Summary
在这里，我们提出了一个工具，可以用来研究原脑外皮细胞中笔录的后笔次调制，方法是使用可诱导的表达系统耦合到移液器电穿孔技术。
Abstract
研究转录后调节对于理解给定信使RNA（mRNA）的调制及其对细胞平衡和代谢的影响至关重要。事实上，笔录表达的波动可以改变笔录的翻译效率，并最终改变笔录的细胞活动。已经开发了几种实验方法来研究mRNA的半衰程，尽管其中一些方法有局限性，无法对后笔后调制进行适当的研究。促进剂诱导系统可以在合成四环素调节促进剂的控制下表达感兴趣的基因。该方法允许在任何实验条件下对给定mRNA进行半衰期估计，而不会干扰细胞平衡。这种方法的一个主要缺点是转染细胞的必要性，这限制了在对传统转染技术高度抗性的分离原发细胞中使用这种技术。原发培养中的阿尔维拉尔上皮细胞已广泛用于研究阿尔维拉尔上皮细胞和分子生物学。原性球状细胞的独特特性和表型使得研究这些细胞中感兴趣的基因的转录后调制至关重要。因此，我们的目标是开发一种新的工具，以研究在原发培养中，对阿尔维拉尔上皮细胞感兴趣的mRNA的后笔后调制。我们设计了一种快速高效的瞬态转染方案，将转录控制的质粒表达系统插入原发性上皮细胞。这种克隆策略，使用病毒表位来标记构造，允许从内源性mRNA的构造表达式容易区分。使用经过修改的+量化周期 （Cq） 方法，可以以不同的时间间隔对笔录的表达式进行量化，以测量其半衰。我们的数据证明了这种新方法在研究原发性外皮细胞中各种病理生理条件下的后转后调节方面的效率。
Introduction
已经开发出几种技术来确定mRNA的半衰程。脉冲-追逐衰减技术，利用标记的mRNA，允许同时评估一个大池的mRNA，最小的细胞扰动。然而，这种方法不允许直接估计单个基因转录的半衰期，不能实施研究mRNA在刺激后与生长因子，ROS，报警，或炎症1的后转后调制。
使用转录抑制剂，如行为霉素D和β-阿马尼特，是一种相对简单的方法，测量mRNA降解动力学随着时间的推移。与以前的技术（即脉冲追逐）相比，这种方法的一个主要优点依赖于直接估计给定笔录的半衰程并比较不同处理如何影响其降解动力学的能力。然而，转录抑制剂对细胞生理学的显著有害影响是方法2的一个主要缺点。事实上，用这些药物抑制整个细胞转录素具有干扰mRNA稳定性关键元素（如微RNA（miRNA））的合成，以及RNA结合蛋白的表达和合成，这对mRNA降解和稳定性非常重要。"因此，这些药物对基因转录的严重扰动可以实际改变转录器的降解曲线。
启动器诱导系统是测量特定 mRNA 半衰程的第三种方法。此方法测量特定 mRNA 的降解方法与使用转录抑制剂的方法类似。经常使用两种类型的诱导系统：血清诱导的c-fos促进剂3和Tet-Off诱导系统4。使用 c-fos 系统时，无需使用对细胞有毒的转录抑制剂。但是，此方法需要细胞周期同步，从而阻止在相位5期间评估笔录的实际稳定性。相反，Tet-Off系统允许在合成四环素调节促进剂的控制下强烈表达感兴趣的基因（GOI）。此系统需要存在两个元素，必须共同转换到细胞中才能正常工作。第一个质粒（pTet-off）表示调节蛋白tTA-Adv，一种混合合成转录因子，由原核抑制剂TetR（来自大肠杆菌）融合到病毒蛋白HSV VP16的三个转录转活域。GOI在合成启动子（PTight）的控制下克隆成pTRE-Tight质粒，包括微小病毒（CMV）促进剂的最小序列，并融合到ttO运算符序列的七次重复。PTight下游基因的转录取决于TetR与TtO的相互作用。在四环素或其衍生物多西环素的存在下，TetR抑制器失去对ttO运算符的亲和力，导致转录4停止。Tet-Off系统的特点使其成为研究真核细胞中特定mRNA表达的理想模型，同时避免潜在的普列益效应，这种效应与真核细胞6中缺乏原核调控序列是次要的。通常，双稳定Tet-off细胞系（HEK 293，HeLa和PC12）用于集成调节器和响应质粒的副本，以方便获得可控基因表达7，8，9。
培养中的藻菌上皮细胞的几种模型被用来研究阿尔维拉尔上皮细胞的细胞和分子生物学。多年来，研究人员广泛利用了人类或啮齿动物原细胞10、11以及不朽的细胞系，如人类A549或大鼠RLE-6TN细胞12、13。虽然它们通常繁殖较少，更容易培养和转染，但原生培养中的奥维拉尔上皮细胞仍然是研究生理和病理条件下奥维拉尔上皮功能和功能障碍的黄金标准。事实上，不朽的细胞系，如A549细胞，没有表现出原细胞的复杂特性和表型，而原发培养物中的球状上皮细胞重述了食位细胞上皮的主要特性，特别是形成偏振和紧密屏障的能力14，15。不幸的是，这些细胞对传统的转染技术非常耐受，例如使用脂体，使得使用启动器诱导系统（如Tet-Off）非常困难。
