Summary
ベンチスケール、軸栽培は、その後のプロセススケールアップの前に、マイクロアルガル特性評価と生産性の最適化を容易にします。光バイオリアクターは、信頼性の高い再現性のある微細藻類実験に必要な制御を提供し、自治体や産業の燃焼放出から腐食性ガス(CO2、SO2、NO2)で微細藻類を安全に栽培できるように適応することができます。
Abstract
光バイオリアクターは、光栄養微生物の実験のための照明栽培システムです。これらのシステムは温度、pHおよびガス組成および流量制御が付いた微細なアルガル栽培のための無菌環境を提供する。ベンチスケールでは、光バイオリアクターは、微小藻系の特性、生産性、および成長の最適化を研究する研究者に有利です。工業規模では、光バイオリアクターは製品の純度を維持し、生産効率を向上させることができます。このビデオでは、腐食性ガス入力の安全な使用を含む、マイクロアルガル栽培のためのベンチスケールの光バイオリアクターの調製と使用について説明し、関連するバイオマス測定とバイオマス生産性の計算について詳しく説明します。具体的には、マイクロアルガル培養貯蔵と接種のための調製、光バイオリアクターの組み立てと滅菌、バイオマス濃度測定、およびマイクロアルガルバイオマス生産性のロジスティックモデルを、速度で示しています。最大および全体的なバイオマス製品を含む計算。さらに、シミュレートされたまたは実際の廃棄物ガスの放出を使用して微細藻類を栽培する実験への関心が高まっているため、ビデオは腐食性ガスを扱うために必要な光バイオリアクター機器の適応をカバーし、安全なサンプリングについて議論します。このようなシナリオ。
Introduction
光バイオリアクターは、開放池では達成できないよりも純粋なマイクロアルガル製品の制御実験や栽培に役立ちます。ベンチスケールフォトバイオリアクターにおける微細藻類栽培は、プロセススケールアップに使用できる基礎知識の開発をサポートします。環境条件のわずかな変化は、微生物学的実験を著しく変化させ、結果1を混同する可能性がある。温度、pH、ガススパージング制御を備えた滅菌プロセスは、様々な条件下で微小藻特性と性能を研究する場合に有利です。さらに、入力ガス濃度、温度、混合によるせん断力、および中型pHの制御は、それ以外の方法で栽培が困難な多様な種をサポートすることができます。光バイオリアクターは、連続ガス供給とスパージングを備えたバッチプロセスとして、または連続ガス供給とスパージングプラス排水および排水排水栄養素入力を備えたケモスタットフロースルーシステムとして実行できます。ここでは、連続ガス供給とスパージングによるバッチ処理をデモンストレーションします。
光バイオリアクターの使用は、いくつかの微細藻類の栽培と生産上の課題に対処します。この分野は、一般に、他の微生物による汚染の懸念、効率的な基板利用(CO2緩和又は廃水処理の場合に特に重要である)2、pH制御、照明変動、及びバイオマス生産性3に苦しむ。光バイオリアクターは、研究者が密接に制御されたバッチシステムで広範囲の光栄養を研究することを可能にし、そこでは、成長の遅い種でさえ捕食者や競合する微生物4から保護されています。これらのバッチシステムは、供給されたガスと均衡する可能性が高い閉鎖システムであるため、CO2使用率とバイオマス生産性の向上にも優れています。光バイオリアクター技術はまた、pH制御を提供し、その欠如は、過去の研究で高いバイオマス生産性を妨げている5.ベンチスケールでは、光バイオリアクターが提供する制御レベルは研究者に有利です。より大きな産業規模では、光バイオリアクターは、商業的な生体製品の純度を維持し、栄養補助的、化粧品、食品、または飼料用途のための生産効率を向上させるために使用することができる 6.
