Summary
Hier stellen wir eine Methode zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virusmitteln vor, die die HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split-Luziferase-Assay-System hemmen. Dieses System ermöglicht den einfachen Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen und eignet sich zur Identifizierung von Inhibitoren solcher Wechselwirkungen.
Abstract
Es besteht ein dringender Bedarf an neuartigen therapeutischen Wirkstoffen für die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV). Obwohl derzeit verfügbare Nukleos(t)ide Analoge die Virusreplikation stark hemmen, haben sie keine direkte Wirkung auf die Expression viraler Proteine, die aus einer viralen kovalent geschlossenen kreisförmigen DNA (cccDNA) transkribiert wurden. Da eine hohe virusfreie Antigenbelastung bei dieser chronischen und HBV-bedingten Karzinogenese eine Rolle spielen kann, ist das Ziel der HBV-Behandlung die Ausrottung viraler Proteine. Das HBV-Regulierungsprotein X (HBx) bindet an das an den Wirt dna schädigende Protein 1 (DDB1) Protein, um die strukturelle Erhaltung der Chromosomen 5/6 (Smc5/6) zu abbauen, was zu einer Aktivierung der viralen Transkription aus cccDNA führt. Hier präsentieren wir mit Einem Split Luciferase Complementation Assay System ein umfassendes zusammengesetztes Screening-System zur Identifizierung von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung. Unser Protokoll ermöglicht eine einfache Erkennung der Interaktionsdynamik in Echtzeit in lebenden Zellen. Diese Technik kann ein wichtiger Test werden, um neue therapeutische Wirkstoffe für die Behandlung von HBV-Infektion zu entdecken.
Introduction
Die Hepatitis-B-Infektion (HBV) ist weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit: Jährliche Schätzungen von 240 Millionen chronisch mit HBV infizierten Menschen und 90.000 Todesfällen aufgrund von Komplikationen durch die Infektion, einschließlich Zirrhose und Hepatozellulärem Karzinom (HCC)1. Obwohl die derzeitigen Anti-HBV-Therapeutika, Nukleos(t)ide-Analoga, die virale Reverse-Transkription ausreichend hemmen, erreichen sie selten die Eliminierung viraler Proteine, was das langfristige klinische Ziel ist. Ihre schlechte Wirkung auf die virale Proteinelimination ist auf ihre fehlende direkte Wirkung auf die virale Transkription von episomalen viralen kovalent geschlossenen kreisförmigen DNA-Minichromosomen (cccDNA) im Hepatozytenkern2zurückzuführen.
Die HBV-Transkription wird durch das HBV-regulatorische X (HBx)-Protein3aktiviert. Jüngste Studien zeigten, dass HBx die strukturelle Erhaltung der Chromosomen 5/6 (Smc5/6), ein Host-Restriktionsfaktor, der die HBV-Transkription von cccDNA blockiert, durch Entführung eines DDB1-CUL4-ROC1 E3 Ubiquitin Ligase-Komplexes4,5,6abbaut. Daher wird angenommen, dass ein entscheidender Schritt bei der Förderung der viralen Transkription von cccDNA die HBx-DDB1-Interaktion ist. Verbindungen, die die Bindung zwischen HBx und DDB1 hemmen können, können die virale Transkription blockieren, und in der Tat wurde Nitazoxanid als Inhibitor der HBx-DDB1-Wechselwirkung über ein in unseremLaborentwickeltes Screening-System 7 identifiziert.
Hier stellen wir Ihnen unser praktisches Screening-System vor, mit dem Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung identifiziert werden, die einen split luciferase komplementären Assay7,8verwendet. Split-Luziferase-Untereinheiten werden mit HBx und DDB1 verschmolzen, und die HBx-DDB1-Interaktion bringt die Untereinheiten in die Nähe, um ein funktionelles Enzym zu bilden, das ein helles Leuchtsignal erzeugt. Da die Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten reversibel ist, kann dieses System schnell dissoziierende HBx-DDB1-Proteine erkennen (Abbildung 1). Mit diesem System kann eine große zusammengesetzte Bibliothek leicht überprüft werden, was zur Entdeckung neuartiger Verbindungen führen kann, die die HBx-DDB1-Interaktion effizient hemmen können.