mRNA的后转后调制是快速调节转录16基因表达的最有效方法之一。mRNA 3' 未翻译区域 （3' UTR） 在这一机制中起着重要的作用。已经表明，与5'UTR不同，3'UTR的长度与生物体的细胞和形态复杂性之间存在指数相关性。这种相关性表明，3'UTR，像mRNA编码区域一样，一直受到自然选择，以便在整个进化过程中进行越来越复杂的后转后调制17。3' UTR包含几个蛋白质和miRNA结合位点，影响笔录的稳定性和翻译。
在目前的工作中，我们开发了一个工具，用于调查高度保守的域在 GOI 3' UTR 中控制笔录稳定性的作用。我们专注于上皮钠通道，α亚基（#ENaC），在上皮生理学中起着关键作用18。在原发培养中，Alveolar上皮细胞成功地与Tet-Off系统的两个组件进行瞬态转染，这使得可以研究与使用转录抑制剂与其他协议相比，3'UTR在mRNA稳定性中的作用。开发了一种克隆策略，使用非内源表达表皮（V5）将GOI的表达与内源基因的表达区分开来。然后，使用移液器电穿孔技术将反应和调节质粒转移到电体上皮细胞中。随后，通过以不同时间间隔孵育多西环素细胞来测量笔录的表达。RT-qPCR使用经过转染的tTA-Ad mRNA产物对笔录的半衰程进行了评价，并采用经过改造的Cq方法进行规范化。通过我们的协议，我们为研究不同条件下成绩单的后笔调制和更详细地定义未翻译区域的参与提供了一种便捷的方法。
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Protocol
所有动物程序都是根据加拿大动物护理理事会的指导方针进行的，并经蒙特利尔大学中心研究中心机构动物护理委员会批准。
1. 表达感兴趣的基因的响应质粒的设计与生成（GOI）
- 使用可诱导的四环素关闭矢量，如 pTRE-Tight。
- 分析向量的 GOI 和多个克隆站点 （MCS） 的顺序，以标识在 GOI 内部不存在的 MCS 中的限制站点。
- 分离原发性肺泡上皮细胞从雄性斯普拉格-道利大鼠肺，如先前描述的19，20。
- 使用标准方法（如酚类/氯仿提取或使用基于二氧化硅的RNA自旋柱）提取从藻类上皮细胞中纯化总RNA。
- 使用寡聚（dT）和高保真反向转录酶将mRNA反向转录成互补DNA（cDNA）。
- 使用高保真Taq聚合酶和标准重叠PCR技术，使用设计引物，用两个选定的限制性酶识别位点来对GOI进行侧翼。
- 有前引底器含有Kozak共识核糖体结合位点21以提高表达水平，以研究蛋白质表达与mRNA稳定性并行。必须包含编码 GOI 上游 V5 表皮的序列，以区分转染 GOI 的表达式和内源表达式（表 1）。
- 在停止 codon 后，让反向底漆包含多反解信号。
- 突变体可以通过顺序删除生成，以研究不同3'UTR区域对GOImRNA稳定性的影响，使用反向底漆编码多反解位，逐渐删除GOI 3'UTR的3'末端（图6）。或者，PCR定向诱变可用于瞄准3'UTR22中感兴趣的特定区域。
- 在适当的孵化温度下消化诱导载体和插入物，在适当的孵育温度下为1小时，随后在病媒反应30分钟内用磷酸酶进行治疗，以避免自我连接。
- 将消化的矢量分开，通过电泳将分段插入 1-1.5% 的琼脂胶凝胶中（浓度取决于刀片大小）。
- 使用刀片和紫外线，收集包含所需插入和矢量的DNA片段进行连接。
注： 协议可以在这里暂停。 - 使用基于二氧化硅的PCR纯化试剂盒从琼脂凝胶中净化收集的片段，并通过260nm的分光光度测量浓度。
- 使用载体：插入摩尔比1：3，增加连接概率，用T4 DNA连接物对GOI和诱导载体进行连接。在室温 （RT） 下孵育反应 3 小时。
- 将结扎反应转化为合格的大肠杆菌（DH5+）。
- 将1-10纳克的载体和基因添加到含有100μL的合格细胞的管子中。将细胞孵育在冰上30分钟，然后在42°C下将热休克细胞孵化45秒。将管子放在冰上2分钟，加入900μL的RT LB介质。在37°C下孵育细胞1小时，在225 rpm时摇动。
- 使用合适的抗生素（例如，pTRE-Tight载体的100微克/mL安培霉素）在LB加盘上传播100 μL的反应，以选择转化的细菌。在37°C下孵化板过夜。
- 使用接种回路或 20 μL 尖端选择单个菌落，并在 5 mL LB 介质中孵育过夜，在 37 °C 下摇动适当的抗生素。转化后的细菌可储存在-80°C的甘油中，LB介质与甘油的比率为400：600。