微細藻類は、CO2をバイオマス炭素として迅速に固定できるため、CO2の生体術に大きな関心を寄せる。しかし、CO2のほとんどの人類起源源は、燃焼プロセス燃料源に応じて、他の腐食性および有毒ガスまたは汚染物質(NOx、SOx、CO、Hg)で汚染されています。持続可能なCO2隔離への関心の高まりは、石炭火力発電所などのCO2-リッチな排出量を処理する光バイオリアクター技術の開発を促している(表1)。残念ながら、研究およびスケールアッププロセス中に腐食性および有毒な汚染物質に人的および環境的暴露の固有のリスクがあります。そのため、腐食性ガスを用いたバイオリアクターの安全な組み立てと操作を記述することは必要であり、有益である。
この方法は、慎重に制御された実験条件下で微細藻類の成長のための2Lベンチスケールの光バイオリアクターを使用するためのものである。このプロトコルは、マイクロアルガル貯蔵、接種体調製、および光バイオリアクターのセットアップと滅菌を記述します。本作業では、基本的な運用にとどまって、マイクロアルガルバイオマスの測定やバイオマス生産性の計算、腐食性ガスによる微細藻類栽培装置の適応について説明します。以下に説明するプロトコルは、より大きな実験制御を行い、微小藻の増殖条件を最適化し、または光栄養性微生物の範囲を異性培養しようとする研究者に適しています。この方法は、可燃性ガスを生成または消費する微生物(例えばCH 4、H2など)の栽培に適した材料を記載していない。7.
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Protocol
1. 腐食性ガスを含む光バイオリアクターの安全な使用とサンプリング
注:この方法は、高可燃性ガスを生成または消費する微細藻類培養物の安全なサンプリングのための適切な手順を説明していません。
- 人間の健康へのリスクとして有毒ガスを管理します。
注:アイオワ大学の化学衛生計画に従って、著者らは大学火災安全コーディネーターおよび大学環境衛生安全産業衛生責任者と協力して、有毒ガスを扱うための安全プロトコルを開発しました。 - 使用中の各有毒ガスのセンサーを備えた有毒ガス監視システムを設置します。製造元の指示に従ってセンサーを調整します。バンプテスト(キャリブレーションガスでセンサーとアラーム機能をチェック)は、メーカーの指示に従って頻繁に。ガスモニターをヒュームフードのすぐ外側に配置します。
- 腐食性ガス実験を開始する前に、近くの人員にリスクと警報システムを通知してください。また、適切なローカル緊急対応者に通知します。使用中の有害ガスを指定する実験室の入り口に標識を掲示します。
- 有毒ガスが検出された場合は、近くの全ての職員に避難するよう指示する。研究室の監督者および緊急対応担当者に通知する。
メモ:停電時にガス規制タワーは、停電時にガスの流れを止めます。ただし、室内の暖房、換気、空調(HVAC)システムやヒュームフードが停電することなくダウンすると、有毒ガスが漏れてしまう。
- 有毒ガスが検出された場合は、近くの全ての職員に避難するよう指示する。研究室の監督者および緊急対応担当者に通知する。
- ヒュームフードが各ガスの米国産業衛生協会(AIHA)の数学的モデリングスプレッドシートIH MOD8を使用して失敗した場合、部屋内の有毒ガスの可能な蓄積濃度をモデル化します。
- HVACメンテナンス担当者またはHVAC技術者の建物から、部屋の供給/排気空気率Qをm 3分-1で取得します。実験室の体積V(Lx W x H)をm3で計算します。理想的なガス法則から適合した式1を使用して、mg min-1の各タイプの有毒ガスの汚染物質放出速度Gを計算します。
(1)
ここで、Pは1気圧(ppmガス/106ppm)で有毒ガスが加える圧力の割合であり、QガスはL分-1におけるガスの流量であり、Rは普遍的ガス定数(0.082057 L·atm·mol-1·K-1)、TはKの温度、MWはgモル-1におけるガスの分子量である。 - IH MOD スプレッドシートの「よく混合された部屋モデルの生成とモデルルームパージを停止するオプションを使用して」アルゴリズムの各ガス(ステップ 1.4.1 で計算)のV、Q、およびGの値を使用して、1440分(24時間)のシミュレーション期間における各ガスの累積ルームガス濃度を計算します。 これらの値を露出限界と比較する (表 2)9.
