Summary
ここでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物を発現する細胞株における活性化B細胞(NF-κB)の核因子カッパ軽鎖増強剤を迅速かつ容易に測定するプロトコルを提示し、細胞溶解物中の発光の測定を行う。さらに、遺伝子発現は、サルモネラ・チフィムリウムに感染した細胞から単離されたRT-qPCRを介して決定される。
Abstract
二量体転写因子NF-κBは、種々のサイトカインおよびケモカインの発現を誘導することによって炎症経路を含む多くの細胞応答経路を調節する。NF-κBは、B細胞阻害剤におけるカッパ光ポリペプチド遺伝子増強剤の阻害性タンパク質核因子によって細胞内で構成的に発現され、隔離される、α(IκBα)である。NF-κBの活性化は、IκBαの分解を必要とし、その後、NF-κB上で核局在化信号を露出させ、核へのその入稿を促進する。いったん核内に入ると、NF−κBはインターロイキン6(IL-6)およびIL-23などのNF−κB標的遺伝子のプロモーター領域に結合し、それらの発現を促進する。
NF-κBの活性化は、転写または翻訳とは独立して起こる。したがって、NF-κBの活性化状態は、核内で特異的にNF-κBを定量するか、またはNF-κB標的遺伝子の発現を定量することによって測定されなければならない。このプロトコルでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞は、in vitro組織培養技術を用いてNF−κB活性化のためにアッセイされる。これらの細胞はサルモネラ・チフィムリウムに感染してNF-κBを活性化し、核に入り込み、ルシフェラーゼのプロモーター領域のκB部位に結合し、その発現を誘導する。細胞はルシフェラーゼアッセイシステムでリゼし、分析される。細胞によって産生されるルシフェラーゼの量は、プレートリーダーによって検出される発光信号の強度と相関する。この手順によって生成される発光信号は、様々な条件下でNF-κB活性化を評価するための迅速かつ高感度な方法を提供します。このプロトコルはまた、遺伝子発現を示す相対mRNAレベルを検出するために定量的逆転写PCR(RT-qPCR)を利用する。
Introduction
タンパク質の核因子-κB(NF-κB)ファミリーは、様々な生物学的経路における遺伝子発現を調節する重要な転写活性化剤である。NF-κBの活性化は、標的遺伝子の転写を誘導し、その多くは免疫および炎症反応、細胞増殖、ストレス応答および癌進行に重要である。NF-κBは、病原体クリアランスのための早期炎症結果を媒取する上で不可欠な役割を果たす。NF-κB活性化によって媒介される多くの生物学的プロセスを考えると、そのシグナル伝達の中断は健康および病気に重大な影響を及ぼす可能性がある。NF-κBシグナル伝達における機能変異の喪失は、いくつかの免疫欠乏表現型に関連しているが、機能変異の獲得は、B細胞リンパ腫および乳癌3を含むいくつかのタイプの癌と関連している。さらに、多くの病原体は、毒性因子4、5、6、7の発現を介してNF−κBの活性化状態を直接調節することが示されている。
NF-κBの活性化は、リポ多糖(LPS)、フラグエリンおよびペプチドグリカン(PamPs)として知られている細菌産物を含む多くの可変刺激の結果であることが知られている。これらのPAMPは、NF-κBの活性化およびNF-κB依存性炎症遺伝子8の配列のその後の発現につながるトール様受容体(TR)およびノッド様受容体(NR)などのパターン認識受容体(PRR)によって検出される。PamPsによるPRR活性化に加えて、細菌エフェクタータンパク質などの他の細菌産物は、NF−κBの活性化を誘導し得る。興味深いことに、細菌はまた、NF−κB経路を積極的に減衰し、その病原性を増強するエフェクタータンパク質を発現し、免疫の必須メディエーターとしてNF-κBの重要性を強調する9。
NF-κBダイマーを形成する5つの異なるサブユニットがあります。p50, p52, RelA (p65), RelB および cRel.2つの主要なNF-κBヘテロダイマーはp50:RelAおよびp52:RelBダイマーである。活性化されたNF-κBダイマーは、κB部位として知られるDNA部位に、種々の標的遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域において結合する。正常な恒常性条件下では、NF-κBはIκBタンパク質として知られている阻害剤タンパク質のファミリーと相互作用し、不活性なままである。刺激の際、IκBはIκBキナーゼ(IKK)によってリン酸化され、ユビキチン化の標的となり、その後の分解を可能にする。IκBの分解は、核局在化信号を明らかにすることによりNF−κBを活性化する。NF-κBは次いで核に転移し、そこで標的遺伝子のプロモーター領域におけるκB部位を結合し、転写10を促進する。従って、NF-κBの活性化は、NF−κB標的遺伝子のmRNA発現をアップレギュレートし、そしてこの変化はRT-qPCR11などのRNA定量アッセイを通じて測定することができる。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、核転座、遺伝子レポーターアッセイなど、NF-κB活性化の測定には、いくつかの方法が存在し、一般的に使用されています。EMSAは、核酸を含むタンパク質複合体を検出するために使用されます。刺激された細胞は、転移したNF-κBを含む核タンパク質を単離するために分画され、その後、NF−κB結合ドメインを含む放射性標識ヌクレオチドでインキュベートされる。サンプルはゲル上で実行され、32P標識核酸の自己放射線撮影によって画像化される。NF-κBがタンパク質画分中に存在する場合、ヌクレオチドは結合し、これはゲルを通してゆっくりと移行し、離散バンドとして存在する。活性化NF-κBを欠く細胞の核分率(例えば、非刺激制御細胞)は、ヌクレオチドがゲルの末端まで速く移行するにつれてバンドを産生しない。この方法の主な欠点は、バイナリーセンス(すなわち、オンまたはオフ)で大部分が定量的であり、NF-κB結合容量の有意な差異を適切に捕捉しないことです。さらに、この方法は、NF−κB標的遺伝子12、13に対して機能的に重要なクロマチン構造を考慮しない。