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Protocol
ANMERKUNG: Eine schematische Darstellung des Split-Luziferase-Assays ist in Abbildung 1Adargestellt, und der Assay-Prozess ist in Abbildung 1Bdargestellt. Die Interaktionsdynamik kann in Echtzeit ohne Zelllyse gemessen werden.
1. Zellvorbereitung
- Pflegen Sie kultivierte HEK293T-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch 10% v/v fetales Rinderserum (FBS), 1x Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in 20% O2 und 5% CO2.
- 5 x 106 Zellen in eine 100-mm-Schale mit 10 ml DMEM säen und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Transient transfekte 1 g HBx und DDB1 mit geteilten Luziferasen in die Zellen nach der folgenden Methode.
ANMERKUNG: Die Menge der transfiden Plasmid-DNA kann vom verwendeten Transfektionsregenten abhängen. Die optimale Position der gespaltenen Luziferase, die mit dem Zielprotein verschmolzen ist, muss vorher bestimmt werden. In diesem Fall lieferte HBx, das an der C-Endstation von HBx (HBx-LgBit) mit LgBit verschmolz, und DDB1, das mit SmBit am N-terminus von DDB1 (SmBit-DDB1) verschmolzen wurde, die besten Ergebnisse (d.h. die hellsten Luziferasesignale). Dieser Prozess wurde bereits ausführlich berichtet7.- Verdünnung von 1 g HBx-LgBit, das DNA-Plasmid exemitt, und 1 g SmBit-DDB1, das DNA-Plasmid (Materialtabelle) im DNA-Kondensationspuffer (Materialtabelle) auf ein Gesamtvolumen von 300 l ausdrückt.
- Fügen Sie 16 L Enhancer-Lösung (Tabelle der Materialien) und mischen durch Wirbeln für 1 s.
- Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 3 min.
- Fügen Sie der Probe 60 L Transfektionsreagenz (Materialtabelle) hinzu und mischen Sie sie durch Wirbeln für 10 s.
- Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 8 min.
- Während der Inkubation das Kulturmedium aus der Schale (in Schritt 1.2 zubereitet) ansaugen und Zellen mit 5 ml phosphatgepufferter Kochchen (PBS) waschen. Entfernen Sie PBS durch Aspiration und fügen Sie 7 ml DMEM hinzu.
- Fügen Sie 3 ml DMEM in das Rohr, das die Transfektionskomplexe enthält. Durch Pipettieren mischen und die Transfektionskomplexe in der 10 cm Schale auf die Zelle geben.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem Inkubator unter 5%CO2 für 10 h.
- Die Zellen in eine weiße 96-Wellplatte bei 5 x 104 Zellen/Gut in 50 l Medium/Well nach folgender Methode zurücksetzen.
- Entfernen Sie das verbrauchte Zellkulturmedium und waschen Sie Zellen mit 5 ml PBS.
- PBS durch Aspiration entfernen, 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen und bei 37 °C für 5 min inkubieren, um Zellen zu lösen.
- Fügen Sie 4 ml DMEM hinzu und dispergieren Sie das Medium, indem Sie mehrmals über die Oberfläche der Zellschicht pipetieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Rohr.
- Zentrifugenzellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Überstand entsorgen und das Zellpellet in 1 ml PBS wieder aufsetzen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie Überstand.
- Verdünnen Sie das Zellpellet mit gepuffertem Zellkulturmedium (Materialtabelle) ergänzt mit 10% FBS zu einer Saatdichte von 1,0 x 106 Zellen/ml.
- Pipette 50 l Zellsuspension in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte und geben Sie die Zellen an den Inkubator zurück.
- Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C unter 5%CO2 für 10 h.
2. Compound Screening
- Während der Inkubation die Siebverbindungen (Materialtabelle) und Lösungsmittel (Dimethylsulfoxid [DMSO]) mit 13,5-facher Konzentration verdünnen. Wenn der Bestand z. B. 10 mM beträgt und die Screening-Konzentration 10 m beträgt, fügen Sie 1 L der Stammlösung zu 73,1 l gepufferten Zellkulturmedium hinzu.