- 使用硅基质粒柱提取质粒DNA，并在260nm的分光光度测量浓度。通过限制分析及其方向确认 GOI 的插入，以及 RT-PCR 期间通过测序可能引入的突变。
2. 将表达感兴趣基因（GOI）的反应质粒转染到原发性上皮细胞中
- 将II型肺泡上皮细胞与大鼠肺部分离。
- 以1 x 106细胞/厘米2的密度在100毫米培养皿中播种细胞，具有完整的最小必要介质（完整的MEM）。完整的MEM是MEM补充10%FBS，0.08毫克/升托布拉霉素，塞普特拉（3微克/米左三米酮和17微克/米硫酸盐氧西索），0.2%NaHCO 3，0.01M HEPES（pH = 7.3），和2 mM L-谷氨酰胺。在加湿培养箱中，在37°C下在5%的CO2中培养细胞24小时。
- 第二天，在新的12孔板的每个孔中放置500μL的完整MEM，并在37°C预热30分钟。在此步骤中，使用无污染四环素或水平过低、无法干扰诱导性的胎儿牛血清非常重要。
- 通过在RT上每口井添加1μg的GOI质粒和1μg的调节载体，准备含有可诱导GOI（GOI质粒）和调节载体（例如pTet-off）的1.5 mL管。对于与RNA结合蛋白（RBP）共同表达实验，在DNA混合物中添加了表示感兴趣的RPB的组成载体（例如pcDNA3）的1μg（如图7）。
- 吸气介质，用PBS（不含钙和镁）在37°C预热时轻轻冲洗细胞。
- 加入5 mL 0.05%胰蛋白素，在37°C预热，并孵育细胞，直到细胞分离（2-4分钟）。通过添加10 mL的完整MEM，不含抗生素，中和胰蛋白酶。
- 将细胞悬浮液收集在50 mL管中，用4 mL的介质清洗培养皿，以收集尽可能多的剩余细胞，然后将细胞悬浮液在300 x g下离心5分钟。
- 轻轻吸气并丢弃上清液，并在 1 mL PBS 中重新悬浮颗粒。使用血细胞计计数和计算细胞数。
- 将细胞在300 x g下离心5分钟。轻轻吸气上清液，以4 x 107细胞/mL的浓度在重新悬浮液中重新悬浮颗粒。从步骤 2.4 中制备的 1.5 mL 管中加入细胞，每口井浓度为 400，000 个细胞，并通过上下移液轻轻混合。
- 将管子放入电镀装置中，并填充3.5 mL的电解缓冲液。
- 通过完全按下活塞，将镀金电极尖端插入移液器中。轻轻混合 1.5 mL 管的内容，并小心地将细胞与移液器吸气。小心防止气泡进入尖端，因为这将导致电弧在电镀过程中，并导致转染效率下降。
- 将移液器插入电镀站，直到发出咔嗒声。
- 为电体上皮细胞选择适当的电穿孔协议，与1，450 V的脉冲电压和2个宽度为20 ms的脉冲相对应，然后按触摸屏上的"开始"。
- 转染后立即取出移液器，将细胞转移到以前充满完整MEM的井中，而没有抗生素，抗生素已预热至37°C。
- 对其余样品重复步骤 2.11-2.14。
- 轻轻摇动板，使细胞均匀地扩散到井面上。在加湿培养箱中以5%的CO2在37°C下孵育细胞。2天后，用抗生素用完整的MEM代替介质。
- 通过观察荧光显微镜下eGFP的表达或使用控制载体的流细胞学，确认转染成功（图1）。
注：此步骤是可选的，需要使用表达 eGFP 的不同质粒（如 pcDNA3-EGFP）进行额外的转染步骤。
3. 诱导GOI的转录抑制
注：细胞可以在多西环引入前用所需的治疗进行预处理，以评估其对mRNA稳定性的影响（图5）。
- 在去离子水中制备1mg/mL的多氧环素库存溶液。将库存溶液存放在 -20°C，防止光线照射。多西环素，四环素衍生物，是使用而不是四环素，因为它的半衰程长（2倍）比四环素。此外，需要低浓度的多西环素完全失活23。
注：多西环素可能影响内源性GOI的mRNA表达。为了验证这一点，应测试24小时用多西环素治疗对卵泡细胞的影响，以确认GOI表达中没有任何变化（图2）。 - 在全MEM 72 h转染后制备新鲜的1μg/mL多氧环素溶液，并将其加热到37°C。
- 将介质更换为1 mL的完整MEM，每口井含有1μg/mL多氧环素，以抑制GOI的转录。
- 在37°C下以5%CO2孵育多口井，时间从15分钟-6小时的不同时间，以评估GOI的mRNA半衰程。
- 在治疗结束时，用冰冷的PBS清洗细胞，然后通过每孔加入500μL的缓冲液和摇动板使细胞均质，用市售的酚-氯仿RNA提取试剂盒将其压榨。
- 根据制造商的协议分离RNA。通过230、260和280nm的分光光度测定RNA的收率和纯度。RNA样本的260：230和260：280的比例分别为1.8和2.0，被认为是纯的。