前の方法と同様に、マルチウェルプレートがNF−κB結合配列を含むヌクレオチドで被覆される「非シフト」アッセイがある。タンパク質の核画分を有する細胞の治療に続いて、NF−κBはウェルに結合したヌクレオチドに結合する。次いで、抗NF-κB抗体が添加され、結合したNF-κBと相互作用し、NF-κBの量に比例した比色シグナルを生成し、NF−κB活性化の程度を示す。この方法は、放射線標識核酸を必要とせず定量的であるという問題でEMSAよりも有利であり、比較して。しかしながら、この方法の注意点は、再びNF−κB標的遺伝子14のクロマチン状態を区別しないことである。
NF-κB活性化が検出され得る別の方法は、クロマチン免疫沈降(ChIP)によるものであり、それによってDNAおよび相互作用タンパク質はホルムアルデヒドと架橋され、特異的な抗NF−κB抗体と免疫沈殿される。その後、特定のヌクレオチド断片を精製し、PCR増幅または直接高スループットシーケンシングを介して同定される。この方法から生成された結果は、標的遺伝子とのNF−κB結合活性の半定量的結果を提供する。しかしながら、結果は各ステップ15における固定条件および精製プロセスに大きく依存する。
核転座アッセイでは、細胞が刺激されNF-κB活性化を誘導し、次いで固定される。抗p65抗体は固定細胞に添加される。あるいは、p65サブユニット自体は、緑色蛍光緑色(GFP)などの蛍光ペプチドでタグ付けすることができる。いずれの場合も、免疫蛍光は、p65の局在化のイメージングを可能にし、細胞分布を決定する。細胞質および核局在タンパク質の割合を測定することにより、研究者はNF−κBの相対的活性化状態を決定することができる。この方法の欠点は、免疫蛍光が比較的時間がかかり、高価な抗体を必要とし、比較的大きな技術的専門知識を必要とすることである。
レポーター遺伝子は、目的の遺伝子の調節パターンおよび発現パターンを研究するために一般的に使用されるツールです。典型的には、レポーター遺伝子は、容易に検出可能なタンパク質をコードする遺伝子に融合された目的遺伝子のプロモーター配列から構築される。酵素活性、蛍光、または発光特性を有するタンパク質は、一般的にアッセイおよび定量化する能力のために選択される。したがって、読み出し(例えば、発光、蛍光)は、遺伝子発現の検出のためのシグナルとして機能する。これらのレポーター構築物は、上皮細胞またはマクロファージなどの異なる細胞型に導入することができる。
プロトコルに記載されているのは、免疫グロブリンκ鎖プロモーター領域17のκBコンセンサスの3つのコピーを含むルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトされたクローンHeLa細胞株(HeLa 57A)の使用である。ルシフェラーゼの発現は、細胞刺激の後に生じるNF-κBの活性化に依存する。刺激された細胞は、ルシフェラーゼアッセイキットに設けられた細胞リシス緩衝液を用いて容易にリンパがされる。次いで、細胞リサートの一部をルシフェリンを含むルシフェラーゼアッセイバッファーと混合する。ルシフェリンはルシフェラーゼの基質であり、ルシフェラーゼの存在下で光を生成するために必要とされる。アッセイバッファーと溶解物を組み合わせた後、溶液は発光と呼ばれるプロセスで光を放出する。生成される光の量は、ルーメンで与えられ、溶解物中に存在するルシフェラーゼの量に比例し、NF−κB活性化の尺度として機能する。ルーメンの読み取り値は、ベースラインNF-κB活性を考慮して非刺激標準と比較して解釈され、信号自体は信頼性の高い測定を可能にするために数分間安定しています。さらに、HeLa 57A細胞株は、NF-κB非依存型βガラクトシダーゼレポーターで安定にトランスフェクトされる。β-ガラクトシダーゼレポーターは構成的に発現され、β-ガラクトシダーゼ活性は、細胞生存率または細胞数17の変動を制御するために測定することができる。ルシフェラーゼ値は、β-ガラクトシダーゼ値に調整し、刺激されない対照細胞のフォールド増加として報告することができる。
NF-κBはNF-κB依存性標的遺伝子の発現増加を担う転写因子であるため、NF-κB依存性増加遺伝子発現を制御するフォローアップ実験は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)。RT-qPCRは、遺伝子発現の変化を数桁にわたって定量することができる高感度な方法です。刺激および対照細胞は、フェノールクロロホルム抽出を介してRNAのために収穫される。相分離の後、RNAは水層の主要成分として抽出される。その後、RNAを沈殿させて洗浄し、純粋なペレットを作製する。このペレットは、DNase処理を介して再構成され、さらに汚染物質DNAを洗浄します。次に、純粋な RNA を逆転写して相補的な DNA (cDNA) を作成します。このcDNAは、特定のmRNA配列の豊富さを定量化して遺伝子発現を決定する定量的PCR技術を通じて分析することができる。この技術は、翻訳制御、翻訳後修飾、タンパク質の存在量、またはタンパク質活性を解明しません。しかしながら、多くの遺伝子、特に炎症前プロセスに関与する遺伝子は、NF-κBを介して調節され、そのmRNAの存在量は、その発現を示す。
