקציה מדחף כדי לקבוע את קצב הסיבוב של האימלר. ודא שקצב הערבוב מהיר מספיק למדיום התרבותי כדי להטמיע את בועות הגז המוספגות.
הערה: למינים מסוימים של microalgal יש מבני תאים חלשים והוא ניזוק או מוקרע בכוח ההטיה הגבוה.
4. התאמת פוטוביריאקטור וכיוונון ניסיוני לשימוש בגז רעיל
התראה: הגזים המורשים של גז הארובה אמיתי או מדומה מורעלים ורעילים. גזים אלה מהווים סיכון רציני אם נשאף.
הערה: שיטה זו אינה מתארת חומרים מתאימים לטיפוח בטוח של חיידקים המייצרים או צורכים גזים דליקים במיוחד (כלומר, מתאן, מימן וכו ').
- החלפת מרכיבי פליז, פלסטיק, צינורות סטנדרטיים עם חומרים עמידים בקורוזיה.
- השימוש פלדת אל-חלד להתנגד באופן אמין קורוזיה מן חומצות חזקות שנוצרו על ידי התגובה בין לאx או כל כךx ומים. החלף פלסטיק אביזרי חיבור מהירה ב-אינלטס גז ושקעים על מגדל גז ויסות עם אביזרי חיבור מהיר נירוסטה. השימוש הרגולטורים נירוסטה לצילינדרים גז כולל צינור שקע בארב ולא בראס.
- השימוש polyטטרפלואורואתילן (מצופה) או הטבעי אתיל ויניל אצטט (EVA) אבובים להתנגד קורוזיה מ-x ו-SOx גזים (בהתאמה) על החיבורים בין גליל הגז אל המגדל גז הוויסות המגדל גז הוויסות לפוטוביורוקטור.
- לאחר האוטוקלינג, הכנס את הפוטוביריאקטור ובלוקי הגז בתוך משטח הליכה. מניחים את photobioreactor חקן על שולחן בתוך בלימה משנית ומניחים גז צילינדרים בקולרים ללא מעמד צילינדר או מתלה צילינדר.
- לאחר התחלת זרימת הגז, להשתמש בסוג בועה גלאי דליפה נוזלי כדי לבדוק דליפות גז בכל החיבורים בין צילינדרים גז ו bioreactor חקן. השתמש בבקבוק לשטוף מלא עם 1:100 (v:v) דילול של סבון תבשיל: מים כדי לכסות את החיבור עם זרם קטן של תמיסת סבון.
הערה: הנזילות תצוין על-ידי בעבוע בחיבורים. - בעת התחלת הניסויים microalgal, התחל לאחר מכן להתאים את ה-pH לפני החיסון (כמו בניסויים הסטנדרטיים photobioreactor חקן).
הערה: אגירת מדיום התרבות במהלך ניסויי גז מאכל מומלצת מאוד מכיוון שגזי הקלט הם חומציים ביותר. - איחסן את הפוטוביריאקטור על-ידי הכנת המיקרוגל המוכן למזרק סטרילי, התאמת המזרק לצינורות המחוברים ליציאת החיסון, פתיחת מהדק החיסונים ודיכוי המזרק.
- בדוק את צג הגז, לחצים צילינדר גז, ו photobioreactor חקן פעמיים ביום (ולפני דגימה) עבור רמות גבוהות של גז רעיל או אינדיקציה של דליפות.
- הגבל את האבנט של מכסה המנוע הנפתח לרוחב המאפשר להגיע לרגולטורים ביוריאקטור וגז. כדי למנוע סיכון לחשיפת שאיפת הנשימה, ודא שהפתח אינו חושף את האדם מעל אזור הגוף.
- להפעיל את הרגולטורים הצילינדר גז למצב סגור כדי להפסיק את זרימת הגז לכור. סגרו את האבנט ומאפשרים 5 דקות למכסה המנוע לפנות את הגזים הקורוזיולים לפני שאתם מחפשים את התרבות הפוטוביואורית.
- המדגם בתוך מכסה המנוע על-ידי פתיחת היציאה לוחית הכותרת ושימוש בחיית מחמד סרולוגית סטרילית או ציור תרבות לתוך מזרק דרך יציאת החיסון/דגימה. אבטחו את יציאות הפוטוביריאקטור לפני פתיחת הצילינדרים וחידוש הניסוי.
5. מדידת פרודוקטיביות ביומסה של microalgal
- השתמש בעקומת כיול כדי להתייחס לתרבות microalgal OD750 מדידות לריכוזי ביומסה של microalgal יבשים.