- HVACメンテナンス担当者またはHVAC技術者の建物から、部屋の供給/排気空気率Qをm 3分-1で取得します。実験室の体積V(Lx W x H)をm3で計算します。理想的なガス法則から適合した式1を使用して、mg min-1の各タイプの有毒ガスの汚染物質放出速度Gを計算します。
(1)2. ミクロアルガル接種の調製
- フォトバイオリアクターのために選択されたScenedesmusobliquusオオクタ、またはフォトバイオリアクターのために選択された他の微細藻類種を準備し、それを貯蔵から移すことによって、寒天培地上で凍結保存または培養するかにかかわらず、実験を開始する。
- 滅菌マイクロアルガル成長培地(トリプル窒素ボールドの基底媒体[3N-BBM]、表3)を、フォームストッパーでキャップした滅菌(150-250 mL)シェイクフラスコに加えます。
メモ:フラスコがスパージされない限り、シェイクフラスコの体積の5分の1のみが液体媒体によって占有されるべきです。 - 細胞を傾斜やシェイクフラスコに移すときに滅菌性を維持するために、バイオセーフティキャビネットを使用してください。寒天上の培養物の場合は、無菌ループを使用して、寒天プレートまたは傾斜からシェイクフラスコに微細藻類を移します。凍結保存された培養物の場合は、凍結保存試料を徐々に解凍し、選択したプロトコル10に従って凍結保護剤を洗い流し、その後、細胞をシェイクフラスコに添加する。
- 培養細胞を20−25°Cで16h:8h光:暗く、115−130rpmで振とう。
- 光学密度(OD)測定値(セクション5および6のように)を使用して、時間の経過に間に合う微細藻類の成長を追跡します。マイクロ藻類が指数成長期(2-4日)に達してから、細胞をフォトバイオリアクターに移すことを許可します。
注:実験の目標に応じて、細胞は培養培地(本研究)をすすり、バイオリアクターの接種前に複数の遠心分離工程で濃縮してもよい。
- 滅菌マイクロアルガル成長培地(トリプル窒素ボールドの基底媒体[3N-BBM]、表3)を、フォームストッパーでキャップした滅菌(150-250 mL)シェイクフラスコに加えます。
3. 光バイオリアクターのセットアップと運用
- 光バイオリアクター(図1)を使用して、温度、pH、攪拌速度、ガス流量、および入力溶液流量を制御します。
注:フォトバイオリアクターは、一般的に酸、ベース、消泡剤、および基板の最大4つの異なる入力溶液の流れを制御するために使用することができます。- 1 N NaOH と 1 N HCl のそれぞれ 100 mL を準備し、それぞれを 250 mL 入力溶液ボトルに追加します。これらのソリューションにはセカンダリ コンテインメントを使用します。
- ディップチューブと無菌インラインエアフィルター付きのベントチューブを装備したオートクレーブ可能なキャップボトルに従量制入力ソリューションを保存します。オートクレーブ可能なチューブを使用して、フォトバイオリアクターの4つの入力ポートにディップチューブを接続し、フォトバイオリアクターの操作中に、入力溶液にディップチューブを浸漬します。手動で選択した流量またはpHおよび発泡レベルプローブからのフィードバックによって制御することができる別々の蠕動ポンプを介して、入力溶液とそのポートの間に1.6mmの内部ディメーター(ID)オートクレーブ可能なチューブを渡します(酸の場合、ベース、および消泡ソリューション)。
- オートクレーブ処理の前に光バイオリアクターpHメーターをキャリブレーションします。
- pHプローブを接続線に取り付け、ねじれてロックすることで、pHプローブをフォトバイオリアクターコントロールタワーに接続します。pH 4 および pH 7 バッファーを使用して、pH メーターを校正します。pHメーター値を受け入れる前に、値が安定するまで待ちます。
- プローブを制御塔に接続する pH メーター・コードから pH プローブを取り外します。
- 表面は70%エタノールで殺菌するか、原子炉でプローブをオートクレーブします。オートクレーブするには、pHプローブをアルミホイルでしっかりとキャップします。
メモ:プローブをオートクレーブ処理すると、蒸気損傷によるプローブ内部の腐食の恐れがあります。このキャッピング方法は、損傷防止を完全に保証するものではありません。 - 培養培地に10mM 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を加えて、pHをより良く制御します。