ここで提案される方法は、NF-κB活性化が細胞溶解物の発光アッセイを介して検出され得る迅速かつ簡単な方法を利用する。NF-κB標的遺伝子発現のRT-qPCRは、特定の遺伝子の発現を定量化し、NF−κB活性化の機能活性を検証するために使用することができる。このようなシステムの主な利点は、NF-κB活性化を調節する条件の範囲の高スループットスクリーニングを可能にする、そのシンプルさと速度です。このプロトコルは、NF−κB::ルシフェラーゼレポーターを発現する他の細胞株に適しており、かつ安定にトランスフェクトされたRAW264.7細胞18において実証されている。細胞溶解から発光信号の生成まで、サンプルの処理に要する時間は最小限で、約1時間のスパンを要します。NF-κBの測定には、不透明プレートなどの基本的な実験装置、発光を測定できるプレートリーダー、スプレッドシートプログラムなどの単純なデータ解析ソフトウェアのみが必要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞パッシングとシード
- 5%CO2インキュベーターで37°Cで5%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を補充したダルベッコの修飾イーグルの媒体(DMEM)の10 mLを含む75cm2フラスコでHeLa 57A細胞を維持します。
- 吸引細胞培養媒体を1mLのトリプシンEDTA溶液で洗浄した。吸引トリプシンを追加の1 mLで交換します。37°Cのインキュベーターに4~5分間入れ、細胞がフラスコから剥離できるようにします。
- 9 mLの細胞培養液を加え、フラスコの底部を数回軽く洗い流して細胞を剥離し、均質な懸濁液を形成する。
- 新鮮な媒体で1:6または1:8細胞を希釈し、新しいフラスコに種子。通路細胞は、90%のコンフルエントまたは3日ごとに、少なくとも25%のコンフルエントで細胞を維持する場合。
- 細胞刺激の1日前に、HeLa 57A細胞をトリプシン化し、成長媒性の10mLで中断する。ヘモサイトメーターを使用して懸濁液中の細胞をカウントし、成長媒体を使用して、細胞を50 mL円錐管内の2.5 x 105細胞/mLの最終濃度に希釈します。
- 250 μLの細胞懸濁液(〜6.25 x 104細胞)を48ウェルプレートの各ウェルに移します。定期的にキャップし、同種の細胞懸濁液を確保するために円錐管をめくります。プレートを側面にそっとタップして、細胞が井戸内で均一に分布していることを確認します。
- プレートを5%CO2インキュベーターで37°Cに移し、細胞が一晩付着して成長できるようにします。
2. 細菌の調製
- 感染の2日前に、サルモネラ菌の凍結ストックをLB寒天プレートに付け、単一のコロニーを作り出した。プレートを37°Cに設定したインキュベーターに移し、一晩の成長を可能にします。
- 感染の1日前に、3mLのリソジェニースープ(LB)を滅菌細菌培養管に加えて、適切な抗生物質をメディアに加える。
- 無菌接種ループを使用して、ストリーク細菌培養物から単一のコロニーを選択し、LBメディアにループに触れます。接種後にチューブをキャップし、ループを破棄します。
- 37°、180rpmに設定された揺れのインキュベーターにチューブを置き、一晩成長させます。
- 感染当日に、インキュベーターから一晩細菌培養物を取り出す。
- 必要に応じて抗生物質を含む新鮮なLBを3mL加えてサブカルチャー用チューブを準備します。
- 一晩の細菌培養物の30μL(100希釈の1)を、新たに調製した媒体に移す。37°Cに設定した揺れのインキュベーターにチューブを3時間置きます。
- 3時間インキュベーション後、1mLの滅菌LBスープをプラスチックキュベットに移し、ブランクとして機能します。サンプル分析に使用する他のキュベットに900 μLのLBを転送します。
- 100μLの細菌サブカルチャーを、900°LのLBとピペットを含むキュベットに移し、数回混合します。細菌の懸濁液ごとにこれを繰り返します。
- 分光光光度計をオンにして、600 nm(OD600)の波長で細菌培養物の光学密度(OD)を測定します。
- 分光光度計にブランクを置きます。このようなことを示す上部にマークがあるはずなので、向きに注意してください。
- 蓋を閉じ、分光光度計の空白ボタンを押して背景吸光度を得ます。
- 空白のキュベットを同じ方向のサンプルキュベットに置き換え、Readキーを押します。
- これらのサンプルの OD600値を記録します。希釈係数を考慮して、値に 10 を掛けます。
- 細菌サブカルチャーを新鮮なLBで希釈し、約1.0の吸光度値を達成し、これはおよそ1 x 109 cfu/mLに相当します。この懸濁液1:10をキュベットで希釈し、吸光度を測定します( ~0.1の値を指定する必要があります)。
- 新しいチューブに、希釈されたサブカルチャーの適切な量を新鮮なLBに加えて、1 x 108 cfu/mLのサスペンションを達成し、接種体として使用します。