- הכינו כמה (מינימום: 4, נפח עבודה מינימלי: 500 mL) מבחנות עם מדיום microalgal סטרילי ו החיסון עם מינים של עניין (למשל, S. בתוך מחקר זה).
- למדוד את התרבות OD750 עד הצמיחה הוא אקספוננציאלי, ומיד sacrificially לדגום את מבחנות על ידי סינון אמצעי אחסון ידוע (מינימום של 100 mL) של התוכן עם ממברנה מסנן 0.45 יקרומטר של המסה ידוע. השתמש מכוסה אלומיניום שוקלים סירות או כלי זכוכית כדי לתמוך ביומסה ומסננים כפי שהם יבשים.
- המסת ביומסה ומסננים לאחר ייבוש במשך כ 18 עד 24 שעות בתנור בין 80-100 ° c. כדי לוודא את הייבוש המלא, מדידת שוב לאחר 2-3 שעות נוספות כדי לקבוע אם המסה התייצב.
- להפחית את מסת המסנן מתוך ביומסה משולב ומסנן לחשב את מסת ביומסה.
- מתווה את עקומת הכיול כפי שנמדד OD750 נגד ריכוז ביומסה (מסה של ביומסה מחולק על-ידי הנפח של התרבות המסוננת) ולהתאים את הנתונים עם רגרסיה ליניארית.
6. מידול פרודוקטיביות וחישובי קצב ביומסה
- חישוב ריכוזי ביומסה ניסוי מ OD750 מדידות באמצעות עקומת הכיול ליניארי רגרסיה (נקבע בסעיף 5).
- התאם את נתוני הגדילה של האצווה מפני השהיה לשלב האקספוננציאלי והנייח עם רגרסיה לוגיסטית (משוואה 2) בתוכנת גרפים וסטטיסטיקה (טבלת חומרים):
2
כאשר L הוא בערך ריכוז ביומסה המרבי של העקומה, k הוא החלק היחסי של השלב האקספוננציאלי (זמן-1), xo הוא הזמן של העקומה של עקומת סיגמותא, ו- x הוא הזמן.- הזן באופן ידני את המשוואה הלוגיסטית לעיל. בחר באפשרות התאם עקומה עם רגרסיה לא לינארית בכרטיסיה ניתוח בתוכנה. בצד השמאלי של הפרמטרים: התיבה רגרסיה לא לינארית , בחר באפשרות צור משוואה חדשה תחת התיבה הנפתחת החדשה . השתמש במשוואה המפורשת המהווה ברירת מחדל כסוג משוואה, תן שם לפונקציה החדשה והגדר את הפונקציה החדשה כ-Y = L/(1 + exp (-k * (x-b)), כאשר b מייצג xo.
- לחשב את הפרודוקטיביות הכוללת ביומסה של אצווה microalgal על ידי חלוקת ההפרש בין ריכוזי ביומסה הסופי הראשונית על ידי ההפרש בין הסופי הראשון הראשונים.
- לחשב את הפרודוקטיביות המירבית של ביומסה של אצוות microalgal מן הנגזרת של המשוואה 2 (משוואה 3) בנקודת האמצע סיגמואיד, כאשר x = xo.
3
2
3Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקומת כיול עבור המיקרואצות הירוקות, S. ob,שנקטפו בשלב האקספוננציאלי, הוקמה עם OD750 וריכוזי ביומסה יבשים (איור 2). לרגרסיה הליניארית היה ערך R2 של 0.9996.
תרבות S. ob, החלה ב-250 ML Erlenmeyer בקבוקון מתרבות המאוחסנים על צלחת אגר בקירור. Microalga היה מחוסן ב 3N-BBM עם 10 מ"מ מאגר HEPES ומלא עם 2.2% CO2 ב-2 L photobioreactor חקן עם 1.5 L עובד נפח (0.07 vvm) (איור 1). האצווה מתבצע במעקב דרך OD750; ריכוזי ביומסה חושבו מעקומת כיול, ולאחר מכן המודל עם עקומה לוגיסטית (איור 3). Photobioreactor שחקן שמר את התרבות ב-pH 6.8, 100 ס"מ3 min-1 תזרים הכולל שיעור זרימת הגז, רציף 280 μm-2 s-1 התאורה, ו 27 ° c. העקומה הלוגיסטית מתאימה לנתוני ריכוז ביומסה מפני השהיה ועד לשלב מעריכי ועד נייח. מן המודל הלוגיסטי, ריכוז ביומסה מרבי במהלך האצווה היה 2070 ± 20 mg L-1, פרודוקטיביות מקסימלית ביומסה התרחשה ביום 4.6, ואת הקצב של פרודוקטיביות ביומסה ספציפי היה 1.0 d-1. הפרודוקטיביות ביומסה מקסימלית, מחושב מתוך נגזרת של עקומת לוגיסטית בזמן הצמיחה המקסימלית, היה 532 ± 60 mg L-1 d-1.