注： 协议可以在这里暂停。
4. 确定 GOI 的 mRNA 稳定性
- 使用无RNA酶DNA酶I（扩增等级）处理1μg的总RNA，去除任何可能干扰后续DNA扩增的质粒DNA痕迹。
- 在0.2 mL PCR管中，结合1μg的总RNA、10x DNase I反应缓冲液1μL、1 μL的DNA酶I（1 U/μL）和无RNA酶水，以获得总体积10μL。
- 在RT孵化反应20分钟。
- 通过在10μL反应混合物中加入1μL的25 mM EDTA，在70°C下孵育反应10分钟，停用DNAse I。
- 使用商业上可用的cDNA合成试剂盒将脱氧核糖核酸总RNA逆转录入cDNA，并混合了寡利（dT）和随机hexamer引物，以提高反向转录效率。
- 简单地说，将4 μL的5倍反应混合物、1 μL的逆转录酶和4μL的无RNA酶水添加到脱氧核糖核酸总RNA混合物的11μL中，以获得总反应量20μL。
- 在25°C下孵育反应5分钟，在46°C下孵育20分钟，然后在95°C下孵育反应1分钟，使反应失去活性。每个反应将产生50纳克/μL的cDNA产物。
- 通过在20μL反应混合物中加入180μL的分子生物学级水，将cDNA反应稀释到5纳克/μL的浓度。将 cDNA 产品储存在 -80°C，或立即执行实时定量 PCR （qPCR）。
注： 协议可以在这里暂停。
- 设计特定于 GOI 的正向和反向 qPCR 引漆。
- 由于GOI在细胞中的内源性表达，底漆必须设计为放大与GOI耦合的V5表位上的100-150bp放大（表1）。
- 内部参考基因引物也必须用作规范化对照。通常，内务基因，如β-actin和低氧磷酸酯转移酶1基因，被用作参考基因。然而，由于转染效率的变化，这些不能用于此感应系统。相反，tTA-Ad 笔录的表达式被评估为规范化的目的，因为它的表达在细胞中是构成的，因为巨细胞病毒促进剂的活动。qPCR 测量其表达的任何变化将代表转染效率（引物：前5'-GCC TGA CGA CAA GGA GGA AAC TC-3'和反向 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3;129 bp amplicon），并允许转染克隆的表达规范化（图3）。
- 使用 SYBR 绿色染料母体混合在三联中制备每个 qPCR 反应。
- 使用分子生物学级水将5纳克/μL cDNA混合物稀释至1.25纳克/μL的浓度。
- 结合5μL SYBR绿色染料主混合物（2倍），0.1μL分子生物学级水，0.45 μL 7.5μM正向底漆，0.45 μL 7.5μM反向底漆，4 μL 1.25纳克/μL cDNA，通过移液在96孔PCR板中上下移液获得总反应量10μL。使用光学粘合膜确保板盖密封，并防止污染和蒸发。
- 通过离心短暂旋转反应混合物，并将板放入 qPCR 热循环器中。
- 使用以下 qPCR 条件放大 V5 标记的 GOI 和 tTA-Ad 放大器：95 °C 为 10 分钟作为变性步骤，然后是 40 个循环 95°C，10 秒，58 °C 表示 15 s，72 °C 为 20 秒。执行放大周期后，必须生成高分辨率熔化曲线，以评估所需安培的特定熔融温度，并确保无噪声放大峰。
- 包括qRT-PCR的负对照，通过将RNA作为模板，将RNA作为模板，而不产生逆转录酶，作为潜在质粒DNA污染和qPCR的控制，而不向qPCR混合物中添加cDNA，以确保缺少底漆二分或污染物。
- 必须根据 GOI 的标准曲线测定优化最佳 cDNA 浓度、引底效率和浓度。为此，使用未经处理的细胞（培养不含多西环素）的cDNA进行连续稀释。标准曲线是通过根据 cDNA 稀释因子的日志绘制 Cq 值生成的，放大效率 （E） 使用以下公式根据标准曲线的斜率计算：
E = 10-1/斜率
注： 放大效率应约为 0.9 到 1.05。否则，必须重新设计引素。
- 使用比较Cq方法分析qPCR数据，将GOI的表达式值与tTA-Ad的表达式规范化，以获得GOI的相对表达水平，并将其表达式作为GOI在起始点（t = 0）的细胞中的mRNA表达式的百分比报告（图4）。
- 使用以下方程从 GOI mRNA 降解曲线的速率常数 （K） 确定半衰程：
t1/2 = ln 2/K。
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Representative Results