- 約102cfu/mLの最終希釈が行われるまで、450μLの滅菌PBS(10倍希釈)を含むチューブに50μLの細菌懸濁液を移すことによって、接種液のシリアル希釈を準備します。
- 2つの最も低い希釈液の100μL(それぞれ10および100コロニー形成単位に対応する102および103)をLB寒天プレートに移し、細胞拡散機で懸濁液を広げ、単一コロニーを得た。これらのプレートを37°Cのインキュベーターに移し、一晩インキュベートします。
- 翌日はコロニーを数え、最初の接種の細菌濃度を計算して実際の接種濃度を決定する。
3. 細胞の感染
注: この時点で、セルは約 90% のコンフルエンシーである必要があります。48ウェルプレート中のHeLa 57A細胞の場合、これはウェル当たり約1 x 105細胞です。細胞は10の感染(MOI)の多重度、または106 cfu/wellに感染します。
- 各井戸に使用される感染状態に応じてプレートのふたにラベルを付け、各状態を三重にします。
- 適切な井戸に10°Lの接種を加えます。感染していないコントロールウェルに滅菌LBを10°L加えます。
- 感染時刻を同期するには、プレートを卓上遠心分離機に置き、5分間500 x gで回転させ、プレートのバランスが取れていることを確認します。
- 感染した細胞を37°Cで5%CO2インキュベーターに1時間転写する。
- 次のステップで使用するために、37°水浴に細胞培養媒体のアリコートを置きます。
- 感染から1時間後に、水浴から細胞培養媒体を取り出し、70%エタノールで外装を拭きます。組織培養プレートをバイオセーフティキャビネットに移す。
- 無菌技術を使用して、井戸から媒体を吸引し、新鮮で温かい細胞培養媒体の250 μLに置き換えます。
- プレートを37°Cで5%CO2インキュベーターに戻し、さらに4時間を加算します。
- CO2インキュベーターからプレートを取り出し、井戸から媒体を吸引します。ルシフェラーゼ分析については、ステップ4.1に進みます。RNA 分離については、ステップ 5.1 に進みます。
4. ルシフェラーゼ分析
- 井戸に1x細胞リシスバッファーの100 μLを追加します。バッファーは、試薬に応じて、最初に作動濃度に希釈する必要があります。
- プレートを-80°Cの冷凍庫に移し、少なくとも30分間インキュベートして、効率的な細胞リシスを確保します。
- 凍結セルリサートを含むプレートをベンチに置き、製造業者の推奨事項に従ってルシフェラーゼ基質試薬を解凍し、調製します。
- ルシフェラーゼ基板試薬が室温に平衡化できるようにします。
- プレートリーダーの電源を入れ、対応するリーダープログラムを開きます。発光を測定するように機械を設定します。
- 各サンプルの10°Lを不透明な96ウェルプレートのウェルに移します。
- 不透明プレートの各ウェルにマルチチャネルピペットを使用して、ルシフェラーゼアッセイ試薬の50°Lを追加します。
- 側面のプレートを軽くタップして井戸を混ぜ、底面が液体で覆われていることを確認します。プレートリーダーにプレートを入れ、読み取りを開始します。
- 発光値をスプレッドシート プログラムにコピーし、結果をプロットします。
5. RNAアイソレーション
- 各ウェルに500μLのグアニジウムチオシアン酸塩を加え、ピペットを数回上下に加え、完全なリシスを確保します。
- 内容物を標識されたマイクロ遠心管に移します。RNA品質を維持するために、可能な限り氷上のサンプルを維持します。
- 卓上遠心分離機を4°Cに設定し、この温度で遠心分離機を維持し、プロトコルの残りの部分を維持します。
- 各サンプルチューブに100μLのクロロホルムを加え、しっかりとキャップし、室温で15sのインキュベートを10分間振ります。
- 遠心分離機は12,000 x gで4°Cで15分間。この間、新しいチューブを標識してRNA精製の次のステップに備えます。
- イソプロパノールの250°Lを含む新しいチューブに上部水相を移し、中層または下層を乱さないように注意してください。
- 未使用の製品は-80°Cの冷凍庫に保管し、タンパク質分析にも使用できます。残留水層は、RNAが後で必要になる場合にバックアップとしても機能する。
- 水層とイソプロパノールの混合物をボルテックスし、サンプルが10分間室温で座ることを可能にする。
- 4 °Cで10分間、12,000 x gでサンプルを遠心分離します。
- 遠心分離機からチューブを取り外します。RNA沈殿物は、チューブの側面および底部に白いペレットを形成する。チューブを開き、廃棄物容器に注ぎ出して慎重に上清を取り除きます。
- 75%エタノールと渦の500°Lを加えてRNAペレットを洗浄します。
- 遠心分離機は8,000 x gで、4°Cで5分間。
- 注ぎ出して上清を取り除き、75%エタノールでペレットを再び洗います。
- 遠心分離機は8,000 x gで、4°Cで5分間。
- 小容量ピペット(例えば、10〜200°L容積)を使用して、可能な限り多くの上清を吸引し、液体をチューブに押し戻したり、ピペット先端でペレットを外さないように注意する。ペレットが外れた場合は、遠心分離機を短時間、そして再び上清を取り除こうとします。
- RNAペレットを空気乾燥します。サンプルに対してペレットが見える場合は、定期的に(5分ごとに)白からクリアに変化するかどうかを確認し、乾燥していることを示します。ペレットが透明に変わり始めたら、20μLの超純度、RNaseフリーウォーターを加えてRNAを溶解します。