- 光バイオリアクターのヘッドプレートの冷たい指と排気コンデンサーを挿入してねじで閉じます。
- 接種ポートを挿入し、しっかりとしっかりとねじ込みます。フォトバイオリアクターヘッドプレートの上の接種ポートのセクションにオートクレーブ可能なチューブの長さを追加します。バイオリアクターをオートクレーブ処理する前に、チューブをオートクレーブ可能ホースクランプで閉じてクランプします。
- 未使用の光バイオリアクターポートに滅菌フィルターでキャップされたチューブを取り付けます。
- オートクレーブ可能なチューブを介して光バイオリアクター入力ポートに酸およびベース入力溶液を取り付けます。培養培地を1.5L添加します。
- 作業量に応じて、121°Cで30−45分の原子炉および関連する入力ソリューションをオートクレーブします。
メモ:培養培地がオートクレーブ処理の影響を受ける場合は、層流フード内の滅菌条件下でオートクレーブ処理後に培地を追加します。プロトコルはここで一時停止できます。
注意:オートクレーブから取り外すと、原子炉は高温になります。 - インペラモーターをインペラシャフトに取り付け、継手を締めます。
- LEDライトパネルは、照明要件に従ってバイオリアクターの外側に対称的に配置します。
- オートクレーブ処理の前に、光度を測定し、光度計で記録します。光バイオリアクター容器内に照度センサーを配置し、光源に向かってセンサーを向きます。
- 最大2気筒を接続して、シミュレートされた石炭火力発電所の排出量(表1)をフォトバイオリアクターの微細藻類に供給します。
注:本研究で使用したガス濃度は、アイオワ大学の発電所のガス濃度を近似した。- ガスシリンダー、ガス調整塔、光バイオリアクタースパージングリング間の接続を組み立てます。20 psiの出口圧力が可能な適切なレギュレータをガスシリンダーに取り付けます。レギュレータ出口ホースバーブに6mm ID耐圧チューブを取り付け、ホースクランプで固定します。ホースバーブを使用して、圧力耐性チューブのもう一方の端を、ホースクランプで固定された6mmステムクイックコネクトフィッティングに使用して、ガス調整タワーガス入口に取り付けます。別の6mmクイックコネクトフィッティングを使用して、ガス調整タワーガスコンセントに3.2 mm IDチューブを接続し、出口チューブのもう一方の端をフォトバイオリアクターヘッドプレートのスパーリングリングポートに接続します。
メモ:2番目の入力ガスの場合は、ステップ3.9.1を繰り返しますが、T字型ホースバーブを使用して、2つの入力ガスラインをスパージングリングポートに接続されたチューブの単一のセクションに統合します。 - 各ガスレギュレータの出口圧力を20 psiに設定し、バイオリアクターインターフェースを使用して実験ガス流量を設定します。
注:1分あたりの液体の体積(vvm)あたりの標準条件下で空気の量を計算し、報告します。体積ガス流量を培養体積で割る。1 つの小さな単位でレポートします。
- ガスシリンダー、ガス調整塔、光バイオリアクタースパージングリング間の接続を組み立てます。20 psiの出口圧力が可能な適切なレギュレータをガスシリンダーに取り付けます。レギュレータ出口ホースバーブに6mm ID耐圧チューブを取り付け、ホースクランプで固定します。ホースバーブを使用して、圧力耐性チューブのもう一方の端を、ホースクランプで固定された6mmステムクイックコネクトフィッティングに使用して、ガス調整タワーガス入口に取り付けます。別の6mmクイックコネクトフィッティングを使用して、ガス調整タワーガスコンセントに3.2 mm IDチューブを接続し、出口チューブのもう一方の端をフォトバイオリアクターヘッドプレートのスパーリングリングポートに接続します。
- 複数のガスボンベでスパージングする場合は、CO2センサでフォトバイオリアクターに供給されたCO2濃度を確認してください。
- ソフトウェア(GasLabなど)互換CO2センサーをコンピュータのUSBポートに接続します。CO2センサーモデルに対応する最新のソフトウェアをダウンロードします。ソフトウェアを開き、センサーモデル、測定時間間隔、測定データロギングの期間を入力します。
- CO2センサーと複合ガスフローチューブ(チューブをバイオリアクターに接続する前)を100~250 mL、キャップ付き、通気容器(バイオリアクターの外部)に配置します。