מודל החדר המעורב שימש לחישוב הריכוז המצטבר של מס '2, אז2, ושות במקרה של כשל במכסה המנוע במשך 24 שעות. ערכים אלה הושוו למגבלות החשיפה (טבלה 2). לדוגמה, בתרחיש שבו 0.05 L min-1 של 400 ppm מס '2 שוחרר במהלך תקופת כשל של כיסוי המנוע של 24 שעות, מודל חדר מעורב היטב עם תשומות של G = 0.0377 מ"ג מינימום-1, Q = 0.0001 m3 דקות-1, V = 100 m3, ו הזמן המרבי עבור הדמיה = 1440 דקות צופה לא2 הצטברות ל 0.54 mg m-3 (0.29 ppm), אשר מעל מגבלת חשיפה כרונית סבירה (הוועידה האמריקנית של ממשלתי תעשייתי שינניות סף תל אביב) ומתחת למגבלת החשיפה לטווח הקצר (סטל).
משפט ראשוני מבטיח עם גז ארובה מדומה השיגה שיעור הפרודוקטיביות מקסימלית גדול יותר microalgal ביומסה (690 ± 70 mg L-1 d-1) מאשר זה של 12% CO2 ו אולטרה אפס אוויר (510 ± 40 mg L-1 d-1) (איור 4). לפני הניסוי, מכויל צג הגז עם CO, לא2, ולכן2. ניסוי הגז הדומה של הארובה בוצע ללא כל סיכון לאדם או נזק לציוד מגזים מאכל.
איור 1: הספסל העליון photobioreactor שחקן מואר על ידי נורות LED אדום וכחול. Photobioreactor שחקן פועל כמו 2 L הכור אצווה עם 1.5 L עובד נפח. הפוטוביריאקטור מוזן באופן רציף עם גזים דרך הטבעת ותעלות הגז העודפות דרך היציאות בלוחית העליונה. הותאם באישור ממויטור ואח '5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומת כיול הנוגעת ל-OD750 ל -S. משקל יבש לתאים. S. ob, לאחר התרבות התא ספיגת אור נמדד ב 750 nm, תאים היו מסוננים ומיובשים כדי להשיג תא יבש מדידות משקל. הודפסה מודפס באישור ממויטור ואח '5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: S. ob, בשנת הצמיחה נתונים בשנת 2.2% CO2 קלט במודל רגרסיה לוגיסטית. נקודות הנתונים מייצגות ערכי ביומסה כמחושבים ממדידות בדחיסות אופטית. הנתונים כבר המודל עם רגרסיה לוגיסטית באמצעות ריבועים פחות התאמה; 
כאשר l = 1955 mgL-1, k = 1.154 d-1, ו- x0 = 3.317 d. R2 = 0.995. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: במודל של הצמיחה האושבית ב 12% CO2, עם ובלי מרכיבים נוספים של הארובות גז מדומה. מדידות ביומסה מכל קבוצה של מיקרואצות המודל היתה עם הקיליות לוגיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רכיב | אחוז |
| H2O | 12.6% |
| שיתוף2 | 11.6% |
| מיכלהשני | 5.8% |
| ושות | 0.048% |
| אז2 | 0.045% |
| מס '2 | 0.022% |
| מיכל2 | 69.9% |
טבלה 1: הרכב פליטת הכוח שנורו פחם. כמויות אלה היו ממוצעים מן האוניברסיטה של איווה תחנת כוח פליטות הנתונים שנאספו במרווחי זמן דקה על טווח של 10 h.