- ペレットがサンプルに対して最初に見えなかった場合は、上清を除去してから5分間超純水を加えるだけです。
- 溶解度を高めるには、ピペットチップを通して溶液を数回渡し、55〜60°Cで10分間インキュベートします。
6. RNAのDNase処理
- RNA の完全性を維持するには、特に記載がない限り、RNA サンプルを氷上に保存します。このとき、10x DNaseバッファーを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍することができます。
- すべてのサンプル分析サーフェスをリントフリークロスで洗浄して、サンプル分析用の分光光度計を準備します。
- 分析の前にバックグラウンド測定を行います。これを行うには、RNAペレットを溶解するために使用される同じ超純水の1.5°Lでセンサーをロードします。[空白の読み取り] ボタンを押して、バックグラウンドの読み取り値を生成します。
- リントフリークロスを使用して、計測器のサンプルローディングサーフェスを拭きます。各サンプルの読み取りの後にこの手順を繰り返します。
- 再懸濁RNAの1.5°Lをサンプルホルダーにロードし、[サンプルの読み取り]を選択します。すべてのサンプルが読み取られるまで繰り返します。
- 1.5 mLマイクロ遠心管に、10x DNaseバッファーの2.4 μLと1μLのDNaseを1サンプルに組み合わせてDNaseマスターミックスを準備します。2 つの余分なボリュームのマスター ミックスを準備します。
- チューブを数回フリックしてマスターミックスを混ぜます。チューブの底部の内容物を収集するために、チューブを短時間遠心分離します。3.4 μLのマスターミックスを20°LのRNAサンプルに加えます。前と同様に、フリックと遠心分離機で内容を混ぜ合わせます。
- サンプルを37°Cに設定したヒートブロックに20分間移し、DNase不活性化試薬を冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。
- ヒートブロックにサンプルを配置した後、20分、作業台に置かれたチューブラックにサンプルを移します。
- DNase不活性化試薬の内容物を穏やかにボルテックスする。2.6 μLのDNase不活性化試薬をRNAを含むチューブに移し、チューブをフリックして均質な混合物を作成します。
- 1分間12,000 x gでサンプルを遠心分離します。
- 慎重に新しいラベル付きチューブに上清をピペット。
7. mRNAからcDNAへの逆転写
- ピペットによる損失を考慮して、サンプルの量に加えて2つの余分なサンプルに応じてマスターミックスを準備します(表1)。1μgのRNAを使用し、合計50°Lの体積にH2Oを加えます。
| 試薬 | 体積(°L) | 最終濃度 |
| MgCl2 (25mM) | 3.5 | 1.75 mM |
| 逆転写バッファー (10x) | 5 | 1x |
| dNTP ミックス(それぞれ 10 μM) | 2.5 | 500 nm |
| ランダムヘキサマー(100μM) | 1.25 | 2.5 μM |
| マルチクライブ逆転写酵素 (50 U/μL) | 1 | 1 U/μL |
| RNase阻害剤(20 U/μL) | 1.25 | 1.25 U/μL |
| RNA (1 μg) | 20 ng/uL | |
| H2O | トップ最大50 |
表 1: 逆転写マスターミックスのコンポーネントとレシピ
- サンプルをしっかりとキャップし、蓋のラベルが後でサーモサイカーの加熱された蓋から取り外され得るとして、側面のPCRチューブにラベルを付けます。渦で混ぜる。
- PCRチューブを短時間遠心分離し、チューブの底部にサンプルを収集します。
- PCRチューブをサーモサイカーに入れ、次の設定でサンプルを実行します。
25 °C 10分、48 °C 30 分、95 °C 5 分、10 °C で保持します。 - 新たに合成したcDNAを含むチューブを-20°Cの冷凍庫に移すか、qPCR分析ですぐに使用してください。
8. RT-qPCR解析用プレートの準備とローディング
- 開始する前に、サンプル分析用の 384 ウェル qPCR プレートのセットアップを計画します。
- 氷の上にプライマーとcDNAを解凍します。
- マスター ミックスを準備し (表 2を参照)、さらに約 10% 余分にして、ピペットによる損失を考慮します。
| 試薬 | 体積(°L) |
| 10 μM F プライマー | 1 |
| 10 μM R プライマー | 1 |
| ウルトラピュア H2O | 4 |
| 2x SYBR グリーン | 10 |
表 2: qPCR マスターミックスのコンポーネントとレシピ
- マスターミックスをボルテックスは、リピーターピペットを使用して384ウェルプレートのウェルに8°Lを分配します。サンプルは、プライマーとcDNAサンプルの組み合わせごとに重複して分析されます。
- P10(またはそれ以下)ピペットを使用して、分析するプライマーセットごとにウェルを複製するためにcDNAの2 μLを転送します。クロス汚染を避けるために、各ウェルの後にチップを交換してください。
- 表面に粘着フィルムを慎重に塗布してプレートを密封し、すべての井戸が覆われていることを確認します。シールパドルまたはローラーを使用してフィルムを押し、しっかりと密封します。