注:実験中、ヘッドスペースCO2濃度は、光バイオリアクターヘッドプレート上のベントチューブの1つから測定され得る。 - ユーザーインターフェイスでCO2濃度測定を開始し、測定が平衡化するのを待ちます。
- 光バイオリアクターのユーザーインターフェイスを使用して、各タンクからのガス流量を、所望の総流量(0.1 L min-1)とCO2濃度(12%)まで調整します。が達成される。
- フォトバイオリアクターのユーザーインターフェイスで、STIRR 関数を使用してインペラ回転速度を設定します。混合速度が培養培地がスパグドガス気泡を同化するのに十分な速さであることを確認します。
注:特定の微細藻類種は、弱い細胞構造を有し、高いせん断力によって損傷または破裂されます。
4. 光バイオリアクターの適応と有毒ガス使用のための実験的セットアップ
注意:実際またはシミュレートされた煙道ガスの腐食性ガスは腐食性で有毒です。これらのガスは吸入すると重大なリスクを引き起こす。
注:この方法は、高可燃性ガス(メタン、水素など)を製造または消費する微生物の安全な栽培のための適切な材料を記載していません。
- 真鍮、プラスチック、標準チューブ部品を耐食性材料に交換してください。
- Noxまたは SO x と水の反応によって形成される強酸からの腐食に確実に抵抗するためにステンレス鋼を使用します。ガス規制タワーのガス入口とコンセントのプラスチッククイックコネクト継手をステンレススチール製のクイックコネクト継手に交換してください。真鍮ではなく、出口ホースバーブを含むガスシリンダーにはステンレス製のレギュレータを使用してください。
- ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)または天然酢酸エチルビニル(EVA)チューブを使用して、ガスシリンダーとガス調整塔とガス調節塔と光バイオリアクターとの間の接続上のNOXおよびSOxガス(それぞれ)からの腐食に抵抗します。
- オートクレーブ処理後、ウォークインヒュームフード内に光バイオリアクターとガスシリンダーを組み立てます。二次格納所内のテーブルの上にフォトバイオリアクターを置き、ガスシリンダーをフリースタンディングシリンダーカラーまたはシリンダーラックに置きます。
- 気流を開始した後、気泡タイプの液体漏れ検出器を使用して、気筒とバイオリアクター間のすべての接続でガス漏れをチェックします。1:100(v:v)のディッシュソープの希釈で満たされた洗浄ボトルを使用して、石鹸溶液の小さな流れとの接続をカバーします。
メモ:リークは、接続でバブリングすることによって示されます。 - ミクロ藻類実験を開始する場合は、スパージングを開始し、接種前にpHを調整します(標準的な光バイオリアクター実験のように)。
注:入力ガスは強酸性であるため、腐食性ガス実験中に培養培地を緩衝することを強くお勧めします。 - 調製したマイクロアルガル接種を滅菌注射器に吸引し、注射口を接種口に取り付けたチューブに注射器を取り付け、接種チューブクランプを開き、注射器を押し込むことで、フォトバイオリアクターを接種する。
- ガスモニター、ガスシリンダー圧力、光バイオリアクターを1日2回(およびサンプリング前)に確認して、有毒ガスのレベルが上昇したり、漏れを確認したりします。
- ヒュームフードサッシの開口部を、バイオリアクターとガスシリンダーレギュレータに到達できる幅に制限します。吸入暴露リスクを避けるため、開口部が胴体領域の上に人員をさらさないようにしてください。
- ガスシリンダーレギュレータを閉じた位置に回して、原子炉へのガスの流れを止めます。ヒュームフードサッシを閉じ、フードが光バイオリアクター培養物をサンプリングする前に腐食性ガスを避難させる5分間を許可します。
- ヘッドプレートポートを開き、無菌血清学的ピペットを使用するか、接種/サンプリングポートを介して注射器に培養を描画することにより、ヒュームフード内のサンプル。ガスシリンダーを開けて実験を再開する前に、光バイオリアクターポートを固定してください。
5. ミクロアルガルバイオマスの生産性の測定
- キャリブレーション曲線を使用して、乾燥ミクロアルガルバイオマス濃度に対するマイクロアルガル培養OD750測定を関連付けます。
- いくつかの(最小:4、最小作業容積:500 mL)を無菌マイクロアルガル培地でフラスコを調製し、目的の種(例えば、この研究ではS.obliquus)と接種する。