- Fügen Sie jedem Brunnen 12,5 l lumineszierendes Substrat (Materialtabelle) hinzu und brüten sie 5 min bei Raumtemperatur.
ANMERKUNG: Als Negativkontrollen sollten die Bohrungen an beiden Enden der Platte (d. h. die Spalten 1 und 12) kein leuchtmfessubstrates Substrat enthalten. - Messen Sie die Grundbeleuchtung mit einem Luminometer (Materialtabelle).
- Unmittelbar nach der ersten Messung 5 l Verbindungen hinzufügen und DMSO in Schritt 2.1 verdünnt kontrollieren.
ANMERKUNG: Die Endkonzentration beträgt 10 m. - Messen Sie Lumineszenzwerte alle 30 min für 2 h.
HINWEIS: Die Platte sollte im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert werden. - Berechnen Sie die hemmenden Effekte im Vergleich mit der Kontrolle DMSO Behandlung nach normalisieren zu den Basissignalen.
ANMERKUNG: Jede Verbindung in doppelter oder dreifacher Weise zu sieben, kann Variationen reduzieren.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse nach der Verwendung dieses Protokolls sind in Abbildung 2A,B dargestellt. Das Signal-Hintergrund-Verhältnis war größer als 80 und der Z-Faktor9 (der Goldstandard-Qualitätsindex für Dasperthemmierungs-Hochdurchsatz) war größer als 0,5, was darauf hindeutet, dass dieses Assay-System für das Screening mit hohem Durchsatz akzeptabel war. Mit der Schwelle auf >40% Hemmung im Vergleich zur Kontrolle (nur DMSO) identifizierten wir Nitazoxanid als Kandidatenmedikament7. Mit diesem System, bessere Kandidaten-Medikamente können durch Screening andere, größere zusammengesetzte Bibliotheken gefunden werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Split-Luziferase-Analyse der HBx-DDB1-Interaktion. (A) Das Prinzip der Detektion der HBx-DDB1-Bindung mit dem Split-Luziferase-Komplementär-Assay-System. Die getrennten Luziferase-Untereinheiten LgBit und SmBit werden mit HBx bzw. DDB1 verschmolzen. Die HBx-DDB1-Interaktion bringt die Untereinheiten in die Nähe, um ein funktionelles Enzym zu bilden, das ein Leuchtsignal erzeugt. Die Interaktion zwischen den Untereinheiten ist reversibel. (B) Split luziferase Assay. Nach der Ko-Transfektion von Plasmiden zur Expression von HBx, die mit LgBit verschmolzen und DDB1 mit SmBit verschmolzen wurde, wurden die Zellen in eine 96-Well-Platte wieder gesät. Die Zugabe von lumineszierendem Substrat ermöglicht die Messung der Luziferaseaktivität ohne Zelllyseschritt. Luziferase-Aktivitäten können nach Zugabe der Screening-Verbindungen gemessen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Erfolgreiche Ergebnisse des Split-Luziferase-Assays. (A) Repräsentative Basissignale von einer 96-Well-Platte. Die Luziferase-Intensität wird durch Zahlen und Farben dargestellt. Die Spalten 1 und 12 sind Steuerungen, bei denen das leuchtende Substrat nicht hinzugefügt wurde. Der Z'-Faktor war größer als 0,5. (B) Repräsentatives Zeitreihenergebnis der relativen Luziferaseaktivität nach Zugabe von Screening-Verbindungen zu einer 96-Well-Platte. Die x-Achse stellt die hemmenden Effekte dar, die im Vergleich zur Kontrolle (DMSO) nach der Standardisierung auf die Luziferase-Basisaktivität berechnet wurden. Die wirksamste Verbindung war Nitazoxanid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir entwickelten ein praktisches Screening-Verfahren mit einem Split-Luziferase-Assay, um HBx-DDB1-Bindungshemmer zu finden. Die Interaktionsdynamik kann in Echtzeit in lebenden Zellen ohne Zelllyse nachgewiesen werden. Die Hemmung der HBx-DDB1-Wechselwirkung führt zur Wiederherstellung von Smc5/6, was zur Unterdrückung der viralen Transkription, Proteinexpression und cccDNA-Produktion7führt. Dieser neuartige Mechanismus der antiviralen Wirkung kann die Unzulänglichkeiten der aktuellen HBV-Therapien überwinden.