该协议已成功用于生成Tet-off转录转录控制的质粒表达系统，以评估βENaC 3' UTR不同部分在主性外皮细胞的分录稳定性调制中的重要性。
该系统实施的第一步是建立一种快速、简单、高效的转染技术，用于初级培养中难以转染的食管上皮细胞。如图1所示，移液器电穿孔技术允许25-30%的转染效率，如荧光显微镜和流细胞测定检测到的eGFP细胞的比率所示。
在应用这种由四环素及其衍生物控制的诱导系统之前，验证了这种药物对我们GOI表达的影响。对上皮细胞进行1.0μg/mL多氧环素治疗，以评估其对内源性βENaC mRNA表达的影响。在1-24小时期间进行的治疗对内源性笔录的表达没有显著影响，如图2所示。
我们的转录控制的质粒表达系统使用qPCR规范化技术，不同于使用内务基因的标准技术。在V5-αENaC的表达中，信号根据tTA-Adv信号进行规范化，以确定使用Cq方法的转染效率。图 3显示了使用 tTA-Adv 转录器使 mRNA 表达正常化。
先前公布的结果表明，使用actino霉素D是不适当的估计βENaC笔录的稳定性，因为它表明异常高mRNA半衰期（约12小时）24。μENaC mRNA在Tet-Off系统（99分钟）的半衰期比存在面的actino霉素D短7倍，如图4所示。这证实了行为霉素D导致一个伪影βENaC mRNA稳定。
该Tet-Off系统还成功地用于测试已知影响βENaC基因表达的不同细胞压力源是否可以调节βENaC mRNA稳定性。如图5所示，环氧西米德治疗显著降低了笔录的稳定性（36分钟），而脂质糖（LPS，用于模仿传染性刺激）则没有。最后，亲炎细胞因子TNF-α导致V5-βENaC mRNA稳定性急剧下降（半衰程为16分钟）。
在目前的工作中，克隆战略旨在阐明3'UTR对调整_ENaC记录表的贡献。生成并测试了多个顺序删除突变体，以映射 #ENaC 3' UTR 不同域对笔录稳定性的贡献。图 6显示了 V5-_ENaC mRNA 稳定性调制的显著变化，具体取决于 3' UTR 的已删除和包含区域。
最后，通过RNA结合蛋白（RBP）对βENaC mRNA稳定性的调制进行了研究。带有pTRE-Tight矢量V5表皮的βENaC mRNA的转录在tTA-Adv.Dhx36、Tial1和hnRNPK的专属控制下，是三个与#ENaC24的3'UTR相连的RbP。因此，在与 Dhx36、Tial1 或 hnRNPK 配合转染后，V5-__ENaC 表达式的任何调制都将是 mRNA 稳定性调制的结果，而不是转录调制的结果。图7显示，Dhx36或Tial1的过度表达与hnRNPK的表达不同，与空pcDNA3质粒的转染相比，V5-_ENaC mRNA的稳定性降低了，这表明了某些限制性商业惯例的具体调制。
这些结果共同证实，我们开发的Tet-off转录控制质粒表达系统是评估笔录实际半衰程及其调制机制的适当工具。此工具将有助于获得新的见解，了解在生理和病理条件下参与奥维拉尔上皮功能的关键GOIs的后录后调控。
图1：通过移液器电穿孔在原培养中转染奥维拉尔上皮细胞的效率。原发性上皮细胞以2μg的pcDNA3质粒（空，克隆#1和#2）瞬时转染，表达或不表达GFP蛋白。转染后（A）荧光显微镜或（B）流细胞学对转染效率进行了48小时评估。单向ANOVA和邦费罗尼后临时测试;\p < 0.001 vs. 空。每个实验条件都使用了至少四个不同大鼠的细胞（n = 4）。比例尺 = 200 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图2：在阿尔维拉尔上皮细胞中，通过多西环素调节内源性βENaC mRNA。阿尔韦拉尔上皮细胞用1.0μg/mL多氧环氨酸治疗，为期1-24小时。βNaC mRNA的表达通过定量RT-PCR进行量化，并呈现为βENaC mRNA = SEM的表达，与未经处理的细胞（Ctrl;t = 0）在正常化后根据β-行为蛋白表达（单向ANOVA，n = 4）的表达。多西环素没有调节内源性βENaC mRNA随着时间的推移。之前在《米格诺》等24年作为图S4发布。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：根据调节mRNA tTA-Ad的表达，使用经过修改的Cq方法使GOI mRNA表达规范化。阿尔韦拉尔上皮细胞与pTet-off质粒和pTRE-Tight质粒编码βENaC cDNA瞬态地结合，其开放读取框架上游的V5上上面和完整的3'UTR序列。