- 培養OD750の培養を指数関数的になるまで測定し、既知の質量の0.45μmフィルター膜で内容物の既知の体積(最低100mL)を濾過することにより、フラスコを速やかに犠牲にしてサンプリングします。覆われたアルミニウム重量ボートまたはガラス容器を使用して、バイオマスおよびフィルターを乾燥時に支える。
- 80~100°Cのオーブンで約18~24時間乾燥した後、バイオマスとフィルターを大量に処理します。完全な乾燥を確認するには、さらに2-3時間後にもう一度測定し、質量が安定したかどうかを確認します。
- 結合されたバイオマスからフィルター質量を引き出し、バイオマス質量を計算します。
- バイオマス濃度(バイオマスの質量を濾過培養量で割った量)に対して測定されたOD750として較正曲線をプロットし、そのデータを線形回帰で適合させます。
6. バイオマス生産性モデリングとレート計算
- 較正曲線線形回帰(セクション5で決定)を用いてOD750測定から実験バイオマス濃度を計算します。
- グラフおよび統計ソフトウェアにおけるロジスティック回帰(式2)を使用して、ラグから指数位相へのバッチミクロアルガル成長データを適合させる(材料表):
(2)
ここで、Lは曲線の最大バイオマス濃度値、kは指数位相の相対勾配(時間-1)、x oはシグモイダル曲線の中点の時間、xは時間です。- 上記のロジスティック方程式を手動で入力します。ソフトウェアの[解析]タブで、[非線形回帰で曲線をフィット]を選択します。[パラメータ: 非線形回帰]ボックスの左側で、[新規作成]ドロップダウン ボックスの下の[新しい方程式を作成]を選択します。デフォルトの明示的方程式を方程式タイプとして使用し、新しい関数に名前を付け、新しい関数を Y = L/(1+ exp(-k*(x-b))として定義します。
- 最終バイオマス濃度と初期バイオマス濃度の差を最終時間と初期時間の差で割って、ミクロアルガルバッチの全体的なバイオマス生産性を計算します。
- 式2(式3)の導関数からミクロアルガルバッチの最大バイオマス生産性を計算し、シグモイド中点で、x =x oの場合。
(3)
(2)
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Representative Results
指数相で収穫された緑色微細藻類S.obliquusの較正曲線を、OD750と乾燥バイオマス濃度で確立した(図2)。線形回帰の R2値は 0.9996 です。
冷蔵寒天板に保存された培養物から250mLエルレンマイヤーフラスコでS.オブリクース培養が始まりました。微細藻類を10 mM HEPESバッファで3N-BBMに接種し、1.5L作動量(0.07 vvm)の2Lフォトバイオリアクターに2.2%CO2を散らしました(図1)。バッチは OD750を介して追跡されました。バイオマス濃度を較正曲線から算出し、次いで物流曲線でモデル化した(図3)。このフォトバイオリアクターは、pH 6.8、100cm3分-1全ガス流量、連続280μmolm-2 s-1照明、および27°Cで培養を維持した。ロジスティック曲線は、ラグから指数位相、静止相までのバイオマス濃度データに適合します。ロジスティックモデルから、バッチ中の最大バイオマス濃度は2070±20mgL-1であり、最大バイオマス生産性は4.6日で発生し、特定バイオマス生産性の速度は1.0d-1であった。最大成長時の物流曲線の誘導体から算出した最大バイオマス生産性は、532±60mgL-1d-1であった。
ウェルミックスルームモデルは、24時間のヒュームフード故障の場合にNO2、SO2、COの累積濃度を算出するために使用した。これらの値を露出限界と比較した(表2)。例えば、400 ppm NO2の0.05 L min-1が24時間のヒュームフード故障期間中に放出されるシナリオでは、 計算されたG = 0.0377 mg min-1、Q= 0.0001 m3分-1、V= 100 m3、およびシミュレーションの最大時間 = 1440 分の混合ルーム モデルは、許容可能な慢性暴露限界 (米国産業衛生限界の米国会議) を超える 0.54 mg m-3 (0.29 ppm) に NO2の蓄積を予測します。ACGIH TLV])、および短期暴露限界(STEL)を下回る。