- プレートを対心分離機に置き、空のプレートをカウンターバランスとして配置します。プレートを500 x gで5分間遠心分離します。
9. qPCR解析用サーモサイカーの実行
- コンピュータとリアルタイムPCR機器の電源を入れ子にします。
- RT-qPCR ソフトウェアを開き、[新しい実験の選択] を選択します。
- [設定] タブで、[実験のプロパティ]を選択します。
- [実験名]を定義して、結果の格納に使用するファイル名と設定を設定します。
- [計測器の選択] で、解析を実行する現在接続されている計測器を選択します。比較 CT (ΔΔCt)実行方法を選択します。
- 使用する蛍光DNA色素としてSYBRグリーン試薬を選択し、ランプ速度として標準を選択します。
- [メルト カーブを含める]の横にあるチェックボックスがオンになっていることを確認します。
- [定義]タブで、ターゲット(すなわち、増幅される遺伝子)とサンプル(すなわち、実験条件)を割り当てます。
- [割り当て]タブを選択します。
- [実行方法] を選択します。に示す分析のパラメータを使用します (表 3)。
| ホールドステージ | PCR ステージ | メルトカーブステージ | |||||
| ステップ 1 | ステップ 2 | ステップ 1 | ステップ 2 | ステップ 1 | ステップ 2 | ステップ 3 | |
| 温度 | 50 °C | 95 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C |
| 時間 | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| データ収集 | はい | はい | |||||
| サイクル数 | 1x | 40× | 1x | ||||
表3:サーモサイカーのサイクルパラメータ
- サーモサイカーに384ウェルプレートを入れ、解析を開始します。
10. デルタCt法によるqPCR結果の分析(2-ΔΔCt)
- qPCR 反応から生成された結果を分析して、下流分析を妨げる可能性のあるエラーがないかどうかを確認します。多くのエラーは、システムによって自動的にフラグが付けられます。
- 適切に構築されたプライマーの場合、メルトカーブはピークを1つだけ持つ必要があります。複数のピークを持つ溶融曲線を含むウェルを、さらなる解析から除外します。
- Ct 値をスプレッドシート プログラムにエクスポートし、ΔΔCt メソッドを使用してデータを分析します。推奨される形式が提供されています (表 4)。最後の列は、コントロール サンプルに対するサンプルの折りたたみ式の変更です。
| ハウスキーピング遺伝子 (GAPDH) | 関心のある遺伝子 (IL6) | ||||||||||
| Ct1 | Ct2 | アヴェ・Ct | Ct1 | Ct2 | アヴェ・Ct | ΔCt | Ave ΔCt Ctrls | ΔΔCt | 2^-(ΔΔCt) | ジオム | |
| コントロール 1 | 15.33 | 15.37 | 15.35 | 26.81 | 26.91 | 26.86 | 11.51 | 10.51 | 1.00 | 0.50 | 1.00 |
| コントロール 2 | 16.83 | 16.77 | 16.80 | 26.89 | 26.92 | 26.91 | 10.11 | 10.51 | -0.41 | 1.33 | |
| コントロール 3 | 17.56 | 17.53 | 17.54 | 27.38 | 27.56 | 27.47 | 9.93 | 10.51 | -0.59 | 1.50 | |
| Sl1344 1 | 15.50 | 15.41 | 15.45 | 22.15 | 22.13 | 22.14 | 6.69 | 10.51 | -3.83 | 14.21 | 13.23 |
| SL1344 2 | 16.02 | 15.98 | 16.00 | 23.01 | 22.96 | 22.98 | 6.98 | 10.51 | -3.53 | 11.57 | |
| SL1344 3 | 17.27 | 17.30 | 17.28 | 23.99 | 23.98 | 23.98 | 6.70 | 10.51 | -3.82 | 14.09 | |
| sipA ソップB ソプ2 1 | 15.38 | 15.41 | 15.39 | 23.31 | 23.09 | 23.20 | 7.80 | 10.51 | -2.71 | 6.56 | 7.29 |
| sipA ソップB ソプ2 2 | 16.01 | 16.05 | 16.03 | 23.89 | 23.92 | 23.91 | 7.88 | 10.51 | -2.64 | 6.23 | |
| sipA ソップB ソプ2 3 | 16.78 | 16.78 | 16.78 | 24.02 | 24.06 | 24.04 | 7.27 | 10.51 | -3.25 | 9.49 | |
| sipA sopB sopE2 ソプ1 | 15.52 | 15.60 | 15.56 | 27.04 | 27.03 | 27.03 | 11.47 | 10.51 | 0.96 | 0.51 | 0.79 |
| sipA sopB sopE2 ソプ2 | 15.56 | 15.59 | 15.57 | 26.37 | 26.42 | 26.39 | 10.82 | 10.51 | 0.31 | 0.81 | |