| גז רעיל | TWA | תקרה | סטלה | ניקוש איLH | ניקוש REL | תל אביב | למרכז הבריאות תיאור |
| ושות | 35 דפים לדקה | 200 דפים לדקה | - | 1,200 דפים לדקה | 35 דפים לדקה | 25 עמודים לדקה | חסר צבע, נטול ריח |
| אז2 | 2 עמודים לדקה | 100 דפים לדקה | 5 עמודים לדקה | 100 דפים לדקה | 2 עמודים לדקה | 2 עמודים לדקה | גז חסר צבע עם ריח מעצבן, מרגיז וחריף |
| מס '2 | 3 עמודים לדקה | 5 עמודים לדקה | 1 עמודים לדקה | 13 עמודים לדקה | 1 עמודים לדקה | 0.2 דפים לדקה | נוזל צהבהב-חום או גז חום-אדמדם (מעל 70 ° פ') עם ניחוח חריף |
שולחן 2: מגבלות החשיפה ותיאורים עבור גזים רעילים (ושות, SO2, לא2) בגז הארובות. האושה: ממוצע משוקלל הזמן (בדרך כלל 8 שעות), התקרה: הערך לא ניתן להגעה, סטל: מגבלת חשיפה לטווח קצר (טי-וו מעל 15 דקות), NIOSH IDLH: סכנה לחיים ובריאות, NIOSH REL: 15 דקות הגבלת חשיפה, ACGIH TLV: מגבלת חשיפה כרונית סבירה, אין
| מתחם | מ מ |
| ננו3 | 8.82 x 100 |
| מדחס4· 7h2O | 3.04 x 10-1 |
| מיכל שלמה | 4.28 x 10-1 |
| K2hpo4 | 4.31 x 10-1 |
| KH2פו4 | 1.29 x 100 |
| כיתה2· 2h2O | 1.70 x 10-1 |
| . לפניהרבהשעות | 3.07 x 10-2 |
| מדחס2· 4h2O | 7.28 x 10-3 |
| מיכלהג | 4.93 x 10-3 |
| כיתה4· 5h2O | 6.29 x 10-3 |
| Co (לא3)2· 6h2O | 1.68 x 10-3 |
| H3בו3 | 1.85 x 10-1 |
| אדטה | 1.71 x 10-1 |
| קו | 5.52 x 10-1 |
| מדחס4· 7h2O | 1.79 x 10-2 |
| H2SO4 (מרוכז) | 1 x 10-3 μl |
שולחן 3: הרכב של חנקן משולשת בינונית בסיס מודגש (3N-BBM). כמות החנקן כבר שולש מ בסיס הבסיס המקורי של Bold11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אצווה, מערכת הניסויים photobiic השחקנים עם pH מוסדר, טמפרטורה, קצב זרימת הגז, וריכוז הגז לקדם תוצאות משמעותיות על ידי סילוק זיהום על ידי שאינם זנים פריחת אצות המטרה והשונות בתנאי התרבות. מדויק טהור תרבות הצמיחה קינטיקה ניתן להשיג גם בנוכחות של גזים מאכל (CO2, כך2, לא2), אשר לשמש חומרים מזינים, הפיכת גזי הפסולת לתוך מוצר רב ערך כגון להאכיל בעלי חיים.
לפני תחילת כל ניסוי microalgal, יש לקחת את התרבות microalgal הנבחרת מאחסון ולקרוא לתרבות הנוזלית. הגדלת המיקרואצות לשלב אקספוננציאלי משפרת את ההסתברות שלניסויים יש תנאים ראשוניים שווי-ערך וכי המיקרואצות לא משצירים בשלב ההשהיה לאחר החיסון.
עקומות כיול הנוגעות לדחיסות אופטית וריכוזי ביומסה חשובים במיוחד במהלך מחקרים של פרודוקטיביות ביומסה. פרודוקטיביות ביומסה גבוהה microalgal היא אחת המטרות המרכזיות של תעשיית microalgal, וככזה, הוא לעתים קרובות אינדיקטור להצלחה מחקר12. לכן, חישובים מדויקים של ריכוזי ביומסה מתוך מדידות צפיפות אופטית חייב לנבוע מינים ספציפיים, מדויק, ומדויקים עקומת כיול נתונים. כדי למנוע הפרעות אופטיות פוטנציאליות, חשוב שהמדידות לעקומת הכיול ובמהלך הניסוי יהיו בפתרונות רקע שקולים. בנוסף, עקומת הכיול צריכה להתבצע באמצעות מדידות שנלקחו ממיקרואצות בשלב הצמיחה (s) הנציג של אלה שבניסויים. מינים מסוימים של microalgal יכולים להיות הבדלים דרמטיים בגודל התא במהלך שלבים הצמיחה שונים אשר יכול לשנות את הצפיפות האופטית וביומסה נתפס ריכוזי. יצוין כי הפרודוקטיביות ביומסה קשורה, אבל לא שווה ערך, שיעור הצמיחה. שיעור גדילה ספציפי תלוי במספר התאים (שינוי צפיפות התא לאורך זמן/צפיפות התא) הנוכחי, ופרודוקטיביות ביומסה ספציפי תלוי במסה בצובר של תאים (שינוי mg/L ביומסה לאורך זמן לכל mg/L ביומסה)13 ההווה.