シミュレートされた煙道ガスを用いた有望な予備試験は、12%CO2および超ゼロ空気(510±40mgL-1 d-1)よりも大きな最大ミクロアルガルバイオマス生産性率(690±70mgL-1 d-1)を達成した(図4)。実験の前に、ガスモニターはCO、NO2、およびSO2で校正された。シミュレートされた煙道ガス実験は、人に危険を及したり、腐食性ガスによる機器に損傷を与えることなく行われました。
図1:赤と青のLEDライトで照らされたベンチトップフォトバイオリアクターフォトバイオリアクターは、1.5 Lの作動容積を有する2Lバッチ原子炉として作動する。光バイオリアクターは、ヘッドプレート内のポートを通して、スパーリングリングと余分なガス通気孔を介してガスを連続的に供給します。モリトールら5の許可を得て適応.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:OD750〜S.オブリクース細胞乾燥重量に関する較正曲線。S.obliquus細胞培養光吸収を750nmで測定し、次いで細胞を濾過し、乾燥させて、細胞乾燥重量測定値を得た。モリトールらの許可を得て転載5.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ロジスティック回帰でモデル化した2.2%CO2入力におけるS.obliquus成長データデータポイントは、光学密度測定から計算されたバイオマス値を表します。データは、最小二乗適合を通じてロジスティック回帰でモデル化されています。
ここで、L = 1955 mg L-1、k= 1.154 d-1、およびx0 = 3.317 d. R2 = 0.995。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:12%CO2でS.オブリクース成長をモデル化し、追加のシミュレートされた煙道ガス成分の有無に関する。微細藻類の各バッチからのバイオマス測定は、ロジスティック回帰でモデル化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | パーセント |
| H2O | 12.6% |
| CO2 | 11.6% |
| O2 | 5.8% |
| 共同 | 0.048% |
| SO2 | 0.045% |
| NO2 | 0.022% |
| N2 | 69.9% |
表1:石炭火力発電所排出量の組成これらの量は、10時間のスパンで分間隔で収集されたアイオワ大学の発電所の排出量データから平均化されました。
| 有毒ガス | Twa | 天井 | STEL | NIOSH IDLH | ニオシュ・レル | ACGIH TLV | CDC の説明 |
| 共同 | 35 ppm | 200 ppm | - | 1,200 ppm | 35 ppm | 25 ppm | 無色、無臭 |
| SO2 | 2 ppm | 100 ppm | 5 ppm | 100 ppm | 2 ppm | 2 ppm | 特徴的な無色ガス、刺激性、刺激性の臭気 |
| NO2 | 3 ppm | 5 ppm | 1 ppm | 13 ppm | 1 ppm | 0.2 ppm | 黄色褐色の液体または赤褐色のガス(70°F以上)に辛味、アクリル臭 |
表2:煙道ガス中の有毒ガス(CO、SO2、NO2)の暴露限界と説明OSHA TWA:時間加重平均(通常8時間期間)、天井:値に達することはありません、STEL:短期暴露限界(15分以上のTWA)、NIOSH IDLH:生命と健康への危険、NIOSH REL:15分暴露限界、ACGIH TLV:許容可能な慢性暴露限界、悪影響なし。
| 化合 物 | ミリメートル |
| ナノ3 | 8.82×100 |
| MgSO4・7H2O | 3.04×10-1 |
| 塩化 ナトリウム | 4.28×10-1 |
| K2HPO4 | 4.31×10-1 |
| KH2PO4 | 1.29×100 |
| CaCl2·2H2O | 1.70×10-1 |
| ズンソ4・7H2O | 3.07×10-2 |
| MnCl2・4H2O | 7.28×10-3 |
| MoO3 | 4.93×10-3 |
| CuSO4・5H2O | 6.29×10-3 |
| コ(NO3)2・6H2O | 1.68×10-3 |
| H3BO3 | 1.85×10-1 |
| Edta | 1.71×10-1 |
| 島 | 5.52×10-1 |
| フェソ4・7H2O | 1.79×10-2 |
| H2SO4 (濃縮) | 1 x 10-3°L |