| sipA ソップB ソプ2 ソプ3 | 15.91 | 15.92 | 15.91 | 26.24 | 26.12 | 26.18 | 10.27 | 10.51 | -0.25 | 1.19 | |
表 4: qPCR データを分析するための形式。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで説明するアッセイは、HeLa細胞のラインに安定にトランスフェクトされるNF-κB依存性ルシフェラーゼレポーターを用いた転写因子NF-κBの活性化に焦点を当てている。活性化されたNF-κBは、炎症性サイトカインIL6およびIL23を含む標的遺伝子のκB結合部位に結合する核に転移する。NF-κB 活性化の概要を図 1に示します。この研究では、NF-κBの活性化剤として、IL6の後方発現として、グラム陰性サルモネラ菌性セロバル・チピムリウムを用いた(図2)。病因に必要な主な毒性因子の1つは、Sを可能にするタイプIII分泌システム-1(T3SS-1)です。細胞に感染し、NF-κB活性化を誘導するチフィム尿。T3SS-1の機能は、細菌タンパク質、エフェクターと呼ばれ、宿主細胞に送り込むことです。ここでエフェクタータンパク質は、宿主上皮細胞の浸潤を媒介する多数の細胞シグナル伝達経路を標的とする。Sによって誘導されるNF-κB活性化。チフィム尿は、主にT3SS-1エフェクタータンパク質SopE、SipA、SopBおよびSopE218に依存している。ここで、HeLa57A細胞は野生型Sに感染した。チフィムリウム株SL1344および3つ(SipA、SopB、SopE2)または4つ(SipA、SopB、SopE2、SopE)エフェクタータンパク質のいずれかを欠く2つの変異株。図2は、Sに感染したHeLa57A細胞におけるNF−κB依存性ルシフェラーゼ活性化(図2A)およびIL6遺伝子発現(図2B)の代表的な実験である。チフィム尿株。野生型SL1344株による感染は、SipA、SopB、SopE2トリプル変異体(SopE依存性応答)に感染した細胞で減少し、SipA、SopB、SopE2、SopE四重変異体による制御レベルに減少する強いルシフェラーゼシグナルを誘導する。相対発光単位 (RLU) はIL6発現レベルと相関しています (図 2)。図3は、RT-qPCR分析から生成された結果を示す。
図1:NF-κB活性化と下流読み出しの概略上述した、NF−κBは、阻害性タンパク質IκBαによって不活性状態の細胞質に保持される。内部刺激と外部刺激の両方がIκBαをリン酸化し、その後のプロテオソーム分解を引き起こすIKKの活性化に寄与することができる。IκBαの分解は、転座を促進するNF-κBの核局在化シグナルを明らかにする。核内では、活性化されたNF−κBは標的遺伝子のκB結合部位に結合し、それらの転写および発現を促進する。サイトカインIL6およびIL23などの標的遺伝子は、RT-qPCRを介して発現および定量される。HeLa 57A細胞ではルシフェラーゼがNF-κB活性化後に発現され、発光アッセイを介して定量することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Sに続く発光アッセイおよびRT-qPCR分析の代表データ。HeLa 57A細胞のチフィム尿感染症。1 x 105 HeLa 57A細胞は、対数相Sの106cfu(MOI=10)に感染した。 チフィムリアム野生型SL1344、またはSipA、SopBおよびSopE2を欠く変異株、およびSipA、SopB、SopE2およびSopEを欠く。1時間後、メディアを交換し、さらに4時間インキュベーションを続けた。(A)細胞を発光アッセイを介してルシフェラーゼの発現のために処理した。(B)細胞をRNAを抽出し、RT-qPCR分析に用いた。デルタデルタCt法(2-ΔΔCt)を用いた標的遺伝子の相対発現が示されている。三重井戸の平均と標準偏差が表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: RT-qPCR 分析から生成された要約結果(A)Sに感染したHeLa 57A細胞からGAPDHを増幅するウェルに対する増幅プロットが示されている。ティフィム尿。(B)GAPDHプライマーを含むウェルの溶融曲線プロットは、約84°Cに対応する単一の溶融ピークを示す。(C) IL-6のプライマーを含むウェルを複製する。井戸の 1 つは、黒い矢印で示される 2 番目のメルト ピークを表示し、解析から除外する必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
記載されているプロトコルの主な貢献は、細胞内のNF-κB活性化を検出する迅速かつ容易な方法を提供し、NF-κB活性化に影響を与える複数の刺激条件または薬物の高スループット分析を可能にすることです。ここでは、サルモネラ菌感染HeLa細胞におけるNF-κB活性化のためのプロトコルについて説明する。これらの細胞は、他の病原体との感染に使用して、NF-κB活性化に対する細菌感染の影響を研究することができる。さらに、HeLa 57A細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化は、NF-κB活性化につながるシグナル伝達経路の活性化または阻害剤のスクリーニングに使用することができる。ここでは、HeLa 57A細胞を48ウェルプレートに播種しますが、これらの実験は96~384ウェルプレートまでスケールアップし、実験あたりのサンプル数を増やすことができます。