כאשר ריכוזי ביומסה microalgal הם המודל עם עקומה לוגיסטית, תוצאות ניסיוני יכול להיות משמעותי בהשוואה באמצעות אינטרפולציה ריכוזי ביומסה מחשב באופן מדויק הפקות ביומסה. עם זאת, הטיפול צריך להילקח בעת פענוח תוצאות אלה ניסיוני; זה לא הולם להשוות את הפרודוקטיביות הכוללת ביומסה אצווה מקסימלית. בעוד ערכי הפרודוקטיביות המירבית של ביומסה שימושיים להשוואת תוצאות האצווה, הפרודוקטיביות הכוללת של ביומסה מטעה ללא מידע נוסף על משך הניסוי ועל שלבי הצמיחה microalgal. תעריפים אלה משתנים ברציפות במהלך ההשהיה, הצמיחה של יומן הרישום והשלבים הנייחים.
במהלך ניסויים עם גזים מאכל האופייניים לתחנת כוח או פליטת בעירה תעשייתית, יש לתרגל זהירות לאריכות ימים של בריאות האדם והציוד. חלקים סטנדרטיים יש להחליף עם חומרים חזקים יותר, מתכלים כגון אבובים צריך להיבדק להחליף לעתים קרובות יותר להתנגד קורוזיה, למנוע דליפות, ולהימנע חשיפה אנושית. אמצעי בטיחות נוספים ומודעות סיכון חיוניים לפעולה בטוחה ומוצלחת ודיגום. השיטה אינה מתאימה לגזים דליקים, משום שיש פוטנציאל להצטברות גזים בחלל הראש והציוד אינו מיועד לסיכונים כאלה וללא מתאים להסתגלות בטוחה לתנאים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי המענק למחקר בוגר קרן המדע הלאומי במסגרת מלגת מס ' 1546595. כל דעה, ממצאים, ומסקנות או המלצות המתבטאת בחומר זה הם אלה של המחברים ואינם משקפים בהכרח את השקפות הקרן הלאומית למדע. העבודה היתה נתמכת גם על ידי אוניברסיטת איווה בוגר מחקר הממשלה סטודנט מומחה המחקר, ואת אוניברסיטת איווה קרן, אלן ס. הנרי התרומה. המחקר נערך במעבדה לפיטוטכנולוגיה. המחברים רוצים להודות לצוות הכוח של אוניברסיטת איווה, במיוחד מארק מקסוול, מומחיות ותמיכה כספית לגזי הארובה המודומים. המחברים גם רוצה להכיר את אמילי מור על עזרתה עם דיגום וניתוח ואמילי גרין על עזרתה והשתתפות בסרטון הפרוטוקול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
- Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J.
- Cheah, W. Y., Pau Loke, S., Chang, J. -S., Ling, T., Juan, J. C. Biosequestration of atmospheric CO2 and flue gas-containing CO2 by microalgae. Bioresource Technology. 184, 190-201 (2014).
- Xu, L., Weathers, P. J., Xiong, X. -R., Liu, C. -Z. Microalgal bioreactors: Challenges and opportunities. Engineering in Life Sciences. 9 (3), 178-189 (2009).
- Tsang, Y. F. Photobioreactors: Advancements, Applications and Research. , Nova Science Publishers, Inc. Hauppauge, NY. (2017).
- Molitor, H. R., Moore, E. J., Schnoor, J. L. Maximum CO2 Utilization by Nutritious Microalgae. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (10), 9474-9479 (2019).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17 (1), 36 (2018).
- Benemann, J. R.
- AIHA. IH MOD. , Available from: https://aiha.org/public-resources/consumer-resources/topics-of-interest/ih-apps-tools (2019).
- Centers for Disease Control and Prevention, Immediately Dangerous To Life or Health (IDLH) Values. The National Institute for Occupational Safety and Health. , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/idlh/intridl4.html (2019).
- Nakanishi, K., Deuchi, K., Kuwano, K. Cryopreservation of four valuable strains of microalgae, including viability and characteristics during 15 of cryostorage. Journal of Applied Phycology. 24 (6), 1381-1385 (2012).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. , University of Texas. Austin, Texas. (1963).
- Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (1), 217-232 (2010).
- Wood, A. M., Everroad, R. C., Wingard, L. M. Measuring growth rates in microalgal cultures. Algal Culturing Techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. Burlington, MA. 270-272 (2005).