表3:三窒素ボールドの基底媒体(3N-BBM)の組成窒素の量は、元のボールドの基底媒体11から3倍にされています。
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Discussion
調整されたpH、温度、ガス流量、ガス濃度を用いたバッチ、軸光バイオリアクター実験は、非標的藻類株による汚染や培養条件の変動を排除することにより、有意義な結果を促進します。栄養として機能する腐食性ガス(CO2、SO2、NO2)が存在する場合でも、正確な純粋培養成長動態を得ることができ、廃ガスを動物飼料などの貴重な製品に変えることができます。
微細藻類の実験を開始する前に、選択された微細藻類培養物を貯蔵から採取し、液体培養に再適合させる必要があります。微細藻類を指数位相に成長させることで、実験が同等の初期条件を持ち、接種後に微細藻類が遅れ相に停滞しない確率が向上します。
バイオマス生産性の研究では、光学密度とバイオマス濃度に関する較正曲線が特に重要です。高い微細藻類バイオマス生産性は、ミクロアルガル産業の主要な目標の一つであり、そのように、しばしば研究の成功の指標である12。したがって、光学密度測定によるバイオマス濃度の正確な計算は、種固有の正確で正確な較正曲線データに由来する必要があります。潜在的な光干渉を避けるためには、キャリブレーション曲線および実験中の測定を同等のバックグラウンドソリューションで行することが重要です。さらに、較正曲線は、実験の最も代表的な成長段階で微細藻類から採取された測定値で行われるべきである。特定の微細藻類種は、光学密度と知覚バイオマス濃度を変化させることができる異なる成長段階の間に細胞サイズに劇的な違いを持つことができます。なお、バイオマス生産性は、成長率と同等ではないが、それに相当する。具体的な増殖速度は、存在する細胞の数(時間/細胞密度に対する細胞密度の変化)に依存し、かつ特異的バイオマス生産性は、細胞の質量(mg/Lバイオマス当たりの経時変化)13に依存する。
微小藻類バイオマス濃度を物流曲線でモデル化すると、バイオマス濃度を補間し、バイオマスの生成物を正確に算出することで、実験結果を有意義に比較することができます。ただし、これらの実験結果を解釈する際には注意が必要です。全体的および最大のバッチバイオマスの生産性を比較することは不適切です。バイオマスの最大生産性値はバッチ結果を比較するのに役立ちますが、全体的なバイオマスの生産性は、実験期間と微小藻の成長段階に関する詳細な情報がなければ誤解を招きます。これらのレートは、ラグ、ログの増加、および静止フェーズの間に継続的に変化します。
発電所や産業燃焼の特徴である腐食性ガスの実験では、人の健康と設備の寿命の両方に注意を払う必要があります。標準部品をより堅牢な材料に交換する必要があり、チューブなどの消耗品は、腐食に抵抗し、漏れを防ぎ、人的暴露を避けるために、より頻繁に検査および交換する必要があります。安全で成功した運用とサンプリングには、特別な安全対策とリスク意識が不可欠です。ヘッドスペース内にガスが蓄積する可能性があり、装置はそのようなリスクのために設計されていないし、そのような条件への安全な適応のために適していないので、この方法は可燃性ガスには適していません。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この資料は、助成金第1546595条に基づく国立科学財団大学院研究フェローシップの支援を受けた作品に基づいています。この資料に記載されている意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。この研究は、アイオワ大学大学院・専門学生政府の研究助成金と、アイオワ大学財団のアレン・S・ヘンリー寄付によっても支援されました。W.M.ケック・フィトテクノロジーズ研究所で研究を行いました。著者らは、アイオワ大学の発電所スタッフ、特にマーク・マクスウェルが、シミュレートされた煙道ガスの専門知識と財政的支援に感謝したいと思います。著者はまた、サンプリングと分析に関する彼女の支援と、プロトコルビデオへの彼女の支援と参加のためのエミリー・グリーンを認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
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