HeLa 57A細胞はLacZを構成的に発現し、β-galアッセイを用いて細胞数および生存率の内部制御として測定することができる。ここで説明するプロトコルは、NF-κB::luciferaseレポーター構築物で安定または一過性にトランスフェクトされた細胞株での使用に適用可能である。RAW264.7マクロファージ細胞株は、このような目的のために既に使用されている18.重要なことに、この方法は、5つの異なるNF−κBサブユニットの異なるホモ/ヘテロダイマーの活性化を区別しない。異なるNF−κBホモ−ヘテロ二量体錯体は、プロモーター配列に対して異なる親和性を有するとともに、異なる転写結果21を有する。免疫グロブリンκ鎖プロモーター領域からのκB結合部位への親和性が低いため、ここで説明するレポーターを用いて特定のNF−κBダイマーの活性化が見逃される可能性がある。
ある細胞株を刺激するのに適した条件は、別の細胞株に直接適用できない可能性があることに注意することが重要です。したがって、アッセイ条件は各アッセイシステムで最適化されることを強くお勧めします。感染の時間、MOI、薬物治療の持続時間、薬物投与、および播種条件はすべて、NF-κB活性化を評価する際に考慮すべき重要な考慮事項である。例えば、RAW264.7マクロファージは、HeLa 57A細胞18で見られるように同様の発光シグナルを生成するために異なる条件を必要とするサルモネラ感染に対してより敏感である。
発光測定では、エッジウェルが同様に刺激された他のウェルとはかなり異なる値を持つことは珍しくありません。これは典型的には、プレート上のエッジウェルの蒸発速度が高いため、薬物濃度の増加につながる。これは、井戸間の空間に血清フリーメディアを添加したり、それを可能にするプレートの場合、蒸発を減らすためにふた/プレートの組み合わせを変更したり、問題が持続する場合はエッジウェルを完全に省略することによって対処できます。
哺乳動物細胞で発現される、ホタルルシフェラーゼは、数時間の半減期を有し、一般に、ほとんどのレポーターアッセイ22の目的のために安定であると考えされる。ここで説明するものよりも長い治療期間を確実に行ってもよい。しかし、ここで用いられるルシフェラーゼアッセイシステムは、最初の1分間だけ安定した信号を生成し、その後すぐに劣化する。したがって、細胞溶解物と基質を混合した後に発光測定を迅速に行うことは非常に重要です。
NF-κBは、サイトカインおよびケモカイン(すなわち、Il6およびIl23)を含む遺伝子の大規模な配列の転写因子である。NF-κB依存性ルシフェラーゼ活性を測定することは、必ずしもこれらのサイトカインおよびケモカインが発現することを意味するわけではない。この方法は、NF-κB活性に影響を与える条件の特性評価のための潜在的な第一画面として機能することにより、既存の分子定量技術を補完することができ、RT-qPCRを介して機能的に検証することができる。NF-κB活性化の機能検証は、mRNA定量が適切でない場合に目的のタンパク質に特異的なウェスタンブロット分析または機能アッセイを介して行うこともできる。これは、NF−κB結合によって転写が誘導される遺伝子であるインターロイキンβ(Il1b)の場合であるが、タンパク質産物は成熟産物23、24を形成するために翻訳後修飾を必要とする。
ここで説明する特定のRNA分離プロトコルは、RT-qPCR分析に使用するために使用され得る唯一のものであり、市販のキットなどの他の好ましい方法を代わりに使用することができる。RNAの品質はプロセスにとって非常に重要であるため、RNAは分解を防ぐためにできるだけ氷上に保つ必要があることに注意することが重要です。384 ウェルプレートをロードする際にこのような小さなボリュームのピペットがエラーの原因となる可能性があるため、RT-qPCR 反応で重複した反応を実行して PCR 反応が一貫していることを確認することが重要です。ハウスキーピング遺伝子のCt値はサンプル間で一貫している必要があり、これからの偏差は、最終結果に影響を与える可能性のある逆転写中のRNA濃度の非効率的な洗浄ステップまたは不一致を示している可能性があります。また、各qPCR実験の後に溶融曲線をチェックすることも重要です。1つのピークの存在は、qPCRプライマーが単一の遺伝子を増幅していることを示唆している。複数の曲線は、プライマーダイマーのオフターゲット遺伝子増幅または存在があることを示唆している。いずれの場合も、溶融曲線に存在する複数のピークは、特異性を確保するためにプライマーを再設計する必要があることを示唆しています。変動の余地が非常に大きいので、あらゆる段階で良いテクニックのエクササイズと洗練は、正確で再現可能な結果を生成するために不可欠です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
キーストラ・ゴウンダー研究所での研究は、NIHのNIAIDから賞番号R21AI122092の助成金と、米国糖尿病協会からの賞番号1-18-JDF-035の助成金によって支えられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| Promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C.
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