V5-_ENaC和tTA-Ad mRNA的表达是通过未经处理细胞的定量RT-PCR测量的。（A） 描绘了两个独立的转染（R1 和 R2）的 V5-αENaC 和 tTA-Ad 的增量规范化 SYBR 绿色荧光信号 （μRn）。（B） 左图：每个实验（R1 和 R2）中 V5-_ENaC 和 tTA-Ad 的 mRNA 表达式表示为循环定量值 （Cq）。介绍了V5-_ENaC和tTA-Ad mRNA表达（μCq）之间的差异。右图：使用 tTA-Ad mRNA 代替内务基因，可以有效规范化 GOI 的表达，与 R2 中的后者相比，GOI 在 R1 中的相对表达率为 0.98。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：在存在且不存在行为霉素 D 的情况下使用转录控制的质粒表达系统时，V5-αENaC mRNA 的降解动力学。原发性上皮细胞与pTet-off质粒和pTRE-TIGHT质粒编码βENaC cDNA暂时结合，其开放读取框架上游带有V5上上，并完成3'UTR序列。细胞预处理或未经治疗与活性霉素D（5.0微克/米L）30分钟孵育后与多西环素（1.0微克/米L）15分钟-6小时。 V5-αENaC mRNA的表达通过定量RT-PCR测量，在规范化后根据tTA-Ad的表达，在未处理的细胞（t = 0）中作为V5-_ENaC mRNA表达的百分比[ SEM]呈现。V5-αENaC mRNA半衰期通过每个细胞制备的单相衰减非线性回归进行估计。多重回归分析表明，与未经治疗的细胞（p < 0.0001）相比，使用活性霉素D治疗的细胞的V5-αENaC mRNA稳定性存在统计学显著性差异。每个实验条件都使用了至少四个不同大鼠的细胞（n = 4）。之前在 Migneault 等人24中作为图 1发布。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：通过不同的细胞和炎症应力调制V5-αENaC mRNA稳定性。原发性上皮细胞与pTet-off质粒和pTRE-TIGHT质粒编码βENaC cDNA暂时结合，其开放读取框架上游带有V5上上，并完成3'UTR序列。细胞预处理30分钟，1.0μM环己胺（CHX）（A）或15μg/mLLPS（B），或5小时100纳克/mL TNF-+（C），然后用1.0μg/mL多氧环氨酸进行治疗，为期15-120分钟。 V5-αENaC mRNA的表达通过定量RT-PCR测量，在规范化后根据tTA-Ad的表达，在未处理的细胞（t = 0）中作为V5-_ENaC mRNA表达的百分比[ SEM]呈现。每个实验条件都使用了至少三个不同大鼠的细胞（n = 3）。（D） 被处理细胞中的V5-βENaC mRNA的半衰程（t1/2）与细胞（Ctrl）中mRNA的半衰程进行比较。半衰程根据V5-αENaC mRNA降解曲线的速率常数（K）使用方程t1/2 = ln 2/K进行测量，然后表示为最小 = SEM（单向 ANOVA 测试和 Bonferroni 后试算测试;[p < 0.01 vs. 对照;n = 3）。改编自图36之前发表在米格诺，F.25 。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：使用顺序删除克隆策略揭示βENaC 3'UTR不同区域在mRNA稳定性调制中的作用。（A） V5-_ENaC 脚本的原理图，在 pTRE-TIGHT 表达式矢量中插入完整的 3' UTR。打开的阅读框架被描绘成灰色框，而 3' UTR 显示为白色框。对具有完整 3' UTR 的克隆和不同的删除突变体（Del 1 到 Del 4）的 3' UTR 部分进行描述。（B） 原发性外皮细胞与pTRE紧质粒进行瞬态共转，编码不同的βENaC 3' UTR删除突变体以及表示tTA-Ad的pTet-off质粒，允许该构造的特定表达和多西环素抑制。转染后72小时，细胞用多西环素（1.0 μg/mL）治疗15分钟至6小时。 V5-_ENaC mRNA的表达通过定量RT-PCR测量，并呈现为V5-_ENaC mRNA表达在未处理细胞（t = 0）后，根据tTTA-Ad的表达的百分比= SEM。使用以下方程从V5-αENaC mRNA降解曲线的速率常数（K）估计每个构造的V5-αENaC mRNA半衰程：t1/2 = ln 2/K。V5-_ENaC mRNA 衰变显示为具有完整 3' UTR （Comp） 的克隆，以及 Del 1 到 Del 4 3' UTR 删除突变体。为每个克隆者给出mRNA衰变的半衰程（t1/2）。在右下角象限中，该图显示了为每个克隆估计的不同 t1/2 = SEM 值的比较。根据克鲁斯卡-瓦利斯测试，不同组之间的 p < 0.05。*p < 0.05 根据邓恩的后临时测试相比，完整的3'UTR。根据邓恩的专后测试与Del 3相比，< 0.05。每个实验条件都使用了至少五种不同动物的细胞（n = 5）。改编自之前发表在《米格诺》第24版上的数字2和3。请点击此处查看此图形的较大版本。