Obwohl eine Reihe von Methoden zur Verfügung stehen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu untersuchen, bleibt die Untersuchung dieser Wechselwirkungen schwierig10. Unser Verfahren ist einfach und benötigt nur eine kurze Zeit, um eine 96-Well-Platte zu überprüfen. Darüber hinaus war die Screening-Qualität mit einer hohen Z'-Punktzahl, dem Goldstandard-Qualitätsindex für High-Throughput-Screening9, zufriedenstellend. Unser Assay eignet sich möglicherweise für die Roboterautomatisierung11 und ist ein effizienter Test für die Arzneimittelentdeckung.
Während das hier beschriebene Protokoll die HEK293T-Zelllinie verwendete, da seine hohe Transfektionswirksamkeit und hohe Proliferationsfähigkeit für das Screening mit hohem Durchsatz geeignet sind, kann dieses Screening-Verfahren mit anderen Zelllinien (z. B. HepG2) ohne Modifikationen durchgeführt werden7. Als realistische Strategie für das Screening von Verbindungen können HEK293T-Zellen im ersten Screening verwendet werden, gefolgt von HepG2-Zellen in einem zweiten Validierungsscreening. Einige Verbindungen zeigen möglicherweise keine signifikanten Ergebnisse in verschiedenen Zelllinien, wenn die Effekte von indirekten Mechanismen abhängig sind.
Da wir eine Screening-Methode mit hohem Durchsatz entwickeln wollten, sind nachfolgende Validierungsstudien notwendig, um zu bestätigen, ob die identifizierten Verbindungen als Wechselwirkungsinhibitoren funktionieren. Verringerte Werte von Lumineszenzsignalen in diesem Test entsprechen nicht immer der Hemmung der HBx-DDB1-Wechselwirkung. Zytotoxizitätstests, Co-Immunpräzipitationsstudien und weitere Anti-HBV-Experimente sind wichtig, um die Wirkung zu bestätigen7.
Obwohl wir zuvor Nitazoxanid als Inhibitor der HBx-DDB1-Wechselwirkung identifiziert haben, indem wir eine relativ kleine zusammengesetzte Bibliothek7screenings, können weitere Studien mit Screening von viel größeren zusammengesetzten Bibliotheken leicht durchgeführt werden, um neuartige Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, Protein-Protein-Wechselwirkungen effizienter zu hemmen. Bei der Durchführung eines solchen weiteren Screenings kann Nitazoxanid als positiv für den Assay verwendet werden. Darüber hinaus kann das hier beschriebene System auf andere Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet werden. Protein-Protein-Wechselwirkungen sind eine wichtige Klasse von Wirkstoffzielen12. Tatsächlich interagieren viele andere Viren mit Wirtsfaktoren, um ihre Pathogenität zu replizieren oder auszudrücken13,14. Der hier beschriebene Split-Luziferase-basierter Assay, der auf die Wechselwirkungen zwischen viralen und Wirtsproteinen abzielt, kann eine neue Strategie zur Entwicklung von Heilmitteln für HBV und andere Infektionskrankheiten bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Bildungsministeriums, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan (#19H03430 und #17K09405 m.O., und #19J11829 an K.S.), durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#18H05024 to M.O.), by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development, AMED (to M.O., #JP19fk021005), by program on the Innovative Development and the Application of New Drugs for Hepatitis B (#JP19fk0310102 to K.K.) die Japan Foundation for Applied Enzymology und von der Kobayashi Foundation for Cancer Research (to M.O.), von GSK Japan Research Grant 2018 (an K.S.) und durch ein Stipendium der Miyakawa Memorial Research Foundation (an K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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