图7：由RNA结合蛋白hnRNPK、Dhx36和Tial1对V5-αENaC mRNA的后录调制。（A） 原发性上皮细胞与pTRE紧质粒编码V5-_ENaC mRNA以及Dhx36、hnRNPK或Tial1 RbPs和pTet-off质粒的表达载体一起共同转染。V5-αENaC mRNA表达通过RT-qPCR 72 h转染后进行量化，与在规范化后根据表达式tTA-Ad进行正常化的细胞中，V5-αENaC mRNA表达的百分比= SEM表示。Dhx36和Tial1的过度表达显著抑制了V5-αENaC mRNA表达，而hnRNPK的过度表达没有效果。*p < 0.05 根据Kruskal-Wallis测试和邓恩的后特设测试相比空矢量;n = 对不同动物的3个样本进行了重复测试，以验证每个实验条件。（B） 通过克隆 pTRE 紧质粒 （V5-@ENaC-Del5） 中 βENaC 停止块旁边的 3' UTR 的远端区域，删除了 _ENaC 3' UTR 的近端部分。（C） 原性球蛋白上皮细胞在pTRE-Tight矢量中与V5-αENaC或V5-_ENaC-Del5以及pTetoff质粒和Dhx36或Tial1 RBP过度表达的表达载体一起被共转。V5-αENaC mRNA表达通过RT-qPCR 72 h转染后进行量化，根据tTA-Ad的表达，与在规范化后与空向量（pcDNA3）转染的细胞相比，V5-αENaC mRNA表达的百分比= SEM表示。Dhx36 和 Tial1 的过度表达对 V5-_ENaC-Del5 mRNA 表达没有影响。*p < 0.05 根据Kruskal-Wallis测试和邓恩的后临时测试，将实验向量与空矢量进行比较;#p < 0.05 根据曼-惠特尼U测试，将实验载体与完整的3'UTR突变体进行比较;n = 6 每个实验条件。改编自之前发表在《米格诺》第24版上的数字5和7。请点击此处查看此图形的较大版本。
| A | |||
| 模板 | 3' UTR | 感知 | 序列 |
| *ENaC cDNA | 完成 | F | 5'-ATCGGCTAG卡茨格特格格格格格 GTAGCCTATTACT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTATGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| 德尔 1 | R | 5'- GCACTATTTTTTCTCTCTCT 加加加卡格特加阿格-3' |
|
| 德尔 2 | R | 5'- GCACTAATTTTTAAAA 卡阿格格格茨特格格-3' |
|
| 德尔 3 | R | 5'-GCACTAATTTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| 德尔 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTATATATCAGAG CGCCAGGGCACAG-3' |
|
| 德尔 5 | R | 5'-ATCGCAATTCTCAGAGCC 海合会加格卡加格-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAATTCTCTCTT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| 目标 | 感知 | 序列 | |
| V5-_ENaC | F | 5'-CCACTCTCTCTCTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTTCTCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGAAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGTGTATGATGCCTCC-3' | ||
表1：本研究中使用的引素。（A） 用于克隆和生成可诱导 pTRE 紧载体中的 V5-_ENaC 突变体的底漆。（B） 用于定量RT-PCR测量mRNA表达的引素。
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Discussion
原培养中奥维拉尔上皮细胞转染率低，是使用Tet-Off系统评估这些细胞mRNA稳定性的严重限制。然而，这一限制通过移液器电穿孔而克服，允许25-30%的转染效率（图1和图3）26。
笔录稳定性的测量对于理解给定mRNA的调制及其对细胞平衡和代谢的影响至关重要。GOI生物利用度的变化可能会改变翻译效率，并直接影响细胞中GOI的表达。由于这些原因，已经开发了几种技术来确定mRNA的半衰程。如上所述，每种技术都有限制和限制，无法正确研究感兴趣的成绩单。与其他技术相比，这里开发的TET-off模型具有在任何实验条件下允许给定mRNA的半衰期估计的优点。然而，它不允许我们直接研究内源性成绩单的稳定性。为了尽可能克服这种限制，建议将笔录的5'UTR和3'UTR序列包括在质粒中，以便构造尽可能类似于内源转录。V5 表位的添加允许 RT-qPCR 与内源性笔录的特定放大目标 mRNA。关于克隆策略，选择插入感兴趣的基因上游的序列对于防止非特异性信号的放大至关重要。由于ORF的表上序列5'的长度较短，且在外皮细胞中缺乏表达，因此有必要添加ORF的V5上位序列5'， 以进行构造的特定qPCR放大。该策略还提供了使用相同诱导系统研究蛋白质翻译调制的机会。尽管 V5 表位（42 nte）体积较小，但仍可能影响转录的稳定性。因此，建议也测试其他表皮，如人类流感血凝素（HA）或任何其他序列在奥维拉尔上皮细胞的转录中没有发现。
该系统的一个局限性是使用多西环素来抑制GOI的转录。几份报告表明，多西环素可能对细胞代谢产生重大影响。在16HBE14支气管细胞中使用这种抗生素可减少增殖，并增加因凋亡而降低的死亡率27。此外，多西环素已被证明参与LPS炎症反应28的调制。因此，这种抗生素可能具有偏离目标的效果，可能会影响给定GOI的mRNA稳定性。出于这些原因，我们评估了1μg/mL多基环素在24小时期间对非转染细胞的影响，发现它不引起内源性βENaC mRNA表达的任何变化（图2）。之所以选择这种浓度，是因为它被广泛用于完全抑制Tet-off系统的转录，建议尽量减少细胞毒性的影响29。我们建议在奥维拉尔上皮细胞中使用这种浓度，并建议验证用于研究其他基因的最佳浓度，或使用Tet-Off系统的其他细胞类型。
我们的系统利用GOI的组成表达式，直到其转录被多西环素抑制。有人建议，过量的mRNA浓度可能对细胞有毒，并影响其新陈代谢。这可能导致GOI转录机的稳定性发生变化，导致其快速退化，因为非生理过度表达30。在我们的Tet-Off模型中，没有观察到这种毒性，因为转染细胞的形态与健康的非转染细胞相似（未显示数据）。根据Tani等人31号，在决定mRNA的半衰期时证明了Tet-off系统的有效性，我们的结果表明，Tet-off系统在外皮细胞中没有毒性，并且产生半衰期αENaC mRNA，不能反映在存在转录抑制剂（如活性素D（图4）的情况下报告的过半衰期。
该系统的发育对测量mRNA半衰期这一系统对记录在存在转录抑制剂（如行为霉素D）时观察到的结果提出了挑战。此方法表明，笔录的半衰期可能比之前测量的短得多。
我们的模型非常适用于研究特定笔录在不同条件下的递后调制，包括亲炎条件或RBP过度表达，以及沉默RNA治疗后。此外，它允许在影响奥维拉尔上皮细胞的病理生理条件下对mRNA的后笔次调制至关重要的未翻译区域进行表征。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
Francis Migneault得到魁北克呼吸保健网络和加拿大卫生研究所肺活训练方案、法国社会研究中心的学生和苏佩里厄斯学院的学生奖学金的支持。蒙特利尔大学博士后。这项工作得到了戈塞林-拉玛雷临床研究主席和加拿大卫生研究所[YBMOP-79544]的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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